Мембранная компартментализация и локальные физико-химические условия
Внутренние мембраны делят эукариотическую клетку на компартменты — отделённые друг от друга пространства, например лизосомы, эндоплазматический ретикулум (ЭР) и митохондрии. Липидный бислой плохо пропускает ионы и крупные полярные молекулы, поэтому такие вещества переходят через мембраны с помощью каналов, переносчиков и насосов. Благодаря этому в разных компартментах поддерживаются разные pH, концентрации ионов и окислительно-восстановительные условия. Так в одной клетке одновременно протекают процессы, требующие разных физико-химических условий. В мембране лизосомы протонный насос V-АТФаза переносит протоны внутрь и создаёт кислую среду с pH около 4,5–5, в которой работают ферменты, расщепляющие макромолекулы. ЭР накапливает Ca²⁺ и создаёт окислительные условия, необходимые для образования дисульфидных связей в секретируемых и мембранных белках. В цитозоле, напротив, среда восстановительная, а концентрация свободного Ca²⁺ в покое низкая, поэтому даже небольшой выброс Ca²⁺ из ЭР служит сигналом. Дыхательная цепь перекачивает протоны через внутреннюю мембрану митохондрий и создаёт электрохимический протонный градиент, энергию которого АТФ-синтаза использует для синтеза АТФ. Различия между компартментами не возникают сами по себе: насосы постоянно затрачивают энергию, чтобы поддерживать их вопреки утечке веществ через мембраны.
Локальная концентрация и формирование внутриклеточного градиента
Внутриклеточный градиент — постепенное изменение концентрации вещества в пространстве клетки: вблизи одного участка она выше, а по мере удаления ниже. Градиент возникает, когда вещество образуется или высвобождается в одном месте (источник), распространяется диффузией и удаляется или инактивируется по пути (сток). Диффузия выравнивает концентрацию, а связывание с белками, мембраны и плотная внутренняя структура клетки ограничивают распространение вещества. Типичный пример — локальное повышение концентрации Ca²⁺ возле открытого кальциевого канала в плазматической мембране или мембране ЭР. По мере удаления от канала концентрация Ca²⁺ быстро снижается, потому что ионы расходятся диффузией, связываются с белками-буферами и откачиваются насосами. Возле канала концентрация Ca²⁺ выше, но сила ответа зависит также от чувствительности конкретного белка-мишени к кальцию. Неравномерное распределение бывает и между компартментами: малая ГТФаза Ran в ядре находится преимущественно в активной форме, связанной с ГТФ (гуанозинтрифосфатом), а в цитоплазме — в неактивной. Так происходит потому, что белок, переводящий Ran в форму, связанную с ГТФ, закреплён на хроматине ядра, а белок, ускоряющий гидролиз ГТФ, находится в цитоплазме. Градиент сохраняется, пока работают источник и сток и затрачивается энергия; благодаря этому сигнал или транспорт направляются в определённое место клетки.
Фосфоинозитиды как маркеры идентичности клеточных мембран
Фосфоинозитиды — мембранные липиды, производные фосфатидилинозитола, которые различаются тем, в каких положениях инозитольного кольца (3, 4 или 5) присоединены фосфатные группы. Обозначение указывает положения фосфатов: например, PI(4,5)P₂ — фосфатидилинозитол с фосфатами в положениях 4 и 5. Эти липиды находятся в цитозольном слое мембран и составляют малую долю липидов, но служат метками, которые распознают цитоплазматические белки. Разные мембраны обогащены разными фосфоинозитидами: плазматическая мембрана — PI(4,5)P₂, аппарат Гольджи — PI4P, ранние эндосомы — PI3P. Белки узнают метку с помощью специальных доменов: например, FYVE-домен белков ранних эндосом связывает PI3P, и такой белок закрепляется на эндосоме. Поэтому набор фосфоинозитидов работает как часть «адреса» мембраны, к которому привлекаются определённые белки. Состав меток быстро меняется: киназы присоединяют фосфатные группы, а фосфатазы их удаляют, и мембрана может сменить метку, например при созревании эндосомы. Так, после активации рецептора фермент PI3K (фосфоинозитид-3-киназа) превращает PI(4,5)P₂ в PI(3,4,5)P₃, а специальная фосфатаза выполняет обратную реакцию. Одна липидная метка не определяет органеллу: её идентичность задаётся сочетанием фосфоинозитидов с белковыми маркерами, прежде всего с белками семейства Rab, разные представители которого находятся на разных органеллах.
Мембранные контактные сайты органелл без слияния мембран
Мембранные контактные сайты — участки, где мембраны двух органелл сближаются до расстояния в несколько десятков нанометров, но не сливаются, и содержимое органелл не смешивается. Мембраны удерживаются рядом связывающими белками, которые закреплены в одной мембране и взаимодействуют с белками или липидами другой. Такие участки позволяют органеллам обмениваться веществами без участия транспортных пузырьков (везикул), то есть без слияния мембран. Через контакты ЭР с аппаратом Гольджи переносятся липиды, которые синтезируются в ЭР, а используются в других мембранах. Например, белок-переносчик CERT извлекает церамид из мембраны ЭР и доставляет его в аппарат Гольджи, где из церамида синтезируется сфингомиелин. В контактах ЭР с митохондриями Ca²⁺, вышедший из ЭР через кальциевые каналы, открываемые инозитолтрифосфатом (IP₃-рецепторы), создаёт рядом с митохондрией участок высокой концентрации кальция. Этот Ca²⁺ проходит через наружную мембрану митохондрии по каналу VDAC, а через внутреннюю — по кальциевому каналу MCU. Кальций в матриксе митохондрии активирует ферменты цикла трикарбоновых кислот и тем самым связывает кальциевый сигнал с выработкой АТФ. Не каждый контакт выполняет все функции: от набора белков в контакте зависит, будут ли через него переноситься липиды, Ca²⁺ или и то и другое.
Направленный транспорт — перемещение пузырьков (везикул), органелл и белковых комплексов по цитоскелету с помощью моторных белков, использующих энергию гидролиза АТФ. Микротрубочки полярны: у каждой есть плюс-конец, на котором сборка идёт быстрее, и противоположный минус-конец. Большинство кинезинов движется к плюс-концу микротрубочки, а цитоплазматический динеин — к минус-концу, поэтому груз может перемещаться в обе стороны. Во многих клетках минус-концы собраны у центросомы (главного центра организации микротрубочек) рядом с ядром, а плюс-концы направлены к периферии. Однако расположение концов различается в разных типах клеток, поэтому движение к плюс-концу не всегда означает движение к периферии. Мотор присоединяется к определённому грузу через белки-адаптеры, и от этих адаптеров зависит, какой груз и куда будет доставлен. Миозины переносят груз по актиновым филаментам, обычно на коротких расстояниях, например под плазматической мембраной. Особенно важен транспорт в нейронах: белки и мембраны образуются в теле клетки, а затем в составе везикул доставляются по микротрубочкам аксона к его окончаниям. Поскольку аксон бывает очень длинным, нарушение такого транспорта в первую очередь сказывается на удалённых участках нейрона.
Слияние и деление мембранных органелл: митохондрии как модель и границы обобщения
Митохондрии в клетке образуют динамическую сеть, которая постоянно перестраивается за счёт двух противоположных процессов — слияния и деления. Слияние позволяет митохондриям обмениваться содержимым, а деление — распределять их по клетке и передавать дочерним клеткам при митозе. Наружные мембраны сливают митофузины MFN1 и MFN2, а внутренние — белок OPA1; все они ГТФазы — ферменты, расщепляющие ГТФ (гуанозинтрифосфат). Деление обеспечивает ГТФаза DRP1: она переходит из цитоплазмы на наружную мембрану, образует вокруг митохондрии кольцо и сжимает её до разделения. Слияние и деление участвуют в контроле качества: при выраженной потере мембранного потенциала могут расщепляться длинные формы OPA1, что ограничивает слияние митохондрий. Повреждённый участок сети иногда отделяется делением и затем удаляется митофагией — избирательным разрушением митохондрий в лизосомах. При этом деление само по себе не означает повреждения: например, митохондрии фрагментируются и при нормальном делении клетки. Механизм слияния митохондрий нельзя напрямую переносить на другие органеллы: их мембраны сливаются с помощью других белков. Например, слияние эндосом с лизосомами обеспечивают белки SNARE, которые стягивают две мембраны, а не митофузины и OPA1.
Биомолекулярные конденсаты: сборка, динамика и критерии интерпретации
Биомолекулярные конденсаты — скопления определённых белков и РНК внутри клетки, не окружённые липидной мембраной; пример — ядрышко, где образуются рибосомы. Их сборку поддерживают многочисленные слабые взаимодействия между молекулами, часто с участием неупорядоченных участков белков, у которых нет устойчивой пространственной структуры. Один из возможных механизмов сборки — жидкостное фазовое разделение, при котором раствор расслаивается на фазу с высокой и фазу с низкой концентрацией компонентов. Однако не всякая безмембранная структура образуется именно так, поэтому механизм нужно устанавливать отдельно для каждого конденсата. Сборка зависит прежде всего от концентрации компонентов, присутствия РНК и модификаций белков, например фосфорилирования, которое может способствовать сборке конденсата или его разборке. Концентрируя одни молекулы и исключая другие, конденсаты могут ускорять реакции или, наоборот, временно изолировать молекулы, например в стресс-гранулах. По свойствам конденсаты бывают жидкими, вязкоупругими (гелеобразными) и почти твёрдыми, и эти свойства могут меняться со временем. Округлая форма, слияние скоплений и быстрый обмен молекулами с окружением согласуются с жидкими свойствами, но сами по себе не доказывают фазовое разделение. Вывод о механизме делают только по совокупности независимых наблюдений и по последствиям направленного нарушения сборки для клетки.
Клеточная полярность — устойчивое неравномерное распределение белков, липидов и органелл, благодаря которому разные участки клетки различаются по строению и функции. В эпителиальной клетке апикальная поверхность обращена в просвет органа, а базолатеральная — к соседним клеткам и базальной мембране, и набор белков на них различается. Различие этих областей мембраны (доменов) задают белковые комплексы полярности: например, комплекс PAR поддерживает апикальную сторону, а комплекс Scribble — базолатеральную, и они ограничивают области действия друг друга. Плотные контакты между соседними клетками затрудняют перемешивание белков и липидов наружного слоя мембраны между апикальной и базолатеральной сторонами. Новые мембранные белки после синтеза сортируются в аппарате Гольджи или эндосомах и упаковываются в пузырьки (везикулы), направляемые к определённой стороне клетки. Пузырьки движутся по полярно организованному цитоскелету и сливаются преимущественно с той областью мембраны, где находятся соответствующие белки слияния. Белки, оказавшиеся в другом домене, могут быть захвачены эндоцитозом и перенаправлены в свой домен. Так направленный транспорт, избирательное слияние пузырьков и ограничение обмена между доменами вместе поддерживают различие апикальной и базолатеральной сторон. Благодаря этому эпителий, например кишечника, может поглощать вещества одной стороной и передавать их в кровь через другую.
Активация β₂-адренорецептора и зависимость ответа от клеточного контекста
β₂-Адренорецептор — сопряжённый с G-белком мембранный рецептор, который активируют адреналин и другие агонисты — вещества, связывающиеся с рецептором и активирующие его. Активированный рецептор катализирует обмен ГДФ (гуанозиндифосфата) на ГТФ (гуанозинтрифосфат) в α-субъединице стимулирующего G-белка Gs, и она переходит в активную форму. Активная субъединица Gαs стимулирует аденилатциклазу, которая синтезирует из АТФ вторичный посредник цАМФ (циклический аденозинмонофосфат). Циклический АМФ активирует протеинкиназу A (PKA), которая фосфорилирует белки-мишени и меняет их активность. В гладкомышечных клетках бронхов PKA фосфорилирует белки, регулирующие сокращение, поэтому мышца расслабляется и бронхи расширяются. Результат зависит от того, какие мишени PKA есть в данной клетке и где именно в клетке образуется цАМФ. β₂-рецепторы есть и в кардиомиоцитах: их активация может усиливать сокращение через цАМФ–PKA, хотя основную роль в адренергической стимуляции сердца играют β₁-рецепторы. Сигнал выключается, когда Gαs гидролизует ГТФ, а ферменты фосфодиэстеразы расщепляют цАМФ. При длительной стимуляции рецептор фосфорилируется и связывает белок β-аррестин, который мешает взаимодействию рецептора с G-белком и способствует эндоцитозу рецептора — так снижается чувствительность клетки к сигналу.
Обратимое фосфорилирование как молекулярный переключатель
Протеинкиназы переносят фосфатную группу с АТФ на остатки серина, треонина или тирозина в белке, а протеинфосфатазы отщепляют её. Фосфатная группа несёт отрицательный заряд, поэтому фосфорилирование может изменить форму белка, его взаимодействия или доступность участков связывания. В результате может меняться активность белка, его положение в клетке или устойчивость к разрушению. Эффект зависит от белка и от конкретного остатка: фосфорилирование одного участка может активировать белок, а другого — подавить. Пример — циклин-зависимая киназа 1 (CDK1), запускающая вход клетки в митоз. Киназа Wee1 фосфорилирует CDK1 по ингибирующему участку, и CDK1 остаётся неактивной, даже если с ней уже связан белок-активатор циклин. Фосфатаза CDC25 удаляет эту фосфатную группу, CDK1 активируется, и клетка переходит в митоз, поэтому соотношение активности Wee1 и CDC25 работает как переключатель. Фосфорилированный участок может также служить местом связывания других белков, которые узнают именно фосфорилированную форму. Доля фосфорилированного белка определяется балансом активности киназ и фосфатаз, поэтому при изменении этого баланса она быстро меняется в любую сторону.
RAS — малая ГТФаза, то есть белок, связывающий и расщепляющий ГТФ (гуанозинтрифосфат); она прикреплена к внутренней стороне плазматической мембраны. В комплексе с ГДФ (гуанозиндифосфатом) RAS неактивна, а в комплексе с ГТФ — активна и может связывать белки-эффекторы. Включение ускоряют факторы обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF): они освобождают RAS от ГДФ, и его место занимает ГТФ, которого в клетке больше. Выключение ускоряют белки GAP (белки, активирующие ГТФазу), которые стимулируют медленную собственную ГТФазную активность RAS, и ГТФ гидролизуется до ГДФ. После связывания фактора роста рецепторная тирозинкиназа фосфорилирует собственные остатки тирозина, к ним присоединяется белок-адаптер, и он привлекает к мембране фактор обмена SOS — один из GEF для RAS. Активная RAS связывает киназу RAF и другие эффекторы и запускает каскады, регулирующие рост, выживание и деление клетки. Длительность сигнала определяется соотношением активности GEF и GAP: чем дольше RAS остаётся связанной с ГТФ, тем дольше передаётся сигнал. Некоторые мутации генов RAS, например приводящие к замене глицина в положении 12, мешают белкам GAP ускорять гидролиз ГТФ, поэтому доля активной RAS растёт, хотя белок не обязательно постоянно связан с ГТФ. Такой избыточный сигнал в одних клеточных условиях способствует неконтролируемому делению, а в других, наоборот, вызывает остановку клеточного цикла.
Депо-зависимый вход кальция — поступление Ca²⁺ в клетку из внеклеточной среды в ответ на уменьшение запасов кальция в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Запасы ЭР обычно расходуются, когда сигнал рецептора приводит к образованию инозитолтрифосфата (IP₃), который открывает кальциевые каналы ЭР, и Ca²⁺ выходит в цитозоль. Снижение концентрации Ca²⁺ внутри ЭР улавливает белок STIM1 — сенсор кальция, встроенный в мембрану ЭР. Потеряв связанный кальций, STIM1 меняет конформацию и собирается в скопления в местах, где ЭР вплотную подходит к плазматической мембране. Там STIM1 напрямую связывает Orai1 — кальциевый канал плазматической мембраны — и открывает его. Это событие отличается от выхода Ca²⁺ из ЭР: здесь кальций поступает в цитозоль из внеклеточной среды через открытый Orai1. Длительный вход кальция поддерживает продолжительный сигнал: например, в лимфоцитах повышенный Ca²⁺ активирует фосфатазу кальциневрин, она дефосфорилирует фактор транскрипции NFAT, и NFAT переходит в ядро. Кальциевый насос ЭР SERCA перекачивает Ca²⁺ из цитозоля обратно в ЭР, а после заполнения депо STIM1 снова связывает кальций и отходит от Orai1. Вход дополнительно ограничивает кальций-зависимая инактивация самого канала Orai1, поэтому завершение сигнала зависит не только от восстановления запасов ЭР.
Киназный каскад — цепочка реакций, в которой активная протеинкиназа фосфорилирует и тем самым активирует следующую киназу. Классический пример — путь RAF–MEK–ERK; его запускает малая ГТФаза RAS в активной форме, связанной с ГТФ (гуанозинтрифосфатом), но сама RAS киназой не является. Активная RAS привлекает к мембране и помогает активировать киназу RAF, RAF фосфорилирует киназу MEK, а MEK фосфорилирует и активирует киназу ERK. ERK (киназа, регулируемая внеклеточными сигналами) фосфорилирует белки цитоплазмы и ядра, в том числе факторы транскрипции, и так меняет экспрессию генов. Сигнал может усиливаться, потому что одна активная киназа успевает фосфорилировать много молекул следующего звена. Однако степень усиления непостоянна: она зависит от количества молекул каждого звена и от активности фосфатаз, поэтому заметное усиление есть не в каждом каскаде. Сигнал выключается двумя основными способами: фосфатазы DUSP (фосфатазы двойной специфичности) снимают фосфатные группы с ERK, а RAS теряет активность после гидролиза ГТФ. Кроме того, активная ERK ослабляет вышестоящие звенья пути, то есть формирует отрицательную обратную связь. Баланс включения и выключения определяет силу и длительность ответа, а длительная активация пути может способствовать неконтролируемому делению клеток, если этому благоприятствуют другие условия в клетке.
Длительность активности ERK и выбор клеточного ответа
Ответ клетки зависит не только от того, активирована ли киназа ERK (киназа, регулируемая внеклеточными сигналами), но и от того, как долго длится её активность. Значение имеют также частота импульсов активности и то, где находится ERK — в цитоплазме или в ядре. При кратковременной активности ERK ген c-fos успевает включиться, но к моменту синтеза белка c-Fos активность ERK уже снижена, и белок быстро разрушается. При длительной активности ERK фосфорилирует вновь синтезированный белок c-Fos, он стабилизируется и дольше работает в составе фактора транскрипции AP-1. Классическая модель — клетки PC12, линия клеток мозгового вещества надпочечника крысы. В этих клетках эпидермальный фактор роста (EGF) обычно вызывает кратковременную активацию ERK и деление клеток. Фактор роста нервов (NGF) вызывает более длительную активацию ERK, и клетки перестают делиться и образуют отростки, как нейроны. Однако EGF и NGF различаются не только длительностью сигнала ERK, а в других клетках длительная активность ERK, наоборот, бывает необходима для деления. Поэтому ответ клетки определяется не самим фактом активации ERK, а сочетанием её динамики во времени с другими сигналами и свойствами клетки.
Положительная и отрицательная обратная связь в адаптации к сигналу
Обратная связь возникает, когда результат работы сигнального пути влияет на его собственные вышестоящие звенья. Отрицательная обратная связь ослабляет активность пути; в некоторых системах благодаря ей ответ снижается даже при продолжающемся действии стимула — это адаптация. Например, активная киназа ERK (киназа, регулируемая внеклеточными сигналами) усиливает экспрессию генов фосфатаз DUSP, которые затем снимают с ERK активирующие фосфатные группы. В результате активность ERK снижается, хотя внешний сигнал ещё действует. Положительная обратная связь, наоборот, усиливает исходное изменение: активный компонент пути усиливает собственную активацию. Например, циклин-зависимая киназа 1 (CDK1), запускающая митоз, активирует фосфатазу CDC25, а CDC25, в свою очередь, ещё сильнее активирует CDK1. Благодаря такой петле небольшое увеличение активности CDK1 быстро переходит в полную активацию, и клетка резко переключается в митоз. При достаточно резкой зависимости ответа от сигнала положительная связь может создавать бистабильность — способность системы сохранять одно из двух устойчивых состояний. При этом отрицательная связь не всегда приводит к полной адаптации, а положительная не гарантирует необратимости: при сильном снижении сигнала система может вернуться в исходное состояние.
Перекрёстная регуляция в сети инсулин–PI3K–AKT–mTORC1–AMPK и селективная инсулинорезистентность
Инсулин связывается со своим рецептором, рецептор фосфорилирует белки IRS (субстраты инсулинового рецептора), и через фермент PI3K (фосфоинозитид-3-киназу) активируется протеинкиназа AKT. В клетках мышц и жировой ткани AKT способствует встраиванию переносчика глюкозы GLUT4 в плазматическую мембрану, и поглощение глюкозы возрастает. В печени AKT фосфорилирует фактор транскрипции FOXO1, он покидает ядро, и транскрипция генов глюконеогенеза снижается, поэтому печень выделяет меньше глюкозы. При наличии аминокислот AKT также способствует активации комплекса mTORC1 (комплекса 1 киназы mTOR), который стимулирует синтез белков и липидов. Если в клетке не хватает энергии, активируется AMPK (протеинкиназа — датчик энергетического состояния клетки), которая тормозит mTORC1 и включает процессы, восполняющие запас АТФ. Таким образом, сигнал инсулина отражает поступление питательных веществ, активность AMPK — энергетический дефицит, а mTORC1 согласует синтез веществ с доступностью ресурсов. Избыточная активность mTORC1 ослабляет передачу сигнала через IRS, то есть формирует отрицательную обратную связь. При селективной инсулинорезистентности печени инсулин плохо подавляет выработку глюкозы, но синтез жиров (липогенез) сохраняется или даже усиливается. Это не объясняется полным выключением одной ветви сети: важны разная чувствительность ветвей, повышенный уровень инсулина в крови и избыток питательных веществ, стимулирующих липогенез.
Нуклеосомная организация и доступность регуляторной ДНК
Нуклеосома — основная единица упаковки ДНК: около 147 пар нуклеотидов ДНК обёрнуто вокруг гистонового октамера, включающего по две копии гистонов H2A, H2B, H3 и H4. Соседние нуклеосомы соединены линкерной (связующей) ДНК, и вместе они образуют хроматин. ДНК, намотанная на гистоны, менее доступна для белков, поэтому положение нуклеосом влияет на связывание факторов транскрипции с промоторами и энхансерами. На многих активных промоторах есть участок, обеднённый нуклеосомами, что облегчает сборку транскрипционного аппарата. Доступность ДНК не постоянна: участок ДНК может временно отходить от гистонов, а специальные белки могут сдвигать нуклеосомы или удалять их. Доступность изменяют также модификации гистонов и замена канонических гистонов на их варианты. Пионерные факторы транскрипции способны связываться со своими последовательностями даже в составе нуклеосомы и затем привлекать комплексы, повышающие доступность участка. Поэтому хроматин нельзя представлять как систему с двумя состояниями «полностью открыт» и «полностью закрыт»: доступность меняется в широком диапазоне и обратимо. Нуклеосома затрудняет транскрипцию, но не делает её невозможной: РНК-полимераза может проходить через нуклеосомы с помощью дополнительных белков.
АТФ-зависимые ремоделеры хроматина — белковые комплексы, которые используют энергию гидролиза АТФ, чтобы изменить контакты ДНК с гистонами. Их АТФазная субъединица перемещает ДНК относительно гистонового октамера — белкового ядра нуклеосомы. В результате нуклеосома может сдвинуться вдоль ДНК, полностью удалиться с участка или изменить свой состав, когда часть гистонов заменяется другими. Так ремоделеры открывают или, наоборот, закрывают участки связывания регуляторных белков. Комплексы семейства SWI/SNF часто способствуют открытию регуляторных участков, сдвигая или вытесняя нуклеосомы с промоторов и энхансеров. Ряд комплексов семейства ISWI, наоборот, помогает упорядочивать нуклеосомы и расставлять их на равных расстояниях, что может снижать доступность ДНК. Эти примеры не означают, что каждое семейство всегда только открывает или только закрывает хроматин: результат зависит от конкретного комплекса и участка генома. Ремоделеры направляются к определённым участкам факторами транскрипции и модификациями гистонов, которые они распознают. Так разные ремоделирующие комплексы участвуют в регуляции транскрипции, репликации и репарации ДНК, повышая или снижая доступность определённых участков.
Посттрансляционные модификации гистонов: ферменты установления и удаления метки и белки-эффекторы, распознающие модификацию
Посттрансляционные модификации гистонов — химические группы (метки), которые ферменты присоединяют к гистонам после их синтеза, чаще всего к выступающим из нуклеосомы «хвостам». С метками работают три группы белков: одни ферменты устанавливают метку, другие её удаляют, а белки-эффекторы её распознают. Например, ацетилтрансферазы присоединяют ацетильные группы к остаткам лизина, а деацетилазы их отщепляют. Ацетилирование нейтрализует положительный заряд лизина и ослабляет связь гистонов с ДНК, поэтому оно часто сопутствует более доступному хроматину. Ацетилированный лизин распознают белки с бромодоменом, которые могут привлекать к этому участку другие регуляторы транскрипции. Метилтрансферазы и деметилазы устанавливают и удаляют метильные группы, и эффект метилирования зависит от положения и числа метильных групп. Например, метка H3K4me3 — три метильные группы (me3) на лизине (K) в положении 4 гистона H3 — характерна для активных промоторов, а H3K27me3 — для подавленных генов. При этом многие метки скорее сопутствуют определённому состоянию хроматина, чем сами по себе достаточны для включения или выключения гена. Итоговое действие определяется сочетанием меток, белками-эффекторами, типом и состоянием клетки, поэтому метку нельзя считать однозначной командой.
Гистоновые варианты и изменение свойств нуклеосомы
Гистоновые варианты — гистоны, которые отличаются от канонических (наиболее распространённых) гистонов аминокислотной последовательностью и меняют свойства нуклеосомы — её устойчивость и набор связывающихся с ней белков. Канонические гистоны встраиваются в хроматин в основном во время репликации ДНК, а многие варианты могут встраиваться и вне репликации. Включение вариантов обеспечивают специализированные гистоновые шапероны — белки, которые доставляют определённый гистон к ДНК. Вариант H3.3 заменяет канонический H3 в участках, где нуклеосомы часто обновляются, особенно в активно транскрибируемых генах. Однако H3.3 встречается и в некоторых участках плотно упакованного хроматина (гетерохроматина) и в теломерах — концевых участках хромосом. Вариант CENP-A (центромерный белок A) занимает место H3 в части нуклеосом центромеры. Такие нуклеосомы отмечают участок, где собирается кинетохор — белковая структура, к которой при делении прикрепляются микротрубочки веретена. Ещё один пример — вариант H2A.Z, который часто находится около промоторов и участвует как в активации, так и в подавлении транскрипции. Функция варианта определяется местом его включения и белками-партнёрами, поэтому один вариант сам по себе не задаёт состояние хроматина.
Установление и поддержание метилирования ДНК у млекопитающих
Метилирование ДНК у млекопитающих — присоединение метильной группы к цитозину с образованием 5-метилцитозина, главным образом в CpG-динуклеотидах, где за цитозином следует гуанин. Последовательность нуклеотидов при этом не меняется, но меняется связывание белков с ДНК. Новые метки устанавливают ДНК-метилтрансферазы DNMT3A и DNMT3B — это метилирование de novo, то есть «заново». После репликации новая цепь ещё не метилирована, и такой полуметилированный участок распознаёт белок UHRF1, который привлекает поддерживающую метилтрансферазу DNMT1. DNMT1 метилирует цитозин новой цепи напротив метилированного цитозина старой цепи, поэтому картина метилирования в основном сохраняется при делении клетки. Метилирование CpG-островков (богатых CpG участков) в промоторах часто связано с подавлением транскрипции, тогда как метилирование внутри транскрибируемой части гена обычно не выключает ген. Метилирование также подавляет активность транспозонов — мобильных элементов генома. При активном деметилировании ферменты TET окисляют 5-метилцитозин; часть окисленных форм затем вырезается и заменяется неметилированным цитозином в ходе репарации ДНК. Метки теряются и пассивно, если после репликации DNMT1 не восстанавливает их на новой цепи, поэтому итоговая картина зависит от баланса установления, поддержания и удаления меток.
Избирательность взаимодействия энхансера и промотора
Энхансер — регуляторный участок ДНК, который через связанные с ним факторы транскрипции усиливает транскрипцию определённых генов, иногда удалённых на сотни тысяч пар нуклеотидов. Факторы транскрипции на энхансере привлекают коактиваторы, например белковый комплекс Mediator, которые способствуют сборке и активации транскрипционного аппарата на промоторе. Промотор — участок начала транскрипции гена; избирательность отчасти зависит от того, совместимы ли белки, связанные с энхансером и с промотором. Трёхмерная организация хроматина часто облегчает взаимодействие энхансера с промотором, сближая их в пространстве ядра. Однако для активации транскрипции не всегда требуется устойчивая петля или постоянное сближение энхансера с промотором. Хромосома разделена на домены, внутри которых участки ДНК контактируют друг с другом чаще, чем с участками соседних доменов, но границы доменов не абсолютны. Поэтому энхансер чаще действует на гены своего домена, хотя не исключено и действие на гены за его пределами. Один энхансер может регулировать несколько генов, а один промотор — получать сигналы от нескольких энхансеров, и набор этих связей различается в разных клетках. Пространственная близость энхансера и гена сама по себе ещё не доказывает, что этот энхансер регулирует данный ген.
Сигнал-зависимая регуляция транскрипционного фактора на примере FOXO
FOXO1 — фактор транскрипции, то есть белок, который связывается с ДНК и регулирует работу определённых генов, в том числе генов обмена веществ и устойчивости к стрессу. На его примере видно, как внешний сигнал быстро меняет активность уже существующего белка без синтеза новых молекул. После еды инсулин через фермент PI3K (фосфоинозитид-3-киназу) активирует протеинкиназу AKT (протеинкиназу B). AKT фосфорилирует FOXO1, после чего с ним связываются белки-адаптеры 14-3-3, и FOXO1 выводится из ядра в цитоплазму. Вне ядра FOXO1 не может включать свои гены-мишени, поэтому снижается экспрессия части генов, необходимых для синтеза глюкозы в печени. В результате после еды печень производит меньше глюкозы. При ослаблении сигнала инсулина, например при голодании, FOXO1 дефосфорилируется, возвращается в ядро и снова активирует свои гены-мишени. Активность FOXO1 меняют и другие сигналы, например связанные со стрессом, поэтому активность этого белка зависит одновременно от питания и от стресса. Однако разные белки семейства FOXO и разные типы клеток отвечают на эти сигналы неодинаково, поэтому пример FOXO1 в печени нельзя считать универсальным.
Хроматиновая память и изменение ответа на повторный сигнал
Хроматиновая память — изменения хроматина, которые сохраняются после прекращения воздействия и делают ответ клетки на повторный сигнал иным, чем на первый. Наиболее наглядный механизм связан с энхансерами: при первом сигнале факторы транскрипции открывают часть энхансеров, и после прекращения сигнала некоторые из них остаются более доступными. Тогда при повторном сигнале эти участки уже доступны для факторов транскрипции, и связанные с ними гены могут активироваться быстрее. Другим возможным механизмом служат устойчивые модификации гистонов, которые сохраняются в этих участках. Память бывает усиливающей, когда повторный ответ сильнее и быстрее первого, и ослабляющей, когда он слабее. Например, клетки врождённого иммунитета после первой встречи с некоторыми продуктами микробного метаболизма отвечают на повторную стимуляцию иначе — сильнее или, наоборот, слабее. Память может сохраняться только в одной долгоживущей клетке, а может передаваться дочерним клеткам при делении, но такая передача происходит не всегда. Изменённый повторный ответ может объясняться и другими причинами: продолжающейся передачей сигнала, накоплением долгоживущих белков или изменением состава клеточной популяции. Поэтому одна устойчивая метка хроматина сама по себе ещё не доказывает хроматиновую память.