Медицинский университет им. Б. В. ПетровскогоКафедра биологии и генетики · Молекулярная биология

Семинар 1 · v4.0

.toolbar,.sidebar,.skip{display:none}.print-only{display:block}.mech{padding-left:20px}

← Вернуться к семинару · ← Раздел I: семинары

Компартменты, локальные условия и обмен

Для изменения схем и проверки ответов включите JavaScript. Ниже в этом же файле приведены все объяснения, вопросы с разбором вариантов и словарь.

Компартменты и локальные условия · шаг 1 из 30

Что делает органеллу компартментом

Компартмент задан не формой, а границей и условиями, которые эта граница удерживает: pH, концентрацией свободного Ca²⁺, потенциалом пары глутатиона и характерным фосфоинозитидом.

Компартмент — область клетки с собственным набором физико-химических условий и границей, которая этот набор удерживает.
Липидный бислой почти непроницаем для ионов: он удерживает различие, но не создаёт его; создают различие насосы мембраны.
Соседние объёмы одной клетки различаются по концентрации протонов в сотни раз, а по свободному Ca²⁺ — в тысячи раз.

Лизосому часто описывают как пузырёк с ферментами. Для клетки важнее другое: в просвете лизосомы pH около 4,5–5,0, а в окружающем цитозоле — около 7,2. Кислые гидролазы имеют оптимум активности в кислой среде, и вне лизосомы их активность значительно ниже (Xu 2015). Лизосому как компартмент определяет сочетание границы и условий внутри неё.

Так же описывают и другие компартменты. В просвете эндоплазматического ретикулума (ЭПР) концентрация свободного Ca²⁺ составляет сотни микромолей при концентрации около 100 нМ в цитозоле покоящейся клетки, а потенциал пары глутатиона менее отрицателен, чем в цитозоле; это благоприятствует образованию дисульфидных связей в секретируемых белках. Матрикс митохондрии слабощелочной, и на внутренней мембране есть потенциал Δψ: матрикс заряжен отрицательно.

Граница — биологическая мембрана — эти различия только удерживает. Создают и поддерживают их мембранные белки, прежде всего насосы, за счёт гидролиза ATP или переноса электронов. Если насос остановить, различие постепенно исчезает, хотя мембрана сохраняется: после ингибирования V-АТФазы бафиломицином A1 лизосомы сохраняются и груз в них доставляется, но не расщепляется (Yoshimori 1991).

На карте выберите параметр. Для каждого компартмента показан порядок величины и то, чем её измеряли. Значения зависят от типа клеток и метода, поэтому их запоминают как порядок величины и направление различия.

Типичная ошибка Органеллу определяет её форма: лизосома — это мембранный пузырёк с ферментами.

Форма не определяет функцию. Лизосома расщепляет груз, пока V-АТФаза удерживает в её просвете pH 4,5–5,0; после ингибирования V-АТФазы мембрана и ферменты сохраняются, но белок, доставленный в лизосому, не расщепляется (Yoshimori 1991).

V-АТФазу лизосом ингибировали бафиломицином A1; целостность мембраны лизосом не нарушена, гидролазы остались в просвете. Какой признак лизосомы как компартмента при этом теряется?

А. Кислый pH просвета (верный вариант)
Кислую среду создаёт V-АТФаза, перенося протоны в просвет; без неё протоны выходят путями утечки, и pH растёт. Граница и набор ферментов сохраняются, но условие, при котором гидролазы активны, исчезает.
Б. Целостность мембраны (неверный вариант)
Бафиломицин A1 ингибирует насос, а не разрушает бислой: в экспериментах Yoshimori 1991 меченый EGF при бафиломицине A1 доставлялся в лизосомы и оставался в них.
В. Набор гидролаз в просвете (неверный вариант)
Ферменты остаются в лизосоме — меняется не их количество, а их активность: она зависит от pH, который больше не поддерживается насосом.

Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →

Источники и условия научного вывода

Схема — сводка порядков величин для покоящихся культивируемых клеток млекопитающих. pH — адресованные pH-чувствительные флуоресцентные белки и красители (обзор Casey 2010); Ca²⁺ — свободная концентрация, измеренная адресованными индикаторами (обзор Rizzuto 2006); E(GSH/GSSG) — фактический потенциал пары, измеренный сенсорами на основе roGFP в клетках HeLa: цитозоль — Gutscher 2008 (от −280 до −320 мВ в зависимости от плотности культуры), просвет ЭПР — Birk 2013 (−208 мВ при pH 7,0), матрикс — Hanson 2004 (около −360 мВ при pH матрикса около 8,0). Эксперимент с бафиломицином A1 — клетки A431, 1 мкМ (Yoshimori 1991, реферат).

Компартменты и локальные условия · шаг 2 из 30

Какими величинами описывают условия внутри компартмента

Компартменты сравнивают по pH, свободному Ca²⁺, потенциалу пары глутатиона и характерному фосфоинозитиду; для каждой величины нужно знать, что именно измерено.

pH и свободный Ca²⁺ измеряют адресованными сенсорами; для Ca²⁺ важна свободная, а не общая концентрация.
Потенциал пары глутатиона E = E°′ − (RT/2F)·ln([GSH]²/[GSSG]) зависит не только от отношения GSH:GSSG, но и от абсолютной концентрации GSH.
Характерный фосфоинозитид — минорный липид цитозольной стороны мембраны, по которому её узнают белки.

pH цистерн аппарата Гольджи снижается от 6,7 до 6,0, в ранних эндосомах он около 6,5, в лизосомах — 4,5–5,0 (Casey 2010). Свободный Ca²⁺ в цитозоле покоящейся клетки — около 100 нМ, в просвете ЭПР — сотни микромолей (Rizzuto 2006); общий кальций депо во много раз выше, потому что большая часть ионов связана белками просвета.

Редокс-состояние описывают потенциалом определённой пары, чаще всего глутатиона. Стандартный потенциал E°′ для 2GSH/GSSG — около −240 мВ при pH 7,0 (Schafer 2001), а фактический потенциал E задаёт уравнение Нернста. Поскольку GSH входит в него в квадрате, при неизменном отношении GSH:GSSG снижение концентрации GSH в 10 раз делает потенциал менее отрицательным примерно на 30 мВ.

Сенсор Grx1-roGFP2 улавливает изменения содержания GSSG на наномолярном уровне на фоне миллимолярного GSH; в цитозоле клеток HeLa потенциал пары составил от −280 до −320 мВ в зависимости от плотности культуры (Gutscher 2008). В цитозоле сенсор почти полностью восстановлен, поэтому около −320 мВ — осторожная оценка: истинный потенциал может быть ещё более отрицательным. При −320 мВ и общей концентрации глутатиона 1–10 мМ отношение GSH:GSSG составляет от 5·10⁴ до 5·10⁵ (Schwarzländer 2016), а не 100:1, как получалось при анализе лизатов. На дрожжах показано, почему лизат вводит в заблуждение: GSSG, не восстановленный в цитозоле, переносится в вакуоль, и его содержание во всей клетке ничего не говорит о цитозольном пуле (Morgan 2013).

В просвете ЭПР клеток HeLa потенциал пары — около −208 мВ при pH 7,0 (Birk 2013), в матриксе — около −360 мВ (Hanson 2004). В калькуляторе меняйте концентрацию GSH, отношение и pH и сравнивайте расчёт с измеренными значениями.

Типичная ошибка В цитозоле отношение GSH:GSSG около 100:1, и одно это отношение описывает редокс-состояние компартмента.

Отношение 100:1 получено в лизатах, где GSSG завышен; сенсор в цитозоле клеток человека показывает от −280 до −320 мВ, что при миллимолярном GSH соответствует отношению от нескольких тысяч до сотен тысяч. Кроме того, потенциал зависит от абсолютной концентрации GSH и от pH, а не только от отношения.

В двух образцах pH одинаков и отношение GSH:GSSG одинаково (10⁴), но концентрация GSH во втором в 10 раз ниже. Каким будет фактический потенциал пары глутатиона во втором образце?

А. Таким же, как в первом (неверный вариант)
Отношение действительно одинаково, но в уравнение Нернста входит [GSH]²/[GSSG] = [GSH] · (GSH:GSSG). При десятикратно меньшем GSH это выражение уменьшается в 10 раз.
Б. Менее отрицательным примерно на 30 мВ (верный вариант)
[GSH]²/[GSSG] уменьшается в 10 раз, и E сдвигается на (RT/2F)·ln 10 ≈ 30 мВ в положительную сторону. Поэтому потенциал нельзя восстановить по одному отношению GSH:GSSG.
В. Более отрицательным примерно на 30 мВ (неверный вариант)
Направление обратное: чем меньше восстановленного глутатиона, тем слабее восстановительная способность пары, и потенциал становится менее отрицательным.

Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →

Источники и условия научного вывода

Калькулятор — расчёт по уравнению Нернста E = E°′ − (RT/2F)·ln([GSH]²/[GSSG]) при 37 °C (RT/2F·ln 10 ≈ 30,8 мВ); E°′ = −240 мВ при pH 7,0 (Schafer 2001), смещение E°′ — около −60 мВ на единицу pH (уравнение Нернста: в реакции пары участвуют два электрона и два протона); значения GSH и отношения выбираются как условные. Измеренные значения: цитозоль клеток HeLa, сенсор Grx1-roGFP2, от −280 до −320 мВ в зависимости от плотности культуры — Gutscher 2008 (полный текст); ЭПР клеток HeLa, сенсор, сопряжённый с глутаредоксином, −208 ± 4 мВ при pH 7,0 — Birk 2013 (реферат); матрикс клеток HeLa, roGFP1, около −360 мВ при pH около 8,0 — Hanson 2004 (реферат); осторожная оценка для цитозоля (около −320 мВ) и отношение GSH:GSSG при 1–10 мМ глутатиона, значения для ЭПР (около −210 мВ) и митохондрий (до −380 мВ из-за более щелочного pH) — обзор Schwarzländer 2016 (полный текст); границы диапазонов на шкале калькулятора — учебные. Механизм завышения GSSG в лизатах показан на дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Morgan 2013, реферат) и не переносится на клетки человека без оговорки. pH — обзор Casey 2010; Ca²⁺ — обзор Rizzuto 2006.

Компартменты и локальные условия · шаг 3 из 30

Почему для входа Ca²⁺ в матрикс достаточно канала, а для закисления лизосомы нужен насос

Направление самопроизвольного переноса иона задаёт электрохимический потенциал Δμ, а не одна разность концентраций; насос нужен там, где Δμ положительна.

Насос переносит вещество против электрохимического градиента за счёт гидролиза ATP или переноса электронов; канал пропускает его только по градиенту.
Δμ = RT·ln(c₂/c₁) + zF·Δψ: для Ca²⁺ (z = 2) при Δψ = −150 мВ электрическая часть (−29 кДж/моль) перевешивает химическую (+6 кДж/моль).
Поэтому Ca²⁺ входит в матрикс через канал MCU, а работу совершила дыхательная цепь, создавшая Δψ.

Различия между компартментами создают белки трёх классов. Насосы — V-АТФаза, SERCA, комплексы дыхательной цепи — переносят ионы против электрохимического градиента, используя энергию гидролиза ATP или переноса электронов. Сопряжённые переносчики используют градиент другого вещества. Каналы пропускают ионы только по градиенту и потому не создают различие, а расходуют его — для передачи сигнала или для возврата к исходному состоянию.

Знак Δμ показывает, нужна ли работа. Для выхода Ca²⁺ из просвета ЭПР (около 370 мкМ свободного Ca²⁺) в цитозоль (0,1 мкМ) химическая часть равна RT·ln(0,1/370) ≈ −21 кДж/моль: достаточно открыть канал, рецептор IP₃. Обратный перенос требует +21 кДж/моль, и его выполняет SERCA за счёт гидролиза ATP.

С переносом Ca²⁺ в матрикс митохондрии дело обстоит иначе. Пусть в цитозоле 0,1 мкМ свободного Ca²⁺, а в матриксе — 1 мкМ (так бывает после предшествующего захвата Ca²⁺; в покое концентрация в матриксе близка к цитозольной, около 0,1 мкМ). Тогда химическая часть переноса из цитозоля в матрикс положительна: RT·ln 10 ≈ +5,9 кДж/моль. Но матрикс заряжен отрицательно, и при Δψ = −150 мВ электрическая часть 2F·Δψ ≈ −28,9 кДж/моль. Сумма −23 кДж/моль: Ca²⁺ входит против концентрационного, но по электрохимическому градиенту. MCU — высокоселективный Ca²⁺-канал внутренней мембраны, а не переносчик (Kirichok 2004). Если протонофор снизит Δψ до −10 мВ, Δμ станет положительной, и при 1 мкМ Ca²⁺ в матриксе вход через MCU прекратится.

Для протонов, закачиваемых в лизосому, уже химическая часть положительна: при pH 7,2 в цитозоле и 4,7 в просвете она равна RT·ln 10^2,5 ≈ +14,8 кДж/моль, поэтому нужен насос — V-АТФаза. Перенос заряда насосом делает просвет положительным, и без встречного переноса противоионов этот потенциал остановил бы закисление (Steinberg 2010).

Типичная ошибка Ион самопроизвольно движется только в сторону меньшей концентрации, поэтому накопление Ca²⁺ в матриксе требует насоса.

Для иона учитывают и электрическую часть Δμ. При Δψ около −150 мВ она для Ca²⁺ почти в пять раз больше химической, и Ca²⁺ входит в матрикс через канал MCU; работу совершает дыхательная цепь, создавшая Δψ.

Свободный Ca²⁺ в цитозоле — 0,1 мкМ, в матриксе — 1 мкМ, Δψ = −150 мВ. Какой белок внутренней мембраны достаточен для входа Ca²⁺ в матрикс?

А. Насос: перенос идёт против разности концентраций (неверный вариант)
Против разности концентраций — да, но для иона решает электрохимический потенциал. При Δψ = −150 мВ электрическая часть делает Δμ отрицательной, и насос не нужен.
Б. Никакой: бислой проницаем для Ca²⁺ (неверный вариант)
Липидный бислой почти непроницаем для ионов. Без канала Ca²⁺ не войдёт в матрикс даже при отрицательной Δμ: движущая сила есть, а пути нет.
В. Канал: Δμ для входа отрицательна (верный вариант)
Электрическая часть (≈ −29 кДж/моль) перевешивает химическую (≈ +6 кДж/моль), Δμ ≈ −23 кДж/моль. Перенос самопроизволен, и канала MCU достаточно; работу совершила дыхательная цепь, создав Δψ.

Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →

Источники и условия научного вывода

Схема — расчёт Δμ = RT·ln(c₂/c₁) + zF·(ψ₂ − ψ₁) при 37 °C (RT = 2,58 кДж/моль, F = 96,5 кДж/(моль·В)). Концентрации — учебные значения порядка величин для покоящихся клеток млекопитающих: цитозоль 0,1 мкМ свободного Ca²⁺, матрикс 1 мкМ (после предшествующего захвата Ca²⁺; в покое — около 0,1 мкМ, как в модели вопроса 4), просвет ЭПР 370 мкМ (Pick 2023: клетки HEK293, сенсор D1ER). Для случая «Ca²⁺ в матрикс» расчёт совпадает с моделью практикума M1. Для мембраны ЭПР электрическая часть принята равной нулю (допущение модели); для лизосомы учтена только химическая часть — она уже положительна. MCU как канал — патч-кламп внутренней мембраны митохондрий клеток COS-7 (Kirichok 2004, реферат). Роль противоионов при закислении — Steinberg 2010 (полный текст, макрофаги мыши).

Компартменты и локальные условия · шаг 4 из 30

Почему различия между компартментами исчезают после остановки насосов

Различия pH, Ca²⁺ и Δψ сохраняются, пока насос уравновешивает утечку. После остановки насоса различие убывает с собственным характерным временем; для этого разрушать мембрану не нужно.

В стационарном неравновесном состоянии перенос насосом равен утечке через мембрану: различие постоянно, но не равновесно.
После остановки насоса утечка продолжается, и различие убывает; скорость убыли задают проводимость путей утечки и буферная ёмкость компартмента.
Времена различаются на порядки: Δψ — секунды и десятки секунд, свободный Ca²⁺ ЭПР — минуты, pH лизосомы — десятки минут.

Лизосомы макрофагов мыши линии RAW264.7 удерживают pH 4,71. После ингибирования V-АТФазы конканамицином A pH альвеолярных макрофагов мыши в первые минуты рос примерно на 0,20 единицы в минуту, а за час превышал 6,5 — верхний предел чувствительности сенсора (Steinberg 2010). В клетках A431 после 1 мкМ бафиломицина A1 pH лизосом поднимался с 5,1–5,5 примерно до 6,3 постепенно, примерно за 50 мин (Yoshimori 1991). Медленность объясняется высокой буферной ёмкостью просвета — 60–80 мМ на единицу pH (Steinberg 2010).

В клетках HEK293 в среде без Ca²⁺ свободный Ca²⁺ просвета ЭПР (около 370 мкМ по сенсору D1ER) после 1 мкМ тапсигаргина за первые 1,5 мин снижался лишь на 6 %, а затем убывал экспоненциально с характерным временем около 162 с (Pick 2023): Ca²⁺ выходил путями утечки; в покое эту утечку уравновешивала SERCA.

Δψ митохондрии после остановки дыхательной цепи и ATP-синтазы падает быстрее — за секунды и десятки секунд (учебная оценка). Прямых измерений этой кинетики в прочитанных работах нет, поэтому в модели время Δψ — учебное значение.

Чтобы различие исчезло, разрушать мембрану не нужно: его рассеивает утечка. Но и по самому исчезновению различия целостность мембраны не установить — её проверяют отдельным контролем, например по удержанию меченого декстрана или груза в просвете (в модели целостность мембраны сохранена по условию). Выберите компартмент и время после остановки насоса. Различия измерены в собственных единицах — единицах pH, мкМ и мВ, поэтому сравнивают не проценты в один момент, а время, за которое каждое различие уменьшается вдвое.

Типичная ошибка Если различие pH или Ca²⁺ между органеллой и цитозолем исчезло, значит, мембрана органеллы повреждена.

Остановка насоса не равна разрушению мембраны: при бафиломицине A1 лизосомы сохраняются и груз в них доставляется, но их просвет теряет кислотность (Yoshimori 1991). Различие рассеивает утечка, которую в покое компенсирует насос.

В клетках HEK293 после добавления тапсигаргина свободный Ca²⁺ в просвете ЭПР за 10 мин снизился с 370 мкМ в десятки раз; маркер просвета ЭПР в цитозоль не выходит. Какой вывод следует из этого эксперимента?

А. Тапсигаргин разрушил мембрану ЭПР (неверный вариант)
Тапсигаргин — ингибитор насоса SERCA. Такое снижение Ca²⁺ не требует разрыва мембраны: его объясняет утечка, которую больше не компенсирует насос. По одному снижению Ca²⁺ целостность мембраны не установить; для неё в условии дан отдельный контроль: маркер просвета ЭПР в цитозоль не выходит, значит, грубого разрыва мембраны нет. Удержание маркера, впрочем, не исключает проницаемости мембраны для малых ионов.
Б. Различие поддерживала работа SERCA (верный вариант)
Тапсигаргин ингибирует SERCA, а пути утечки продолжают выпускать Ca²⁺. Различие исчезает потому, что его больше ничто не восстанавливает: оно было стационарным, а не равновесным.
В. Тапсигаргин открыл каналы IP₃R (неверный вариант)
Тапсигаргин не открывает каналы ЭПР. Ca²⁺ выходит через пути утечки, которые работают и в покое, — тогда их уравновешивает SERCA.

Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →

Источники и условия научного вывода

Схема — учебная модель практикума M1 (вопрос 1, базовый уровень): x(t) = x_off + (x₀ − x_off)·e^(−t/τ) (для ЭПР — после начальной фазы). Лизосома: pH 4,7 → 6,5, τ = 10 мин (начальная скорость 0,18 ед./мин; Steinberg 2010: альвеолярные макрофаги мыши, 1 мкМ конканамицина A, 0,20 ед./мин; Yoshimori 1991: клетки A431, 1 мкМ бафиломицина A1, около 6,3 к 50 мин, реферат). Плато 6,5 выбрано для учебного расчёта и из измерений не следует: выше 6,5 сенсор Steinberg 2010 значений не различает, поэтому конечный pH в этих экспериментах не определён. От выбранного плато зависит время уменьшения различия вдвое: при выравнивании с цитозолем (pH около 7,2) и той же начальной скорости оно составило бы около 10 мин вместо 12 — по-прежнему больше, чем у Ca²⁺ ЭПР. Просвет ЭПР: 370 мкМ → 0,1 мкМ двухфазно — за первые 90 с потеря около 6 % (в модели линейно), затем экспонента с τ = 162 с (Pick 2023: HEK293, сенсор D1ER, 1 мкМ тапсигаргина, среда без Ca²⁺; τ описывает фазу после точки перегиба; полный текст PMC). Матрикс: Δψ −150 → −5 мВ, τ = 20 с — учебное значение. «Мембрана не повреждена» — условие модели во всех состояниях; в эксперименте целостность проверяют отдельно. Время, за которое различие уменьшается вдвое, считается в собственных единицах каждого различия (ед. pH, мкМ, мВ): Δψ — 15 с, Ca²⁺ ЭПР — 3,2 мин, pH лизосомы — 12 мин.

Компартменты и локальные условия · шаг 5 из 30

Что поддерживает мембранный потенциал митохондрии и что от него зависит

Δψ — состояние мембраны, а не поток: его величину задаёт баланс генераторов и путей возврата протонов, а от неё зависят синтез ATP, импорт белков через TIM23 и вход Ca²⁺.

Дыхательная цепь выводит протоны из матрикса; ATP-синтаза в прямом направлении возвращает их, синтезируя ATP.
При остановке дыхания ATP-синтаза может работать в обратном направлении: гидролизовать гликолитический ATP и поддерживать Δψ.
TIM23 переносит положительно заряженную MTS только при достаточном Δψ; от Δψ зависит и вход Ca²⁺ через MCU.

Перенос протонов дыхательной цепью создаёт протон-движущую силу из двух частей — Δψ и разности pH. В покоящихся нейронах коры крысы Δψ, измеренный калиброванной флуоресцентной методикой с зондом TMRM, равен −139 мВ (Gerencser 2012). TMRM показывает величину Δψ, но не скорость переноса электронов (Brand и Nicholls 2011).

С помощью ингибиторов определяют, какой генератор поддерживает Δψ. Олигомицин закрывает возврат протонов через ATP-синтазу: Δψ становится немного отрицательнее, а потребление O₂ снижается до уровня, который задаёт утечка протонов. Протонофор FCCP в заранее подобранной оптимальной концентрации снимает Δψ, и, если субстратов и O₂ достаточно, а у клеток есть дыхательный резерв (исходная скорость дыхания ниже максимальной), дыхание растёт до максимальной скорости, возможной в этих условиях (избыточная концентрация FCCP или ограничение окисления субстратов уменьшают этот ответ); ATP-синтаза при этом гидролизует гликолитический ATP, но Δψ не восстанавливается. Антимицин A снижает потребление O₂ до немитохондриального — у большинства клеток около 10 % исходного (Brand и Nicholls 2011). Потребление O₂ измеряют в закрытой ячейке с клетками кислородным электродом или флуоресцентным датчиком O₂ (например, в анализаторе Seahorse XF) и по ходу эксперимента последовательно добавляют олигомицин, FCCP, затем ротенон с антимицином A; схема — в режиме «Как измеряют потребление O₂».

После антимицина A при глюкозе в среде Δψ может сохраняться: его поддерживает ATP-синтаза, гидролизуя гликолитический ATP. Если олигомицин после этого вызывает деполяризацию, потенциал создавала обратная работа ATP-синтазы; если лёгкую гиперполяризацию — митохондрии ещё синтезировали ATP (проба с олигомицином, Brand и Nicholls 2011).

От Δψ зависит импорт белков: в изолированных митохондриях Neurospora crassa перенос N-концевых адресующих последовательностей (MTS) требовал именно Δψ, а не всей протон-движущей силы (Martin 1991). От него же зависит электрическая часть Δμ для входа Ca²⁺ через MCU.

Типичная ошибка Если Δψ нормален, дыхательная цепь работает нормально.

Δψ — состояние, а не поток. При остановленном дыхании его может поддерживать ATP-синтаза, гидролизующая гликолитический ATP. О работе дыхательной цепи судят по потреблению O₂ или по ответу Δψ на олигомицин (Brand и Nicholls 2011).

Клетки в среде с глюкозой обработали олигомицином; дыхательная цепь не ингибирована. Как изменится Δψ по сравнению с контролем?

А. Станет немного отрицательнее (верный вариант)
Олигомицин закрывает главный путь возврата протонов в матрикс — через ATP-синтазу. Остаётся только утечка, и Δψ немного растёт по абсолютной величине; потребление O₂ при этом падает.
Б. Упадёт почти до нуля (неверный вариант)
Так Δψ ведёт себя после олигомицина, только если его поддерживала ATP-синтаза за счёт гидролиза ATP, — например, после антимицина A. Здесь дыхательная цепь работает и продолжает выводить протоны.
В. Не изменится (неверный вариант)
Δψ задаётся балансом вывода и возврата протонов. Олигомицин закрывает один из путей возврата, поэтому баланс смещается, и потенциал становится немного отрицательнее.

Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →

Источники и условия научного вывода

Схема — учебная модель практикума M1 (вопрос 1, продвинутый уровень): стационары пяти условий для клеток в среде с глюкозой; Δψ контроля −150 мВ, потребление O₂ и импорт — % от контроля, импорт — учебная крутая зависимость от Δψ, Δμ — расчёт для 0,1 мкМ Ca²⁺ в цитозоле и 1 мкМ в матриксе (после предшествующего захвата Ca²⁺). Качественные соотношения — по обзору Brand и Nicholls 2011 (полный текст PMC): лёгкая гиперполяризация и снижение дыхания после олигомицина, рост дыхания после протонофора в оптимальной концентрации у клеток с дыхательным резервом (в модели максимальная скорость — 220 % от контроля), немитохондриальное потребление O₂ около 10 %, проба с олигомицином, гидролиз ATP ATP-синтазой при протонофоре; TMRM уравновешивается между средой и клеткой около 60 мин, между цитозолем и матриксом — намного быстрее. Схема измерения потребления O₂ — по тому же обзору: закрытая ячейка (кислородный электрод или анализатор Seahorse XF), последовательные добавки олигомицина, FCCP, ротенона с антимицином A; уровни на схеме — из учебной модели практикума (контроль, олигомицин, FCCP, антимицин A). −139 мВ — нейроны коры крысы в культуре (Gerencser 2012, реферат). Импорт и Δψ — изолированные митохондрии Neurospora crassa (Martin 1991, реферат); транслоказы — обзор Wiedemann и Pfanner 2017 (реферат).

Компартменты и локальные условия · шаг 6 из 30

Как одна граница одновременно изолирует реакции и обеспечивает обмен

Граница компартмента разделяет несовместимые реакции, а избирательные переносчики, челноки и транслоказы ведут обмен через неё, не разрушая неравновесия.

Кислые гидролазы активны в кислом просвете лизосомы; при нарушении целостности её мембраны катепсины попадают в цитозоль и могут запустить гибель клетки.
NADH не проходит через внутреннюю мембрану митохондрии: восстановительные эквиваленты переносят челночные системы.
Белки матрикса поступают из цитозоля через транслоказы TOM и TIM23; каждый переносчик пропускает определённые вещества, и различия сохраняются.

Изоляция

В лизосоме работают более 60 гидролаз (Xu 2015). Если мембрана лизосомы становится проницаемой, её содержимое выходит в цитозоль, и катепсины расщепляют цитозольные белки; в зависимости от масштаба утечки клетка погибает по типу некроза или апоптоза (Aits и Jäättelä 2013). Так же изолированы реакции пероксисомы: пероксид водорода, который образуется при β-окислении очень длинноцепочечных жирных кислот, разлагает каталаза той же органеллы (Schrader 2015).

Обмен

Обмен идёт через избирательные белки. Малат-аспартатный челнок переносит восстановительные эквиваленты цитозольного NADH на NAD⁺ матрикса: оксалоацетат восстанавливается до малата, малат входит в матрикс через переносчик и там вновь окисляется с образованием NADH. Глицерофосфатный челнок передаёт электроны иначе — через митохондриальную глицерол-3-фосфатдегидрогеназу на внешней стороне внутренней мембраны прямо в пул убихинона, минуя комплекс I (Mráček 2013). Белки матрикса синтезируются в цитозоле и переносятся транслоказами TOM и TIM23, причём перенос через TIM23 требует Δψ (Wiedemann и Pfanner 2017).

Значение

Болезни лизосомного накопления — более 70 наследственных болезней, большинство из них наследуются аутосомно-рецессивно. Их вызывают мутации генов лизосомных ферментов и мембранных белков; при дефекте этих белков нерасщеплённые вещества накапливаются в лизосомах (Platt 2018). Чаще причиной служат мутации генов гидролаз, но нарушения выноса продуктов и мембранного транспорта тоже приводят к накоплению (Xu 2015). Например, при болезни Помпе (гликогенозе II типа) из-за мутаций гена GAA недостаточна активность кислой α-глюкозидазы, и в лизосомах накапливается гликоген.

Типичная ошибка Компартмент тем лучше выполняет свою функцию, чем меньше веществ проходит через его мембрану.

Изоляцию и обмен обеспечивают одни и те же избирательные белки: через внутреннюю мембрану митохондрии непрерывно идут метаболиты, ATP и ADP, белки с MTS, но каждый переносчик пропускает определённые вещества в определённом направлении, и неравновесие сохраняется.

Электроны цитозольного NADH передаются в дыхательную цепь глицерофосфатным челноком. Куда они поступают в митохондрии?

А. На NAD⁺ матрикса с образованием NADH (неверный вариант)
Так работает малат-аспартатный челнок: малат входит в матрикс и окисляется там с образованием NADH. Глицерофосфатный челнок матриксный NAD⁺ не использует.
Б. В пул убихинона, минуя комплекс I (верный вариант)
Митохондриальная глицерол-3-фосфатдегидрогеназа на внешней стороне внутренней мембраны окисляет глицерол-3-фосфат и передаёт электроны через FAD прямо на убихинон (Mráček 2013).
В. Прямо на комплекс IV и кислород (неверный вариант)
Комплекс IV принимает электроны от цитохрома c, а не от дегидрогеназ челноков. Электроны глицерофосфатного челнока входят в цепь раньше — на уровне убихинона.

Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →

Источники и условия научного вывода

Схема механизма; числа не показываются. Гидролазы лизосомы и болезни накопления — обзор Xu 2015 (полный текст PMC); проницаемость мембраны лизосомы и лизосомная гибель клетки — обзор Aits и Jäättelä 2013 (реферат); пероксисома — обзор Schrader 2015 (не прочитан); глицерофосфатный челнок — обзор Mráček 2013 (реферат); малат-аспартатный челнок — обзор Borst 2020 (реферат); импорт белков — Wiedemann и Pfanner 2017 (реферат); болезни лизосомного накопления — обзор Platt 2018 (реферат: более 70 болезней, чаще аутосомно-рецессивное наследование, суммарно около 1 случая на 5000 живорождённых). Пример болезни Помпе — по обзору Platt 2018 (рубрика «Glycogen Storage Disease Type II») и классическому описанию дефицита кислой α-глюкозидазы.

Компартменты и локальные условия · шаг 7 из 30

Как измеряют pH и редокс-потенциал внутри органеллы

Обычный pH-микроэлектрод слишком велик для малых органелл, поэтому в них доставляют флуоресцентный сенсор. В рассматриваемой методике pH определяют по отношению сигналов при двух длинах волн после калибровки в той же клетке.

Сенсор доставляют в компартмент: декстран с pH-чувствительным красителем — эндоцитозом в лизосомы, генетически кодируемый сенсор — по адресующей последовательности.
Ратиометрия: отношение сигналов при двух длинах волн возбуждения практически не зависит от количества сенсора.
Калибровка: ионофоры уравнивают pH органеллы и буфера известного pH; по кривой «отношение — pH» сигнал переводят в pH.

Чтобы измерить pH лизосом макрофагов мыши, их загружали pH-чувствительным декстраном методом «пульс — погоня»: декстран поглощается эндоцитозом и накапливается в лизосомах. Флуоресценцию возбуждали при 490 и 440 нм и брали отношение сигналов (Steinberg 2010). Для матрикса митохондрий клеток HeLa использовали белковый сенсор SypHer с адресующей последовательностью и отношение сигналов при возбуждении 480 и 430 нм (Poburko 2011).

Яркость при одной длине волны зависит от количества сенсора, толщины клетки и выцветания, поэтому сама по себе не даёт pH. Отношение двух сигналов одного сенсора от количества сенсора практически не зависит, но остаётся условной величиной, пока его не откалибровали.

В конце эксперимента клетки переводили в растворы с высоким K⁺ и известным pH (4,0–6,5) с нигерицином; ионофор выравнивает pH органеллы с pH раствора, и по нескольким точкам строят кривую «отношение — pH» (Steinberg 2010). У сенсора есть рабочий диапазон: выше pH 6,5 краситель лизосом уже не различал значений. После калибровки сенсора SypHer в каждой клетке pH матрикса клеток HeLa составил 7,61 — ниже прежних оценок 7,8–8,1 (Poburko 2011).

Потенциал пары глутатиона измеряют сенсором Grx1-roGFP2: глутаредоксин быстро уравновешивает сенсор именно с парой GSH/GSSG (Gutscher 2008). Калибруют по крайним точкам — полностью восстановленному и полностью окисленному сенсору — и пересчитывают степень окисления в милливольты. Сенсор сам реагирует с глутатионом и потому входит в измеряемую систему.

Типичная ошибка Чем ярче флуоресценция pH-сенсора в органелле, тем выше (или ниже) в ней pH.

Яркость одного канала зависит от количества сенсора, толщины клетки и выцветания. В рассматриваемой методике pH определяют по отношению двух сигналов после калибровки в той же клетке: отношение уменьшает зависимость от количества сенсора, а поправки на фон и выцветание проверяют отдельно. Есть и другие проверенные способы, например по времени жизни флуоресценции; без калибровки сигнал остаётся относительным.

pH-сенсор в лизосомах регистрировали по яркости при одной длине волны возбуждения. В клетках, где сенсора вдвое больше, яркость оказалась вдвое выше. Что можно заключить о pH в лизосомах этих клеток?

А. pH в лизосомах этих клеток выше (неверный вариант)
Удвоение яркости объясняется удвоением количества сенсора. Чтобы судить о pH, нужна величина, не зависящая от количества сенсора, — отношение сигналов при двух длинах волн.
Б. pH в лизосомах этих клеток ниже (неверный вариант)
Связь яркости с pH здесь не установлена: сигнал вырос пропорционально количеству сенсора. По одному каналу без калибровки направление сдвига pH определить нельзя.
В. О pH из этих данных судить нельзя (верный вариант)
Яркость одного канала пропорциональна количеству сенсора, и двукратная разница полностью объясняется им. Сравнить pH позволяют ратиометрия и калибровка с ионофорами.

Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →

Источники и условия научного вывода

Схемы методов; значения на кривой калибровки условные, кроме названных. Лизосомы: макрофаги мыши RAW264.7 и альвеолярные макрофаги, декстраны, возбуждение 490/440 нм, калибровка в растворах 145 мМ KCl с нигерицином 10 мкг/мл при pH 4,0–6,5, аппроксимация сигмоидой; верхний предел чувствительности — pH 6,5 (Steinberg 2010, полный текст PMC). Матрикс: клетки HeLa, mitoSypHer, возбуждение 480/430 нм, калибровка каждой клетки нигерицином и монензином; pH матрикса в покое 7,61 ± 0,02 (79 клеток; Poburko 2011, полный текст). Grx1-roGFP2 — Gutscher 2008 (реферат); калибровка по крайним точкам (полное окисление и полное восстановление сенсора) — схема метода.

Локальная концентрация · шаг 8 из 30

Почему концентрация без указания объёма и формы не определена

Одно и то же число молекул даёт разную концентрацию в зависимости от объёма, к которому его относят, и от того, какая часть молекул свободна.

Концентрация c = N/(N_A·V): при неизменном числе частиц N она обратно пропорциональна объёму V.
Анализ лизата даёт среднюю по клетке концентрацию, а эффектор отвечает на локальную — в том объёме, где он находится.
Для Ca²⁺ общая концентрация намного выше свободной: большую часть вошедших ионов связывают буферы.

Пусть через канал за короткое время вошло 10⁴ ионов Ca²⁺. Если бы они равномерно распределились по клетке объёмом 1 пл (10⁻¹² л), общая концентрация кальция выросла бы на c = N/(N_A·V) = 10⁴/(6,02·10²³ моль⁻¹ · 10⁻¹² л) ≈ 1,7·10⁻⁸ М, то есть примерно на 17 нМ. Это меньше фонового уровня свободного Ca²⁺ в цитозоле покоящейся клетки (около 100 нМ) и находится на пределе обнаружения.

Те же 10⁴ ионов в объёме 10⁻¹⁶ л — кубе со стороной около 0,5 мкм у устья канала — дают прибавку около 170 мкМ, в 10 000 раз больше. Это прибавка общего кальция; свободного Ca²⁺ будет заметно меньше, потому что большую часть вошедших ионов связывают цитозольные буферы (Rizzuto 2006). Но и с этой поправкой у канала создаётся концентрация, на порядки превышающая фоновую.

Поэтому утверждение «концентрация вещества выросла» неполно, пока не названы три вещи: где именно (объём), о какой форме идёт речь (свободная или общая) и с каким порогом чувствительности эффектора её сравнивают. Средняя концентрация в лизате полезна как мера общего содержания, но не говорит, достигнут ли порог там, где находится эффектор.

В калькуляторе выберите число ионов, объём и долю ионов, связанных буферами: схема сравнивает общую и свободную прибавку концентрации с фоновым уровнем свободного Ca²⁺.

Типичная ошибка Если анализ лизата не показал роста концентрации вещества, сигнала не было.

Средняя по клетке концентрация почти не меняется, когда вещество накапливается в малом объёме: 10⁴ ионов дают 17 нМ в объёме клетки и 170 мкМ в микродомене. Неизменный результат анализа лизата совместим и с отсутствием сигнала, и с локальным событием, и с перераспределением вещества, которое произошло быстрее, чем длилось измерение.

Через канал вошло 10⁴ ионов Ca²⁺, и все они остались в объёме 10⁻¹⁶ л у его устья. Какой будет прибавка общей концентрации кальция в этом объёме?

А. Около 17 нМ (неверный вариант)
17 нМ — прибавка, если те же ионы распределить по всей клетке объёмом 10⁻¹² л. Объём микродомена в 10 000 раз меньше, и концентрация во столько же раз выше.
Б. Около 170 мкМ (верный вариант)
c = 10⁴/(6,02·10²³ моль⁻¹ · 10⁻¹⁶ л) ≈ 1,7·10⁻⁴ М. Это общий кальций: свободного будет меньше, потому что большую часть ионов связывают буферы.
В. Около 1,7 мкМ (неверный вариант)
Ошибка на два порядка: при делении 10⁴ на 6,02·10²³ и на 10⁻¹⁶ получается 1,7·10⁻⁴ М, то есть 170 мкМ.

Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →

Источники и условия научного вывода

Rizzuto R., Pozzan T. 2006. Microdomains of intracellular Ca²⁺: molecular determinants and functional consequences. Physiol Rev

Схема — расчёт по формуле c = N/(N_A·V) для заданных числа ионов и объёма; объёмы — порядки величины (клетка около 1 пл, микродомен у устья канала около 10⁻¹⁶ л), это учебные оценки. Доля ионов, связанных буферами, выбирается как условный параметр; то, что буферы связывают большую часть вошедшего Ca²⁺, — по обзору Rizzuto 2006. Фон свободного Ca²⁺ в цитозоле покоящейся клетки — около 100 нМ (там же).

Локальная концентрация · шаг 9 из 30

Как краудинг меняет равновесие, диффузию и скорость реакций

Цитоплазма заполнена макромолекулами. Исключённый объём при прочих равных может благоприятствовать сборке комплексов, но в живой клетке действуют и неспецифические взаимодействия, поэтому итог зависит от белка; диффузия же в цитоплазме медленнее, чем в разбавленном растворе.

Макромолекулы занимают 20–30 % объёма цитоплазмы (200–300 мг/мл), и для каждой новой крупной молекулы доступна лишь часть объёма — это макромолекулярный краудинг.
Исключённый объём при прочих равных благоприятствует компактным состояниям и ассоциации; неспецифические взаимодействия с другими белками могут действовать в обратную сторону.
Коэффициент диффузии снижается: у GFP в цитоплазме клеток CHO он примерно втрое ниже, чем в солевом растворе.

Белки обычно изучают в разбавленных растворах, а в цитоплазме суммарная концентрация макромолекул составляет 200–300 мг/мл, и они занимают 20–30 % объёма (Ellis 2001). Значительная часть объёма недоступна для каждой новой крупной молекулы. Последствия этого удобно разделить на три величины.

Равновесие: эффективная активность макромолекул выше их номинальной концентрации, и исключённый объём при прочих равных благоприятствует сборке комплексов, укладке и полимеризации (Ellis 2001). Однако в цитоплазме действуют и неспецифические, в том числе электростатические, взаимодействия с окружающими белками: в клетках E. coli они меняли устойчивость небольшого белкового домена иначе, чем предсказывает теория краудинга (Smith 2016). Поэтому изменение устойчивости белка, а по данным других работ и связывания, зависит от конкретного белка и среды. Диффузия: по восстановлению флуоресценции после выцветания коэффициент диффузии GFP в цитоплазме клеток CHO оказался около 27 мкм²/с против 87 мкм²/с в солевом растворе (Swaminathan 1997); крупные комплексы замедляются сильнее.

Наблюдаемая скорость процесса — то, как быстро система приходит к новому состоянию, — зависит от обоих эффектов и от того, какая стадия лимитирует. Реакция, ограниченная частотой встреч партнёров, в цитоплазме идёт медленнее, чем в пробирке; сборка комплекса, определяемая равновесием, может дать больше комплекса, если неспецифические взаимодействия не действуют в обратную сторону. Поэтому рост локальной концентрации не гарантирует роста потока: если фермент насыщен субстратом, добавочный субстрат скорость почти не меняет.

Краудинг регулируется. В клетках дрожжей и HEK293 рапамицин, подавляющий mTORC1, за 2–3 ч снижал содержание рибосом, и подвижность частиц диаметром 40 нм росла; подвижность молекул размером 5 нм и меньше не менялась (Delarue 2018).

Типичная ошибка Если повысить локальную концентрацию субстрата у фермента, реакция всегда ускорится.

Скорость растёт, только пока фермент не насыщен и стадия встречи партнёров лимитирует. Насыщенный фермент на добавочный субстрат почти не отвечает, а в плотной цитоплазме встречи замедлены диффузией.

Фермент работает в режиме насыщения субстратом. Субстрат дополнительно сконцентрировали в малом объёме вокруг фермента; количество и каталитические свойства фермента, вязкость и другие условия не изменились. Как изменится скорость реакции?

А. Вырастет пропорционально концентрации (неверный вариант)
Пропорциональный рост скорости наблюдается, только пока концентрация субстрата намного ниже Kм. Насыщенный фермент уже работает почти с максимальной скоростью.
Б. Почти не изменится (верный вариант)
Активные центры насыщенного фермента почти всё время заняты, поэтому добавочный субстрат скорость не повышает. Рост локальной концентрации увеличивает поток, только пока фермент не насыщен.
В. Снизится из-за краудинга (неверный вариант)
Краудинг замедляет диффузию, но сам по себе не снижает скорость насыщенного фермента: его активные центры по-прежнему заняты субстратом.

Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →

Источники и условия научного вывода

Доля занятого объёма и концентрация макромолекул — оценки обзора Ellis 2001 (полный текст). Коэффициенты диффузии GFP-S65T — данные эксперимента: FRAP в цитоплазме клеток CHO и в солевом растворе (Swaminathan 1997): время полувосстановления 83 и 30 мс, относительная вязкость цитоплазмы 3,2, D в растворе 87 мкм²/с. Регуляция краудинга — Delarue 2018: дрожжи и клетки HEK293, рапамицин 2–3 ч, трекинг частиц GEM диаметром 40 нм. Направления изменений на схеме — качественные, числа даны только для D. Неспецифические взаимодействия в клетке — Smith 2016 (клетки E. coli, ¹⁹F-ЯМР в клетке, SH3-домен белка drk; прочитан реферат).

Локальная концентрация · шаг 10 из 30

Как источник, диффузия и сток создают устойчивый градиент

Неоднородность распределения растворимого вещества внутри одного объёма сохраняется, пока его непрерывно производит источник и удаляет сток; масштаб градиента — длина диффузии λ = √(D/k).

Источник — локальный синтез, выход из депо или направленный транспорт — поддерживает концентрацию c₀ у мембраны.
Молекулы расходятся диффузией с коэффициентом D и удаляются стоком с константой k; в стационаре профиль c(x) = фон + (c₀ − фон)·e^(−x/λ).
Длина диффузии λ = √(D/k): ускорение стока сужает домен без изменения источника.

Простейшая модель устойчивой неоднородности внутри компартмента содержит три составляющие. Без источника нет неоднородности, без диффузии — распространения, а без стока вещество со временем распределится по всему объёму равномерно. Так устроены градиенты растворимых сигнальных молекул; закрепление вещества на мембране или цитоскелете — другой способ создать неоднородность.

В одномерной модели вещество образуется у плоскости x = 0, диффундирует с коэффициентом D и удаляется процессом первого порядка с константой k. В стационарном профиле избыток концентрации над фоном убывает экспоненциально и на расстоянии λ = √(D/k) падает в e ≈ 2,7 раза. λ не следует путать со среднеквадратичным смещением √(2Dt) за время t: λ описывает профиль, который не меняется во времени.

Для свободного Ca²⁺ λ составляет десятые доли микрометра: из измерений в экстракте ооцитов шпорцевой лягушки дальность действия свободного Ca²⁺ до связывания буфером оценена в 0,1 мкм, а IP₃ (D = 283 мкм²/с) — в 24 мкм (Allbritton 1992). В интактных клетках диффузия IP₃ затруднена: в клетках нейробластомы человека D ≤ 10 мкм²/с, и дальность действия IP₃ меньше 5 мкм, поэтому в клетках млекопитающих IP₃ скорее местный, чем глобальный посредник (Dickinson 2016). Для фосфорилированного белка с D порядка 10 мкм²/с и временем жизни фосфорилированной формы в секунды λ — единицы микрометров (Brown и Kholodenko 1999).

Размер домена можно изменить, не трогая источник: повышение активности фосфодиэстеразы или фосфатазы сужает домен, подавление — расширяет. Быстрый ненасыщенный буфер действует как сток лишь в начальной фазе сигнала; в длительном стационаре связывание и отщепление уравновешиваются, а подвижный буфер может даже ускорять распространение. Локальность кальциевого сигнала поэтому условна: при сильном выбросе Ca²⁺ буферы насыщаются, и могут возникать подъёмы и волны, охватывающие всю клетку (Berridge 2003).

Типичная ошибка Если вещество диффундирует в 100 раз медленнее, его домен во столько же раз уже.

Длина диффузии λ пропорциональна квадратному корню из отношения D/k: при уменьшении D в 100 раз домен сужается в 10 раз, а одновременное изменение D и k в одно и то же число раз профиль не меняет.

Белок фосфорилируется киназой у мембраны и дефосфорилируется фосфатазой в цитозоле; D = 10 мкм²/с. Активность фосфатазы повысили в 4 раза. Как изменится длина диффузии фосфорилированной формы?

А. Уменьшится в 4 раза (неверный вариант)
Константа стока выросла в 4 раза, но длина диффузии зависит от неё через квадратный корень: λ = √(D/k).
Б. Не изменится (неверный вариант)
Киназа у мембраны действительно прежняя, но размер домена задаёт ещё и сток: фосфатаза быстрее дефосфорилирует белок, и фосфорилированная форма успевает продиффундировать от мембраны на меньшее расстояние.
В. Уменьшится в 2 раза (верный вариант)
λ = √(D/k): при росте k в 4 раза λ уменьшается в √4 = 2 раза. Так сток меняет размер домена, не меняя источник.

Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →

Источники и условия научного вывода

Схема — учебная модель практикума (вопрос 2, базовый уровень): одномерный стационарный профиль — решение уравнения D·c″ − k·(c − фон) = 0 с постоянной концентрацией у источника c₀ и c → фон вдали от него; фон 5 % от c₀ поддерживает равномерный базальный источник k·фон. Показан участок полубесконечной среды длиной 20 мкм; это не точное решение для замкнутой клетки с непроницаемым дальним концом (такое решение — в модели шага «Микродомены cAMP»). Для точечного источника в трёх измерениях профиль спадает быстрее (множитель 1/r), но масштаб λ тот же. Дальность действия Ca²⁺ и IP₃ — расчёт Allbritton 1992 из коэффициентов диффузии, измеренных в цитозольном экстракте ооцитов Xenopus laevis, и времён жизни посредников. Оценка для фосфобелков — Brown и Kholodenko 1999 (расчёт по измеренным D и активностям киназ и фосфатаз). Волны Ca²⁺ — обзор Berridge 2003.

Локальная концентрация · шаг 11 из 30

Как пороговый эффектор превращает плавный градиент в границу

Градиент — непрерывная величина, а ответ клетки часто дискретен. Преобразование выполняет эффектор, ответ которого зависит от концентрации круче гиперболы.

Ответ эффектора R = cⁿ/(K½ⁿ + cⁿ): K½ задаёт положение границы домена, коэффициент Хилла n — её резкость.
При n = 1 ответ повторяет плавный профиль; при n = 4 для перехода от 10 до 90 % ответа концентрация должна вырасти всего в 3 раза.
Сверхчувствительность ответа возникает при кооперативном связывании, многоступенчатом фосфорилировании и насыщении субстратом киназы и фосфатазы.

Если ответ эффектора зависит от концентрации сигнала плавно, профиль ответа повторяет профиль градиента и остаётся размытым. Если же ответ зависит от концентрации круче гиперболы, в области, где концентрация выше порога, эффектор активен почти полностью, а за её пределами почти неактивен. Так градиент и порог вместе создают позиционную информацию: профиль задаёт координату, порог превращает её в границу.

Крутизну описывают коэффициентом Хилла. При n = 1 ответ растёт от 10 до 90 %, когда концентрация увеличивается в 81 раз, при n = 4 — всего в 3 раза. При одном и том же K½ граница домена (ответ 50 %) остаётся на месте; меняются ширина переходной зоны и остаточный ответ вдали от источника.

Кооперативное связывание: занятие одного сайта повышает сродство остальных, как у кальмодулина с четырьмя сайтами Ca²⁺. Многоступенчатое фосфорилирование: белок активен только после присоединения нескольких фосфатов. Сверхчувствительность нулевого порядка: если киназа и фосфатаза насыщены субстратом, доля фосфорилированного белка очень резко зависит от отношения их активностей (Goldbeter и Koshland 1981; Ferrell и Ha 2014).

Для резкого ответа недостаточно требования двух независимых условий: коинцидентное узнавание — узнавание по совпадению двух и более признаков (вопрос 3) — повышает избирательность, но ответ на каждое условие остаётся гиперболическим.

Типичная ошибка Чем выше коэффициент Хилла, тем чувствительнее эффектор и тем шире область, где он отвечает.

Коэффициент Хилла меняет крутизну, а не положение порога: при том же K½ граница домена остаётся на месте, а при концентрации ниже K½ кооперативный эффектор отвечает слабее некооперативного.

Киназа и фосфатаза, действующие на один белок, насыщены субстратом, и их активности равны: фосфорилирована половина молекул. Активность киназы повысили на 10 %. Как изменится доля фосфорилированного белка?

А. Вырастет примерно на 10 % (неверный вариант)
Плавный, почти линейный ответ получается, когда ферменты не насыщены: тогда перевес киназы на 10 % повышает долю фосфорилированного белка лишь с 50 до 54 %. При насыщении эта доля зависит от отношения активностей очень резко.
Б. Почти не изменится (неверный вариант)
Насыщение не делает систему нечувствительной: каждый фермент работает почти с постоянной максимальной скоростью, и небольшой перевес киназы накапливается, пока почти весь белок не станет фосфорилированным.
В. Вырастет до большей части молекул (верный вариант)
Это сверхчувствительность нулевого порядка: при насыщении обоих ферментов перевес киназы на 10 % переводит долю фосфорилированного белка с 50 % примерно до 90 % (расчёт по Goldbeter и Koshland 1981).

Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →

Источники и условия научного вывода

Режим «Градиент и эффектор» — учебная модель практикума (вопрос 2, базовый уровень) при D = 10 мкм²/с и k = 1 с⁻¹; ответ рассчитан по уравнению Хилла. Режим «Нулевой порядок» — расчёт стационарной доли фосфорилированного белка по формуле Goldbeter и Koshland 1981 при равных константах Михаэлиса киназы и фосфатазы, выраженных в долях общего количества белка-субстрата (1 — ферменты не насыщены, 0,01 — насыщены).

Локальная концентрация · шаг 12 из 30

Почему одинаковый средний уровень cAMP даёт разные ответы

Аденилатциклаза — источник cAMP, фосфодиэстеразы — сток, AKAP удерживает PKA у мишени. Поэтому ответ мишени определяет концентрация cAMP рядом с ней, а не средний уровень в клетке.

Гормон активирует аденилатциклазу в своём мембранном домене; синтезированный cAMP гидролизуют фосфодиэстеразы.
AKAP удерживают PKA, а часто и аденилатциклазу, PDE и фосфатазы рядом с определённой мишенью.
Средняя концентрация cAMP зависит только от общей скорости синтеза и стока; ответ мишени — от cAMP рядом с ней и от того, есть ли там PKA.

Эксперименты на сердце

В изолированном перфузируемом сердце крысы изопротеренол (агонист β-адренорецепторов, 10 нМ) и простагландин E1 (30 мкМ) одинаково повышали содержание cAMP и активность PKA, но сократимость и активность гликогенфосфорилазы повышал только изопротеренол (Hayes 1979). В кардиомиоцитах взрослого кролика изопротеренол повышал cAMP и в растворимой фракции гомогената, и в нерастворимой (корпускулярной), а PGE1 — только в растворимой; PGE1 не активировал ни PKA нерастворимой фракции, ни фосфорилазу (Buxton и Brunton 1983).

Генетически кодируемые сенсоры позволили увидеть домены. В кардиомиоцитах новорождённой крысы β-адренергическая стимуляция создавала микродомены повышенного cAMP у мембраны Т-трубочек, дальность действия cAMP составляла около 1 мкм, его распространение ограничивали фосфодиэстеразы, а активировалась прежде всего PKA, закреплённая рядом (Zaccolo и Pozzan 2002). В тех же клетках ответ на β-агонист связан с PKA типа II и фосфорилированием фосфоламбана и тропонина I, а ответ на PGE1 — с PKA типа I, без фосфорилирования этих белков (Di Benedetto 2008).

Как удерживается домен

Свободный cAMP диффундирует быстро — по измерениям 100–700 мкм²/с, — а фосфодиэстеразы работают медленно, и по этим числам домены удерживаться не могли бы. Возможное объяснение: при физиологических концентрациях большая часть cAMP связана с регуляторными субъединицами PKA и другими белками, и его перемещение замедлено («буферированная диффузия»); вокруг отдельных PDE возникают нанодомены низкого cAMP размером 10–30 нм (Bock 2020; обзор Bock 2024). Какого размера домены — десятки нанометров или микрометры — зависит от системы и остаётся предметом исследований.

На схеме — учебная модель практикума: при гормонах А и Б cAMP синтезируется с одинаковой скоростью, поэтому средний cAMP одинаков, а фосфорилирование мишени А — нет. IBMX, ингибируя PDE, расширяет домены; пептид Ht31 отделяет PKA от AKAP, и фосфорилирование мишени снижается при прежнем cAMP рядом с ней.

Типичная ошибка Если два гормона одинаково повышают cAMP в лизате, они вызывают одинаковый ответ.

Лизат даёт среднюю концентрацию. Ответ мишени зависит от cAMP рядом с ней и от присутствия закреплённой PKA: в перфузируемом сердце изопротеренол и PGE1 одинаково повышали cAMP, но сократимость повышал только изопротеренол (Hayes 1979).

Два гормона одинаково повысили средний cAMP в клетках, но фосфорилирование белка-мишени у мембраны вызвал только первый. Рассматривается стационарная модель, в которой константа гидролиза cAMP в обоих экспериментах одинакова. Какое объяснение согласуется с этим результатом?

А. PDE гидролизуют cAMP второго гормона по пути к мишени (верный вариант)
В этой модели средний cAMP одинаков, потому что одинакова общая скорость синтеза. Но cAMP второго гормона гидролизуется фосфодиэстеразами по пути и до PKA у мишени почти не доходит.
Б. При втором гормоне синтезируется меньше cAMP (неверный вариант)
В этой модели равные стационарные средние концентрации при одинаковой константе удаления означают одинаковую общую скорость синтеза. Различие — в месте синтеза.
В. Первый гормон сам активирует PKA у мишени, без cAMP (неверный вариант)
Гормон связывается с рецептором на внешней стороне мембраны и до PKA не доходит; PKA активируется cAMP, который связывается с её регуляторными субъединицами.

Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →

Источники и условия научного вывода

Hayes 1979: изолированное перфузируемое сердце крысы, изопротеренол 10 или 80 нМ, PGE1 2 или 30 мкМ; измерены cAMP, активность PKA, фосфорилазы и dP/dt. Buxton и Brunton 1983: изолированные кардиомиоциты взрослого кролика, изопротеренол 1 мкМ, PGE1 10 мкМ; cAMP и PKA во фракциях гомогената (3000 g, 5 мин). Zaccolo и Pozzan 2002: кардиомиоциты новорождённой крысы, норадреналин, FRET-сенсор на основе субъединиц PKA (по реферату). Di Benedetto 2008: кардиомиоциты новорождённой крысы (по реферату). Bock 2020: клетки HEK293 (полный текст PMC); буферированная диффузия cAMP и нанодомены у PDE. Схема — учебная модель практикума (вопрос 2, продвинутый уровень): одномерная клетка 20 мкм, эффективный D cAMP 30 мкм²/с (учебный), величины условные.

Локальная концентрация · шаг 13 из 30

Как градиент RanGTP задаёт направление ядерного транспорта

Фактор обмена RCC1 связан с хроматином, а активатор гидролиза GTP RanGAP1 находится в цитоплазме; поэтому RanGTP сосредоточен в ядре. Там он разбирает комплексы импортинов с грузом и, наоборот, собирает комплексы экспортинов с грузом.

RCC1 на хроматине заменяет GDP на GTP в Ran; RanGAP1 вместе с RanBP1 в цитоплазме ускоряет гидролиз GTP на Ran.
Импортин связывает груз в цитоплазме и освобождает его в ядре при связывании RanGTP; комплекс импортин–RanGTP возвращается в цитоплазму.
Экспортин (например, XPO1/CRM1) связывает груз с сигналом ядерного экспорта вместе с RanGTP в ядре; в цитоплазме RanGAP1 ускоряет гидролиз GTP на Ran, комплекс распадается, и груз освобождается.
NTF2 переносит RanGDP обратно в ядро; в митозе RanGTP образуется у хромосом и служит позиционной информацией для сборки веретена.

Ran — малая ГТФаза, существующая в форме, связанной с GTP, и в форме, связанной с GDP. Обмен и гидролиз нуклеотида на Ran ускоряют белки-регуляторы, а градиент возникает потому, что эти белки размещены в разных компартментах. Фактор обмена RCC1 связан с хроматином, то есть находится в ядре; активатор гидролиза RanGAP1 находится в цитоплазме, а белок RanBP1, связывающий RanGTP, ускоряет вызванный RanGAP1 гидролиз на порядок (Bischoff 1995).

Поэтому RanGTP сосредоточен в ядре: FRET-сенсоры показали резкий перепад RanGTP между ядром и цитоплазмой в экстрактах яиц шпорцевой лягушки (Kalab 2002). Импортин связывает груз в цитоплазме, проходит через ядерную пору и в ядре связывает RanGTP, который освобождает груз. Комплекс импортин–RanGTP выходит в цитоплазму, где после гидролиза GTP импортин освобождается для нового цикла (Stewart 2007).

Экспорт устроен как цепь, обратная по геометрии, но не по химии: нуклеотидный цикл Ran тот же, меняется лишь то, что RanGTP делает с комплексом. Импортин и груз RanGTP разобщает, а экспортин, напротив, связывает груз только вместе с RanGTP. Это показано для CRM1 (XPO1) — экспортина, который узнаёт богатый лейцином сигнал ядерного экспорта (NES) в составе груза. CRM1 служит посредником NES-зависимого экспорта (Fukuda 1997), а комплекс из CRM1, NES и RanGTP образуется кооперативно: каждый из двух лигандов повышает сродство экспортина к другому (Fornerod 1997). По данным структуры, RanGTP усиливает связывание груза не прямым контактом с ним, а перестройкой самого экспортина на расстоянии (Monecke 2009). Поэтому тройной комплекс экспортин–RanGTP–груз собирается в ядре, где RanGTP много, и проходит через пору в цитоплазму. Там RanGAP1 ускоряет гидролиз GTP на Ran, а RanBP1 и Ran-связывающие домены RanBP2 помогают отделить комплекс от поры; RanGDP груз уже не удерживает, и комплекс распадается. Если Ran не гидролизует GTP (мутант Q69L), CRM1 остаётся на цитоплазматической стороне поры (Kehlenbach 1999). Освободившийся экспортин возвращается в ядро и начинает новый цикл.

Каждый цикл выносит Ran из ядра. Запас Ran в ядре восполняется белком NTF2: он связывает RanGDP и переносит его через пору; в ядре RCC1 заменяет GDP на GTP, а к RanGTP NTF2 сродства не имеет, и Ran остаётся в ядре (Ribbeck 1998). Направление транспорта задаёт не пора, а разделение источника RanGTP (RCC1) и его стока (RanGAP1): одно и то же разделение разбирает в ядре комплексы импорта и собирает комплексы экспорта. Энергия расходуется в цикле Ran, на гидролиз GTP, ускоренный RanGAP1, а не на перенос груза самой порой (Görlich и Kutay 1999; Stewart 2007).

Эта схема относится не ко всему экспорту. CRM1 — лишь один из экспортинов: экспортин CAS возвращает в цитоплазму импортин-α, связываясь с ним вместе с RanGTP и предпочтительно в форме без груза, поэтому импортированный груз остаётся в ядре (Kutay 1997). Экспорт мРНК в основном опирается на посредников, не родственных импортину-β, и рассмотренной схемой не описывается (Görlich и Kutay 1999).

В митозе ядерной оболочки нет, но RCC1 остаётся на хромосомах. В митотических клетках человека FRET-сенсор Rango показал, что вокруг хромосом свободных грузов импортина-β больше; этот градиент ускоряет сборку веретена, но для поддержания уже собранного веретена в основном не нужен (Kaláb 2006).

Типичная ошибка Направление ядерного импорта задаёт ядерная пора, пропускающая белки только внутрь.

Пора пропускает транспортные рецепторы в обе стороны. Направление задаёт асимметрия RanGTP: RCC1 в ядре и RanGAP1 в цитоплазме; импортин освобождает груз там, где связывает RanGTP, — в ядре. RanGTP не означает «внутрь»: в ядре он разбирает комплекс импортина с грузом и собирает комплекс экспортина с грузом.

Мысленный эксперимент: RanGAP1 вместе с RanBP1 поместили в ядро, где RCC1 продолжает работать. Как изменится освобождение импортных грузов в ядре?

А. Не изменится: груз освобождается в ядерной поре (неверный вариант)
Пора пропускает комплекс импортина с грузом, но не разрывает его. Груз освобождается при связывании импортина с RanGTP.
Б. Ослабнет: RanGTP в ядре станет меньше (верный вариант)
Сток RanGTP окажется рядом с источником: GTP на Ran будет гидролизоваться и в ядре, RanGTP станет меньше, и импортины будут хуже освобождать груз.
В. Усилится: Ran будет быстрее обменивать GTP (неверный вариант)
RanGAP1 ускоряет не обмен, а гидролиз GTP на Ran. В ядре он превращал бы RanGTP в RanGDP, а RanGDP груз не освобождает.

Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →

Источники и условия научного вывода

Схема механизма; числа не показаны. Ускорение гидролиза RanBP1 — эксперименты с очищенными белками (Bischoff 1995). Перепад RanGTP между ядром и цитоплазмой — FRET-сенсоры в экстрактах яиц Xenopus laevis (Kalab 2002, по реферату). Импорт Ran при помощи NTF2 — система in vitro с пермеабилизированными клетками (Ribbeck 1998, по реферату). Градиент в митозе — клетки человека и экстракты яиц Xenopus, сенсор Rango, FRET и FLIM (Kaláb 2006, по реферату). Общая схема цикла — обзор Stewart 2007. Экспорт: CRM1 — посредник NES-зависимого экспорта, ингибирование лептомицином B (Fukuda 1997, по реферату); кооперативное связывание CRM1 с NES и RanGTP — очищенные белки in vitro и экспорт в ооцитах Xenopus (Fornerod 1997, по реферату); структура комплекса snurportin1–CRM1–RanGTP (Monecke 2009, по реферату); роль RanBP1 и RanBP2 в отделении CRM1 от поры и мутант Ran Q69L — реконструкция в пермеабилизированных клетках (Kehlenbach 1999, по реферату); экспорт импортина-α белком CAS — in vitro и клетки (Kutay 1997, по реферату); экспорт мРНК и энергетика транспорта — обзор Görlich и Kutay 1999.

Локальная концентрация · шаг 14 из 30

Как измеряют градиенты в живой клетке и чем ограничены эти измерения

Лизат уничтожает пространственную информацию, поэтому градиенты измеряют в живых клетках: биосенсорами, методом FRAP и управляемым вмешательством. Каждый метод сам входит в измеряемую систему.

Сенсор на основе FRET: связывание лиганда меняет перенос энергии между двумя флуоресцентными белками; сенсор с одним флуоресцентным белком меняет яркость.
FRAP: флуоресценцию в малой области гасят светом и по скорости её восстановления оценивают подвижность белка и долю неподвижных молекул.
Перенос фермента химически индуцируемым сближением или активация синтеза светом проверяет достаточность события; удаление белка — его необходимость.

Генетически кодируемый биосенсор можно адресовать в нужное место клетки и измерять величину там, где идёт событие. Первые сенсоры Ca²⁺ были построены на FRET между двумя флуоресцентными белками, соединёнными кальмодулином (Miyawaki 1997). В сенсоре cAMP Epac1-camps cAMP-связывающий домен Epac находится между голубым и жёлтым флуоресцентными белками, и связывание cAMP уменьшает перенос энергии (Nikolaev 2004). Сегодня часто применяют сенсоры с одним флуоресцентным белком, яркость которого меняется при связывании лиганда (Greenwald 2018).

Сенсор связывает лиганд и потому буферирует его: при высокой экспрессии сенсора свободного cAMP или Ca²⁺ может становиться меньше, а его динамика и пространственный профиль — меняться. Насколько и как долго, зависит от синтеза и удаления лиганда, подвижности сенсора и обратных связей клетки (Bock 2020). Адресованный сенсор сообщает величину только для того места, куда он адресован, адресация может изменить его динамический диапазон, а без калибровки насыщение сенсора неотличимо от прекращения роста концентрации лиганда (Lyons 2023). Поэтому сообщение о локальной концентрации должно указывать сенсор, место, диапазон и способ калибровки.

FRAP измеряет подвижность: по восстановлению флуоресценции был определён коэффициент диффузии GFP в цитоплазме (Swaminathan 1997); неполное восстановление указывает на долю неподвижных молекул (Lippincott-Schwartz 2001).

Вмешательство проверяет достаточность. Фотоактивируемая аденилатциклаза bPAC при освещении повышает активность примерно в 300 раз и синтезирует cAMP в выбранный момент (Stierl 2011); рапамицин соединяет домены FKBP и FRB и за минуты переносит слитый с одним из них фермент к мембране, несущей другой домен (Putyrski и Schultz 2012).

Типичная ошибка Чем больше сенсора cAMP экспрессировано в клетке, тем точнее он измеряет концентрацию.

Сенсор связывает cAMP и буферирует его: избыток сенсора может снизить свободный cAMP и исказить его динамику и пространственный профиль. Нужны умеренная экспрессия, контроль количества сенсора и калибровка (Lyons 2023).

Сенсор cAMP, адресованный к мембране домена, экспрессировали в 10 раз сильнее, чем в первом эксперименте; синтез cAMP и активность фосфодиэстераз в обоих экспериментах одинаковы, а ответ измеряли через 30 с после стимуляции, до установления стационара. После стимуляции гормоном доля сенсора, связавшего cAMP, у мембраны выросла меньше, чем при низкой экспрессии. Какое объяснение согласуется с этим результатом?

А. Сенсор насытился cAMP раньше, чем при низкой экспрессии (неверный вариант)
Насыщение означало бы, что почти весь сенсор связан с cAMP. При десятикратном избытке сенсора та же порция cAMP распределяется по большему числу молекул, и доля связанного сенсора, наоборот, ниже.
Б. Отношение сигналов зависит от количества сенсора (неверный вариант)
Отношение сигналов одного сенсора, в отличие от яркости, от его количества не зависит. Меньший ответ объясняется тем, что изменилась сама концентрация свободного cAMP.
В. Сенсор связал часть cAMP и снизил свободный cAMP (верный вариант)
Сенсор входит в измеряемую систему: в начальной фазе ответа он связывает часть cAMP и снижает свободную концентрацию (в длительном стационаре неподвижный обратимый сенсор её почти не меняет). Насколько и как долго, зависит от синтеза и гидролиза cAMP, подвижности сенсора и обратных связей, поэтому экспрессию сенсора держат умеренной и контролируют (Lyons 2023).

Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →

Источники и условия научного вывода

Схемы методов; числа на схемах условные, кроме названных. Принцип FRET-сенсора Ca²⁺ — Miyawaki 1997, сенсора cAMP Epac1-camps — Nikolaev 2004 (по реферату). Ограничения сенсоров (буферирование, адресация, динамический диапазон, калибровка) — обзор Lyons 2023 (полный текст PMC). FRAP GFP в клетках CHO — Swaminathan 1997. bPAC: активность в темноте и на свету измерена в E. coli и ооцитах Xenopus, рост около 300 раз (Stierl 2011). Перенос белков рапамицином — обзор Putyrski и Schultz 2012 (по реферату). Режим «Сенсор буферирует» — расчёт связывания cAMP сенсором в закрытой системе: общее количество cAMP фиксировано (3 условные единицы), Kd сенсора — 1 условная единица, синтез и гидролиз не учитываются. Буферирование cAMP в клетке и нанодомены — Bock 2020 (клетки HEK293).

Фосфоинозитиды · шаг 15 из 30

Как минорные липиды размечают мембраны компартментов

Мембраны разных компартментов различаются характерным фосфоинозитидом — производным фосфатидилинозитола с фосфатами в положениях 3, 4 или 5 инозитольного кольца. Это распределение называют липидным кодом, но точнее говорить о разметке, которую белки считывают вместе с другими признаками мембраны: один липид встречается в нескольких мембранах.

Плазматическая мембрана размечена PI(4,5)P₂, аппарат Гольджи — PI4P, ранняя эндосома — PI3P, поздняя эндосома и лизосома — PI(3,5)P₂; PI(3,4,5)P₃ появляется после активации рецепторов.
Содержание метки распределено непрерывно: PI4P есть и на Гольджи, и в плазматической мембране, и на поздних эндосомах.
Разметка существует и поперёк бислоя: фосфатидилсерин удерживается в цитозольном монослое флиппазами и выходит наружу при активации скрамблаз.

Все мембраны клетки построены из одних и тех же основных классов липидов. Для быстрой разметки служат фосфоинозитиды — малая по количеству группа производных фосфатидилинозитола (PI). Их инозитольное кольцо фосфорилировано в положениях 3, 4 или 5 в разных сочетаниях; головная группа обращена в цитозоль, где её узнают белки. Каждую комбинацию фосфатов на мембране создают и удаляют свои ферменты, поэтому метка меняется за секунды–минуты и может смениться без изменения основного липидного состава мембраны.

Распределение фосфоинозитидов по компартментам устойчиво и составляет то, что называют липидным кодом (Balla 2013; Posor 2022). Слово «код» требует ограничения. Это не таблица адресов: характерный фосфоинозитид обогащён в своём компартменте, но встречается и в других. Сенсор P4M, для связывания которого PI4P необходим и достаточен, показывает этот липид на Гольджи, на плазматической мембране и на поздних эндосомах (Hammond 2014). Белок узнаёт участок мембраны с вероятностью, которая зависит от сочетания метки, поверхностного заряда, кривизны и белков-партнёров (Posor 2022; Lai 2025).

Разметка существует и поперёк бислоя. Фосфатидилсерин сосредоточен в цитозольном монослое плазматической мембраны: его переносят туда ATP-зависимые флиппазы семейства P4-АТФаз. Скрамблазы TMEM16F (активируется подъёмом Ca²⁺) и Xkr8 (активируется расщеплением каспазами при апоптозе) переносят липиды в обе стороны без затраты ATP и рассеивают асимметрию; фосфатидилсерин на внешней поверхности узнают фагоциты (Sakuragi 2023). Без скрамблазы спонтанный переход фосфолипида между монослоями занимает часы.

На схеме головная группа показана как кольцо с пронумерованными положениями — это схема, а не структурная формула. Карта меток построена по модели практикума: числа условны и показывают, где липид преобладает.

Типичная ошибка Каждая мембрана несёт один фосфоинозитид, и этот липид служит её однозначным адресом.

Один и тот же фосфоинозитид присутствует в нескольких мембранах, и его содержание меняется непрерывно; мембрану узнают по сочетанию липида с другими признаками — зарядом, кривизной, белками-партнёрами.

Сенсор P4M, для связывания которого PI4P необходим и достаточен, показал сигнал на аппарате Гольджи, на плазматической мембране и на поздних эндосомах. Что следует из этого для липидного кода?

А. Один фосфоинозитид размечает несколько мембран (верный вариант)
PI4P характерен для Гольджи, но его синтезируют и в других мембранах. Поэтому метка обозначает не адрес, а один из признаков, по которым белок узнаёт мембрану вместе с другими.
Б. Сенсор ошибается: PI4P бывает только на Гольджи (неверный вариант)
Пул PI4P плазматической мембраны подтверждён удалением PI4P фосфатазой: после него P4M диссоциирует от этой мембраны (Hammond 2014).
В. Эти три мембраны образуют один компартмент (неверный вариант)
Компартменты различаются набором условий и белков, а не одним липидом; общий липид в разных мембранах не делает их одним компартментом.

Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →

Источники и условия научного вывода

Распределение фосфоинозитидов — по обзорам Balla 2013 и Posor 2022 (клетки млекопитающих); пулы PI4P на Гольджи, плазматической мембране и поздних эндосомах — Hammond 2014 (сенсор P4M, клетки COS-7 и другие линии). Асимметрия монослоёв, флиппазы и скрамблазы — обзор Sakuragi и Nagata 2023. Содержания на карте меток — учебная модель практикума (вопрос 3, базовый уровень), 100 у. е. — содержание липида на его характерной мембране. Головная группа показана схемой, без структурной формулы.

Фосфоинозитиды · шаг 16 из 30

Как киназы и фосфатазы меняют метку при созревании эндосомы

Метку на мембране синтезирует местная киназа, а удаляют местные фосфатазы или следующая киназа; её содержание — стационар синтеза и удаления. При созревании эндосомы одна метка сменяется другой: PI(4,5)P₂ ямки дефосфорилируется, на ранней эндосоме VPS34 заново синтезирует PI3P, затем PIKfyve превращает его в PI(3,5)P₂. Параллельно идёт отдельный процесс — смена Rab5 на Rab7: её запускают не липидкиназы, а GEF Rab7, комплекс MON1–CCZ1, который Rab5-GTP и PI3P привлекают к мембране.

Липидкиназы и липидфосфатазы сами локализованы на определённых мембранах, поэтому превращения идут не в объёме, а на конкретной мембране.
На ранней эндосоме VPS34 синтезирует PI3P; при созревании PIKfyve превращает его в PI(3,5)P₂.
Смена липидов сопровождается сменой малых ГТФаз (Rab5 на Rab7), но это отдельный процесс: Rab5-GTP привлекает MON1–CCZ1 — GEF Rab7, комплекс активирует Rab7 и вытесняет GEF Rab5, после чего меняется набор белков-эффекторов.

Фосфоинозитиды взаимопревращаются набором ферментов, каждый из которых фосфорилирует или дефосфорилирует определённое положение кольца. Метка непрерывно обновляется: PI3P исчезает с эндосом вскоре после подавления PI3K, потому что фосфатазы продолжают его удалять (Hammond и Balla 2015). Содержание метки — стационарное неравновесное состояние между синтезом и удалением.

Наиболее полно описана смена метки при эндоцитозе (Wallroth и Haucke 2018; Posor 2022). Там, где формируется клатриновая ямка, PI(4,5)P₂ служит платформой для сборки белков эндоцитоза; при отделении пузырька его дефосфорилируют 5-фосфатазы. На образующейся ранней эндосоме VPS34, связанная с Rab5, синтезирует PI3P. При созревании PIKfyve фосфорилирует PI3P с образованием PI(3,5)P₂, а Rab5 сменяется на Rab7; последнее — отдельный процесс, и его механизм описан ниже. Каждый шаг меняет набор белков, узнающих мембрану, поэтому смена метки — один из механизмов созревания компартмента (Huotari и Helenius 2011).

Смену липидов и смену Rab нельзя отождествлять. PI3P в PI(3,5)P₂ превращает липидкиназа PIKfyve, но Rab5 в Rab7 она не превращает: это две разные ГТФазы со своими регуляторами — GEF, GAP и шапероном GDI. Смену ГТФаз называют Rab-конверсией, и её основные звенья известны (Poteryaev 2010; Langemeyer 2020). На ранней эндосоме Rab5-GTP привлекает VPS34, и мембрана обогащается PI3P; сам Rab5 удерживается в активной форме положительной обратной связью с участием своего GEF — Rabex-5. Затем Rab5-GTP связывает комплекс MON1–CCZ1, а к мембране этот комплекс привлекают и отрицательно заряженные липиды, в том числе PI3P. MON1–CCZ1 — GEF Rab7 (Nordmann 2010), а не липидкиназа: он не изменяет PI3P, а ускоряет замену GDP на GTP у Rab7, который приходит из цитозоля в комплексе с GDI. Rab7-GTP закрепляется на мембране и связывает свои эффекторы. Кроме того, MON1 (у C. elegans — SAND-1) вытесняет Rabex-5 с мембраны и тем самым разрывает положительную обратную связь, поддерживавшую Rab5 (Poteryaev 2010). В итоге Rab5-положительная ранняя эндосома переходит в Rab7-положительную позднюю.

Доказательства здесь неоднородны. Вытеснение Rabex-5 комплексом SAND-1/MON1 показано на клетках-целомоцитах Caenorhabditis elegans (Poteryaev 2010), а GEF-активность MON1–CCZ1 в отношении Rab7 установлена на дрожжах (Nordmann 2010). Прямая реконструкция выполнена на очищенных белках дрожжей и дрозофилы и на липосомах: мембранный Rab5-GTP оказался необходим и достаточен для активации Rab7 комплексом MON1–CCZ1; заряженные липиды, включая PI3P, помогают посадке комплекса, но без Rab5 не обеспечивают его GEF-активности, а выраженной избирательности к головной группе фосфоинозитида не выявлено (Langemeyer 2020). Для млекопитающих тот же механизм предполагается по гомологии. Неупорядоченный N-концевой домен MON1 подавляет Rab5-зависимую GEF-активность комплекса на мембране; участок связывания Rab5 найден моделированием, и мутации в нём ослабляют активность (Borchers 2023). Какие белки завершают выключение Rab5 — по рабочей модели, GAP Rab5 и шаперон GDI, — в этих работах предположено, но не показано; как включение Rab7 согласовано с выключением Rab5, остаётся открытым вопросом (Langemeyer 2020). Наконец, смена Rab — лишь часть созревания: одновременно меняются кислотность просвета, сортировка груза, слияние и отпочкование мембран (Huotari и Helenius 2011).

Из того, что метки связаны цепочкой превращений, следует важное для эксперимента правило. Подавление VPS34 снижает не только PI3P, но и PI(3,5)P₂: субстрата для PIKfyve становится мало. Подавление PIKfyve апилимодом (Cai 2013) снижает PI(3,5)P₂; в модели практикума PI3P на поздней эндосоме при этом накапливается, потому что перестаёт превращаться.

На схеме показаны три стадии и содержания меток по модели практикума; числа условны, последовательность событий — по обзорам.

Типичная ошибка Метку достаточно поставить один раз: липид остаётся на мембране, пока его не израсходуют.

Фосфоинозитид непрерывно синтезируется и удаляется; при подавлении киназы фосфатазы за минуты снижают его содержание, и мембрана теряет признак.

Эндосома созревает: PI3P превращается в PI(3,5)P₂, а Rab5 сменяется на Rab7. Как изменится связывание EEA1, который узнаёт PI3P и Rab5-GTP, с этой эндосомой?

А. Сохранится: связавшийся белок не следит за меткой (неверный вариант)
Связывание домена с липидом обратимо: когда PI3P превращается, а Rab5 сменяется на Rab7, EEA1 диссоциирует от мембраны.
Б. Ослабнет: исчезают оба признака, которые он узнаёт (верный вариант)
PI3P превращается в PI(3,5)P₂, а Rab5 сменяется на Rab7. EEA1 теряет оба признака и диссоциирует от мембраны; так смена метки меняет набор белков на созревающей эндосоме.
В. Усилится: PI(3,5)P₂ тоже фосфорилирован в положении 3 (неверный вариант)
Домен FYVE избирательно связывает PI3P; второй фосфат в положении 5 меняет головную группу, и PI(3,5)P₂ им не узнаётся.

Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →

Источники и условия научного вывода

Последовательность смены меток (PI(4,5)P₂ ямки; PI3P ранней эндосомы, синтезированный заново киназой VPS34; PI(3,5)P₂ поздней эндосомы) и смена Rab5 на Rab7 — обзоры Huotari и Helenius 2011, Wallroth и Haucke 2018, Posor 2022 (клетки млекопитающих). Быстрое исчезновение сенсоров PI3P после подавления PI3K — обзор Hammond и Balla 2015. Апилимод как ингибитор PIKfyve — Cai 2013. Содержания меток на схеме — учебная модель практикума (ингибитор VPS34 — 10 % активности, апилимод — 5 % активности PIKfyve); накопление PI3P при подавлении PIKfyve — следствие модели. Механизм Rab-конверсии: вытеснение RABX-5 белком SAND-1/MON1 — целомоциты C. elegans (Poteryaev 2010, по реферату); MON1–CCZ1 как GEF Ypt7 — дрожжи, очищенные белки и вакуоли (Nordmann 2010, по реферату); реконструкция на липосомах с белками дрожжей и дрозофилы и регуляция казеинкиназой Yck3 у дрожжей (Langemeyer 2020); автоингибирование MON1 и участок связывания Rab5 — дрожжи, нефроциты дрозофилы, моделирование (Borchers 2023, по реферату). Участие GAP Rab5 и GDI в завершении цикла Rab5 — рабочая модель, а не результат опыта; результаты реконструкции не переносятся автоматически на клетки млекопитающих.

Фосфоинозитиды · шаг 17 из 30

Чем белки узнают фосфоинозитиды и почему одного домена мало

Метку считывают белковые модули — домены PH, PX, FYVE, ENTH/ANTH, C2 — которые обратимо связываются с головной группой липида. Сродство отдельного домена обычно умеренное, поэтому один домен редко даёт надёжную адресацию.

Периферическое связывание: белок удерживается на поверхности мембраны электростатически и частично погружёнными гидрофобными участками, а не встроен в бислой.
У доменов PH, PX, FYVE, ENTH/ANTH и C2 свои лиганды; константы диссоциации — в микромолярном диапазоне.
При таком сродстве домен частично связывается и с «неправильными» мембранами и чувствителен к колебаниям концентрации липида.

Белок узнаёт метку доменом, связывающим фосфорилированную головную группу. Связывание обратимо: при смене метки белок диссоциирует от мембраны. PH-домены связывают PI(4,5)P₂, PI(3,4,5)P₃ или PI4P (PLCδ1, AKT, OSBP); PX-домены сортирующих нексинов и FYVE-домены EEA1 и HRS — PI3P на ранних эндосомах; ENTH- и ANTH-домены эпсина и AP180 — PI(4,5)P₂ в эндоцитозной ямке; C2-домены синаптотагмина и PKC — кислые липиды при участии Ca²⁺.

Многое определяет соотношение сродства домена и концентрации липида. PH-домен PLCδ1 связывает PI(4,5)P₂ с константой диссоциации около 2 мкМ, а концентрация доступного PI(4,5)P₂ в клетке оценивается примерно в 10 мкМ; поэтому с мембраной связана большая часть сенсора, по оценке 50–90 %, но не весь (Hammond и Balla 2015). У многих PH-доменов избирательность к одному фосфоинозитиду невысока, и для связывания с мембраной им нужен второй признак, например малая ГТФаза.

Отсюда следует экспериментальная трудность: сенсор на основе одного домена показывает не распределение липида, а места, где липид сочетается с подходящими условиями. Точность адресации достигается не повышением сродства одного домена, а требованием двух признаков одновременно — это тема шага «Что даёт и чего не даёт коинцидентное узнавание».

Типичная ошибка Чем выше сродство домена к липиду, тем точнее белок находит свою мембрану.

Сродство одиночных доменов умеренное, и один липид есть в нескольких мембранах; избирательность адресации даёт совпадение нескольких признаков, а не сила одного контакта.

PH-домен PLCδ1 связывает PI(4,5)P₂ с Kd около 2 мкМ, а доступный PI(4,5)P₂ в клетке оценивают примерно в 10 мкМ. Какая доля сенсора будет связана с плазматической мембраной?

А. Практически весь сенсор (неверный вариант)
Концентрация лиганда всего в несколько раз выше Kd, поэтому часть сенсора остаётся в цитозоле; полного связывания при таком сродстве нет.
Б. Меньшая часть сенсора (неверный вариант)
При концентрации лиганда выше Kd занятость больше половины; меньшая часть была бы связана при концентрации ниже Kd.
В. Большая часть, но не весь (верный вариант)
При концентрации лиганда в несколько раз выше Kd связана большая часть сенсора — по оценке Hammond и Balla, от 50 до 90 %, — но не весь.

Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →

Источники и условия научного вывода

Домены и их лиганды — обзор Hammond и Balla 2015. Kd PH-домена PLCδ1 около 2 мкМ, оценка доступного PI(4,5)P₂ около 10 мкМ (от 4 до 17 мкМ в разных клетках) и доля связанного сенсора 50–90 % — оценки из того же обзора. Схема — таблица, без расчёта.

Фосфоинозитиды · шаг 18 из 30

Что даёт и чего не даёт коинцидентное узнавание

Коинцидентное узнавание — узнавание по совпадению двух и более признаков: белок прочно связывается с мембраной, когда совпадают независимые признаки, например PI3P и Rab5-GTP у EEA1 в модели практикума. В простейшей модели независимых сайтов доля связанного белка равна произведению занятостей f = fA·fB: это даёт избирательность и авидность, но не порог.

Коинцидентное узнавание: каждый признак сам по себе даёт слабое связывание, их совпадение — прочное.
EEA1 связывается доменом FYVE с PI3P и соседним участком с Rab5-GTP; при подавлении PI3K EEA1 диссоциирует от эндосом.
При постоянной занятости второго сайта зависимость f от первого признака остаётся гиперболой с коэффициентом Хилла 1.

Классический пример — EEA1, необходимый для слияния ранних эндосом. Он связывается с PI3P доменом FYVE, а с GTP-связанным Rab5 — участком, примыкающим к домену (Lawe 2000). По данным Simonsen 1998, связь EEA1 с эндосомой требовала и Rab5-GTP, и активности PI3K. Так возникло представление, что белок собирается там, где совпадают липидная метка компартмента и активное состояние ГТФазы (Carlton и Cullen 2005).

Количественную сторону легко преувеличить. Пусть два сайта связывают свои признаки независимо, а прочное удержание требует обоих. Тогда доля прочно связанного белка f = fA·fB. На мембране, где есть только один признак, произведение мало — это избирательность. Энергии двух контактов складываются, поэтому при совпадении признаков связывание прочнее — это авидность. Резкого порога произведение не даёт: при постоянном fB зависимость f от содержания PI3P остаётся гиперболой с меньшей высотой.

Поэтому совпадение признаков, кооперативность, сверхчувствительность и бистабильность — разные свойства. Кооперативность означает, что связывание одного признака повышает сродство к другому. Резкость ответа требует кооперативности или многоступенчатых механизмов, а два устойчивых состояния — ещё и положительной обратной связи. Резкая граница домена в микроскопе указывает на такие дополнительные механизмы, а не на сам факт совпадения признаков.

Реальные данные согласуются с произведением лишь качественно. Избыток Rab5-GTP сохранял EEA1 на мембране и при подавленной PI3K (Simonsen 1998); в модели это возмещение частичное. Мутанты EEA1, не связывающие Rab5 C-концевым участком, локализовались на эндосомах так же, как белок дикого типа (Lawe 2002): для посадки EEA1 решающим оказался PI3P, а связывание Rab5, по-видимому, регулирует последующее слияние эндосом. Модель f = fA·fB — упрощение: она показывает логику коинцидентного узнавания, а не реальное соотношение двух признаков. На схеме — учебная модель практикума.

Типичная ошибка Логическое И на мембране работает как переключатель с порогом: ниже порогового PI3P EEA1 не связывается, выше — связывается полностью.

Для независимых сайтов f = fA·fB, и по каждому признаку кривая остаётся гиперболой без порога; порог и бистабильность требуют кооперативности и обратной связи.

В модели практикума EEA1 прочно связывается с эндосомой только при совпадении PI3P и Rab5-GTP, а сайты связывают их независимо. Чего такое узнавание само по себе не даёт?

А. Избирательности к мембране, где есть оба признака (неверный вариант)
Избирательность — как раз главный результат: на мембране с одним признаком произведение занятостей мало.
Б. Резкого порога по содержанию PI3P (верный вариант)
При постоянной занятости сайта Rab5 доля связанного EEA1 зависит от PI3P гиперболически, с коэффициентом Хилла 1; порог требует кооперативности или других механизмов.
В. Более прочного связывания при совпадении признаков (неверный вариант)
Энергии двух контактов складываются, и связывание при совпадении признаков прочнее, чем по одному из них, — это авидность.

Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →

Источники и условия научного вывода

Simonsen 1998 — клетки млекопитающих (в том числе HeLa), вортманнин, избыток Rab5-GTP; Lawe 2000 и 2002 — клетки COS, микроинъекция и экспрессия фрагментов и мутантов EEA1. Модель f = fA·fB (упрощение), KA = 40 у. е. PI3P, занятость Rab5-GTP 0,5 (дикий тип), 0,08 (S34N) и 0,95 (Q79L) — учебная модель практикума (вопрос 3, продвинутый уровень). Кооперативная кривая (коэффициент Хилла 4) нарисована только для сравнения.

Фосфоинозитиды · шаг 19 из 30

Как доказать, что метка — причина, а не только признак

Маркер — признак, по которому исследователь узнаёт мембрану; причинный детерминант — признак, от которого зависят её свойства. Причинность доказывают вмешательством: липид быстро удаляют из одной мембраны и смотрят, что изменится.

Рапамицин сближает FKBP и FRB: фосфатаза, слитая с FKBP, за минуты переносится на мембрану с закреплённым FRB.
Удаление одного PI(4,5)P₂ освобождает PH-PLCδ1, но почти не снимает полиосновные белки; удаление одного PI4P не меняет PI(4,5)P₂.
Полиосновные белки диссоциируют от плазматической мембраны только при удалении обоих липидов.

Совпадение белка и липида на одной мембране — корреляция. Утверждение о причинном детерминанте требует вмешательства: липид удаляют и проверяют, меняется ли поведение мембраны. Удаление показывает необходимость; перенос фермента на чужую мембрану проверяет достаточность.

В экспериментах Hammond 2012 в клетках COS-7 FRB закрепили на плазматической мембране, а фосфатазы слили с FKBP. Рапамицин за минуты переносил на мембрану домен 5-фосфатазы INPP5E (PI(4,5)P₂ → PI4P), химеру «псевдоянин» из INPP5E и 4-фосфатазы Sac1 (удаляет оба липида), её вариант PJ-Sac с инактивированным доменом INPP5E (PI4P → PI) или вариант PJ-Dead с обоими инактивированными доменами. 5-фосфатаза снижала PI(4,5)P₂ и немного повышала PI4P, и сенсор PH-PLCδ1 переходил в цитозоль. PJ-Sac удаляла PI4P, но PI(4,5)P₂ и его сенсоры оставались прежними: основная часть PI4P этой мембраны не нужна для поддержания PI(4,5)P₂ в стационаре. Авторы предложили два объяснения: PIP5K сразу использует вновь синтезированный PI4P, или PI4P поступает из других мембран. Полиосновные зонды MARCKS-ED и хвост Rit1 диссоциировали от мембраны, только когда псевдоянин удалял оба липида; пренилированный хвост K-Ras при этом оставался на мембране, но переставал на ней обогащаться. PI4P Гольджи псевдоянин не затрагивал.

Вывод авторов: PI4P и PI(4,5)P₂ — необходимые, но независимые признаки плазматической мембраны; для удержания полиосновных белков они взаимозаменяемы, и в этом смысле PI4P — не только предшественник. Встроенные контроли — эксперимент без рапамицина и неактивная фосфатаза — показывают, что эффект даёт именно ферментативная активность на мембране.

Типичная ошибка Если белок и липид находятся на одной мембране, липид определяет локализацию белка.

Колокализация — корреляция; причинность показывает вмешательство. В эксперименте Hammond 2012 удаление PI(4,5)P₂ сняло PH-PLCδ1, но не полиосновные белки: их удерживал и PI4P.

Химеру PJ-Sac (активен только домен 4-фосфатазы Sac1) рапамицином перенесли на плазматическую мембрану: PI4P исчез, а PI(4,5)P₂ и его сенсоры остались прежними. Какой вывод следует из этого эксперимента?

А. PI(4,5)P₂ синтезируется без участия PI-4-киназ (неверный вариант)
Ингибитор PI-4-киназ фениларсиноксид мешал восстановлению PI(4,5)P₂ (Hammond 2012); эксперимент с PJ-Sac говорит о запасе PI4P в мембране, а не о ферментах синтеза.
Б. Большая часть PI4P мембраны не нужна для PI(4,5)P₂ (верный вариант)
PI4P удалили, а PI(4,5)P₂ сохранился: PIP5K, вероятно, сразу использует вновь синтезированный PI4P, или PI4P поступает из других мембран (Hammond 2012). Значит, большая часть PI4P мембраны выполняет другую функцию.
В. PI4P в плазматической мембране отсутствует (неверный вариант)
PI4P там есть: его содержание снижалось именно после переноса PJ-Sac, а сенсор P4M показывает пул PI4P плазматической мембраны.

Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →

Источники и условия научного вывода

Hammond 2012: клетки COS-7; рапамицин-индуцируемый перенос на плазматическую мембрану химер FKBP с доменом INPP5E, с псевдоянином (INPP5E и Sac1), с PJ-Sac (активен только домен Sac1) или с PJ-Dead; окрашивание PI4P и PI(4,5)P₂, флуоресцентные зонды, наблюдение в течение минут. Схема и таблица — качественные данные статьи, без чисел. Строка «PI4P аппарата Гольджи» проверена авторами для псевдоянина.

Фосфоинозитиды · шаг 20 из 30

Как сигнальные фосфоинозитиды связаны с AKT, лизосомным Ca²⁺ и болезнями

PI(3,4,5)P₃ — кратковременный сигнал рецептора: его синтезирует PI3K класса I, а удаляют PTEN и SHIP; пока он есть, на плазматической мембране удерживаются AKT и другие белки, PH-домены которых связывают PI(3,4,5)P₃. PI(3,5)P₂ прямо активирует лизосомный канал TRPML1; мутации генов ферментов обмена фосфоинозитидов связаны с болезнями.

PI3K класса I после фактора роста превращает PI(4,5)P₂ в PI(3,4,5)P₃; PTEN дефосфорилирует его до PI(4,5)P₂, SHIP — до PI(3,4)P₂.
Без PTEN PI(3,4,5)P₃ накапливается даже без стимула, и AKT дольше удерживается на мембране.
PI(3,5)P₂ связывается с каналом TRPML1 и открывает его; при дефиците PI(3,5)P₂ поздние эндосомы и лизосомы увеличиваются.

PI(3,4,5)P₃ в покоящейся клетке почти нет. После связывания фактора роста рецептор активирует PI3K класса I, которая фосфорилирует PI(4,5)P₂ в положении 3. PTEN отщепляет этот фосфат (Maehama и Dixon 1998), SHIP — фосфат в положении 5. Пока PI(3,4,5)P₃ есть в мембране, с ней связываются белки, PH-домены которых узнают этот липид, в том числе киназа AKT. Утрата PTEN повышает содержание PI(3,4,5)P₃ и без стимула: в экспериментах Maehama и Dixon неактивный мутант PTEN вызывал накопление PI(3,4,5)P₃ без инсулина.

PI(3,5)P₂ поздних эндосом и лизосом связывается с каналом TRPML1 и открывает его; через канал Ca²⁺ выходит из лизосомы. В фибробластах мыши с дефицитом PI(3,5)P₂ эндолизосомы увеличивались, а повышенная экспрессия TRPML1 уменьшала этот фенотип (Dong 2010). Синтез липида киназой PIKfyve тем самым управляет местным кальциевым сигналом лизосомы.

Мутации генов ферментов обмена фосфоинозитидов вызывают болезни или связаны с ними, и вид связи нужно называть точно. Наследственные мутации PTEN вызывают синдром Каудена (Liaw 1997), соматическая утрата PTEN часта в опухолях. Активирующие соматические мутации PIK3CA часто находят в опухолях человека (Samuels 2004). Мутации FIG4 вызывают болезнь Шарко — Мари — Тута типа 4J (Chow 2007). Мутации 5-фосфатазы OCRL вызывают синдром Лоу (Attree 1992), мутации INPP5E — синдром Жубера (Bielas 2009). Общий признак — нарушение местного баланса синтеза и удаления метки: при мутациях PTEN и PIK3CA избыточен сигнал PI3K — AKT, при мутациях FIG4, OCRL и INPP5E нарушаются созревание мембран, транспорт и функция ресничек.

Типичная ошибка PTEN нужна только после стимула: без фактора роста её утрата ничего не меняет.

PTEN работает и в покое, уравновешивая базальную активность PI3K; без неё PI(3,4,5)P₃ накапливается и без стимула.

В клетках подавили PIKfyve, и содержание PI(3,5)P₂ на лизосомах снизилось. Как изменится активность канала TRPML1 в лизосомах?

А. Снизится: канал теряет активирующий липид (верный вариант)
PI(3,5)P₂ прямо связывается с TRPML1 и открывает его; при дефиците липида канал реже открыт, и выход Ca²⁺ из лизосомы уменьшается (Dong 2010).
Б. Не изменится: канал регулируется только Ca²⁺ (неверный вариант)
Активность TRPML1 зависит от фосфоинозитида мембраны: PI(3,5)P₂ связывается с каналом и активирует его (Dong 2010).
В. Возрастёт: накапливается PI3P (неверный вариант)
Активатором TRPML1 служит PI(3,5)P₂, а не его предшественник PI3P; избыток PI3P не возмещает потерю PI(3,5)P₂.

Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →

Источники и условия научного вывода

Maehama и Dixon 1998 — клетки HEK293, инсулин, неактивный мутант PTEN C124S, рекомбинантный фермент. Dong 2010 — ток канала TRPML1 через мембрану эндолизосом, фибробласты мыши с дефицитом PI(3,5)P₂, дрожжи. Связи с болезнями — Liaw 1997 (синдром Каудена, наследственные мутации), Samuels 2004 (соматические мутации PIK3CA в опухолях), Chow 2007 (FIG4, CMT4J), Attree 1992 (OCRL, синдром Лоу), Bielas 2009 (INPP5E, синдром Жубера). Содержания PI(3,4,5)P₃ и PI(3,5)P₂ и занятость PH-AKT на схеме — учебная модель практикума. Лечебных выводов шаг не делает.

Фосфоинозитиды · шаг 21 из 30

Что показывают методы изучения фосфоинозитидов и где их пределы

Сенсор на основе домена показывает доступный ему липид в местах, где выполнены его условия связывания; липидомика измеряет количество, но теряет локализацию. Необходимость липида показывает только вмешательство — быстрое удаление его из выбранной мембраны.

Сенсор на основе липид-связывающего домена связывает часть свободного липида и конкурирует с собственными белками клетки; при сильной экспрессии он может подавлять процесс.
Сенсору может быть нужен второй признак (PH-FAPP1 — Arf1-GTP), а липид, связанный с эффекторами, сенсору не виден.
Масс-спектрометрия экстракта не различает мембраны; региоизомеры одной массы по одной массе иона не различить — для этого применяют предварительное разделение, например хроматографическое.

Генетически кодируемый биосенсор фосфоинозитида — домен, слитый с флуоресцентным белком. Он сообщает о доле липида, которая свободна от собственных белков клетки и доступна ему (Hammond и Balla 2015). Избыточная экспрессия сенсоров PI(4,5)P₂ подавляла сигнализацию через фосфолипазу C и экзоцитоз. Сенсор с дополнительным требованием показывает не все пулы липида: PH-FAPP1 выделяет Гольджи, а P4M, которому достаточно PI4P, — ещё плазматическую мембрану и поздние эндосомы (Hammond 2014).

Надёжность сенсоров неодинакова. Сенсор PI(3,5)P₂ ML1N×2 (Li 2013) при проверке оказался малоизбирательным: его локализация во многом не зависела от синтеза PI(3,5)P₂ (Hammond 2015). Позже предложен белок SnxA (Vines 2023). Проверка сенсора включает удаление липида: если сигнал не исчезает, сенсор показывает что-то другое.

Липидомика измеряет количество фосфоинозитидов в экстракте и точна, но не даёт разрешения на уровне отдельной клетки и мембраны; разделение органелл трудоёмко и даёт артефакты (Hammond и Balla 2015). По одной массе иона региоизомеры, например PI(4,5)P₂ и PI(3,4)P₂, не различить. Методы с предварительным хроматографическим разделением — хиральной хроматографией (PRMC-MS; Morioka 2022) или сверхкритической флюидной хроматографией (Shimanaka 2022) — позволяют измерять их раздельно; исходную органеллу анализ общего экстракта при этом всё равно не устанавливает.

Ни сенсор, ни липидомика не доказывают, что липид нужен. Необходимость показывает вмешательство: фосфатазу за минуты переносят на выбранную мембрану (сближение FKBP–FRB) и смотрят, что изменится (шаг «Как доказать, что метка — причина»).

Типичная ошибка Яркость сенсора на мембране пропорциональна содержанию липида в ней.

Сенсор насыщается, конкурирует с собственными белками клетки и может требовать второго признака; он показывает доступный ему липид в местах, где выполнены условия связывания.

Липидомика без разделения региоизомеров показала, что общее количество фосфоинозитида с массой PIP₂ в клетках после воздействия не изменилось. Какой вывод корректен?

А. PI(4,5)P₂ в плазматической мембране не изменился (неверный вариант)
Экстракт всей клетки не различает мембраны: количество в одной мембране могло измениться за счёт другой.
Б. Воздействие не затронуло ферменты обмена фосфоинозитидов (неверный вариант)
Активность ферментов могла измениться, если синтез и удаление сместились одинаково или изменения в разных мембранах уравновесили друг друга.
В. Перераспределение липида между мембранами не исключено (верный вариант)
Анализ общего экстракта теряет локализацию, а без хроматографического разделения не различает PI(4,5)P₂ и PI(3,4)P₂ одной массы, поэтому постоянство общего количества не исключает перераспределения.

Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →

Источники и условия научного вывода

Свойства сенсоров и липидомики — обзор Hammond и Balla 2015; P4M и PH-FAPP1 — Hammond 2014 (клетки COS-7 и др.); ML1N×2 — Li 2013 и проверка Hammond 2015 (клетки COS-7, эмбриональные стволовые клетки мыши, фармакологическое и генетическое подавление синтеза PI(3,5)P₂); SnxA — Vines 2023 (Dictyostelium и клетки млекопитающих); региоизомеры в масс-спектрометрии — Hammond 2012; их раздельное измерение — Morioka 2022 (PRMC-MS: хиральная хроматография и масс-спектрометрия; ткани мыши и клеточные линии) и Shimanaka 2022 (сверхкритическая флюидная хроматография; ткани мыши и культуры клеток), прочитаны рефераты. Схемы методов — без чисел.

Контактные сайты · шаг 22 из 30

Что такое мембранный контактный сайт и чем он отличается от слияния

Мембранный контактный сайт — участок устойчивого сближения мембран двух органелл без их слияния. Характерное расстояние зависит от типа контакта; 10–30 нм — диапазон для контакта ЭПР — митохондрия, рассматриваемого здесь. В этом шаге разбираются три проверки — геометрия, удержание мембран и раздельность содержимого; каждую выполняют отдельным измерением, а функцию контакта измеряют ещё отдельно.

Контактный сайт — устойчивое сближение мембран двух органелл, которое удерживают тетеринг-белки; расстояние зависит от типа контакта.
Мембраны сохраняют целостность, содержимое компартментов не смешивается; этим контакт отличается от слияния.
Чаще всего партнёром в контакте оказывается ЭПР: его сеть трубочек и цистерн проходит через весь объём клетки.

Компартменты обмениваются веществом тремя способами. Участок мембраны с грузом отделяется в виде пузырька и сливается с мембраной-получателем; растворимый переносчик связывает молекулу в одном месте и отдаёт в другом; наконец, органеллы обмениваются веществом через сближенные мембраны без слияния. Третий путь и есть мембранный контактный сайт.

Группа исследователей контактов предложила описывать контакт по четырём признакам: удержанию мембран рядом, отсутствию слияния, особой функции и особому набору белков и липидов; одно расстояние контакт не определяет — верхнюю границу в разных работах задают от 10 до 80 нм (Scorrano 2019). В этом шаге разбираются три проверки. Первая — геометрия: в контакте ЭПР — митохондрия зазор порядка 10–30 нм достаточно мал, чтобы белок средних размеров перекрыл его, и достаточно велик, чтобы мембраны не сливались (слияние бислоёв происходит лишь при их сближении до 1–2 нм, для чего нужны специальные белки). Вторая — тетеринг-белки, удерживающие это расстояние: их удаление должно увеличивать зазор или уменьшать площадь контакта (хотя в большинстве контактов таких белков несколько, и удаление одного может не дать эффекта). Третья — раздельность содержимого: компартменты остаются разными, и именно это отличает контакт от слияния.

Контакты образуют почти все органеллы, но чаще других в них участвует ЭПР — с митохондриями, плазматической мембраной, эндосомами, лизосомами, пероксисомами, липидными каплями и аппаратом Гольджи (Wu 2018; Prinz 2020). По оценке Rizzuto 1998, в клетках HeLa с ЭПР сближено от 5 до 20 % поверхности митохондрий.

Признаки устанавливаются с разной полнотой, и вывод ограничен тем, что измерено. Если измерена площадь сближения, можно говорить о площади, но не о переносе вещества: для этого нужно отдельное измерение потока или зависящей от него функции (Calì 2025). Поэтому результат записывают не словами «контакт есть», а перечнем установленных признаков и методов.

Типичная ошибка В контакте мембраны органелл частично сливаются, чтобы передать вещество.

При контакте обе мембраны сохраняют целостность и содержимое не смешивается. Вещество переносят белки — переносчики липидов и каналы в зоне сближения; при слиянии же содержимое органелл объединяется.

ЭМ-томография показала, что мембраны ЭПР и митохондрии сближены на 15–20 нм, а маркеры просветов двух органелл не смешиваются. Какая из трёх проверок, разобранных в этом шаге, этими данными ещё не выполнена?

А. Удержание расстояния тетеринг-белками (верный вариант)
Расстояние и раздельность содержимого измерены. Чтобы выполнить третью проверку, нужно назвать белки, удерживающие зазор, удалить их и показать, что зазор растёт или площадь контакта уменьшается.
Б. Расстояние между мембранами органелл (неверный вариант)
Расстояние уже измерено томографией: 15–20 нм. Неизвестно другое — какие белки удерживают мембраны на этом расстоянии.
В. Раздельность содержимого органелл (неверный вариант)
Раздельность содержимого показали маркеры просветов: они не смешиваются. Не хватает данных о белках, удерживающих зазор.

Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →

Источники и условия научного вывода

Определение и признаки контакта — согласованные рекомендации группы авторов (Scorrano 2019, полный текст PMC: четыре признака, верхняя граница расстояния в разных работах 10–80 нм; Calì 2025, обзор). Доля поверхности митохондрий, сближенной с ЭПР (5–20 %), — оценка Rizzuto 1998 для живых клеток HeLa по трёхмерной флуоресцентной микроскопии (полный текст). Схема — схема механизма; расстояния не в масштабе.

Контактные сайты · шаг 23 из 30

Какие белки удерживают мембраны рядом и почему контакт динамичен

Тетеринг-белки одновременно связаны с мембранами двух органелл; многие из них не только удерживают контакт, но и переносят вещество. Роль белка в контакте доказывают удалением: должны измениться геометрия контакта и зависящая от него функция.

VAP-A и VAP-B на мембране ЭПР связывают мотив FFAT белков-партнёров, в том числе OSBP, и привязывают перенос липидов к месту контакта.
У дрожжей ЭПР с митохондрией связывает комплекс ERMES; у животных его нет, но белок ЭПР PDZD8 несёт SMP-домен, функционально соответствующий домену белка Mmm1 из ERMES (Hirabayashi 2017).
Контакт — равновесие образования и распада: число и площадь контактов меняются с условиями.

Тетеринг-белки одновременно связаны с мембранами двух органелл и удерживают их на определённом расстоянии, не вызывая слияния; их отличают от моторных адаптеров, перемещающих органеллы, и от белков слияния. Первый такой комплекс нашли у дрожжей: в генетическом скрининге клеток, которые выживали только при искусственной привязке ЭПР к митохондрии, выявили белки комплекса ERMES (Kornmann 2009). У животных комплекса ERMES нет, но белок ЭПР PDZD8 несёт SMP-домен, функционально соответствующий домену Mmm1 — одного из белков ERMES (Hirabayashi 2017).

Многие тетеринг-белки одновременно переносят вещество. Мотив FFAT, который связывают VAP-A и VAP-B, есть у OSBP, белков ORP и переносчика церамида CERT, поэтому пара VAP–FFAT удерживает контакт и привязывает к нему перенос липидов. E-Syt связывают ЭПР с плазматической мембраной; при подъёме Ca²⁺ зазор в контактах, образованных E-Syt1, сокращается (Fernández-Busnadiego 2015). После опустошения депо сенсор ЭПР STIM1 в контакте с плазматической мембраной связывается с каналом Orai1 и открывает депо-зависимый вход Ca²⁺ (Saheki 2017). В нейронах мыши без PDZD8 митохондрии хуже захватывали Ca²⁺, вышедший из ЭПР при синаптической стимуляции (Hirabayashi 2017).

Роль митофузина 2 долго оставалась спорной. По данным de Brito и Scorrano (2008), удаление MFN2 в фибробластах мыши и клетках HeLa ослабляло связь ЭПР с митохондриями и захват Ca²⁺; по данным Filadi 2015, удаление MFN2 в нескольких типах клеток, напротив, усиливало сближение органелл и перенос Ca²⁺. Расхождение связывают со способами оценки сближения и с изменением формы митохондрий без MFN2. В 2023 году описаны ЭПР-специфические варианты сплайсинга гена MFN2: ERMIT2 находится на границе ЭПР и митохондрии и, связываясь с митофузинами митохондрии, удерживает органеллы рядом, а ERMIN2 участвует в организации ЭПР (Naón 2023). Поэтому в экспериментах с MFN2 нужно различать варианты белка и способ вмешательства; связь болезни с нарушением контакта этим ещё не установлена.

Число и площадь контактов меняются при изменении метаболических условий, при стрессе ЭПР и по ходу клеточного цикла — за счёт количества тетеринг-белков, их фосфорилирования и протеолиза.

Типичная ошибка Любой белок, найденный в зоне контакта, удерживает этот контакт.

Локализация в зоне контакта ещё не доказывает удержания. Нужно удалить белок и показать, что зазор растёт или площадь уменьшается, и проверить, меняется ли функция, зависящая от контакта. История MFN2 показывает, что разные способы оценки могут дать противоположные ответы.

Две ранние работы (2008 и 2015 годов): после удаления митофузина 2 одна группа исследователей наблюдала ослабление связи ЭПР с митохондриями, другая — усиление. Какой вывод следует из этих двух работ?

А. MFN2 — доказанный тетеринг-белок этого контакта (неверный вариант)
В работе Filadi 2015 удаление MFN2 усиливало сближение органелл. Две работы дали противоположные результаты, поэтому по ним роль белка не установлена.
Б. Роль MFN2 по этим данным не установлена (верный вариант)
Результаты двух групп противоречат друг другу; расхождение связывают со способами оценки сближения и с изменением формы митохондрий без MFN2. Позже описан ЭПР-специфический вариант белка ERMIT2, который удерживает ЭПР у митохондрии (Naón 2023); это подтверждает участие продуктов гена MFN2 в удержании контакта, но причину расхождения двух ранних работ само по себе не объясняет.
В. MFN2 участвует только в слиянии митохондрий (неверный вариант)
MFN2 обнаружен и на мембране ЭПР, а его удаление в обеих работах меняло связь ЭПР с митохондриями — в разные стороны, но меняло.

Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →

Источники и условия научного вывода

ERMES — дрожжи Saccharomyces cerevisiae, синтетический скрининг (Kornmann 2009). PDZD8 — клетки HeLa и нейроны коры мыши (Hirabayashi 2017). E-Syt — криоэлектронная томография клеток COS-7 с избытком E-Syt (Fernández-Busnadiego 2015). STIM1–Orai1 и E-Syt — обзор Saheki и De Camilli 2017. MFN2: de Brito и Scorrano 2008 — фибробласты мыши и клетки HeLa; Filadi 2015 — несколько типов клеток, морфология и перенос Ca²⁺ (для обеих работ прочитаны рефераты); варианты ERMIT2 и ERMIN2 — клетки HeLa и печень мыши (Naón 2023, прочитан реферат). Таблица — сводка данных.

Контактные сайты · шаг 24 из 30

Как липид переносится через контакт против градиента

OSBP переносит холестерин из ЭПР в аппарат Гольджи в обмен на PI4P. Перенос сопряжён с обратным переносом PI4P и его гидролизом в ЭПР, а PI-4-киназа восстанавливает PI4P на Гольджи за счёт ATP.

OSBP связывается PH-доменом с PI4P транс-Гольджи и мотивом FFAT с VAP на ЭПР, а его домен ORD переносит липиды между мембранами.
За один цикл молекула холестерина переходит из ЭПР в Гольджи, а молекула PI4P — обратно; в ЭПР PI4P гидролизует фосфатаза SAC1.
PI4KIIIβ за счёт ATP создаёт контрградиент PI4P; сам OSBP ATP не гидролизует.

Большая часть липидов синтезируется в ЭПР, а нужны они всем мембранам; холестерина в транс-Гольджи и плазматической мембране намного больше, чем в ЭПР. Часть липидов доставляют пузырьки, но через контакты идёт и невезикулярный перенос: липид-транспортный белок извлекает молекулу липида из мембраны в гидрофобный карман и отдаёт её соседней мембране.

OSBP переносит холестерин против градиента благодаря обмену (Mesmin 2013). Белок связан одновременно с двумя мембранами, принимает холестерин в ЭПР и отдаёт его в Гольджи, а обратно переносит PI4P. В ЭПР PI4P гидролизует фосфатаза SAC1, поэтому его там мало; на Гольджи PI-4-киназа синтезирует PI4P заново, расходуя ATP. Так поддерживается контрградиент PI4P — постоянный перепад от Гольджи к ЭПР, который и движет обмен. Без синтеза PI4P перенос затухает, без стока в ЭПР обмен приближается к равновесию. Энергетически значим весь цикл: ATP расходуется при синтезе PI4P киназой, а сопряжённые обратный перенос PI4P и его гидролиз в ЭПР делают обмен направленным; по формулировке Mesmin 2013, гидролиз PI4P движет перенос стерола.

Масштаб цикла велик: по оценке Mesmin 2017, OSBP расходует около половины всего клеточного PI4P, и этот расход зависит от количества переносимого холестерина. В клетках RPE-1 ингибитор OSW-1 повышал сигнал PI4P в транс-Гольджи примерно в 5 раз, а холестерин накапливался в ЭПР и липидных каплях.

Тот же принцип используют родственные белки с другим грузом. ORP5 и ORP8 в контактах ЭПР с плазматической мембраной обменивают фосфатидилсерин на PI4P и обогащают плазматическую мембрану фосфатидилсерином (Chung 2015). CERT переносит церамид из ЭПР в аппарат Гольджи, где из него синтезируется сфингомиелин (Hanada 2003); с Гольджи CERT связывается через PI4P, но обмена на PI4P не выполняет.

Типичная ошибка Энергию для переноса холестерина даёт одна стадия цикла: либо синтез PI4P за счёт ATP, либо его гидролиз в ЭПР.

Энергетически значим весь цикл. PI-4-киназа восстанавливает PI4P на Гольджи за счёт ATP, OSBP переносит PI4P в ЭПР в обмен на холестерин, а SAC1 гидролизует его там; гидролиз делает обмен направленным (Mesmin 2013), синтез восполняет расходуемый PI4P. Без синтеза перенос затухает, без гидролиза обмен приближается к равновесию. Сам OSBP ATP не гидролизует.

Почему OSBP может переносить холестерин из ЭПР в аппарат Гольджи, где холестерина больше, хотя сам не гидролизует ATP?

А. Холестерин идёт по градиенту: в ЭПР его больше (неверный вариант)
В ЭПР холестерина меньше, чем в транс-Гольджи; перенос идёт против его градиента.
Б. OSBP гидролизует ATP в каждом цикле переноса (неверный вариант)
АТФазной активности у OSBP нет; ATP расходует PI-4-киназа, синтезирующая PI4P.
В. Перенос сопряжён с обратным переносом PI4P (верный вариант)
Обмен идёт один к одному: холестерин движется против своего градиента, PI4P — по своему. Перепад PI4P создаёт PI-4-киназа за счёт ATP и поддерживает SAC1, гидролизующая PI4P в ЭПР.

Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →

Источники и условия научного вывода

Четырёхстадийный цикл OSBP — реконструкция на липосомах и эксперименты на клетках HeLa (Mesmin 2013; прочитан реферат). Расход PI4P, действие OSW-1 (20 нМ) и 25-гидроксихолестерина — клетки RPE-1, зонд PI4P и масс-спектрометрия (Mesmin 2017; прочитаны реферат и изложение результатов). ORP5/ORP8 — клетки HeLa и фибробласты мыши (Chung 2015, полный текст). CERT — клетки яичника китайского хомячка LY-A (Hanada 2003, реферат). Числа схемы — учебная модель практикума (вопрос 4, продвинутый уровень); подавление SAC1 и VAP в модели неполное: остаточная активность SAC1 3 % и остаточное число мостиков VAP–OSBP 8 %; от этих допущений зависят числа 49 и 35 %.

Контактные сайты · шаг 25 из 30

Почему контакт с ЭПР ускоряет захват Ca²⁺ митохондрией

При открытии рецепторов IP₃ в зазоре контакта ЭПР — митохондрия возникает микродомен Ca²⁺ порядка 10 мкМ. Канал MCU с регулятором MICU1 открывается при концентрации Ca²⁺ выше примерно 1 мкМ, поэтому захват идёт прежде всего у контакта.

Ca²⁺ выходит из ЭПР через IP₃R в зазор, проходит наружную мембрану через VDAC и входит в матрикс через MCU по электрохимическому градиенту.
MICU1 удерживает MCU закрытым при низком Ca²⁺ и обеспечивает кооперативное открытие при высоком; отсюда кажущийся порог около 1 мкМ.
Ca²⁺ матрикса активирует дегидрогеназы цикла Кребса; работу по накоплению Ca²⁺ совершает дыхательная цепь, создавшая Δψ.

Рецепторы IP₃ есть и в зоне контакта ЭПР с митохондрией. Когда они открываются, Ca²⁺ из просвета ЭПР входит в узкий зазор и достигает митохондрии раньше, чем рассеется по цитозолю и свяжется с буферами. Так возникает микродомен: в клетках RBL-2H3 сенсор, закреплённый в зазоре, показал подъём Ca²⁺ в среднем около 9 мкМ, в части клеток — до 25 мкМ, и авторы считают эти значения нижней оценкой (Csordás 2010); по данным Giacomello 2010, у небольших участков поверхности митохондрий Ca²⁺ был в 5–10 раз выше, чем в остальном цитозоле.

Движущая сила для входа Ca²⁺ в матрикс велика при любой концентрации в цитозоле, и MCU — высокоселективный канал (Kirichok 2004). Однако захват ведёт себя так, будто у него низкое сродство к Ca²⁺. Причина — регулятор MICU1 (Csordás 2013): примерно до 0,5–1 мкМ он удерживает канал закрытым, выше обеспечивает крутое, кооперативное открытие. Без MICU1 порог снижается: митохондрии гепатоцитов мыши и клеток HeLa захватывали Ca²⁺ уже при 0,3–0,4 мкМ, а рост захвата с повышением Ca²⁺ был менее крутым.

Поэтому микродомен делает захват быстрым и избирательным по месту: митохондрия отвечает на выброс Ca²⁺ из ЭПР и почти не отвечает на небольшие подъёмы среднего уровня. Контакт не служит единственным условием входа: при подъёме Ca²⁺ во всём цитозоле выше порога MCU работает и вне контактов. Ca²⁺ матрикса активирует пируватдегидрогеназный комплекс, изоцитратдегидрогеназу и 2-оксоглутаратдегидрогеназу (Denton 2009) и тем связывает сигнал с окислением субстратов. Избыточный захват опасен: при искусственном сужении зазора митохондрии легче перегружались Ca²⁺ (Csordás 2006).

Типичная ошибка MCU — насос, который закачивает Ca²⁺ в матрикс против градиента.

MCU — канал: Ca²⁺ входит через него в матрикс по электрохимическому градиенту, потому что матрикс заряжен отрицательно. Накопление Ca²⁺ в матриксе выше цитозольного уровня обеспечивает дыхательная цепь, создавшая Δψ.

Свободный Ca²⁺ в матриксе стал выше, чем в цитозоле. Что совершило работу по его накоплению?

А. Дыхательная цепь, создавшая Δψ митохондрии (верный вариант)
Ca²⁺ входит через MCU по электрохимическому градиенту: отрицательный заряд матрикса перевешивает разность концентраций. Этот потенциал создаёт дыхательная цепь, перенося протоны из матрикса.
Б. Канал MCU, расходующий ATP на перенос (неверный вариант)
MCU — канал, ATP он не гидролизует; Ca²⁺ проходит через него только по электрохимическому градиенту.
В. Регулятор MICU1, связывающий ионы Ca²⁺ (неверный вариант)
MICU1 меняет вероятность открытия канала, но работы по переносу не совершает: связывание Ca²⁺ EF-мотивами — регуляция, а не перенос.

Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →

Источники и условия научного вывода

Ca²⁺ в зазоре: Csordás 2010 — клетки RBL-2H3, сенсор на индуцируемой привязке между ЭПР и митохондрией, стимуляция через рецепторы IP₃ (полный текст); Giacomello 2010 — культивируемые клетки человека, сенсор на наружной мембране митохондрии (прочитан реферат). MICU1: Csordás 2013 — гепатоциты мыши после подавления MICU1 in vivo и клетки HeLa (полный текст). Перегрузка при сужении зазора — клетки RBL-2H3 с искусственной привязкой (Csordás 2006, полный текст). Числа схемы — учебная модель практикума (вопрос 4, базовый уровень): Ca²⁺ в зазоре 15 мкМ, кривые захвата — уравнение Хилла. Ca²⁺ в матриксе рассчитан по условному балансу: 0,1 мкМ + 20 мкМ × скорость захвата (доля от максимальной); выведение Ca²⁺ из матрикса, буферирование и изменение Δψ отдельно не моделируются, поэтому это иллюстрация, а не прогноз концентрации в эксперименте.

Контактные сайты · шаг 26 из 30

Почему рост площади контакта не означает роста переноса

Контакт сокращает расстояние, но сам ничего не переносит: поток задают переносчики, движущая сила и буферы. О росте переноса при росте площади контакта можно судить, только если перенос измерен отдельно.

Поток через контакт ограничивает самая медленная стадия: синтез PI4P, его гидролиз в ЭПР, число и занятость переносчиков или каналов.
Если поток ограничен синтезом PI4P, дополнительные мостики VAP–OSBP почти не увеличивают перенос холестерина.
Слишком тесное сближение может мешать переносу; оптимальная ширина зазора — гипотеза, подтверждённая лишь отдельными экспериментами.

Сближение мембран меняет условия переноса, но не создаёт его. Поток через контакт определяется числом и занятостью переносчиков и каналов в зоне сближения, движущей силой, буферами и тем, насыщен ли принимающий компартмент. Из уменьшения расстояния не следует автоматически ни рост концентрации, ни ускорение переноса.

Модель цикла OSBP показывает это численно. На каждую перенесённую молекулу холестерина нужна молекула PI4P, синтезированная PI-4-киназой. Если вдвое увеличить число мостиков VAP–OSBP при прежней активности PI4KIIIβ и SAC1, перенос вырастет лишь на 9 %, а PI4P в Гольджи снизится: OSBP быстрее извлекает уже имеющийся PI4P. Удвоение синтеза PI4P, напротив, почти удваивает перенос. Заметно зависит от площади перенос лишь тогда, когда мостиков мало: при половинной площади он снижается до 86 %.

С геометрией связаны и ограничения другого рода. Слишком узкий зазор не вмещает крупные белковые комплексы. В клетках RBL-2H3 искусственные привязки разной длины меняли подъём Ca²⁺ в зазоре двухфазно: самые тесные контакты не были самыми эффективными (Csordás 2010). Предположение, что для каждого вида переноса существует оптимальная ширина зазора, систематически не проверено и остаётся гипотезой.

Отсюда правило чтения работ: сообщение об увеличении площади контактов при болезни или воздействии — ещё не сообщение об увеличении переноса (Calì 2025). Площадь может меняться и как следствие изменения обмена веществ.

Типичная ошибка Если площадь контакта выросла вдвое, перенос через контакт тоже вырос вдвое.

Поток задаёт самая медленная стадия: синтез PI4P, его гидролиз, число переносчиков или каналов, движущая сила. Если ограничивает не площадь, её рост почти не меняет перенос; перенос нужно измерить отдельно.

По данным ЭМ площадь контактов ЭПР — митохондрия в клетках после некоторого воздействия вдвое больше, чем в контроле. Что можно заключить о переносе Ca²⁺ в митохондрии?

А. Перенос Ca²⁺ вырос примерно вдвое (неверный вариант)
Пропорциональный рост предполагает, что поток ограничен площадью. Его могут ограничивать каналы, MICU1, выход Ca²⁺ из ЭПР или буферы.
Б. Без измерения переноса вывод сделать нельзя (верный вариант)
ЭМ измеряет геометрию. Чтобы судить о переносе, нужно при одинаковом стимуле измерить скорость захвата или Ca²⁺ в матриксе (Calì 2025).
В. Перенос Ca²⁺ снизился: тесный контакт мешает (неверный вариант)
Двухфазная зависимость от ширины зазора показана для отдельных конструкций; площадь не равна ширине, и без измерения вывод о снижении так же необоснован.

Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →

Источники и условия научного вывода

Зависимость переноса от площади — учебная модель практикума (вопрос 4, продвинутый уровень): «площадь» — число мостиков VAP–OSBP, «синтез вдвое выше» — учебное допущение. Двухфазная зависимость подъёма Ca²⁺ в зазоре от длины искусственной привязки — клетки RBL-2H3, Csordás 2010 (полный текст). Рекомендация отделять площадь от переноса — Calì 2025 (обзор, полный текст).

Контактные сайты · шаг 27 из 30

Что ещё координирует контакт и чем он не является

Контакты отмечают места деления митохондрий и сводят в одном месте синтез липидов, Ca²⁺-сигнал и энергетический обмен. Контакт не равен ни везикулярному транспорту, ни слиянию органелл, ни аутофагии.

Трубочка ЭПР охватывает митохондрию в месте будущего деления ещё до того, как туда привлекается Drp1.
Rab7, связанный с GTP, поддерживает контакт митохондрии с лизосомой; после гидролиза GTP на Rab7 контакт расходится.
При контакте целостность мембран сохраняется, содержимое не смешивается, партнёр не разрушается.

Место деления митохондрии часто задаёт контакт. В клетках дрожжей и млекопитающих митохондрия делилась там, где её охватывала трубочка ЭПР; сужение начиналось ещё до привлечения динамин-подобного белка Drp1 (Friedman 2011). Контакт с лизосомой тоже отмечает точку деления. Его образованию способствует Rab7, связанный с GTP, а расхождению — гидролиз GTP на Rab7; этот гидролиз стимулирует белок TBC1D15, который привлекается к митохондрии белком FIS1 (Wong 2018).

Контакт сводит в одном месте синтез липидов, Ca²⁺-сигнал и энергетический обмен, поэтому изменение числа, состава или геометрии контактов может менять несколько потоков одновременно. Какие из них изменились, устанавливают отдельными измерениями: если поток ограничивает другое звено, он может почти не измениться. Изменения контактов описаны при нейродегенеративных болезнях, нарушениях обмена и опухолевом росте, но площадь контакта может быть и причиной, и следствием изменения метаболизма; важно, измерена ли функция или только морфология.

Пример осторожного вывода — ген MFN2. Мутации в нём вызывают наследственную моторно-сенсорную нейропатию Шарко — Мари — Тута типа 2A (Züchner 2004). Белок участвует в слиянии митохондрий, а ЭПР-специфический вариант того же гена ERMIT2 удерживает ЭПР у митохондрии (Naón 2023). Продукты гена выполняют несколько функций, поэтому приписывать болезнь только нарушению контактов нет оснований.

Контакт легко спутать с тремя другими процессами. При везикулярном транспорте груз упакован в пузырёк, который сливается с мембраной-получателем. При слиянии органелл мембраны объединяются и содержимое смешивается. При аутофагии органелла-партнёр разрушается. При контакте мембраны сохраняются, содержимое не смешивается, а органелла-партнёр не разрушается.

Типичная ошибка Контакт митохондрии с лизосомой — начало её разрушения в лизосоме.

Контакты митохондрий с лизосомами образуются и в здоровых клетках и отличаются от поглощения повреждённых митохондрий: обе органеллы сохраняют целостность, а контакт расходится после гидролиза GTP на Rab7 (Wong 2018).

В клетках экспрессировали Rab7 Q67L — форму, которая связывает GTP, но почти не гидролизует его. Как изменится длительность контактов митохондрий с лизосомами?

А. Сократится: Rab7-GTP разрывает контакт (неверный вариант)
Rab7, связанный с GTP, способствует образованию контакта; разрыв требует гидролиза GTP.
Б. Не изменится: Rab7 влияет только на лизосому (неверный вариант)
Rab7 на лизосоме участвует в связи с митохондрией: от его состояния зависит, сколько длится контакт.
В. Увеличится: без гидролиза GTP он не расходится (верный вариант)
Контакт расходится после гидролиза GTP на Rab7; этот гидролиз стимулирует белок TBC1D15. В клетках с Rab7 Q67L контакты длились дольше, а митохондрии делились реже (Wong 2018).

Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →

Источники и условия научного вывода

Деление в месте контакта с ЭПР — дрожжи и клетки COS-7 (Friedman 2011, реферат). Контакты митохондрий с лизосомами, Rab7 Q67L и мутанты TBC1D15 — клетки HeLa и HCT116, прижизненная микроскопия и ЭМ (Wong 2018, полный текст). MFN2 и болезнь Шарко — Мари — Тута типа 2A — генетическое исследование семей (Züchner 2004). Таблица — сводка данных.

Контактные сайты · шаг 28 из 30

Как доказывают, что мембраны в контакте, а не слились

Каждый метод устанавливает свой признак контакта и имеет свои ограничения. Колокализация в обычном световом микроскопе контакт не доказывает, а репортёр из двух половин может сам стабилизировать контакт.

Обычный световой микроскоп разрешает около 200–250 нм в плоскости препарата и 500–700 нм по оси z — много больше зазора контакта, поэтому контакт, слияние и соседство в нём неразличимы.
Электронная томография измеряет зазор; FRET и BRET дают сигнал только при сближении донора и акцептора примерно до 10 нм.
Репортёр из двух половин накапливает сигнал от всех контактов за время экспрессии и может их стабилизировать; раздельность содержимого проверяют маркерами просветов.

Разрешение обычного светового микроскопа — около 200–250 нм в плоскости препарата и 500–700 нм по оси z (Scorrano 2019), а зазор контакта ЭПР — митохондрия — 10–30 нм. К тому же маркер находится не на самой поверхности мембраны. Поэтому перекрывание сигналов маркеров двух органелл одинаково выглядит при контакте, при слиянии и при простом соседстве: колокализация в обычном микроскопе не доказывает контакта и не даёт расстояния между мембранами.

Расстояние между мембранами измеряет электронная микроскопия, особенно томография, дающая трёхмерную картину зазора (Csordás 2006). Криоэлектронная томография обходится без химической фиксации: в клетках с избытком E-Syt зазор между ЭПР и плазматической мембраной составлял 19–22 нм (Fernández-Busnadiego 2015). ЭМ показывает геометрию в один момент, но не перенос.

Сигнал только при сближении дают FRET и BRET: при FRET возбуждённый донор безызлучательно передаёт энергию акцептору на расстоянии примерно до 10 нм, в BRET донором служит люцифераза. При комплементации расщеплённого флуоресцентного белка (split-GFP, SPLICS) половины, закреплённые на разных органеллах, при сближении собираются в целый белок. Сборка малообратима, поэтому репортёр накапливает сигнал от всех сближений за время экспрессии; версии SPLICS регистрировали узкие (8–10 нм) и широкие (40–50 нм) контакты ЭПР с митохондриями (Cieri 2018). При избыточной экспрессии такие репортёры способны стабилизировать контакты и увеличить измеряемую площадь (Filadi 2026).

От слияния контакт отличает раздельность содержимого: маркеры просветов двух органелл не смешиваются. Количественный вывод, полученный репортёром, подтверждают методом без искусственной привязки.

Типичная ошибка Чем ярче сигнал репортёра из двух половин, тем больше контактов было в клетке до измерения.

Сборка половин малообратима: репортёр накапливает сигнал от всех контактов за время экспрессии и при избытке может их стабилизировать. Сигнал отражает и саму конструкцию, поэтому вывод проверяют методом без искусственной привязки, например ЭМ.

FRET между донором на мембране ЭПР и акцептором на наружной мембране митохондрии вырос. Что показывает этот результат?

А. Мембраны двух органелл слились (неверный вариант)
FRET требует сближения донора и акцептора, но не слияния; о содержимом компартментов он ничего не говорит.
Б. Донор и акцептор сблизились примерно до 10 нм (верный вариант)
FRET возникает, когда донор и акцептор находятся на расстоянии около 10 нм и ближе. Это сближение конструкций; зазор между мембранами зависит ещё от их длины и ориентации.
В. Через контакт стало проходить больше Ca²⁺ (неверный вариант)
FRET регистрирует сближение, а не поток; перенос Ca²⁺ измеряют отдельно, например сенсором Ca²⁺ в матриксе.

Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →

Источники и условия научного вывода

Предел разрешения и сравнение методов — Scorrano 2019 (полный текст PMC: 250 нм в плоскости, 500–700 нм по оси z); обзоры Filadi 2026 и Calì 2025 (прочитаны рефераты). Электронная томография связей ЭПР — митохондрия — митохондрии печени крысы и клетки DT40 (Csordás 2006, полный текст). Криоэлектронная томография контактов E-Syt — клетки COS-7 (Fernández-Busnadiego 2015, реферат). SPLICS — клетки HeLa и HEK293, нейроны рыбки данио in vivo (Cieri 2018, полный текст). Схемы — схемы методов; расстояния не в масштабе.

Исследование · шаг 29 из 30

Как выбрать величину, метод и контроль

Для каждого механизма семинара сначала решают, какую величину измерять, затем — каким методом и с каким контролем. Во всех четырёх разделах одно и то же наблюдение совместимо с несколькими механизмами, и разделяют их только правильно выбранные величина и контроль.

Величина: pH и свободный Ca²⁺ в просвете органеллы, концентрация в точке и средняя по клетке, содержание метки на мембране, расстояние между мембранами и поток через контакт — разные измерения, и одно не заменяет другое.
Метод: адресованный ратиометрический сенсор с калибровкой, прижизненная съёмка с пространственным разрешением, сенсор на основе липид-связывающего домена, электронная томография и измерение переноса.
Контроль: удаление белка или метки показывает необходимость, а перенос фермента в новое место или искусственная привязка — достаточность; каждый инструмент проверяют на то, не меняет ли он сам измеряемую величину.

Каждый из четырёх механизмов описывается своей величиной. Для компартмента это pH, свободный Ca²⁺ или потенциал пары глутатиона в просвете конкретной органеллы; их измеряют сенсором, адресованным в эту органеллу, по отношению сигналов при двух длинах волн и с калибровкой в крайних точках. Для локальной концентрации нужна величина в точке, а не средняя: анализ лизата уничтожает именно ту пространственную информацию, которая определяет ответ.

Для липидного кода величина — содержание определённого фосфоинозитида на определённой мембране. Сенсор на основе одного домена показывает места, где липид сочетается с условиями связывания, и сам конкурирует с эндогенными эффекторами; липидомика даёт состав, но теряет локализацию. Причинность метки проверяют вмешательством: фосфатазу переносят на мембрану за минуты и смотрят, что меняется. Для контакта величины три: расстояние между мембранами (электронная томография), состав белков в зоне сближения и поток вещества, который измеряют отдельно.

Контроль отвечает на вопрос, который задаёт эксперимент. Удаление белка показывает, что без него процесс нарушается, но не то, что белок сам выполняет процесс. Достаточность проверяют добавлением: фермент переносят в новое место, мембраны соединяют искусственной привязкой. Наконец, у каждого инструмента есть собственное действие: сенсор буферирует лиганд, репортёр из двух половин стабилизирует контакт, ингибитор в высокой дозе действует и на другие мишени. Переключайте механизмы в таблице и сравнивайте строки «ограничение».

Типичная ошибка Если белок необходим для процесса, его достаточно, чтобы этот процесс шёл.

Удаление белка показывает только необходимость. Достаточность проверяют отдельным экспериментом: фермент переносят в новое место или мембраны соединяют искусственной привязкой и смотрят, возникает ли процесс.

После стимула общее содержание кальция в лизате клеток не изменилось. Какой вывод из этого измерения допустим?

А. О локальном сигнале по этому измерению судить нельзя (верный вариант)
Лизат даёт среднюю по клетке величину и общий, а не свободный кальций. Неизменное среднее совместимо и с отсутствием сигнала, и с локальным подъёмом в малом объёме, и с перераспределением между депо и цитозолем. Различить их можно только адресованным сенсором с разрешением во времени и пространстве.
Б. Сигнала Ca²⁺ в клетках не было (неверный вариант)
Отсутствие изменения среднего не доказывает отсутствия сигнала: 10⁴ ионов в объёме клетки прибавляют лишь около 17 нМ общего кальция, а в микродомене те же ионы дают около 170 мкМ.
В. Сигнал был, но кальций связали буферы (неверный вариант)
Этот вариант тоже делает вывод, которого измерение не поддерживает: общее содержание кальция не говорит ни о наличии сигнала, ни о том, какая часть ионов связана. Для такого заключения нужен отдельный эксперимент со свободным Ca²⁺.

Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →

Источники и условия научного вывода

Сводная таблица по шагам разделов 1–4; схемы методов показаны в шагах «Как измеряют pH и редокс-потенциал внутри органеллы», «Как измеряют градиенты в живой клетке и чем ограничены эти измерения», «Что показывают методы изучения фосфоинозитидов и где их пределы» и «Как доказывают, что мембраны в контакте, а не слились». Перенос фосфатазы на плазматическую мембрану рапамицином — Hammond 2012 (клетки COS-7); ограничения адресованных сенсоров — Lyons 2023; рекомендации к доказательству контакта — Calì 2025.

Исследование · шаг 30 из 30

Исследование одной лизосомы: кислый просвет, метка, кальций и контакты

Лизосома объединяет все четыре механизма семинара: насос поддерживает кислую среду просвета, мембрану размечает PI(3,5)P₂, выход Ca²⁺ через канал TRPML1 создаёт местный сигнал, а выход Ca²⁺ из ЭПР через IP₃R участвует в пополнении её запаса Ca²⁺ (путь в просвет лизосомы не установлен). Эксперимент Medina 2015 показывает, как отличить местный сигнал от общего подъёма Ca²⁺ во всём цитозоле.

Компартмент и метка: V-АТФаза поддерживает pH просвета 4,5–5,0, а PI(3,5)P₂ поздних эндосом и лизосом активирует Ca²⁺-канал TRPML1 (MCOLN1).
Местный сигнал: в клетках HeLa в солевом растворе без аминокислот и сыворотки (HBSS) Ca²⁺ выходит из лизосом через TRPML1, кальциневрин дефосфорилирует TFEB, и TFEB перемещается в ядро; экворин общего подъёма Ca²⁺ в объёме цитозоля при этом не обнаруживает.
Пополнение: выход Ca²⁺ из ЭПР через рецепторы IP₃ участвует в пополнении запаса Ca²⁺ лизосомы — блокада этих рецепторов прекращала пополнение. IP₃R находится в мембране ЭПР и не служит каналом через обе мембраны: в просвет лизосомы Ca²⁺ должен войти отдельным путём, который не установлен; участие тесного сближения органелл авторы предлагают как объяснение (Garrity 2016).

Лизосома удобна как итоговый пример, потому что в ней сходятся все четыре вопроса. Её просвет — неравновесный компартмент: V-АТФаза закачивает протоны и поддерживает pH 4,5–5,0, а свободного Ca²⁺ в просвете — сотни микромолей при концентрации около 100 нМ в цитозоле. Мембрану поздней эндосомы и лизосомы размечает PI(3,5)P₂, синтезируемый киназой PIKfyve; в экспериментах с изолированными лизосомами этот липид прямо активировал канал TRPML1 (Dong 2010). Так метка мембраны оказывается условием работы её канала.

Medina и соавторы (2015) искали фосфатазу, которая дефосфорилирует фактор транскрипции TFEB. Ею оказался кальциневрин — Ca²⁺-зависимая фосфатаза. В клетках HeLa в солевом растворе без аминокислот и сыворотки TFEB перемещался в ядро, хотя экворин в объёме цитозоля не регистрировал подъёма Ca²⁺. Сигнал зарегистрировал сенсор GCaMP3, присоединённый к самому TRPML1, то есть закреплённый на поверхности лизосомы. Перемещение TFEB подавляли быстрый буфер Ca²⁺ BAPTA (но не медленный EGTA) и подавление синтеза TRPML1. Такой набор результатов согласуется с микродоменом — тесным пространственно-временным сопряжением источника Ca²⁺ и мишени: ион связывается с ближайшей мишенью раньше, чем его перехватит медленный буфер или он разбавится в объёме цитозоля. Определённое расстояние из сравнения BAPTA и EGTA без кинетической модели не следует, тем более что одинаковые дозы BAPTA-AM и EGTA-AM не обязательно создают в клетке одинаковую буферную ёмкость.

Запас Ca²⁺ лизосомы ограничен, и после выброса он должен пополняться. Garrity и соавторы (2016) показали, что пополнение продолжалось при ингибиторе V-АТФазы, но прекращалось при опустошении ЭПР или блокаде рецепторов IP₃; авторы предположили, что Ca²⁺ поступает в местах тесного сближения ЭПР с лизосомой. Как Ca²⁺, вышедший из ЭПР, пересекает затем мембрану лизосомы, из этих экспериментов не следует; на схеме этот участок пути показан точками со знаком вопроса. Контакт лизосомы с митохондрией, в свою очередь, задаёт место деления митохондрии (Wong 2018). Переключайте условия на схеме и проследите, какое показание меняется в каждом эксперименте: pH просвета, сигнал у лизосомы, средняя концентрация Ca²⁺ в цитозоле или положение TFEB.

Типичная ошибка Если средняя концентрация Ca²⁺ в цитозоле не выросла, то и Ca²⁺-зависимые ферменты не активировались.

Фермент у источника отвечает на локальную концентрацию. В солевом растворе без аминокислот и сыворотки экворин в объёме цитозоля не регистрировал подъёма, а сенсор на поверхности лизосомы регистрировал, и кальциневрин дефосфорилировал TFEB; быстрый буфер BAPTA этот ответ подавлял, медленный EGTA — нет.

В клетках HeLa в растворе без аминокислот и сыворотки TFEB перемещается в ядро. Сенсор GCaMP3, присоединённый к каналу TRPML1, регистрирует сигнал у лизосомы, а экворин общего подъёма Ca²⁺ в цитозоле не обнаруживает; подавление синтеза TRPML1 уменьшает перемещение TFEB. BAPTA подавляет перемещение, EGTA — нет. Что следует из этих результатов?

А. Сигнал создаёт местный выброс Ca²⁺ у лизосомы (верный вариант)
Источник — лизосома: сигнал регистрирует сенсор на TRPML1, а подавление синтеза TRPML1 уменьшает перемещение TFEB. На местный характер сигнала указывают отсутствие общего подъёма по экворину и действие быстрого буфера BAPTA при отсутствии эффекта медленного EGTA.
Б. Перемещение TFEB не зависит от ионов Ca²⁺ (неверный вариант)
Против этого говорят условие — BAPTA подавляет перемещение — и другие эксперименты той же работы: ингибиторы кальциневрина и клетки без его регуляторной субъединицы уменьшали перемещение TFEB. Отсутствие общего подъёма Ca²⁺ по экворину не исключает местного сигнала.
В. Сигнал создаёт медленный подъём Ca²⁺ во всём цитозоле (неверный вариант)
Экворин общего подъёма Ca²⁺ в объёме цитозоля не обнаружил, а медленный буфер EGTA ответ не подавил. Оба результата согласуются с местным сигналом у лизосомы, а не с общим подъёмом.

Источники и условия научного вывода

Выход Ca²⁺ через TRPML1, кальциневрин и TFEB — клетки HeLa (также HEK293 и мышечные волокна мыши); среда — солевой раствор HBSS без аминокислот и сыворотки; Ca²⁺ в объёме цитозоля — экворин, у лизосомы — сенсор ML1-GCaMP3 (ратиометрическое измерение при 474 и 410 нм); BAPTA-AM 5–25 мкМ, EGTA-AM 5 мкМ (Medina 2015, полный текст); принцип сравнения быстрого и медленного буферов — Eggermann 2012; дозы BAPTA-AM и EGTA-AM в работе различались, и равенство их внутриклеточной буферной ёмкости не проверялось. В экспериментах с буферами и с подавлением TRPML1 сигнал сенсора и средний Ca²⁺ не измеряли — на схеме «нет данных». Активация TRPML1 липидом PI(3,5)P₂ — электрофизиология изолированных эндолизосом (Dong 2010). Пополнение запаса Ca²⁺ лизосом из ЭПР через рецепторы IP₃ — клетки HEK293 и фибробласты, повторный вызов выброса агонистом TRPML1 (Garrity 2016, по реферату). Уровни на схеме качественные («нет / низкий / средний / высокий»), числа pH и Ca²⁺ — порядки величины для покоящихся клеток млекопитающих.

Краткий словарь

Компартмент: Область клетки, отделённая от окружения границей — биологической мембраной или фазовой границей, — внутри которой набор физико-химических условий (pH, ионный состав, редокс-состояние, состав липидов и белков) отличается от условий в окружающем объёме. Компартмент задан не формой, а границей и набором условий, которые она удерживает. Различие бывает равновесным (избирательное распределение веществ) или неравновесным — тогда его поддерживает избирательный транспорт с затратой энергии.
Биологическая мембрана: Липидный бислой со встроенными и связанными с ним белками. Сам бислой почти непроницаем для ионов и полярных молекул и потому может удерживать различие концентраций, но не создаёт его; избирательный перенос через мембрану выполняют белки — насосы, каналы, переносчики и транслоказы.
Разность электрохимического потенциала (Δμ): Мера движущей силы переноса вещества через мембрану: Δμ = RT·ln(c₂/c₁) + zF·(ψ₂ − ψ₁), где первое слагаемое — химическая часть (разность концентраций), второе — электрическая (z — заряд иона, ψ — потенциал стороны). Если Δμ < 0, перенос со стороны 1 на сторону 2 самопроизволен и для него достаточно канала; если Δμ > 0, нужен насос или сопряжённый переносчик. Для иона «по градиенту» не всегда значит «в сторону меньшей концентрации».
Мембранный потенциал митохондрии (Δψ): Разность электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрии (около −150…−180 мВ; матрикс заряжен отрицательно), которую создаёт перенос протонов дыхательной цепью. Вместе с разностью pH составляет протон-движущую силу. Δψ — состояние мембраны, а не поток: нормальный Δψ сам по себе не доказывает работы дыхательной цепи. Оценивают по накоплению катионного зонда, например TMRM; протонофор FCCP снимает Δψ.
Свободная и общая концентрация: Свободная концентрация — концентрация вещества, не связанного с белками и другими лигандами; именно она определяет связывание с эффектором и движущую силу переноса. Общая концентрация — сумма свободной и связанной форм. Для Ca²⁺ они различаются во много раз: буферы связывают большую часть вошедших ионов, а в депо общий кальций намного выше свободного.
Локальная концентрация и микродомен: Локальная концентрация — концентрация вещества в том малом объёме, где идёт рассматриваемая реакция (просвет органеллы, область у устья канала, поверхность мембраны), в отличие от средней концентрации, отнесённой к объёму всей клетки. Микродомен — область от десятков нанометров до нескольких микрометров, где концентрация сигнального вещества или другой параметр устойчиво отличается от среднего по компартменту.
Стационарное неравновесное состояние: Состояние, которое не меняется во времени, потому что противоположные потоки равны (перенос насосом и утечка, синтез и удаление), а не потому, что процессы остановились. Оно поддерживается непрерывной затратой энергии и после остановки источника энергии релаксирует к равновесию; время релаксации у разных параметров различается на порядки.
Генетически кодируемый биосенсор: Белок, кодируемый введённым в клетку геном, у которого связывание лиганда или изменение измеряемого параметра (pH, Ca²⁺, потенциал пары глутатиона, cAMP, фосфоинозитид) меняет флуоресценцию. Сенсор можно адресовать в нужный компартмент и измерять величину там, где идёт событие. Сенсор входит в измеряемую систему: он связывает лиганд и потому буферирует его, а его динамический диапазон ограничен.
Фосфоинозитиды: Производные фосфатидилинозитола (PI), у которых инозитольное кольцо дополнительно фосфорилировано в положениях 3, 4 или 5 в разных сочетаниях (PI3P, PI4P, PI(3,5)P₂, PI(4,5)P₂, PI(3,4,5)P₃ и др.). Составляют малую долю мембранных фосфолипидов — заметно меньшую, чем сам фосфатидилинозитол, — но служат одним из основных признаков, по которым белки узнают мембрану того или иного компартмента; их взаимопревращают локализованные липидкиназы и липидфосфатазы.
Насос (первично-активный переносчик): Мембранный белок, переносящий вещество против его электрохимического градиента за счёт непосредственного сопряжения с источником энергии — гидролизом ATP (V-АТФаза, SERCA, Na⁺/K⁺-АТФаза) или переносом электронов (комплексы дыхательной цепи). Создаёт различие между компартментами; при остановке насоса различие постепенно рассеивается утечкой.
Канал: Мембранный белок, через пору которого ион проходит только по электрохимическому градиенту (Δμ < 0). Канал не создаёт различие, а расходует его — для передачи сигнала (рецептор IP₃, MCU) или для возврата к исходному состоянию. Избирательность канала определяет, какой ион пройдёт, но не направление переноса.
Сопряжённый переносчик (вторично-активный транспорт): Переносчик, перемещающий вещество против его градиента за счёт энергии градиента другого вещества, созданного насосом: симпортеры и антипортеры, например Na⁺/Ca²⁺-обменник плазматической мембраны. Сам ATP не гидролизует.
Транслоказы TOM и TIM23; MTS: Белковые комплексы наружной (TOM) и внутренней (TIM23) мембран митохондрии, переносящие в матрикс белки, синтезированные в цитозоле. Сигналом служит N-концевая адресующая последовательность (MTS) — положительно заряженный пептид, который отщепляется после импорта. Перенос MTS через TIM23 требует Δψ, а не всей протон-движущей силы.
Протон-движущая сила: Энергия, запасённая в градиенте протонов на внутренней мембране митохондрии: сумма электрической части (Δψ) и химической (разность pH между матриксом и межмембранным пространством). Используется ATP-синтазой и рядом переносчиков; Δψ отдельно движет импорт через TIM23 и вход Ca²⁺ через MCU.
Деполяризация митохондрии: Снижение абсолютной величины Δψ (матрикс становится менее отрицательным), а не изменение формы органеллы. Последствия зависят от величины и длительности снижения и от причины: протонофор, остановка дыхания, открытие пор во внутренней мембране.
Потенциал пары глутатиона E(GSH/GSSG): Фактический окислительно-восстановительный потенциал пары 2GSH/GSSG в компартменте: E = E°′ − (RT/2F)·ln([GSH]²/[GSSG]). Отличается от стандартного потенциала E°′ (около −240 мВ при pH 7,0) и зависит от отношения GSH:GSSG, от абсолютной концентрации GSH, от pH и температуры. Описывает только пару глутатиона: другие редокс-пары того же компартмента не обязаны быть с ней в равновесии.
Кислые гидролазы; катепсины: Ферменты просвета лизосомы (протеазы, липазы, гликозидазы, нуклеазы — более 60), расщепляющие макромолекулы; их оптимум активности — в кислой среде. Катепсины — лизосомные протеазы; при выходе в цитозоль через повреждённую мембрану лизосомы они расщепляют цитозольные белки и могут запустить гибель клетки.
V-АТФаза: Вакуолярная H⁺-АТФаза — насос мембран лизосом, эндосом и пузырьков аппарата Гольджи; за счёт гидролиза ATP переносит протоны из цитозоля в просвет. Создаёт кислую среду лизосомы; степень закисления зависит и от переноса противоионов. Ингибируется бафиломицином A1 и конканамицином A.
SERCA: Ca²⁺-АТФаза мембраны ЭПР: за счёт гидролиза ATP переносит Ca²⁺ из цитозоля в просвет ЭПР и поддерживает там сотни микромолей свободного Ca²⁺. Необратимо ингибируется тапсигаргином.
MCU (митохондриальный кальциевый унипортер): Высокоселективный Ca²⁺-канал внутренней мембраны митохондрии. Ca²⁺ входит через него в матрикс по электрохимическому градиенту, который создаёт отрицательный Δψ; работу совершает дыхательная цепь, а не MCU. Регуляторы MICU1/MICU2 делают захват Ca²⁺ пороговым (раздел 4).
ATP-синтаза: Комплекс внутренней мембраны митохондрии: протоны, возвращаясь в матрикс через Fo-часть, приводят в действие синтез ATP в F1-части. Реакция обратима: при сниженном Δψ и наличии ATP (например, гликолитического) фермент гидролизует ATP и выводит протоны из матрикса, поддерживая Δψ. Гликолитический ATP поступает в матрикс через транслокатор адениннуклеотидов; гидролиз ограничивает белок-ингибитор IF1.
Бафиломицин A1: Ингибитор V-АТФазы; F-АТФазу митохондрий в тех же концентрациях не ингибирует. Мембрану лизосомы не разрушает: pH просвета растёт постепенно, а доставленный в лизосомы белок перестаёт расщепляться. Исследовательский инструмент, а не лекарство.
Тапсигаргин: Необратимый ингибитор SERCA. Каналы ЭПР не открывает и мембрану не разрушает: Ca²⁺ выходит из просвета путями утечки (в покое утечку уравновешивает SERCA), и после короткой начальной фазы депо опустошается за минуты; опустошение запускает депо-зависимый вход Ca²⁺ через плазматическую мембрану.
Антимицин A и олигомицин: Антимицин A ингибирует комплекс III дыхательной цепи и останавливает перенос электронов к кислороду. Олигомицин ингибирует Fo-часть ATP-синтазы и блокирует оба направления её работы. Вместе они останавливают оба генератора Δψ; по отдельности позволяют различить, что поддерживает потенциал.
FCCP (протонофор): Липофильная слабая кислота, переносящая протоны через внутреннюю мембрану в обход ATP-синтазы (разобщитель). Снимает Δψ и протонный градиент. Если концентрация протонофора оптимальна, субстратов достаточно, а у клеток есть дыхательный резерв, дыхание ускоряется до максимальной скорости, возможной в этих условиях (избыток протонофора дыхание подавляет), а синтез ATP в митохондриях прекращается; при глюкозе в среде ATP-синтаза гидролизует гликолитический ATP, но Δψ не восстанавливается. Дыхательную цепь не ингибирует.
TMRM: Катионный флуоресцентный зонд, накапливающийся в матриксе тем сильнее, чем отрицательнее матрикс (распределение по уравнению Нернста). Отвечает и на потенциал плазматической мембраны. При загрузке в низких наномолярных концентрациях уравновешивается между средой и клеткой примерно за 60 мин, а между цитозолем и матриксом — намного быстрее, поэтому изменения Δψ видны за секунды и минуты (Brand и Nicholls 2011). Показывает состояние — Δψ, а не поток.
Ратиометрия: Способ измерения, при котором берут отношение сигналов одного сенсора при двух длинах волн возбуждения или испускания. Отношение практически не зависит от количества сенсора, толщины клетки и (в первом приближении) выцветания, но становится числом pH или потенциала только после калибровки.
Калибровка сенсора in situ: Перевод сигнала сенсора в физическую величину в той же клетке: для pH — растворы известного pH с ионофорами (нигерицин, монензин), выравнивающими pH органеллы и раствора; для редокс-сенсора — полное восстановление и полное окисление. Задаёт рабочий диапазон: вне его сенсор не различает значений.
Челночные системы (малат-аспартатный и глицерофосфатный челноки): Способы перенести восстановительные эквиваленты цитозольного NADH в митохондрию, не перенося сам NADH, для которого внутренняя мембрана непроницаема. Малат-аспартатный челнок восстанавливает NAD⁺ матрикса; глицерофосфатный передаёт электроны через FAD митохондриальной глицерол-3-фосфатдегидрогеназы в пул убихинона, минуя комплекс I.
Средняя по клетке концентрация: Количество вещества, отнесённое к объёму всей клетки (или к массе белка), — то, что даёт анализ лизата: c = N/(N_A·V), где N — число молекул, N_A = 6,02·10²³ моль⁻¹, V — объём. Мера общего содержания; не показывает, какая концентрация достигнута там, где находится эффектор.
Буфер (кальциевый буфер): Белок или другая молекула, обратимо связывающая ион или посредник. В начальной фазе сигнала быстрый ненасыщенный буфер удаляет свободную форму как сток; в длительном стационаре связывание и отщепление уравновешиваются, и постоянного стока буфер не создаёт. Неподвижные буферы ограничивают распространение свободного Ca²⁺, подвижные могут его ускорять; насыщенный буфер перестаёт сужать домен.
Макромолекулярный краудинг: Совокупность эффектов, вызванных тем, что 20–30 % объёма цитоплазмы занято макромолекулами (200–300 мг/мл): эффективная активность белков выше номинальной, исключённый объём при прочих равных благоприятствует сборке комплексов, диффузия замедлена. Неспецифические взаимодействия с окружающими белками могут действовать в обратную сторону, поэтому итог для устойчивости и связывания зависит от белка. Регулируется, например, через содержание рибосом.
Коэффициент диффузии (D): Мера подвижности молекулы, мкм²/с: среднеквадратичное смещение за время t в одном измерении — √(2Dt). Для IP₃ в цитозольном экстракте — 283 мкм²/с, для GFP в цитоплазме — около 27 мкм²/с, для мембранных белков в плоскости мембраны — 0,05–1 мкм²/с.
Источник (в модели градиента): Место, где вещество образуется или поступает в цитозоль: закреплённый фермент (аденилатциклаза, киназа), канал выхода из депо (рецептор IP₃) или направленный транспорт. Без источника неоднородности нет.
Сток (в модели градиента): Процесс, удаляющий вещество из отслеживаемой формы: ферментативное разрушение (PDE для cAMP), секвестрация (SERCA для Ca²⁺), а в начальной фазе сигнала — связывание ненасыщенным буфером; для фосфорилированного белка — фосфатаза. Ускорение стока сужает домен.
Длина диффузии (λ): Масштаб стационарного профиля «источник — диффузия — сток»: λ = √(D/k), где k — константа стока первого порядка. На расстоянии λ избыток концентрации над фоном падает в e ≈ 2,7 раза. Не путать со среднеквадратичным смещением √(2Dt) за время t.
Стационарный профиль концентрации: Распределение вещества, которое не меняется во времени, потому что в каждой точке приток диффузией и от источника равен удалению стоком. В одномерной модели с равномерным базальным источником, поддерживающим фон: c(x) = фон + (c₀ − фон)·e^(−x/λ). Исчезает, если остановить источник или сток.
Сверхчувствительность: Ответ, зависящий от концентрации сигнала круче гиперболы Михаэлиса. Крутизну описывает коэффициент Хилла n в уравнении R = cⁿ/(K½ⁿ + cⁿ): при n = 1 для перехода от 10 до 90 % ответа нужен рост концентрации в 81 раз, при n = 4 — в 3 раза.
Сверхчувствительность нулевого порядка: Резкая зависимость доли модифицированного белка от отношения активностей киназы и фосфатазы, возникающая, когда оба фермента насыщены субстратом (Goldbeter и Koshland 1981). Не требует кооперативного связывания.
Позиционная информация: Сведения о положении в клетке или ткани, которые несёт градиент: профиль концентрации задаёт координату, а эффектор с порогом превращает её в границу между областями с разным ответом.
Аденилатциклаза (AC): Мембранный фермент, синтезирующий cAMP из ATP; активируется белком Gs после связывания гормона с рецептором. Источник cAMP в своём мембранном домене; форсколин активирует её напрямую.
Фосфодиэстеразы (PDE): Ферменты, гидролизующие cAMP (и cGMP) до 5′-нуклеотидмонофосфата; cAMP гидролизуют восемь семейств. Многие изоформы закреплены у определённых мембран; работают как местный сток cAMP. IBMX — неизбирательный ингибитор.
Протеинкиназа A (PKA): Тетрамер из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц; связывание cAMP с регуляторными субъединицами освобождает активность каталитических. Донор фосфата — ATP. Закрепляется у мишеней белками AKAP.
AKAP (белки, закрепляющие PKA): Якорные белки, связывающие регуляторные субъединицы PKA и удерживающие её у определённой мембраны или мишени; часто связывают также аденилатциклазу, PDE и фосфатазы. Определяют место работы PKA. Пептид Ht31 отделяет от них PKA типа II.
IBMX: 3-изобутил-1-метилксантин — неизбирательный ингибитор фосфодиэстераз. Повышает cAMP по всей клетке и размывает границы доменов; служит проверкой того, что домен поддерживается стоком.
Пептид Ht31: Пептид из участка AKAP Ht31, связывающий регуляторную субъединицу RIIα PKA с наномолярным сродством и вытесняющий её из комплексов с AKAP. Проверяет, нужно ли закрепление PKA для ответа: активность PKA он не подавляет.
Градиент RanGTP: Неравномерное распределение ГТФазы Ran в форме, связанной с GTP: её много в ядре (или у хромосом в митозе), где работает фактор обмена RCC1, и мало в цитоплазме, где гидролиз ускоряют RanGAP1 и RanBP1. Задаёт направление ядерного транспорта: в ядре RanGTP разбирает комплексы импортинов с грузом и собирает комплексы экспортинов с грузом.
FRET (фёрстеровский резонансный перенос энергии): Безызлучательный перенос энергии от возбуждённого флуоресцентного белка-донора к акцептору, если они находятся на расстоянии в несколько нанометров. В сенсорах связывание лиганда меняет это расстояние, и измеряют отношение свечения донора и акцептора.
FRAP: Восстановление флуоресценции после выцветания: флуоресценцию в малой области гасят интенсивным светом и следят за её восстановлением. Скорость восстановления характеризует подвижность белка, неполное восстановление — долю неподвижных молекул.
Липидный код: Устойчивое распределение фосфоинозитидов по мембранам компартментов: PI(4,5)P₂ — плазматическая мембрана, PI4P — аппарат Гольджи (и плазматическая мембрана), PI3P — ранние эндосомы, PI(3,5)P₂ — поздние эндосомы и лизосомы. Точнее — разметка, которую белки считывают вместе с другими признаками мембраны: один липид встречается в нескольких мембранах, содержание меняется непрерывно, и белок узнаёт мембрану по сочетанию признаков, а не по одному липиду.
Характерный фосфоинозитид: Фосфоинозитид, обогащённый в мембране данного компартмента по сравнению с другими мембранами. Это не самый массовый липид мембраны, а минорный компонент, по которому её узнают белки; «характерный» не значит «единственный».
Липидкиназы и липидфосфатазы: Ферменты, присоединяющие фосфат к определённому положению инозитольного кольца (киназы: PI4K, PIP5K, PI3K, VPS34, PIKfyve) или отщепляющие его (фосфатазы: PTEN, SHIP, SAC1, OCRL, INPP5E, FIG4). Сами локализованы на определённых мембранах, поэтому определяют, где какой липид образуется.
Смена метки (конверсия): Смена фосфоинозитида мембраны под действием киназ и фосфатаз при переходе компартмента в другое состояние. Например, при созревании эндосомы PI(4,5)P₂ ямки дефосфорилируется, на ранней эндосоме VPS34 заново синтезирует PI3P, затем PIKfyve превращает его в PI(3,5)P₂. Смена метки сопровождается сменой малых ГТФаз и белков-эффекторов.
Периферическое связывание: Обратимое связывание белка с поверхностью мембраны без встраивания в бислой: за счёт электростатического взаимодействия с головной группой липида и, у многих доменов, погружения гидрофобных участков в поверхностный слой. При изменении метки белок диссоциирует.
PH-домен: Домен гомологии плекстрину; у части белков связывает фосфоинозитиды плазматической мембраны или Гольджи: PI(4,5)P₂ (PLCδ1), PI(3,4,5)P₃ и PI(3,4)P₂ (AKT), PI4P (OSBP, FAPP1). Многие PH-домены связывают липиды слабо и неизбирательно и требуют второго признака.
FYVE-домен: Домен, связывающий PI3P; есть у EEA1 и HRS. Тандем из двух FYVE-доменов (2×FYVE) используют как сенсор PI3P ранних эндосом.
PX-домен: Домен, у большинства белков связывающий PI3P; есть у сортирующих нексинов ранних эндосом.
ENTH- и ANTH-домены: Домены белков эндоцитоза (эпсин, AP180), связывающие PI(4,5)P₂ в формирующейся клатриновой ямке.
C2-домен: Домен, связывающий кислые фосфолипиды, у многих белков при участии Ca²⁺ (синаптотагмин, протеинкиназа C).
Коинцидентное узнавание: Узнавание по совпадению двух и более признаков: механизм адресации, при котором белок прочно связывается с мембраной только при одновременном узнавании нескольких независимых признаков, например PI3P и Rab5-GTP у EEA1. В простейшей модели независимых сайтов доля связанного белка равна произведению занятостей: это даёт избирательность и авидность, но не порог, кооперативность или бистабильность. Признаки бывают неравноценны: для посадки EEA1 решающим оказался PI3P (Lawe 2002).
Маркер и причинный детерминант: Маркер — признак, по которому исследователь узнаёт мембрану; причинный детерминант — признак, от которого зависят её свойства. Причинность доказывают вмешательством (удаление показывает необходимость, перенос фермента — достаточность), а не совпадением локализаций.
Асимметрия монослоёв: Различие липидного состава наружного и цитозольного монослоёв: фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин плазматической мембраны сосредоточены в цитозольном монослое. Создаётся ATP-зависимыми флиппазами (P4-АТФазы), рассеивается скрамблазами (TMEM16F — при подъёме Ca²⁺, Xkr8 — после расщепления каспазами) без затраты ATP.
Rab5 и Rab7: Малые ГТФазы эндосом: Rab5 — ранних, Rab7 — поздних. В GTP-связанной форме связываются с эффекторами, после гидролиза GTP — нет. Rab5 S34N преимущественно связывает GDP, Rab5 Q79L почти не гидролизует GTP. При созревании эндосомы Rab5 сменяется на Rab7: Rab5-GTP привлекает GEF Rab7 — комплекс MON1–CCZ1, и Rab7 включается, а GEF Rab5 вытесняется; смену липидов выполняют другие ферменты.
PI3K класса I и PTEN: PI3K класса I после активации рецепторов фосфорилирует PI(4,5)P₂ в положении 3 и создаёт PI(3,4,5)P₃ в плазматической мембране; PTEN отщепляет этот фосфат и возвращает PI(4,5)P₂. Баланс двух ферментов задаёт содержание PI(3,4,5)P₃ и в покое, и после стимула.
VPS34 (PI3K класса III): Липидкиназа, синтезирующая PI3P из фосфатидилинозитола на ранних эндосомах (в комплексе, связанном с Rab5) и при аутофагии. Избирательные ингибиторы снижают PI3P и вместе с ним PI(3,5)P₂.
PIKfyve: Липидкиназа поздних эндосом, превращающая PI3P в PI(3,5)P₂; работает в комплексе с VAC14 и фосфатазой FIG4. Подавляется апилимодом; при её подавлении поздние эндосомы и лизосомы увеличиваются.
Рапамицин-индуцируемое сближение FKBP–FRB: Метод быстрого вмешательства: FRB закрепляют на выбранной мембране, фермент сливают с FKBP; рапамицин связывает оба домена, и фермент за минуты оказывается на мембране. Так удаляют липид в одной мембране; контроли — без рапамицина и с неактивным ферментом.
Сенсор на основе липид-связывающего домена: Липид-связывающий домен, слитый с флуоресцентным белком. Показывает свободный и доступный ему липид в местах, где выполнены его условия связывания; насыщается, конкурирует с собственными белками клетки, а при сильной экспрессии может подавлять процессы, зависящие от липида.
TRPML1: Канал мембраны поздних эндосом и лизосом, через который Ca²⁺ выходит из просвета; прямо активируется PI(3,5)P₂ (Dong 2010).
Мембранный контактный сайт: Участок устойчивого сближения мембран двух органелл, которое удерживают тетеринг-белки; расстояние зависит от типа контакта (у контакта ЭПР — митохондрия порядка 10–30 нм); мембраны не сливаются, содержимое компартментов не смешивается. Через контакт идёт невезикулярный перенос липидов, Ca²⁺ и метаболитов. Scorrano и соавторы (2019) рекомендуют описывать контакт по удержанию мембран, отсутствию слияния, функции и набору белков и липидов; одно расстояние контакт не определяет.
Тетеринг-белки: Белки или белковые комплексы (от англ. tether — привязь), одновременно связанные с мембранами двух органелл и удерживающие их на определённом расстоянии; не вызывают слияния. Отличаются от моторных адаптеров и белков слияния. Примеры: VAP с белками, несущими мотив FFAT; PDZD8; E-Syt; у дрожжей — комплекс ERMES.
Три проверки контакта (в этом семинаре): Геометрия (расстояние между мембранами; его типичная величина зависит от типа контакта), тетеринг-белки, удерживающие это расстояние (их удаление увеличивает зазор или уменьшает площадь), и раздельность содержимого. Каждую проверку выполняют отдельным методом; площадь сближения не говорит о переносе — его измеряют отдельно.
Невезикулярный перенос липидов: Перенос липида между мембранами без пузырьков: липид-транспортный белок извлекает молекулу в гидрофобный карман и отдаёт её другой мембране. Обычно идёт в контактных сайтах, где белок может быть связан с обеими мембранами.
OSBP (оксистерол-связывающий белок): Белок контакта ЭПР — транс-Гольджи: PH-доменом связывается с PI4P Гольджи, мотивом FFAT — с VAP на ЭПР, доменом ORD переносит липиды. За цикл переносит молекулу холестерина из ЭПР в Гольджи и молекулу PI4P обратно; ATP не гидролизует.
Контрградиент PI4P: Постоянный перепад содержания PI4P между аппаратом Гольджи (высокое) и ЭПР (низкое). Его создаёт PI-4-киназа Гольджи, расходующая ATP, и поддерживает фосфатаза SAC1 в ЭПР. Перепад движет обмен, при котором OSBP переносит холестерин против его градиента.
VAP-A и VAP-B: Белки мембраны ЭПР, связывающие короткий мотив FFAT белков-партнёров (OSBP, ряд белков ORP, CERT). Пара VAP–FFAT удерживает контакт и привязывает к нему перенос липидов.
ORP5 и ORP8: Белки ЭПР, родственные OSBP. В контактах ЭПР с плазматической мембраной обменивают фосфатидилсерин на PI4P: доставляют фосфатидилсерин в плазматическую мембрану, а PI4P — к фосфатазе SAC1 в ЭПР (Chung 2015).
CERT: Белок, переносящий церамид из ЭПР в аппарат Гольджи, где из него синтезируется сфингомиелин. Связывается с PI4P Гольджи PH-доменом и с VAP на ЭПР мотивом FFAT; обмена на PI4P не выполняет.
PI4KIIIβ: Фосфатидилинозитол-4-киназа аппарата Гольджи: переносит фосфат с ATP на положение 4 инозитольного кольца (PI → PI4P). В цикле OSBP — единственная стадия, где расходуется ATP. PI4P синтезируют и другие PI-4-киназы.
OSW-1: Природное соединение, которое связывается с OSBP и родственным белком ORP4 и тормозит перенос липидов. В клетках повышает содержание PI4P в транс-Гольджи и смещает холестерин в ЭПР и липидные капли (Mesmin 2017). Цитотоксичен; исследовательский инструмент.
MICU1 и MICU2: Регуляторы митохондриального кальциевого унипортера в межмембранном пространстве. MICU1 связывает Ca²⁺ EF-мотивами, удерживает MCU закрытым при низком Ca²⁺ и обеспечивает кооперативное открытие при высоком; отсюда кажущийся порог захвата около 1 мкМ. MICU2 работает в комплексе с MICU1.
VDAC: Потенциал-зависимый анионный канал (порин) наружной мембраны митохондрии. Делает наружную мембрану проницаемой для ионов и небольших метаболитов; на контакте с ЭПР связан с рецептором IP₃ через шаперон GRP75.
Ca²⁺-микродомен контакта ЭПР — митохондрия: Область зазора, где при открытии рецепторов IP₃ свободный Ca²⁺ достигает порядка 10 мкМ, тогда как в остальном цитозоле он поднимается примерно до 1 мкМ. Позволяет MCU с MICU1 открываться именно у контакта; при подъёме Ca²⁺ во всём цитозоле выше порога захват идёт и вне контактов.
PDZD8: Белок ЭПР, участвующий в образовании контактов ЭПР с митохондриями в клетках млекопитающих (Hirabayashi 2017); его SMP-домен функционально соответствует домену белка Mmm1 дрожжевого комплекса ERMES. В нейронах мыши без PDZD8 митохондрии хуже захватывали Ca²⁺, вышедший из ЭПР.
E-Syt (расширенные синаптотагмины): Белки ЭПР (E-Syt1–3), связывающие ЭПР с плазматической мембраной и переносящие глицеролипиды. Работа E-Syt1 зависит от Ca²⁺: при его подъёме зазор контакта сокращается. У дрожжей родственные белки — трикальбины.
STIM1 и Orai1: STIM1 — сенсор Ca²⁺ в мембране ЭПР; после опустошения депо он перемещается в контакты ЭПР с плазматической мембраной и связывается с каналом Orai1, открывая депо-зависимый вход Ca²⁺ в клетку.
Электронная (крио)томография: Метод трёхмерной электронной микроскопии: серия снимков под разными углами восстанавливается в объёмное изображение. Позволяет измерить зазор между мембранами и увидеть связи; криоэлектронная томография исследует замороженные образцы без химической фиксации. Показывает геометрию в один момент, но не перенос.
Митофузин 2 (MFN2): ГТФаза наружной мембраны митохондрии, участвующая в их слиянии; часть белка локализуется на ЭПР. Ранние данные о его роли в удержании контакта ЭПР — митохондрия противоречивы; в 2023 году описаны ЭПР-специфические варианты сплайсинга: ERMIT2 удерживает ЭПР у митохондрии, связываясь с митофузинами, ERMIN2 участвует в организации ЭПР (Naón 2023). Мутации в гене MFN2 вызывают наследственную нейропатию Шарко — Мари — Тута типа 2A.
Репортёр из двух половин (split-GFP, SPLICS): Две половины флуоресцентного белка, закреплённые на мембранах разных органелл; при сближении собираются в целый флуоресцирующий белок. Сборка малообратима: репортёр накапливает сигнал от всех контактов за время экспрессии и при избыточной экспрессии может их стабилизировать. В отличие от него FRET и BRET регистрируют сближение донора и акцептора примерно до 10 нм без сборки белка.
Необходимость белка: Свойство, которое показывает эксперимент с удалением или подавлением белка: без белка процесс нарушается. Необходимость не означает, что белок сам выполняет процесс или что его достаточно: удаление может нарушить процесс косвенно, через другие звенья.
Достаточность: Свойство, которое показывает эксперимент с добавлением: фермент, перенесённый в новое место, или мембраны, соединённые искусственной привязкой, вызывают процесс там, где его раньше не было. Пример — перенос фосфатазы на плазматическую мембрану рапамицином в эксперименте Hammond 2012.
Кальциневрин: Фосфатаза, которую активирует Ca²⁺ в комплексе с кальмодулином. Дефосфорилирует факторы транскрипции NFAT и TFEB, после чего они перемещаются в ядро. В экспериментах Medina 2015 кальциневрин дефосфорилировал TFEB по остаткам Ser142 и Ser211 (нумерация TFEB человека).
Быстрый и медленный буферы Ca²⁺ (BAPTA и EGTA): Хелаторы Ca²⁺ со сходным сродством, но с разной скоростью связывания: BAPTA связывает ион намного быстрее, чем EGTA. Поэтому BAPTA успевает связать Ca²⁺ на более коротком пути от источника к мишени, чем EGTA. Если при сопоставимых эффективных концентрациях и проверенной загрузке ответ подавляет BAPTA, но не EGTA, это согласуется с тесным пространственно-временным сопряжением источника Ca²⁺ и мишени. Определённое расстояние из такого сравнения без кинетической модели не следует: оно зависит от концентрации буферов, силы и длительности источника и свойств мишени (Eggermann 2012). В клетки их вводят в виде проникающих эфиров (BAPTA-AM, EGTA-AM).
MON1–CCZ1: GEF малой ГТФазы Rab7 (у дрожжей — Ypt7): комплекс ускоряет замену GDP на GTP у Rab7. Это гетеродимер, а у многоклеточных — гетеротример с третьей субъединицей. На эндосоме комплекс привлекают Rab5-GTP и отрицательно заряженные липиды, в том числе PI3P; MON1 вытесняет GEF Rab5 (Rabex-5) и прерывает положительную обратную связь Rab5. Липидкиназой комплекс не является и фосфоинозитиды не превращает (Poteryaev 2010; Nordmann 2010; Langemeyer 2020).
Экспортин, CRM1 (XPO1): Транспортный рецептор семейства импортина-β, выносящий груз из ядра. CRM1 (XPO1) узнаёт богатый лейцином сигнал ядерного экспорта (NES) и связывает его кооперативно с RanGTP в ядре; в цитоплазме после гидролиза GTP на Ran комплекс распадается. Не весь экспорт идёт через CRM1: импортин-α возвращает в цитоплазму экспортин CAS, а экспорт мРНК в основном опирается на другие посредники.