ISR: eIF2α и ATF4 · шаг 1 из 30Как разные воздействия сходятся на eIF2αИнтегрированный стрессовый ответ (ISR) — система регуляции трансляции, в которой разные воздействия сходятся на одной модификации: фосфорилировании остатка Ser51 в α-субъединице фактора инициации eIF2. Поэтому ответы на недостаток аминокислот, стресс ЭПР, вирусную РНК и недостаток гема имеют общее звено, хотя запускаются разными киназами.У млекопитающих четыре киназы — GCN2, PERK, PKR и HRI — фосфорилируют Ser51 eIF2α.GCN2 воспринимает недостаток аминокислоты как рост доли деацилированных тРНК: HisRS-подобный домен связывает такую тРНК, торможение киназного домена снимается, и GCN2 фосфорилирует Ser51 eIF2α.eIF2 с фосфорилированной α-субъединицей подавляет обменную активность eIF2B, и доступность тройного комплекса для инициации трансляции уменьшается.Общий узел не означает одинакового ответа: исход зависит от силы и длительности воздействия и от других путей, которые оно активирует.Синтез белка начинается с инициации трансляции: малая субъединица рибосомы с инициаторной метионил-тРНК находит старт-кодон мРНК. Метионил-тРНК доставляет фактор инициации eIF2 в GTP-связанной форме. ISR изменяет именно этот этап. Поэтому ISR определяют не через «стресс вообще», а через конкретное молекулярное событие — фосфорилирование eIF2α по Ser51.Это событие катализируют четыре киназы, каждая из которых воспринимает свой сигнал. GCN2 активируется при недостатке аминокислот: сигналом служат тРНК без присоединённой аминокислоты (деацилированные, или «незаряженные» тРНК); как киназа воспринимает такие тРНК, разобрано в следующих абзацах. PERK — трансмембранная киназа ЭПР; её активирует накопление неправильно свёрнутых белков в просвете ЭПР. PKR активируется двухцепочечной РНК, которая появляется при репликации многих вирусов. HRI связана с доступностью гема, а также с некоторыми другими воздействиями, в том числе с нарушением работы митохондрий. Соответствие «сигнал — киназа» описывает канонические условия: одно воздействие может активировать больше одной киназы.Заряженная и незаряженная тРНК различаются тем, присоединена ли аминокислота к 3′-концу молекулы. В норме аминоацил-тРНК-синтетаза присоединяет к нему аминокислоту, и аминоацилированная тРНК пригодна для работы на рибосоме. При нехватке одной аминокислоты возрастает доля деацилированных тРНК, которые соответствуют именно ей; из этого не следует, что все тРНК клетки одновременно теряют аминокислоты.Воспринимает такую тРНК регуляторный домен GCN2, по строению сходный с гистидил-тРНК-синтетазой (HisRS-подобный домен). Он сохранил способность связывать тРНК, но утратил связывание гистидина и АТФ и поэтому тРНК не аминоацилирует: это псевдофермент, работающий как сенсор (Yin 2024, криоЭМ-структура в составе полноразмерной GCN2). Пока тРНК не связана, киназный домен, по данным для дрожжевой Gcn2, удерживается в неактивном состоянии контактом с этим регуляторным участком. Для сильного связывания деацилированной тРНК дрожжевой Gcn2 нужны HisRS-подобный домен и следующий за ним C-концевой участок, который связывает рибосому; тРНК мешает их взаимодействию с киназным доменом, и торможение снимается (Dong 2000). Аминоацилирование тРНК (в опыте с тРНК-Phe) ослабляло её связывание, поэтому киназа различает тРНК с аминокислотой и без неё. Освобождённый киназный домен фосфорилирует Ser51 eIF2α, и недостаток аминокислоты превращается в изменение eIF2α.Связывание деацилированных тРНК — не единственный путь активации GCN2. С рибосомой и с GCN2 взаимодействует белок GCN1, и вклад рибосомного контекста зависит от воздействия. По данным Misra и соавт. (2024), при условиях, вызывающих деацилирование тРНК, GCN2 активируется прямой ассоциацией с тРНК, а при ингибиторах элонгации трансляции необходимы столкновения рибосом; в обоих случаях требуется HisRS-подобный домен. Поэтому не следует сводить все случаи активации GCN2 ни к незаряженным тРНК, ни к столкновениям рибосом. Как именно GCN1 и рибосома сочетаются с прямым связыванием тРНК в клетке, остаётся предметом исследований. Дальнейшие события — подавление eIF2B (шаг 2) и избирательная трансляция ATF4 (шаг 3) — общие для всех четырёх киназ.Через PERK ISR пересекается с ответом на неправильно свёрнутые белки (UPR). Но PERK — лишь одна из трёх ветвей UPR, а нарушение сворачивания в ЭПР — лишь один из входов ISR. Две другие ветви UPR, IRE1α и ATF6, фосфорилирование eIF2α не используют; GCN2, PKR и HRI фосфорилируют eIF2α без участия ЭПР.Общий узел возник в эволюции рано. У пекарских дрожжей есть одна киназа eIF2α — Gcn2, связанная с недостатком аминокислот; у млекопитающих киназ четыре, и они воспринимают разные сигналы. Из сходства узла не следует, что вся сеть регуляторов у дрожжей и человека одинакова.Типичная ошибка Любое нарушение работы ЭПР обязательно запускает ISR, а любой ISR — это ответ ЭПР.ЭПР связан с ISR только через PERK. Другие киназы фосфорилируют eIF2α без участия ЭПР, а ветви UPR IRE1α и ATF6 действуют без фосфорилирования eIF2α.Какое звено является общим для канонического ответа, запускаемого GCN2, PERK, PKR и HRI у млекопитающих?А. Удаление интрона из мРНК XBP1. (неверный вариант)Это выход РНКазной активности IRE1, а не общий выход четырёх eIF2α-киназ.Б. Расщепление мембранного белка ATF6 в аппарате Гольджи. (неверный вариант)Так активируется отдельная ветвь UPR; этот процесс не является общим этапом ISR.В. Фосфорилирование Ser51 в α-субъединице eIF2. (верный вариант)Все четыре киназы сходятся на этой модификации; дальнейший ответ зависит также от других регуляторов.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаCosta-Mattioli M., Walter P. The integrated stress response: From mechanism to disease. Science. 2020.Wek R.C., Anthony T.G., Staschke K.A. Surviving and Adapting to Stress: Translational Control and the Integrated Stress Response. Antioxid Redox Signal. 2023.Ryoo H.D. The integrated stress response in metabolic adaptation. J Biol Chem. 2024.Dong J., Qiu H., Garcia-Barrio M., Anderson J., Hinnebusch A.G. Uncharged tRNA activates GCN2 by displacing the protein kinase moiety from a bipartite tRNA-binding domain. Mol Cell. 2000;6:269–79.Yin J.Z., Keszei A.F.A., Houliston S. et al. The HisRS-like domain of GCN2 is a pseudoenzyme that can bind uncharged tRNA. Structure. 2024;32:795–811.e6.Misra J., Carlson K.R., Spandau D.F., Wek R.C. Multiple mechanisms activate GCN2 eIF2 kinase in response to diverse stress conditions. Nucleic Acids Res. 2024;52:1830–46.Схема механизма для клеток млекопитающих; состояния качественные. Соответствие воздействия и киназы приведено для канонических условий (обзоры Costa-Mattioli 2020, Wek 2023, Ryoo 2024); в конкретной клетке одно воздействие может активировать несколько киназ. Сравнение с дрожжами Saccharomyces cerevisiae (одна киназа Gcn2) не означает одинакового состава всей регуляторной сети. GCN2: HisRS-подобный домен — псевдофермент, который связывает тРНК, но не связывает гистидин и АТФ (Yin 2024, прочитана аннотация). Снятие торможения киназного домена тРНК показано in vitro и на мутантах дрожжевой Gcn2 (Dong 2000, прочитана аннотация); перенос деталей на GCN2 млекопитающих — допущение. Два механизма активации GCN2 в клетках — Misra 2024 (прочитана аннотация). Роль GCN1 указана как контекст: в прочитанных аннотациях она не изучалась.
ISR: eIF2α и ATF4 · шаг 2 из 30Почему фосфорилирование eIF2α снижает общую трансляциюДля каждой новой инициации трансляции eIF2 должен снова связать GTP. Этот обмен нуклеотидов катализирует eIF2B, и именно eIF2B подавляется, когда α-субъединица eIF2 фосфорилирована.eIF2 в GTP-связанной форме присоединяет инициаторную метионил-тРНК и образует тройной комплекс eIF2·GTP·Met-тРНКi.После узнавания старт-кодона из комплекса выходит фосфат, образовавшийся при гидролизе GTP, и eIF2·GDP покидает рибосому; для нового цикла GDP должен быть заменён на GTP с участием eIF2B.eIF2(αP) связывается с eIF2B прочнее, чем немодифицированный eIF2, и подавляет его обменную активность; тройного комплекса образуется меньше.Каноническая инициация трансляции у эукариот начинается с тройного комплекса: eIF2, связанный с GTP, присоединяет инициаторную метионил-тРНК (Met-тРНКi). Вместе с другими факторами инициации тройной комплекс связывается с малой субъединицей рибосомы (40S), и она просматривает 5′-область мРНК в поисках старт-кодона. Распознавание старт-кодона сопровождается высвобождением неорганического фосфата, образовавшегося при гидролизе GTP. После этого eIF2·GDP покидает рибосому, и к малой субъединице присоединяется большая.eIF2·GDP не способен связать новую Met-тРНКi. Чтобы eIF2 снова участвовал в инициации, связанный GDP должен быть заменён на GTP. Сам eIF2 освобождает GDP медленно; обмен ускоряет фактор обмена гуаниновых нуклеотидов eIF2B — крупный комплекс из двух копий пяти типов субъединиц. eIF2B не фосфорилирует GDP и не синтезирует GTP: он способствует освобождению GDP, после чего eIF2 связывает GTP из цитозоля.Фосфорилирование Ser51 изменяет взаимодействие eIF2 с eIF2B. eIF2(αP) связывается с eIF2B прочнее немодифицированного eIF2 и, по структурным и биохимическим данным, переводит eIF2B в конформацию с низкой обменной активностью. Поэтому прежнее описание eIF2(αP) как простого конкурентного ингибитора считают неполным. Молекул eIF2B в клетке значительно меньше, чем молекул eIF2, и фосфорилирования даже небольшой части eIF2 достаточно, чтобы заметно замедлить обмен. В результате тройного комплекса образуется меньше, и инициация трансляции большинства мРНК замедляется.Важно различать содержание eIF2B и его активность. В показанном случае количество eIF2B не меняется: уменьшается скорость катализируемого им обмена. Насколько снижается общий синтез белка, зависит от доли eIF2(αP), типа клеток и воздействия, поэтому одного универсального значения в процентах нет. Малая молекула ISRIB действует именно на этом звене: связываясь с eIF2B, она уменьшает его чувствительность к eIF2(αP), но не изменяет фосфорилирование eIF2α.Типичная ошибка eIF2B — это киназа, которая превращает GDP в GTP, а при ISR количество eIF2B в клетке уменьшается.eIF2B — фактор обмена нуклеотидов: он ускоряет освобождение GDP из eIF2, после чего eIF2 связывает GTP. При ISR количество eIF2B может оставаться прежним; снижается его обменная активность под действием eIF2(αP).Содержание eIF2B не изменилось, но его обменная активность уменьшилась вследствие связывания eIF2(αP). Какое непосредственное следствие ожидается?А. Доступность eIF2·GTP·Met-тРНКi уменьшится. (верный вариант)При замедленном обмене меньше eIF2 возвращается в GTP-связанную форму, способную образовать тройной комплекс.Б. Образование тройного комплекса ускорится. (неверный вариант)Обмен GDP на GTP необходим для повторного образования комплекса; подавление обмена не ускоряет этот процесс.В. Образование тройного комплекса сохранится, поскольку общее содержание eIF2B не изменилось. (неверный вариант)Содержание комплекса не задаёт его обменную активность; при её подавлении образование тройного комплекса может уменьшиться.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаCosta-Mattioli M., Walter P. The integrated stress response: From mechanism to disease. Science. 2020.Wek R.C., Anthony T.G., Staschke K.A. Surviving and Adapting to Stress: Translational Control and the Integrated Stress Response. Antioxid Redox Signal. 2023.Schoof M. et al. eIF2B conformation and assembly state regulate the integrated stress response. eLife. 2021;10:e65703.Rabouw H. H. et al. Small molecule ISRIB suppresses the integrated stress response within a defined window of activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116:2097–2102.Схема механизма, качественные состояния; клетки млекопитающих. Подавление eIF2B описано по обзору Wek 2023 (полный текст) и работе Schoof 2021 (очищенные белки и клетки человека; прочитаны тематические фрагменты об аллостерическом подавлении eIF2B и действии ISRIB). Состояние с ISRIB относится к умеренному ISR: при высокой доле eIF2(αP) ISRIB перестаёт восстанавливать трансляцию (Rabouw 2019: клеточные линии, заражение пикорнавирусами, poly(I:C) и арсенит; прочитана аннотация). Слова «высокая», «снижена» на схеме не являются измерениями.
ISR: eIF2α и ATF4 · шаг 3 из 30Как уменьшение доступности тройного комплекса усиливает трансляцию ATF4При ISR трансляция большинства мРНК замедляется, а синтез ATF4 усиливается. Причина — устройство 5′-области мРНК ATF4: две короткие рамки uORF с разными ролями и повторная инициация после первой из них.После трансляции короткой uORF1 малая субъединица рибосомы остаётся на мРНК и продолжает сканирование, но для новой инициации ей нужен новый тройной комплекс.Если тройного комплекса достаточно, субъединица присоединяет его до старт-кодона uORF2. uORF2 перекрывает начало рамки ATF4 в другой рамке считывания, и после её трансляции рибосома оказывается за стартом ATF4.Если тройного комплекса меньше, часть субъединиц присоединяет его уже после старт-кодона uORF2 и начинает трансляцию на старт-кодоне ATF4.В 5′-области мРНК ATF4 млекопитающих перед основной рамкой считывания находятся две короткие открытые рамки. uORF1, ближайшая к 5′-концу, кодирует пептид из трёх аминокислот. uORF2 начинается дальше, а заканчивается уже за старт-кодоном ATF4, причём в другой рамке считывания: она перекрывает начало кодирующей области ATF4. Рибосома, транслирующая uORF2, не может начать синтез ATF4 — она проходит его старт-кодон, считывая другую рамку.Малая субъединица рибосомы с тройным комплексом связывается у 5′-конца мРНК и начинает трансляцию на uORF1. После завершения этой короткой рамки малая субъединица часто не отделяется от мРНК и продолжает сканирование. Met-тРНКi уже израсходована, поэтому для следующей инициации субъединица должна заново присоединить тройной комплекс. Без стресса тройного комплекса много, он присоединяется быстро, и ближайшим старт-кодоном оказывается старт uORF2. Рибосома транслирует uORF2, завершает трансляцию за стартом ATF4 и отделяется от мРНК; синтез ATF4 остаётся низким.При умеренном ISR доля eIF2(αP) возрастает, обмен на eIF2B замедляется, и тройного комплекса становится меньше. Сканирующей субъединице требуется больше времени, чтобы снова его присоединить. За это время часть субъединиц проходит старт uORF2 без инициации и присоединяет тройной комплекс уже между стартом uORF2 и стартом ATF4. Эти субъединицы начинают трансляцию ATF4. Количество мРНК ATF4 при этом может не меняться: усиливается её трансляция. Такую модель задержанной повторной инициации предложили Vattem и Wek (2004) по экспериментам с мРНК ATF4 мыши; сходный механизм у дрожжей регулирует трансляцию мРНК GCN4.У механизма есть границы. Предполагают, что при очень сильном снижении доступности тройного комплекса уменьшается и число малых субъединиц, начинающих сканирование мРНК, поэтому синтез ATF4 не возрастает беспредельно с ростом доли eIF2(αP). Кроме того, uORF имеются во многих мРНК, но избирательную трансляцию при стрессе обеспечивают лишь некоторые из них: значение имеют положение, длина uORF и окружение их старт-кодонов.Типичная ошибка При ISR синтез ATF4 возрастает потому, что усиливается транскрипция гена ATF4.Канонический механизм — трансляционный: при неизменном количестве мРНК ATF4 изменяется место повторной инициации после uORF1. Изменения транскрипции ATF4 в отдельных условиях возможны, но они не объясняют, почему синтез ATF4 растёт, когда общая трансляция подавлена.Количество мРНК ATF4 не изменилось. При умеренном ISR повторное присоединение тройного комплекса после uORF1 замедлилось. Как это может усилить синтез ATF4?А. Реинициация на uORF2 усиливается, и те же рибосомы после её трансляции переходят к старту ATF4. (неверный вариант)В канонической схеме uORF2 перекрывает старт основной рамки ATF4. После трансляции uORF2 рибосома оказывается за этим стартом; усиление использования uORF2 не объясняет усиление трансляции ATF4.Б. Торможение общей трансляции одинаково усиливает использование всех стартов на мРНК ATF4. (неверный вариант)Разные старты не отвечают одинаково: значение имеют их положение и момент повторного присоединения тройного комплекса.В. Часть сканирующих субчастиц проходит старт uORF2 и повторно инициирует на ATF4. (верный вариант)Позднее присоединение тройного комплекса уменьшает использование ингибирующей uORF2 и позволяет использовать старт ATF4.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWek R.C., Anthony T.G., Staschke K.A. Surviving and Adapting to Stress: Translational Control and the Integrated Stress Response. Antioxid Redox Signal. 2023.Vattem KM., Wek RC. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:11269–74.Lu PD. et al. Translation reinitiation at alternative open reading frames regulates gene expression in an integrated stress response. J Cell Biol. 2004;167:27–33.Схема механизма; каноническое устройство 5′-области мРНК ATF4 мыши и человека. Количество мРНК в схеме постоянно. Модель задержанной повторной инициации — Vattem и Wek 2004 (мРНК ATF4 мыши, клетки млекопитающих и репортёрные конструкции; прочитана аннотация) и Lu 2004 (библиографическая запись); полный текст — обзор Wek 2023. Длины рамок и расстояния на схеме условные; соотношения субъединиц, начинающих трансляцию на разных стартах, показаны качественно. Утверждение о спаде синтеза ATF4 при очень сильном дефиците тройного комплекса — предположение обзора, а не измерение.
ISR: eIF2α и ATF4 · шаг 4 из 30Как GADD34 и CReP ограничивают фосфорилирование eIF2αATF4 изменяет транскрипцию многих генов, в том числе гена GADD34 — регуляторной субъединицы фосфатазы. Так возникает отрицательная обратная связь: доля eIF2(αP) снижается, и инициация трансляции возобновляется.ATF4 действует в ядре как транскрипционный фактор: усиливает транскрипцию генов синтеза и переноса аминокислот (например, ASNS) и гена GADD34.GADD34 и CReP — регуляторные субъединицы, которые направляют каталитическую субъединицу PP1 к eIF2(αP); комплекс отщепляет фосфат от Ser51.Доля eIF2(αP) определяется соотношением фосфорилирования и дефосфорилирования; когда она снижается, обменная активность eIF2B и инициация трансляции восстанавливаются.Важно различать регуляцию синтеза ATF4 и действие уже синтезированного белка. Синтез самого ATF4 регулируется при трансляции его мРНК (предыдущий шаг). Синтезированный ATF4 действует уже как транскрипционный фактор: перемещается в ядро и вместе с белками-партнёрами связывается с регуляторными участками генов. Среди его мишеней — гены синтеза и переноса аминокислот, например ген аспарагинсинтетазы ASNS, гены других транскрипционных факторов (CHOP, ATF5) и гены белков обратной связи.Один из белков обратной связи — GADD34 (продукт гена PPP1R15A). Собственной фосфатазной активности у GADD34 нет: он связывает каталитическую субъединицу протеинфосфатазы 1 (PP1) и направляет её к eIF2(αP). Novoa и соавт. (2001) показали, что комплекс GADD34 с PP1 дефосфорилирует eIF2α in vitro, а при избытке GADD34 в клетках доля eIF2(αP) снижалась, хотя активность киназ PERK и GCN2 не изменялась. Образование GADD34 зависит от стресса: в клетках без PERK или GCN2 при соответствующем воздействии GADD34 не появлялся. мРНК GADD34 к тому же транслируется избирательно при повышенной доле eIF2(αP).Вторая регуляторная субъединица, CReP (PPP1R15B), образуется постоянно и обеспечивает фоновое дефосфорилирование eIF2α. При подавлении CReP методом РНК-интерференции фосфорилирование eIF2α возрастало и ISR активировался без внешнего воздействия (Jousse 2003). Следовательно, доля eIF2(αP) в каждый момент — результат двух противоположных процессов: фосфорилирования киназами и дефосфорилирования комплексами PP1 с GADD34 или CReP.Обратная связь через GADD34 срабатывает с задержкой: сначала должны образоваться ATF4, затем мРНК и белок GADD34. Поэтому в начале ответа доля eIF2(αP) высока, а позже, при той же активности киназ, снижается, и синтез белка частично возобновляется. Если нарушение сохраняется, обратная связь не устраняет его причину: киназы продолжают фосфорилировать eIF2α.Типичная ошибка Обратная связь через GADD34 сразу и полностью прекращает ISR, даже если вызвавшее его нарушение сохраняется.GADD34 образуется с задержкой и ускоряет дефосфорилирование eIF2α, но не устраняет причину стресса. При продолжающемся воздействии киназы остаются активными, поэтому фосфорилирование eIF2α и часть ответа сохраняются.При одинаковой активности киназ усилилось направляемое GADD34 дефосфорилирование eIF2α. Какое изменение соответствует отрицательной обратной связи ISR?А. Доля eIF2(αP) остаётся прежней, поскольку активность киназ не изменилась. (неверный вариант)Доля модифицированного белка зависит от соотношения фосфорилирования и дефосфорилирования, а не только от активности киназ.Б. Общая инициация снижается дальше из-за усиления подавления eIF2B. (неверный вариант)Дефосфорилирование eIF2α ослабляет, а не усиливает подавление eIF2B в показанной петле.В. Доля eIF2(αP) уменьшается, что способствует восстановлению инициации. (верный вариант)PP1 в комплексе с регуляторной субъединицей удаляет фосфат с eIF2α и ослабляет подавление eIF2B.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWek R.C., Anthony T.G., Staschke K.A. Surviving and Adapting to Stress: Translational Control and the Integrated Stress Response. Antioxid Redox Signal. 2023.Ryoo H.D. The integrated stress response in metabolic adaptation. J Biol Chem. 2024.Novoa I. et al. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2alpha. J Cell Biol. 2001;153:1011–22.Jousse C. et al. Inhibition of a constitutive translation initiation factor 2alpha phosphatase, CReP, promotes survival of stressed cells. J Cell Biol. 2003;163:767–75.Схема механизма, качественные состояния «раньше» и «позже» при одинаковой активности киназы; клетки млекопитающих. Novoa 2001 — клетки CHO и мышиные клетки без PERK или GCN2; стресс ЭПР и отсутствие аминокислот; избыточная экспрессия C-концевого фрагмента GADD34 (прочитана аннотация). Jousse 2003 — подавление CReP РНК-интерференцией в культуре клеток (прочитана аннотация). Обзоры Wek 2023 и Ryoo 2024 — полные тексты. Временная шкала не задана: «раньше» и «позже» обозначают порядок событий. ASNS и переносчики аминокислот приведены как примеры мишеней ATF4 (Wek 2023).
ISR: eIF2α и ATF4 · шаг 5 из 30Почему длительный ISR не означает неизбежной гибели клеткиISR — не программа гибели клетки. Его исход зависит от того, устранено ли вызвавшее его нарушение, насколько сильным и долгим был ответ и в какой клетке он идёт.Раннее снижение общей трансляции уменьшает поступление новых полипептидов, в том числе в ЭПР, и уменьшает расход аминокислот на синтез белка.ATF4 и связанные с ним регуляторы изменяют экспрессию генов синтеза и переноса аминокислот, обратной связи и других адаптационных процессов.При длительном неустранённом нарушении часть выходов ISR, в том числе зависимых от CHOP, может способствовать гибели клетки; само по себе содержание CHOP исход не определяет.Первое следствие ISR — замедление инициации трансляции большинства мРНК. В клетке со стрессом ЭПР это означает, что в просвет ЭПР поступает меньше новых полипептидов, которые нужно свернуть. В клетке с недостатком аминокислот на синтез белка расходуется меньше аминокислот. Одновременно избирательно транслируется мРНК ATF4, и ATF4 усиливает транскрипцию генов синтеза и переноса аминокислот, гена GADD34 и генов других транскрипционных факторов, например CHOP.Если нарушение устранено — аминокислоты вернулись в среду, белки в ЭПР свернулись, — киназы eIF2α перестают активироваться. Комплексы PP1 с CReP и GADD34 дефосфорилируют eIF2α, обменная активность eIF2B восстанавливается, и трансляция возвращается к исходной. Белки, синтезированные во время ответа, ещё некоторое время сохраняются в клетке. В этом случае ISR завершается адаптацией.Если нарушение сохраняется долго, состояние клетки меняется. Ось ATF4–CHOP–GADD34 возобновляет синтез белка, но при хронической активации ISR может способствовать гибели клетки (Ryoo 2024). CHOP (DDIT3) — транскрипционный регулятор, который вместе с ATF4 изменяет экспрессию многих генов, в том числе генов, способствующих апоптозу. Однако повышенное содержание CHOP показывает лишь, что ISR активен давно или сильно, а не то, что клетка уже погибла или обязательно погибнет. Исход зависит от типа клеток, силы и длительности воздействия и от других сигнальных путей.Отклонения в обе стороны связаны с болезнями. У мышей без PERK и у людей с мутациями её гена секреторные β-клетки поджелудочной железы не снижают синтез белка в ответ на стресс ЭПР, и уже в раннем возрасте развивается сахарный диабет. С диабетом связывают и мутацию, нарушающую CReP: β-клетки без CReP при постоянно повышенном фосфорилировании eIF2α легче вступают в апоптоз. Нормальной работе β-клеток нужен ответ, соответствующий нарушению, а не максимальный или нулевой.Типичная ошибка Длительный ISR всегда приводит клетку к гибели, а CHOP — однозначный признак уже погибшей клетки.ISR прежде всего обеспечивает адаптацию. При длительном неустранённом нарушении вклад механизмов, способствующих гибели, возрастает, но исход зависит от клетки, силы и длительности воздействия; CHOP — регулятор, а не показатель завершённого апоптоза.В клетке длительно повышено содержание CHOP. Достаточно ли этого признака, чтобы утверждать, что клетка уже погибла?А. Нет: CHOP может участвовать в ответе, но исход зависит от дополнительных условий. (верный вариант)Роль CHOP зависит от типа клеток и от того, сохраняется ли нарушение; один белок не определяет весь исход.Б. Да: образование CHOP само по себе равнозначно завершённому апоптозу. (неверный вариант)Регуляторный белок и исход клеточного процесса — разные уровни описания; его наличие не устанавливает факт гибели.В. Нет: CHOP регулирует только адаптацию и не может способствовать гибели. (неверный вариант)Отсутствие однозначного прогноза не означает отсутствия вклада CHOP в механизмы, способствующие гибели.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаCosta-Mattioli M., Walter P. The integrated stress response: From mechanism to disease. Science. 2020.Wek R.C., Anthony T.G., Staschke K.A. Surviving and Adapting to Stress: Translational Control and the Integrated Stress Response. Antioxid Redox Signal. 2023.Ryoo H.D. The integrated stress response in metabolic adaptation. J Biol Chem. 2024.Acosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Схема механизма, качественные состояния «раньше / позже»; обобщение по обзорам Costa-Mattioli 2020, Wek 2023, Ryoo 2024 (полные тексты) и Acosta-Alvear 2025. Количественный прогноз выживаемости и время начала апоптоза не задаются: они различаются для разных клеток и воздействий. Примеры с PERK и CReP — мыши без PERK, больные с синдромом Уолкотта–Раллисона и наблюдения на β-клетках, описанные в обзоре Costa-Mattioli 2020; выводов о лечении из них не следует.
ISR: eIF2α и ATF4 · шаг 6 из 30Почему отсутствие PERK не устраняет все пути ISRОтсутствие одной киназы eIF2α выключает лишь один вход ISR. Другие киназы по-прежнему фосфорилируют тот же Ser51, если активирован их собственный сигнал.PERK передаёт к eIF2α сигнал о нарушении сворачивания белков в ЭПР; без PERK этот вход нарушен.GCN2, PKR и HRI фосфорилируют eIF2α независимо от PERK, когда активированы своими сигналами; GCN2 для этого связывает деацилированные тРНК HisRS-подобным доменом (шаг 1).При нарушении работы митохондрий протеаза OMA1 расщепляет белок DELE1; фрагмент DELE1 выходит в цитозоль, связывается с HRI и активирует её.Четыре киназы eIF2α воспринимают разные сигналы, но действуют на общий субстрат. Поэтому выключение одной киназы — не то же самое, что выключение ISR. В клетках мыши без PERK накопление неправильно свёрнутых белков в ЭПР не вызывало фосфорилирования eIF2α, синтез белка оставался высоким, а клетки хуже переживали стресс ЭПР (Harding 2000). Если же в клетках без PERK активировать PKR двухцепочечной РНК, PKR фосфорилирует eIF2α, и дальнейшие события — подавление eIF2B, снижение общей трансляции и синтез ATF4 — развиваются так же, как при активации PERK.Такое сравнение называют генетическим: клетки, различающиеся одним геном, подвергают отдельным воздействиям и определяют один и тот же показатель — фосфорилирование eIF2α. Вывод корректен, если остальные киназы и сам eIF2α сохранены, а каждое воздействие активирует известную киназу. На схеме сопоставлены исходные клетки и клетки без PERK при трёх воздействиях.Значение отдельного входа видно и у человека. Мутации гена EIF2AK3, кодирующего PERK, вызывают синдром Уолкотта–Раллисона — редкое аутосомно-рецессивное заболевание, при котором сахарный диабет развивается в первые месяцы жизни, а позже появляются нарушения развития скелета (Delépine 2000). Синдром связывают с утратой именно PERK-зависимого входа в секреторных клетках, прежде всего в β-клетках поджелудочной железы, а не с утратой всех стрессовых ответов.Перечень входов ISR не ограничен каноническими сигналами. Guo и соавт. (2020) показали на клетках человека, что при нарушении работы митохондрий митохондриальная протеаза OMA1 расщепляет белок DELE1, связанный с внутренней мембраной. Фрагмент DELE1 накапливается в цитозоле, связывается с HRI и активирует её, а HRI фосфорилирует eIF2α. Так состояние митохондрий (семинар 9) влияет на трансляцию в цитозоле. Этот путь не следует отождествлять с ответами, которые регулируют сворачивание белков внутри самих митохондрий.Типичная ошибка HRI отвечает только на недостаток гема, поэтому нарушение работы митохондрий на ISR не влияет.HRI активируется и другими воздействиями. При нарушении работы митохондрий OMA1 расщепляет DELE1, фрагмент DELE1 в цитозоле связывается с HRI и активирует её, и eIF2α фосфорилируется без участия PERK.В клетках отсутствует PERK, но PKR и eIF2α сохранены. Воздействие двухцепочечной РНК активировало PKR. Может ли при этих условиях повыситься фосфорилирование eIF2α?А. Нет: фосфорилировать eIF2α способна только PERK. (неверный вариант)PERK — одна из четырёх киназ этого субстрата; PKR создаёт независимый вход.Б. Нет: PKR может действовать на eIF2α только через предварительную активацию PERK. (неверный вариант)PKR сама является киназой eIF2α; PERK не является обязательным промежуточным звеном этого пути.В. Да: активная PKR может фосфорилировать сохранённый eIF2α. (верный вариант)Потеря одной киназы не устраняет путь от другой активной киназы к общему субстрату.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаCosta-Mattioli M., Walter P. The integrated stress response: From mechanism to disease. Science. 2020.Harding H. P., Zhang Y., Bertolotti A., Zeng H., Ron D. Perk is essential for translational regulation and cell survival during the unfolded protein response. Mol Cell. 2000;5:897–904.Guo X. et al. Mitochondrial stress is relayed to the cytosol by an OMA1-DELE1-HRI pathway. Nature. 2020;579:427–432.Delépine M. et al. EIF2AK3, encoding translation initiation factor 2-alpha kinase 3, is mutated in patients with Wolcott-Rallison syndrome. Nat Genet. 2000;25:406–9.Схема генетического сравнения, качественные состояния; клетки млекопитающих, в которых остальные киназы и eIF2α сохранены; каждое воздействие задано как активирующее известную киназу (двухцепочечная РНК — PKR). Harding 2000 — эмбриональные клетки мыши с мутацией гена PERK, туникамицин (прочитана аннотация). Guo 2020 — клетки человека, нарушение работы митохондрий, скрининг CRISPRi (прочитана аннотация); обзор Wek 2023 — полный текст. Delépine 2000 — две семьи с синдромом Уолкотта–Раллисона, мутации EIF2AK3 (прочитана аннотация); выводов о лечении не делается.
ISR: eIF2α и ATF4 · шаг 7 из 30Как различить фосфорилирование eIF2α и изменение трансляцииФосфорилирование eIF2α, общий синтез белка и трансляция мРНК ATF4 — три разные величины. Каждую измеряют своим методом, и по одной из них нельзя заключить о другой.Иммуноблот показывает содержание определённой формы белка — eIF2α с фосфорилированным Ser51 — в сравнении с общим eIF2α.Кратковременное мечение новосинтезируемых белков характеризует общий синтез белка за выбранный интервал.Репортёр с 5′-областью мРНК ATF4, полисомное и рибосомное профилирование показывают изменение трансляции определённых мРНК, если количество этих мРНК проконтролировано.Фосфорилирование и общий синтез белкаФосфорилирование eIF2α определяют иммуноблотом. Белки клеточного лизата разделяют по размеру, переносят на мембрану и выявляют антителами к eIF2α с фосфорилированным Ser51 и к общему eIF2α. Сравнение двух сигналов при одинаковой загрузке показывает, как изменилась доля eIF2(αP); абсолютную долю без калибровки так не определить, а о скорости трансляции блот прямо не говорит. Общий синтез белка оценивают кратковременным мечением: клетки на короткое время переносят в среду с меченым метионином (радиоактивным или его химическим аналогом), затем определяют метку в белковой фракции. Метка отражает синтез за выбранный интервал, а не всё накопленное количество белка.Трансляция отдельных мРНКРепортёрная конструкция содержит 5′-область мРНК ATF4 перед последовательностью легко измеряемого белка, например люциферазы. Сигнал репортёра сравнивают при одинаковом количестве репортёрной мРНК и с вариантами, в которых изменён старт-кодон одной из uORF. Полисомное профилирование разделяет в градиенте плотности сахарозы свободные субъединицы, мРНК с одной рибосомой и полисомы — мРНК с несколькими рибосомами. При подавлении инициации доля полисом уменьшается. Рибосомное профилирование (Ribo-seq) устроено иначе: рибосома защищает от нуклеазы участок мРНК около 30 нуклеотидов, защищённые фрагменты секвенируют и по их положению видят, какие рамки транслируются — uORF или основная рамка.Пример: действие ISRIBПри умеренном ISR ISRIB восстанавливает общий синтез белка и снижает избирательный синтез ATF4, хотя сигнал фосфорилированного eIF2α на иммуноблоте почти не меняется. Это не противоречие: ISRIB связывается с eIF2B и уменьшает его чувствительность к eIF2(αP), а не действует на киназы или фосфатазы. При высокой доле eIF2(αP) эффект ISRIB пропадает (Rabouw 2019). Поэтому образцы «контроль», «стресс» и «стресс + ISRIB» сравнивают при одном сроке воздействия и одним набором методов.Типичная ошибка Полисомное профилирование и рибосомное профилирование — два названия одного метода.Полисомное профилирование разделяет мРНК по числу связанных рибосом в градиенте плотности. Рибосомное профилирование определяет секвенированием положение защищённых рибосомой фрагментов на мРНК и поэтому показывает, транслируется ли uORF или основная рамка.При умеренном ISR добавление ISRIB восстановило общую трансляцию, а сигнал p-eIF2α на иммуноблоте существенно не изменился. Какое объяснение согласуется с механизмом действия ISRIB?А. ISRIB непосредственно удалил фосфат с каждой молекулы eIF2α. (неверный вариант)Такой механизм не согласуется ни с мишенью ISRIB, ни с сохранённым сигналом p-eIF2α.Б. ISRIB ослабил подавление eIF2B, не изменив фосфорилирования eIF2α. (верный вариант)ISRIB действует на eIF2B; его эффект не равнозначен дефосфорилированию eIF2α.В. Иммуноблот p-eIF2α непосредственно измерил скорость синтеза всех белков. (неверный вариант)Блот определяет фосфорилированную форму; общую трансляцию регистрируют отдельно.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWek R.C., Anthony T.G., Staschke K.A. Surviving and Adapting to Stress: Translational Control and the Integrated Stress Response. Antioxid Redox Signal. 2023.Rabouw H. H. et al. Small molecule ISRIB suppresses the integrated stress response within a defined window of activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116:2097–2102.Schoof M. et al. eIF2B conformation and assembly state regulate the integrated stress response. eLife. 2021;10:e65703.Vattem KM., Wek RC. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:11269–74.Схемы принципов методов и учебные рисунки сигналов — не данные эксперимента. Образцы «контроль», «стресс» и «стресс + ISRIB» сравниваются при одном сроке; общий eIF2α и загрузка считаются неизменными, сигналы — в линейном диапазоне регистрации. Действие ISRIB — обзор Wek 2023 (полный текст), Rabouw 2019 (клеточные линии; прочитана аннотация), Schoof 2021 (тематические фрагменты); репортёр с 5′-областью ATF4 — Vattem и Wek 2004 (прочитана аннотация). Длина защищённого рибосомой фрагмента (около 30 нуклеотидов) приведена как типичная для метода.
UPR: три ветви ответа ЭПР · шаг 8 из 30Когда нагрузка на ЭПР превышает возможности сворачивания белковЭндоплазматический ретикулум (ЭПР) обрабатывает секреторные и многие мембранные белки. Стресс ЭПР возникает, когда белковая нагрузка превышает функциональную ёмкость ЭПР. Это несоответствие воспринимают три сенсора — PERK, IRE1α и ATF6, а ответ на неправильно свёрнутые белки (UPR) восстанавливает соответствие с двух сторон.Новые секреторные и мембранные полипептиды переносятся в ЭПР, где шапероны, ферменты образования дисульфидных связей и Ca²⁺-зависимые белки обеспечивают их сворачивание.Если поступление белков растёт или возможности сворачивания снижаются, в просвете ЭПР накапливаются неправильно свёрнутые белки — это и есть стресс ЭПР.Шаперон BiP участвует в регуляции сенсоров UPR, но не является единственным механизмом их активации: неправильно свёрнутые белки и состояние мембраны тоже влияют на сенсоры.Почти все секреторные белки и большинство мембранных белков синтезируются рибосомами, связанными с мембраной ЭПР, и уже во время синтеза переносятся в его просвет. Здесь полипептид приобретает нативную структуру: его связывают шапероны, в том числе BiP, ферменты образуют дисульфидные связи, присоединяются олигосахариды, а белки, зависимые от Ca²⁺, работают при высокой концентрации этого иона в просвете ЭПР. Только правильно свёрнутые и собранные белки покидают ЭПР в транспортных пузырьках.Белковой нагрузкой называют поступление белков, которые должны пройти эту обработку. Функциональная ёмкость ЭПР — совокупные возможности сворачивания, сборки и удаления дефектных молекул в данных условиях. Стресс ЭПР возникает при несоответствии двух величин, а не при росте одной из них: нагрузка может превысить ёмкость, если синтез белка усилен, например в плазматической клетке, или если ёмкость снижена — при нарушении работы шаперонов, условий образования дисульфидных связей или при уменьшении содержания Ca²⁺ в ЭПР.У млекопитающих несоответствие воспринимают три трансмембранных белка ЭПР: PERK, IRE1α и ATF6. По классической модели BiP связан с их люминальными доменами и при накоплении неправильно свёрнутых белков переходит к ним, освобождая сенсоры. Эта модель неполна: развёрнутые участки белков могут непосредственно связываться с люминальными доменами IRE1α и, по сходству строения, PERK, а IRE1α и PERK реагируют также на изменение липидного состава мембраны ЭПР.Поэтому стресс ЭПР и UPR различают: первое — отклонение от нормального состояния, второе — ответ на него, один из механизмов протеостаза — согласования синтеза, сворачивания, транспорта и удаления белков. UPR уменьшает поступление новых белков, увеличивает ёмкость ЭПР и ускоряет удаление дефектных молекул; следующие шаги разбирают, какая ветвь что изменяет.Типичная ошибка Стресс ЭПР возникает только тогда, когда клетка синтезирует больше белка.Важно соотношение нагрузки и ёмкости. При прежнем синтезе стресс ЭПР развивается, если снижены возможности сворачивания, например при нарушении работы шаперонов или потере Ca²⁺ из ЭПР.Скорость поступления новых белков в ЭПР не изменилась, но работа шаперонов нарушилась. Может ли при этом возникнуть стресс ЭПР?А. Да: прежняя нагрузка может превысить снизившиеся возможности сворачивания. (верный вариант)Важны обе стороны соотношения: поступление белков и способность ЭПР обработать их.Б. Нет: при неизменном поступлении белков нагрузка всегда соответствует возможностям ЭПР. (неверный вариант)При прежнем поступлении белков возможности их обработки могут уменьшиться; сравнивать нужно обе стороны соотношения.В. Нет: уменьшение числа функциональных шаперонов само по себе снижает поступление белков в той же степени. (неверный вариант)Автоматического равного уменьшения поступления из условия не следует; в вопросе скорость поступления прямо зафиксирована.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаAcosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Wiseman R.L., Mesgarzadeh J.S., Hendershot L.M. Reshaping Endoplasmic Reticulum Quality Control Through the Unfolded Protein Response. Mol Cell. 2022.Схема механизма для клеток млекопитающих; нагрузка и ёмкость показаны как качественные состояния, а не как измеряемые величины с общей шкалой. Модели активации сенсоров (связывание BiP, непосредственное связывание развёрнутых белков, влияние липидного состава мембраны) изложены по обзорам Acosta-Alvear 2025 и Wiseman 2022; на схеме все три сенсора активируются одновременно — это упрощение, их чувствительность и кинетика в клетках различаются.
UPR: три ветви ответа ЭПР · шаг 9 из 30Как PERK связывает стресс ЭПР с регуляцией трансляцииPERK — ветвь UPR, которая связывает состояние просвета ЭПР с регуляцией трансляции в цитозоле. Фосфорилируя eIF2α, PERK уменьшает общую инициацию трансляции, и в ЭПР поступает меньше новых белков.PERK пересекает мембрану ЭПР: люминальный домен воспринимает нарушение сворачивания белков в просвете, а киназный домен находится в цитозоле.Активированная PERK фосфорилирует Ser51 eIF2α; обменная активность eIF2B снижается, и тройного комплекса для инициации становится меньше.Общая трансляция замедляется, поэтому в ЭПР поступает меньше новых полипептидов, и нагрузка на ЭПР уменьшается.PERK — трансмембранная киназа ЭПР. Её люминальный домен обращён в просвет ЭПР и сходен с люминальным доменом IRE1α; киназный домен расположен в цитозоле и сходен с доменами других киназ eIF2α — PKR и HRI. При накоплении неправильно свёрнутых белков молекулы PERK объединяются в олигомеры и фосфорилируют друг друга, после чего киназный домен фосфорилирует субстрат — остаток Ser51 в α-субъединице eIF2.Дальше PERK использует тот же узел, что и другие киназы интегрированного стрессового ответа: фосфорилированный eIF2 подавляет обменную активность eIF2B, и тройной комплекс eIF2·GTP·Met-тРНКi образуется медленнее (подробно — в шаге «Почему фосфорилирование eIF2α снижает общую трансляцию»). Инициация трансляции на большинстве мРНК замедляется. Поскольку многие из этих мРНК кодируют секреторные и мембранные белки, в ЭПР поступает меньше новых полипептидов, и нагрузка на систему сворачивания снижается.Это снижение, а не прекращение синтеза белка. Часть мРНК, например мРНК ATF4, при фосфорилировании eIF2α транслируется даже активнее. ATF4 изменяет транскрипцию позже, чем PERK изменяет трансляцию, и определяет следующий этап ответа. Гены шаперонов ЭПР, в том числе BiP, регулируются прежде всего ветвями IRE1α–XBP1s и ATF6, поэтому BiP не следует считать прямой мишенью ATF4 во всех клетках.Значение этой разгрузки видно в генетическом эксперименте: в клетках мыши с мутацией гена Perk стресс ЭПР не вызывал фосфорилирования eIF2α, синтез белка оставался высоким, стресс ЭПР был сильнее, а выживание клеток ниже. У человека инактивирующие мутации PERK вызывают синдром Уолкотта–Раллисона с неонатальным сахарным диабетом: β-клетки поджелудочной железы особенно зависят от этой регуляции.Типичная ошибка Активированная PERK останавливает синтез всех белков клетки.PERK снижает общую инициацию трансляции, но не прекращает её: синтез белка продолжается с меньшей скоростью, а трансляция отдельных мРНК, например мРНК ATF4, даже усиливается.Какое раннее изменение непосредственно связано с киназным выходом PERK при стрессе ЭПР?А. Удаление 26-нуклеотидного интрона из мРНК XBP1. (неверный вариант)Это выход IRE1; PERK непосредственно фосфорилирует eIF2α.Б. Повышение p-eIF2α и уменьшение общей инициации трансляции. (верный вариант)Так киназный сигнал PERK уменьшает скорость поступления новых белков в систему ЭПР.В. Освобождение N-концевого фрагмента ATF6 в аппарате Гольджи. (неверный вариант)Это протеолитическая активация другой ветви UPR, а не непосредственный киназный выход PERK.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаHarding HP. et al. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 1999;397:271–4.Harding H. P., Zhang Y., Bertolotti A., Zeng H., Ron D. Perk is essential for translational regulation and cell survival during the unfolded protein response. Mol Cell. 2000;5:897–904.Acosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Wiseman R.L., Mesgarzadeh J.S., Hendershot L.M. Reshaping Endoplasmic Reticulum Quality Control Through the Unfolded Protein Response. Mol Cell. 2022.Схема механизма; ранний канонический ответ на стресс ЭПР в клетках млекопитающих, другие киназы eIF2α в схеме не активированы. Состояния качественные: сила торможения трансляции в разных клетках и при разных воздействиях различается. Эксперимент с Perk: клетки мыши с мутацией гена Perk, стресс ЭПР вызван туникамицином и другими воздействиями; измерены фосфорилирование eIF2α, синтез белка и выживание (Harding 2000, по аннотации). Синдром Уолкотта–Раллисона и роль PERK в β-клетках — по обзору Acosta-Alvear 2025.
UPR: три ветви ответа ЭПР · шаг 10 из 30Как IRE1 и РНК-лигаза образуют мРНК XBP1sIRE1α — трансмембранный белок ЭПР с киназным и эндорибонуклеазным (РНКазным) доменами. При стрессе ЭПР его РНКазный домен вырезает из мРНК XBP1 короткий интрон. Соединяет части мРНК другой фермент — РНК-лигаза RtcB; в результате образуется мРНК XBP1s, кодирующая активный транскрипционный фактор.При стрессе ЭПР молекулы IRE1α объединяются в олигомеры и фосфорилируют друг друга; при этом активируется их РНКазный домен, обращённый в цитозоль.РНКазный домен IRE1α расщепляет мРНК XBP1 на границах интрона из 26 нуклеотидов, а РНК-лигаза RtcB соединяет 5′- и 3′-части мРНК.Удаление 26 нуклеотидов сдвигает рамку считывания в 3′-части мРНК, и вместо белка XBP1u синтезируется XBP1s — транскрипционный фактор с доменом активации.Белок IRE1α кодирует ген ERN1. Его люминальный домен расположен в просвете ЭПР, а киназный и РНКазный домены — в цитозоле. При накоплении неправильно свёрнутых белков молекулы IRE1α образуют олигомеры и фосфорилируют друг друга; в таком состоянии РНКазный домен расщепляет определённые РНК. Главный субстрат — мРНК XBP1. Её доставляет к мембране ЭПР сам транслируемый полипептид XBP1u: гидрофобный участок этого белка распознаётся частицей узнавания сигнала, и мРНК оказывается рядом с IRE1α.Удаление интрона из мРНК XBP1 называют неканоническим сплайсингом: оно происходит в цитозоле без сплайсосомы. IRE1α разрезает мРНК в двух местах и освобождает интрон, у большинства позвоночных длиной 26 нуклеотидов. Концы мРНК сближаются, и РНК-лигаза RtcB вместе с кофактором археазой соединяет их. В клетках без RtcB сплайсинг мРНК XBP1 при стрессе ЭПР нарушался, а восстановление активной лигазы его возвращало. IRE1α разрезает мРНК, но не соединяет её части. Для двух разрезов мРНК XBP1 в реконструированной системе субъединицы IRE1 должны были работать кооперативно в олигомере (Tam 2014); чем это отличается от расщепления других РНК, объясняет шаг 13.Число 26 не кратно трём, поэтому после удаления интрона 3′-часть мРНК читается в другой рамке. Белки XBP1u и XBP1s имеют общий N-концевой bZIP-домен, связывающий ДНК, но разные C-концы. У XBP1s C-конец содержит домен активации транскрипции, и этот белок усиливает экспрессию генов шаперонов, ферментов сворачивания и белков ERAD. XBP1u несёт дегрон, быстро разрушается и может выводить XBP1s и активный ATF6 из ядра, ограничивая ответ.У почкующихся дрожжей Ire1 — единственный сенсор стресса ЭПР: он вырезает интрон из мРНК HAC1, и белок Hac1 регулирует транскрипцию. Hac1 и XBP1 сходны по строению, но мРНК HAC1 и XBP1 различаются длиной интрона и способами регуляции, поэтому число 26 и детали механизма нельзя переносить с одного организма на другой.Типичная ошибка IRE1α сам вырезает интрон и сшивает мРНК XBP1, как это делает сплайсосома.IRE1α только разрезает мРНК. Части мРНК соединяет отдельный фермент — РНК-лигаза RtcB; без неё мРНК XBP1s не образуется, хотя IRE1α активен.Как распределяются функции при образовании мРНК XBP1s у млекопитающих?А. IRE1α выполняет и разрезание мРНК, и соединение экзонов без отдельной лигазы. (неверный вариант)РНКазный домен выполняет разрезание, а соединение экзонов требует РНК-лигазы RtcB.Б. IRE1α расщепляет мРНК, а RtcB соединяет оставшиеся экзоны. (верный вариант)Эндорибонуклеазная реакция и лигирование выполняются разными белками.В. Сплайсосома удаляет интрон в ядре без участия IRE1α. (неверный вариант)Рассматриваемое событие — неканонический сплайсинг, зависящий от IRE1, а не канонический сплайсинг пре-мРНК сплайсосомой.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаAcosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Calfon M. et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 2002;415:92–6.Lu Y. et al. A synthetic biology approach identifies the mammalian UPR RNA ligase RtcB. Mol Cell. 2014;55:758–70.Tam A.B., Koong A.C., Niwa M. Ire1 has distinct catalytic mechanisms for XBP1/HAC1 splicing and RIDD. Cell Rep. 2014;9:850–8.Схема механизма для клеток млекопитающих; этапы показаны последовательно и качественно. Длина интрона 26 нт относится к мРНК XBP1 большинства позвоночных (Acosta-Alvear 2025). Роль RtcB: клетки мыши с выключенным геном Rtcb и эксперименты сплайсинга in vitro (Lu 2014, по аннотации). IRE1 непосредственно расщепляет мРНК XBP1 in vitro; XBP1 необходим для UPR у нематоды Caenorhabditis elegans и для дифференцировки плазматических клеток у мыши (Calfon 2002, по аннотации). Кооперативность субъединиц IRE1 при разрезах XBP1/HAC1 — Tam 2014 (опыты in vitro, прочитана аннотация).
UPR: три ветви ответа ЭПР · шаг 11 из 30Почему ATF6 должен пройти через аппарат ГольджиATF6α синтезируется как мембранный белок ЭПР, и его транскрипционная часть не может попасть в ядро, пока не отделена от мембраны. Отделяют её протеазы аппарата Гольджи S1P и S2P, поэтому при стрессе ЭПР ATF6α сначала переносится из ЭПР в аппарат Гольджи.ATF6α — мембранный белок ЭПР; его N-концевая часть с bZIP-доменом обращена в цитозоль, C-концевая — в просвет ЭПР.При стрессе ЭПР ATF6α переносится в пузырьках COPII в аппарат Гольджи, где S1P, а затем S2P расщепляют его.Освобождённый N-концевой фрагмент ATF6f переходит в ядро и активирует транскрипцию генов шаперонов и других белков ЭПР.ATF6α — белок массой около 90 кДа, пересекающий мембрану ЭПР один раз. Его N-концевая половина с bZIP-доменом, способным связывать ДНК, обращена в цитозоль, а C-концевая часть — в просвет ЭПР. Пока белок закреплён в мембране, его транскрипционная часть в ядро не поступает. Поэтому ветвь ATF6 устроена иначе, чем ветвь IRE1α: изменяется не мРНК, а уже синтезированный белок.При стрессе ЭПР ATF6α покидает ЭПР в пузырьках COPII. Для ATF6α показано, что при этом восстанавливаются межмолекулярные дисульфидные связи, удерживающие его в олигомерах, и восстановленный белок входит в транспортные пузырьки. В аппарате Гольджи ATF6α расщепляют две протеазы: S1P разрезает его со стороны просвета, затем S2P — внутри мембраны. Это те же протеазы, которые активируют транскрипционные факторы SREBP при недостатке холестерина. Освобождённый фрагмент массой около 50 кДа, ATF6f, переходит в ядро.Перенос и протеолиз — два разных необходимых этапа. Если ATF6α не покидает ЭПР, протеазы с ним не встречаются. Если белок доставлен в аппарат Гольджи, но протеолиз заблокирован, полноразмерный ATF6α накапливается, а новый ATF6f не образуется. Поэтому различают образование фрагмента — скорость его освобождения — и содержание ATF6f в ядре, которое зависит также от его разрушения.В ядре ATF6f вместе с XBP1s активирует гены шаперонов, ферментов сворачивания и белков ERAD. Вклад ATF6α и XBP1 в эти гены частично перекрывается: в фибробластах мыши подавление ATF6α или ATF6β методом РНК-интерференции мало изменяло индукцию изученных генов UPR, а при сочетании отсутствия XBP1 с подавлением ATF6α нарушения были выражены сильнее. Мыши без ATF6α или без ATF6β развиваются, а без обоих белков погибают на ранних стадиях развития.Типичная ошибка Как только ATF6α попадает в аппарат Гольджи, он уже работает как транскрипционный фактор.В аппарате Гольджи ATF6α ещё закреплён в мембране. Транскрипцию регулирует только N-концевой фрагмент ATF6f, который освобождается после расщепления S1P и S2P.В учебной системе ATF6α достиг аппарата Гольджи, но его расщепление S1P и S2P полностью блокировано. Что произойдёт с образованием активного N-концевого фрагмента?А. Образование продолжится с прежней скоростью, поскольку доставки ATF6α в аппарат Гольджи достаточно. (неверный вариант)Доставка и протеолитическое освобождение домена — разные этапы. В условии следующий необходимый этап блокирован.Б. Образование сохранится благодаря повышению количества полноразмерного ATF6α в аппарате Гольджи. (неверный вариант)Накопление полноразмерного субстрата не заменяет полностью блокированное образование его N-концевого фрагмента.В. Образование нового фрагмента по этому пути прекратится, хотя ATF6α доставлен в аппарат Гольджи. (верный вариант)Транспорт и протеолитическая активация — разные необходимые этапы показанного пути.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаHaze K. et al. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 1999;10:3787–99.Ye J., Rawson R. B., Komuro R. et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 2000;6:1355–1364.Acosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Wiseman R.L., Mesgarzadeh J.S., Hendershot L.M. Reshaping Endoplasmic Reticulum Quality Control Through the Unfolded Protein Response. Mol Cell. 2022.Lee A.-H., Iwakoshi N. N., Glimcher L. H. XBP-1 regulates a subset of endoplasmic reticulum resident chaperone genes in the unfolded protein response. Mol Cell Biol. 2003;23:7448–7459.Схема механизма; ATF6α млекопитающих, состояния качественные. Мембранная топология и превращение p90 в p50 при стрессе ЭПР — клетки HeLa, туникамицин и тапсигаргин (Haze 1999, по аннотации). Расщепление S1P и S2P: в клетках CHO без S2P процессинг ATF6 блокирован полностью, без S1P — частично (Ye 2000, по аннотации); в вопросе блок обеих протеаз полный — это условие учебной задачи. Пузырьки COPII, восстановление дисульфидных связей ATF6α, фенотипы мышей без ATF6α и ATF6β — Acosta-Alvear 2025. Зависимость генов UPR от XBP1 и ATF6α — фибробласты мыши с нокаутом XBP1 и нокдауном ATF6α методом РНК-интерференции (Lee 2003). ATF6β и родственные белки семейства CREB3 здесь не рассматриваются.
UPR: три ветви ответа ЭПР · шаг 12 из 30Как UPR изменяет возможности секреторной клеткиUPR восстанавливает соответствие нагрузки и ёмкости ЭПР тремя способами: уменьшает поступление новых белков, увеличивает возможности сворачивания и ускоряет удаление дефектных молекул. Последний путь — деградация, связанная с ЭПР (ERAD): дефектный белок переносится из ЭПР в цитозоль и разрушается протеасомой.PERK снижает общую инициацию трансляции, и в ЭПР поступает меньше новых белков; этот эффект развивается быстро.XBP1s и ATF6f усиливают экспрессию генов шаперонов, ферментов сворачивания и белков ERAD; ёмкость ЭПР растёт медленнее — по мере синтеза этих белков.ERAD распознаёт дефектный белок, переносит его через мембрану ЭПР в цитозоль, где белок убиквитинируется и разрушается протеасомой; повторное сворачивание, напротив, идёт в просвете ЭПР.Белок, поступивший в ЭПР, может пройти два пути. Если шапероны и ферменты сворачивания доводят его до нативной структуры, он покидает ЭПР и через аппарат Гольджи достигает места назначения. Если белок остаётся неправильно свёрнутым, его повторно связывают шапероны; а если и это не помогает, белок распознаётся как дефектный и направляется на ERAD. При ERAD белок переносится через мембрану ЭПР в цитозоль, по мере выхода убиквитинируется и разрушается протеасомой. Устойчивые к ERAD белки и агрегаты, например некоторые формы проколлагена и нестабильные варианты инсулина, удаляются иначе — при ER-фагии части ЭПР поступают в лизосомы. Подробно эти пути разбирает семинар 11.UPR изменяет все три стороны баланса. PERK быстро снижает поступление новых белков. Транскрипционные факторы XBP1s и ATF6f увеличивают экспрессию генов шаперонов, ферментов сворачивания и белков ERAD, а также стимулируют синтез липидов и расширение мембран ЭПР. Ёмкость растёт медленнее, чем снижается поступление: для этого нужны транскрипция, трансляция и сборка новых белков. Уменьшение поступления не удаляет уже накопленные неправильно свёрнутые белки — для этого нужны повторное сворачивание и ERAD.Значение такой перестройки видно в специализированных секреторных клетках. Покоящийся B-лимфоцит содержит мало ЭПР, а плазматическая клетка, образующаяся из него, заполнена ЭПР и секретирует тысячи молекул антител в секунду; ЭПР расширяется под действием IRE1α–XBP1s ещё до начала массового синтеза антител, а без XBP1 стимулированные B-клетки мыши не завершают секреторное созревание и интенсивная секреция антител нарушается. β-клетки поджелудочной железы после стимуляции глюкозой синтезируют до миллиона молекул проинсулина в минуту, но непостоянно; для них важны и XBP1s, и PERK.Типичная ошибка Если PERK снизила поступление белков, накопившиеся неправильно свёрнутые белки исчезают сами.PERK уменьшает только поступление новых белков. Уже накопленные дефектные молекулы должны быть повторно свёрнуты шаперонами или удалены — путём ERAD или ER-фагии.Какой процесс отличает ERAD от повторного сворачивания белка шаперонами в просвете ЭПР?А. Использование информации о качестве структуры белка. (неверный вариант)Оценка структуры относится к обоим маршрутам и поэтому не является их отличительным признаком.Б. Перенос дефектного белка в цитозоль и его разрушение протеасомой. (верный вариант)Этот маршрут удаления отличает ERAD от попытки восстановить структуру в просвете ЭПР.В. Сохранение белка в просвете ЭПР до восстановления нативной структуры. (неверный вариант)Так описывается путь повторного сворачивания, а не отличительный этап ERAD.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаWiseman R.L., Mesgarzadeh J.S., Hendershot L.M. Reshaping Endoplasmic Reticulum Quality Control Through the Unfolded Protein Response. Mol Cell. 2022.Acosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Схема механизма; состояния качественные, «раннее» и «позднее» — порядок событий, а не измеренные сроки. Пути контроля качества, ERAD и ER-фагия, плазматические клетки (мышь, B-клетки ex vivo) и β-клетки (модели мыши и клеточные линии) — по обзору Wiseman 2022; это разные экспериментальные системы, и их данные не объединены в один эксперимент. Роль UPR в расширении мембран ЭПР — Acosta-Alvear 2025.
UPR: три ветви ответа ЭПР · шаг 13 из 30Почему активность IRE1 не сводится к образованию XBP1sРНКазный домен IRE1α расщепляет не только мРНК XBP1. При RIDD он разрушает и другие РНК, уменьшая их содержание, а фосфорилированный IRE1α может передавать сигнал на путь JNK. Поэтому образование XBP1s — лишь один из выходов IRE1α, и по одному показателю нельзя судить обо всех последствиях его активации.Продуктивный выход РНКазного домена — сплайсинг мРНК XBP1, после которого синтезируется транскрипционный фактор XBP1s.Один и тот же РНКазный домен работает в разных режимах: в реконструированной системе для разрезов XBP1/HAC1 нужна кооперативная работа субъединиц в олигомере IRE1, а для RIDD достаточно одной субъединицы без кооперативности (Tam 2014).При RIDD IRE1α непосредственно расщепляет другие РНК, прежде всего мРНК, связанные с мембраной ЭПР; их содержание снижается без участия XBP1s.Фосфорилированный IRE1α может связывать TRAF2 и активировать путь JNK; последствия этого сигнала зависят от клеток и условий.Сплайсинг мРНК XBP1 и RIDD выполняет один и тот же РНКазный домен IRE1α, но это разные события. При сплайсинге мРНК XBP1 не разрушается: из неё удаляется интрон, и образуется мРНК, кодирующая активный транскрипционный фактор. При RIDD IRE1α расщепляет другие РНК, и их фрагменты разрушаются клеточными нуклеазами. Содержание этих РНК снижается сразу, без транскрипции, которую регулирует XBP1s.В фибробластах мыши мРНК разрушались при стрессе ЭПР в клетках с нормальным IRE1, но не в клетках с вариантом IRE1 без нуклеазной активности. С помощью варианта IRE1, который активируется аналогом ATP, удалось вызвать сплайсинг XBP1 без стресса ЭПР, однако RIDD при этом не наблюдался: для него потребовались и активность IRE1, и стресс ЭПР. Значит, разные состояния ЭПР могут включать разные выходы одного белка.Как один РНКазный домен различает эти выходы, показали Tam и соавт. (2014) in vitro. В реконструированной системе мРНК XBP1 (у дрожжей — HAC1) расщеплялась субъединицами IRE1, которые работали кооперативно внутри олигомера, а RIDD выполняла одна субъединица без кооперативности. Два режима удалось разделить: комплементацией каталитически неактивного варианта РНКазы и заменами на поверхностях, через которые IRE1 образует олигомеры. Следовательно, в этой системе один и тот же РНКазный домен работает с разными РНК по-разному: для разреза XBP1 существенна организация комплекса, а для расщепления других РНК — нет.Из этого результата не следует правило «олигомер — только сплайсинг XBP1, мономер или малая сборка — только RIDD». Работа выполнена in vitro; какие сборки IRE1 действуют в клетке на какие субстраты, зависит от системы и в разобранных источниках не определено. На выбор выхода могут влиять и другие факторы: доступность РНК у мембраны ЭПР (мРНК XBP1 подводит к мембране синтезируемый полипептид XBP1u, а мишени RIDD — преимущественно мРНК, связанные с мембраной), строение и последовательность самой РНК, сила и длительность стресса, конформация и олигомерное состояние IRE1. Вклад каждого фактора для отдельных мишеней не установлен, и общей для всех клеток временной последовательности выходов нет.Субстраты RIDD часто кодируют секреторные и мембранные белки, поэтому RIDD уменьшает поступление белков в ЭПР. Описаны и более специальные мишени: расщепление мРНК BLOS1 изменяет расположение лизосом, мРНК DR5 — чувствительность к сигналам апоптоза, мРНК DGAT2 — синтез липидов. Фосфорилированный IRE1α связывает адаптерный белок TRAF2 и активирует путь JNK. Ни один из этих выходов сам по себе не определяет судьбу клетки.Ингибитор 4μ8C закрывает доступ субстрата к активному центру РНКазного домена и подавляет оба РНКазных режима, но не удаляет белок и не прекращает напрямую связывание IRE1α с TRAF2; влияние 4μ8C на путь к JNK в разобранных работах не измеряли, поэтому его нельзя считать выключателем всех функций IRE1α.Выходы Ire1 различаются и у дрожжей. У почкующихся дрожжей Ire1 действует главным образом через сплайсинг мРНК HAC1, а у делящихся дрожжей транскрипционной программы такого типа нет, и ответ опирается на RIDD. Это показывает, что один сенсор может использовать разные выходы, но не восстанавливает последовательность их появления в эволюции.Типичная ошибка XBP1s объясняет все последствия активации IRE1α, поэтому без XBP1 у IRE1α нет других эффектов.IRE1α непосредственно расщепляет и другие РНК (RIDD) и через TRAF2 влияет на путь JNK. Эти выходы не зависят от транскрипции, которую регулирует XBP1s, хотя используют тот же сенсор.Почему образование XBP1s не описывает все возможные последствия активации IRE1?А. РНКазные эффекты IRE1 сводятся к транскрипционному действию белка XBP1s. (неверный вариант)IRE1 может непосредственно расщеплять другие РНК; этот выход нельзя заменить последующей транскрипцией, регулируемой XBP1s.Б. По количеству XBP1s можно определить набор других РНК, расщеплённых IRE1. (неверный вариант)Показатель одного субстрата не задаёт автоматически набор и выраженность остальных РНКазных выходов.В. IRE1 может также расщеплять другие РНК, изменяя их содержание. (верный вариант)Помимо сплайсинга XBP1 у IRE1 есть и другие выходы, включая RIDD; их последствия зависят от субстратов.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаAcosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Hollien J. et al. Regulated Ire1-dependent decay of messenger RNAs in mammalian cells. J Cell Biol. 2009;186:323–31.Wiseman R.L., Mesgarzadeh J.S., Hendershot L.M. Reshaping Endoplasmic Reticulum Quality Control Through the Unfolded Protein Response. Mol Cell. 2022.Cross B. C. S., Bond P. J., Sadowski P. G. et al. The molecular basis for selective inhibition of unconventional mRNA splicing by an IRE1-binding small molecule. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:E869–E878.Tam A.B., Koong A.C., Niwa M. Ire1 has distinct catalytic mechanisms for XBP1/HAC1 splicing and RIDD. Cell Rep. 2014;9:850–8.Схема механизма; выходы показаны качественно и по отдельности. RIDD в клетках млекопитающих: фибробласты мыши, вариант IRE1 без нуклеазной активности и вариант, активируемый аналогом ATP (Hollien 2009, по аннотации). Примеры субстратов RIDD (BLOS1, DR5, DGAT2, MHC класса I) и различие выходов Ire1 у почкующихся и делящихся дрожжей — Acosta-Alvear 2025; набор субстратов зависит от типа клеток. Связь фосфорилированного IRE1 с TRAF2 и JNK — Wiseman 2022. 4μ8C подавляет сплайсинг XBP1 и RIDD, киназная активность сохраняется (Cross 2012, по аннотации). Tam 2014 — опыты in vitro с IRE1 (прочитана аннотация): кооперативность при разрезах XBP1/HAC1 и её отсутствие при RIDD показаны в этой системе и не переносятся как общее правило на все клетки. Те же авторы с ингибитором STF-083010 сообщили о разных последствиях подавления сплайсинга XBP1 и RIDD для выживания клеток; здесь этот вывод не используется.
UPR: три ветви ответа ЭПР · шаг 14 из 30Какие признаки позволяют различить три ветви UPRКаждую ветвь UPR определяют по её собственному молекулярному событию: PERK — по фосфорилированию eIF2α, IRE1α — по сплайсингу мРНК XBP1, ATF6 — по образованию N-концевого фрагмента. Один показатель не устанавливает состояние двух других ветвей, а p-eIF2α не указывает, какая киназа его фосфорилировала.Фосфорилирование eIF2α — общий узел интегрированного стрессового ответа: при стрессе ЭПР его вызывает PERK, но тот же Ser51 фосфорилируют и другие киназы.Сплайсинг мРНК XBP1 — признак одного выхода IRE1α; его определяют по продуктам ОТ-ПЦР разной длины.Образование ATF6f — признак протеолитической активации ATF6; его определяют иммуноблотом по фрагменту меньшей массы.Три ветви UPR изменяют разные молекулы, поэтому и регистрируют их разными способами. Для ветви PERK обычно измеряют содержание фосфорилированного по Ser51 eIF2α относительно общего eIF2α (иммуноблот). Для ветви IRE1α — сплайсинг мРНК XBP1: из РНК получают кДНК, амплифицируют участок вокруг интрона и разделяют продукты XBP1u и XBP1s, различающиеся на 26 пар нуклеотидов. Для ветви ATF6 — появление N-концевого фрагмента ATF6f на иммуноблоте. Каждый показатель отвечает на свой вопрос и не заменяет двух других.Стресс ЭПР вызывают веществами с известными первичными мишенями. Туникамицин ингибирует GlcNAc-1-P-трансферазу — фермент первой стадии N-гликозилирования в мембране ЭПР. Тапсигаргин ингибирует Ca²⁺-АТФазу ЭПР (SERCA), и запасы Ca²⁺ в ЭПР уменьшаются. DTT восстанавливает дисульфидные связи и препятствует их образованию во вновь синтезированных белках. Все три вещества нарушают сворачивание белков разными путями; ни одно из них не является прямым активатором сенсора.Чтобы проверить вклад ветви, её подавляют. 4μ8C ковалентно связывается с остатком лизина в РНКазном домене IRE1 и подавляет сплайсинг XBP1 и RIDD, сохраняя киназный домен. GSK2606414 ингибирует PERK, но в той же или меньшей концентрации ингибирует и киназу RIPK1, поэтому вывод о PERK подтверждают генетически: клетки без PERK или IRE1α сравнивают с исходными и проверяют, восстанавливается ли ответ при возвращении белка.Отрицательный результат тоже ограничен. Если полоса продукта XBP1s не видна, это значит, что его содержание ниже порога обнаружения метода, а не что IRE1α полностью неактивен; к тому же RIDD этим методом не регистрируется. Для проверки вклада выбранного фактора остальные условия — срок, дозу, генотип и способ подготовки образца — сохраняют сопоставимыми.Типичная ошибка Если продукт XBP1s в геле не виден, IRE1α в клетке полностью неактивен.Отсутствие полосы означает, что содержание мРНК XBP1s ниже чувствительности метода. Кроме того, IRE1α может работать через RIDD или путь JNK, которые ОТ-ПЦР XBP1 не регистрирует.В образце повышен p-eIF2α. Данных о XBP1s и расщеплении ATF6 нет. Какой вывод обоснован?А. Все три ветви UPR активированы, причём в одинаковой степени, поскольку они отвечают на один стресс ЭПР. (неверный вариант)Один показатель общего узла ISR не измеряет независимо выходы IRE1 и ATF6.Б. Источник сигнала однозначно установлен: фосфорилирование eIF2α в этом образце вызвала киназа PERK. (неверный вариант)Тот же Ser51 фосфорилируют и другие киназы; для установления входа требуется дополнительное сравнение.В. Повышено фосфорилирование eIF2α; источник сигнала и состояние двух других ветвей ещё не установлены. (верный вариант)Для различения ветвей нужны показатели их собственных молекулярных событий и соответствующие контроли.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаAcosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Wiseman R.L., Mesgarzadeh J.S., Hendershot L.M. Reshaping Endoplasmic Reticulum Quality Control Through the Unfolded Protein Response. Mol Cell. 2022.Lu Y. et al. A synthetic biology approach identifies the mammalian UPR RNA ligase RtcB. Mol Cell. 2014;55:758–70.Yoo J., Mashalidis E. H., Kuk A. C. Y. et al. GlcNAc-1-P-transferase–tunicamycin complex structure reveals basis for inhibition of N-glycosylation. Nat Struct Mol Biol. 2018;25:217–224.Thastrup O., Cullen P. J., Drøbak B. K. et al. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca²⁺ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:2466–2470.Braakman I., Helenius J., Helenius A. Manipulating disulfide bond formation and protein folding in the endoplasmic reticulum. EMBO J. 1992;11:1717–1722.Cross B. C. S., Bond P. J., Sadowski P. G. et al. The molecular basis for selective inhibition of unconventional mRNA splicing by an IRE1-binding small molecule. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:E869–E878.Axten J. M., Medina J. R., Feng Y. et al. Discovery of GSK2606414, a potent and selective first-in-class inhibitor of PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK). J Med Chem. 2012;55:7193–7207.Rojas-Rivera D., Delvaeye T., Roelandt R. et al. When PERK inhibitors turn out to be new potent RIPK1 inhibitors: critical issues on the specificity and use of GSK2606414 and GSK2656157. Cell Death Differ. 2017;24:1100–1110.Схемы методов и учебные рисунки полос — не данные эксперимента; интенсивности качественные, образцы условно собраны в один срок. Мишени веществ: туникамицин — GlcNAc-1-P-трансфераза человека (Yoo 2018); тапсигаргин — Ca²⁺-АТФаза ЭПР, микросомы печени крысы (Thastrup 1990); DTT — восстановление дисульфидных связей гемагглютинина вируса гриппа в клетках CHO (Braakman 1992); 4μ8C — Lys907 РНКазного домена IRE1 (Cross 2012); GSK2606414 — ингибитор PERK (Axten 2012), ингибирует также RIPK1 (Rojas-Rivera 2017). Сведения о веществах взяты из аннотаций этих работ.
KEAP1–NRF2 · шаг 15 из 30Почему содержание NRF2 мало без электрофильного воздействияБез электрофильного воздействия NRF2 синтезируется постоянно, но его содержание остаётся низким: белок быстро разрушается. Скорость разрушения задаёт комплекс KEAP1–CUL3–RBX1, который направляет NRF2 на убиквитинирование и протеасомную деградацию.KEAP1 связывает NRF2 и служит субстратным адаптером убиквитинлигазного комплекса CUL3–RBX1.Комплекс присоединяет к NRF2 цепь убиквитина, и убиквитинированный NRF2 расщепляется протеасомой.В стационарном состоянии NRF2 разрушается с той же общей скоростью, с какой синтезируется; его содержание тем выше, чем меньшая доля молекул разрушается за единицу времени, поэтому замедление разрушения при прежнем синтезе повышает содержание.NRF2 (продукт гена NFE2L2) — транскрипционный фактор, регулирующий гены защиты от электрофилов и окислителей. В клетке без такого воздействия мРНК NRF2 транслируется, и белок образуется непрерывно. Тем не менее NRF2 в клетке мало: по данным разных работ, период полужизни NRF2 в исходном состоянии составляет около 7–20 мин.Быстрое удаление NRF2 зависит от KEAP1. Раньше KEAP1 считали пассивным «якорем», удерживающим NRF2 в цитоплазме. Эксперименты с трансфицированными клетками показали иное: KEAP1 связывает NRF2 и как субстратный адаптер присоединяет его к куллину CUL3, а белок RBX1 этого комплекса обеспечивает перенос убиквитина. Сам KEAP1 не протеаза и не фермент переноса убиквитина: он определяет, какой белок будет убиквитинирован. NRF2 с цепью убиквитина распознаётся и расщепляется протеасомой.Содержание любого белка складывается из двух процессов — образования и удаления. При постоянной скорости синтеза замедление разрушения увеличивает стационарное содержание NRF2, а ускорение разрушения уменьшает его. Сразу после замедления разрушения NRF2 удаляется медленнее, чем образуется, и накапливается; новое стационарное содержание устанавливается, когда общая скорость разрушения — произведение числа молекул на разрушаемую долю — снова сравнивается со скоростью синтеза. Поэтому накопление NRF2 возможно без усиления транскрипции его гена: достаточно ослабить KEAP1-зависимое разрушение. Кроме KEAP1-зависимого пути есть и другой: киназа GSK3 фосфорилирует участок NRF2, и фосфорилированный участок распознаётся убиквитинлигазой с β-TrCP. Этот путь сохраняется при нарушенной работе KEAP1.Тот же принцип — регуляция количества белка через скорость его разрушения — встретится в разделе о HIF-α. Там распознавание определяется гидроксилированием пролина, а убиквитинирование выполняет другой комплекс. Сходство здесь функциональное: в обоих случаях содержание фактора определяется скоростью его разрушения, хотя молекулярные участники разные.Типичная ошибка Если NRF2 в клетке мало, значит, его ген слабо транскрибируется или мРНК почти не транслируется.В исходном состоянии NRF2 синтезируется постоянно; его мало потому, что он быстро разрушается при участии KEAP1. Количество белка нельзя оценивать только по синтезу.В исходном стационарном состоянии скорость синтеза NRF2 постоянна. KEAP1-зависимое направление NRF2 на разрушение замедлилось; остальные пути распада не изменились. Какое изменение содержания NRF2 ожидается?А. Содержание уменьшится из-за усиления его убиквитинирования. (неверный вариант)В условии ослаблен путь к разрушению; увеличение убиквитинирования не является заданным изменением.Б. Содержание возрастёт за счёт замедленного распада. (верный вариант)При продолжающемся синтезе уменьшение скорости удаления приводит к накоплению белка.В. Содержание останется прежним, поскольку скорость синтеза не изменилась. (неверный вариант)Стационарное содержание зависит также от скорости распада; постоянный синтез не фиксирует количество белка.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Kobayashi A. et al. Oxidative stress sensor Keap1 functions as an adaptor for Cul3-based E3 ligase to regulate proteasomal degradation of Nrf2. Mol Cell Biol. 2004;24:7130–9.Ulasov A.V. et al. Nrf2/Keap1/ARE signaling: Towards specific regulation. Life Sci. 2022;291:120111; online 2021.Схема механизма, качественные состояния; величины на шкалах условные (уровни «низкий — высокий»), а не измерения. KEAP1-зависимый путь показан как канонический для клеток млекопитающих. Период полужизни NRF2 7–18 мин в разных клетках приведён по обзору Ulasov 2022; менее 20 мин — Kobayashi 2004 (клетки млекопитающих в культуре, по аннотации). Путь GSK3–β-TrCP описан в обзоре Ulasov 2022; в схеме он показан пунктиром и не меняется.
KEAP1–NRF2 · шаг 16 из 30Как модификация цистеинов KEAP1 изменяет устойчивость NRF2Электрофилы ковалентно модифицируют тиоловые группы цистеинов KEAP1, и комплекс KEAP1–CUL3–RBX1 перестаёт эффективно убиквитинировать NRF2. Для накопления NRF2 не обязательно, чтобы он отделился от KEAP1: связывание и продуктивное убиквитинирование — разные свойства комплекса.Электрофил принимает электронную пару, а тиоловая группа цистеина служит её донором; при реакции образуется ковалентная связь с остатком цистеина.Разные цистеины KEAP1 выполняют разные функции: Cys151 домена BTB нужен для ответа на сульфорафан и ряд других индукторов, а Cys273 и Cys288 промежуточной области IVR — для самого убиквитинирования NRF2.После модификации KEAP1 может по-прежнему связывать NRF2, но убиквитинирование ослабевает; занятый KEAP1 не принимает новые молекулы NRF2, и они накапливаются.Электрофил — соединение, способное принимать электронную пару при образовании химической связи. Тиоловая группа (–SH) боковой цепи цистеина богата электронами и легко вступает в такие реакции. Электрофилы — это не то же самое, что свободные радикалы или любые окислители: перекись водорода, например, окисляет цистеины KEAP1, но по другому механизму и с участием других остатков.В KEAP1 домен BTB обеспечивает образование димера и связывание с CUL3. Два домена Kelch этого димера распознают мотивы ETGE и DLG белка NRF2; связывание с ETGE прочнее, чем с DLG. Между доменами BTB и Kelch каждого мономера KEAP1 расположена промежуточная область IVR. Цистеины этих частей неравноценны. В экспериментах Zhang и Hannink (2003) на трансфицированных клетках замены Cys273 и Cys288 нарушали KEAP1-зависимое убиквитинирование NRF2, а Cys151 был нужен для того, чтобы сульфорафан и окислительное воздействие подавляли разрушение NRF2. Набор важных остатков зависит от индуктора, поэтому вывод о Cys151 нельзя переносить на все электрофилы.Как модификация останавливает разрушение NRF2? По данным Baird и соавт. (2013), полученным в живых клетках, комплекс проходит цикл: сначала NRF2 связан с одним мономером KEAP1 через ETGE, затем с обоими — через ETGE и DLG; в этом «закрытом» состоянии NRF2 убиквитинируется. Индуктор останавливает цикл в закрытом состоянии без освобождения NRF2: KEAP1 остаётся занят, и вновь синтезированный NRF2 накапливается. Это одна из моделей; общий вывод обзоров — электрофилы мало меняют связывание, но подавляют функцию KEAP1 как адаптера убиквитинлигазы.Возможен и другой путь — конкуренция за связывание без модификации цистеинов. Так действует p62: его мотив KIR связывается с доменом Kelch и вытесняет NRF2 из связи через DLG. Это иной механизм, и его следует отличать от электрофильной модификации.Типичная ошибка Все индукторы NRF2 действуют через один и тот же цистеин KEAP1 — Cys151.Набор важных остатков зависит от индуктора: ответ на сульфорафан требует Cys151, Cys273 и Cys288 нужны для самого убиквитинирования NRF2, а перекись водорода окисляет другие цистеины KEAP1.После действия электрофила KEAP1 продолжает связывать NRF2, но продуктивное убиквитинирование NRF2 уменьшается. Совместим ли такой результат с накоплением NRF2?А. Да: сохранённое связывание не означает сохранённого направления на разрушение. (верный вариант)Физическая связь и продуктивное убиквитинирование — разные свойства комплекса; первое может сохраняться при ослаблении второго.Б. Нет: NRF2 может накапливаться только после полного отделения от каждой молекулы KEAP1. (неверный вариант)Обязательная полная диссоциация не является общим условием электрофильной активации этого пути.В. Нет: любое связывание с KEAP1 обязательно ускоряет разрушение NRF2 в прежней степени. (неверный вариант)Модификация KEAP1 может менять функцию связанного комплекса без устранения самого взаимодействия.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Baird L. et al. Regulatory flexibility in the Nrf2-mediated stress response is conferred by conformational cycling of the Keap1-Nrf2 protein complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:15259–64.Zhang DD., Hannink M. Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1-dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress. Mol Cell Biol. 2003;23:8137–51.Dinkova-Kostova A. T. et al. Direct evidence that sulfhydryl groups of Keap1 are the sensors regulating induction of phase 2 enzymes that protect against carcinogens and oxidants. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99:11908–11913.Komatsu M. et al. The selective autophagy substrate p62 activates the stress responsive transcription factor Nrf2 through inactivation of Keap1. Nat Cell Biol. 2010;12:213–23.Схема механизма, качественные состояния; показан один мономер KEAP1, хотя KEAP1 действует как димер. Zhang & Hannink 2003 — трансфицированные клетки млекопитающих в культуре, сульфорафан и окислительное воздействие (прочитана аннотация; по индексам MeSH — клетки COS и NIH 3T3). Baird 2013 — живые клетки, перенос энергии флуоресценции, измеряемый методом времени жизни флуоресценции (по аннотации). Номера Cys151, Cys273 и Cys288 одинаковы для KEAP1 человека и мыши. Dinkova-Kostova 2002 — очищенный KEAP1 мыши (25 цистеинов), модификация дексаметазонмезилатом, масс-спектрометрия триптических пептидов: наиболее реакционноспособны C257, C273, C288, C297 (по аннотации). В экспериментах с очищенным белком авторы наблюдали разрушение комплекса KEAP1–Neh2 индукторами, а в клетках связывание в основном сохраняется — результат зависит от системы. Механизм p62 — Komatsu 2010, Liu 2022.
KEAP1–NRF2 · шаг 17 из 30Как NRF2 регулирует транскрипцию через малые Maf и AREСтабилизированный NRF2 действует в ядре: вместе с малым Maf-белком он образует гетеродимер, который связывается с элементом антиоксидантного ответа (ARE) в регуляторных областях генов-мишеней. Количество NRF2, его ядерная доля, связывание с ARE и синтез РНК генов-мишеней — четыре разных события, и их не следует сводить к одному показателю «активации».Накопившийся NRF2 переносится в ядро; в цитоплазме и ядре его количество задаётся также соотношением импорта и экспорта.NRF2 и малый Maf (MafF, MafG или MafK) образуют гетеродимер через лейциновые «молнии»; этот комплекс связывается с последовательностью ARE в ДНК.Связывание с ARE усиливает транскрипцию соответствующих генов; на части генов ARE может быть занят репрессором BACH1 в комплексе с малым Maf.После того как разрушение NRF2 замедлилось, новые молекулы накапливаются и переходят в ядро. NRF2 содержит сигналы ядерной локализации и сигналы ядерного экспорта, поэтому его распределение между цитоплазмой и ядром определяется балансом импорта и экспорта. Ядерная доля — отдельная величина: она может меняться иначе, чем общее количество белка.NRF2 принадлежит к белкам с основным участком и лейциновой «молнией» (bZIP). Связываться с ДНК он может только в паре с партнёром — одним из малых Maf-белков. Гетеродимер NRF2–Maf распознаёт ARE — короткую регуляторную последовательность ДНК в промоторах и энхансерах генов-мишеней. ARE — это участок ДНК, а не белок и не показатель окислительного повреждения. Не следует путать его с HRE — элементом, с которым связывается комплекс HIF-α с ARNT в ответе на гипоксию.Малые Maf-белки образуют комплексы и с другими факторами. Один из них — репрессор BACH1: в комплексе с малым Maf он занимает ARE ряда генов, например гена HMOX1, и подавляет их транскрипцию. В клетках HaCaT арсенит выводил BACH1 из ядра уже за 30 мин, и HMOX1 индуцировался задолго до заметного накопления NRF2 в ядре. Значит, транскрипция гена-мишени зависит не только от количества NRF2, но и от того, свободен ли ARE.Из этого следует порядок событий: стабилизация белка → накопление в ядре → связывание с ARE → синтез РНК. Каждое событие измеряют отдельно, и одно не доказывает другого. Наличие похожей на ARE последовательности в гене также не означает, что этот ген будет активирован в любой ткани: важны доступность хроматина и другие регуляторы.Типичная ошибка Если NRF2 оказался в ядре, все гены с последовательностью ARE обязательно активируются в любой клетке.Ядерная локализация — лишь одно из условий. Для транскрипции нужны гетеродимер с малым Maf, связывание с доступным ARE и отсутствие конкурирующих репрессоров, например BACH1.Какой комплекс непосредственно участвует в распознавании ARE в канонической транскрипционной программе NRF2?А. Комплекс NRF2 с KEAP1, который переносит оба белка к ARE. (неверный вариант)В каноническом ДНК-связывающем комплексе партнёром NRF2 служит малый Maf, а KEAP1 относится к регуляции его устойчивости.Б. Гетеродимер NRF2 с одним из малых Maf-белков. (верный вариант)Малые Maf служат партнёрами NRF2 в комплексе, связывающем соответствующие последовательности ДНК.В. Гетеродимер NRF2 с ARNT, который связывает HRE. (неверный вариант)ARNT и HRE относятся к канонической системе HIF; они не заменяют малые Maf и ARE в этом механизме.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Ulasov A.V. et al. Nrf2/Keap1/ARE signaling: Towards specific regulation. Life Sci. 2022;291:120111; online 2021.Схема механизма, качественные состояния; шкалы условные. Гетеродимер NRF2–малый Maf и ARE — обзоры Liu 2022 и Ulasov 2022. Сигналы ядерной локализации и экспорта NRF2 — обзор Ulasov 2022. Пример HMOX1: клетки HaCaT (кератиноциты человека), арсенит; выход BACH1 из ядра через 30 мин, накопление NRF2 в ядре к 3 ч — эксперимент, описанный в обзоре Liu 2022 (первичная работа в этой подготовке не прочитана).
KEAP1–NRF2 · шаг 18 из 30Почему NRF2-зависимая защита требует синтеза ферментовNRF2 — транскрипционный фактор: он сам не восстанавливает пероксиды и не связывает электрофилы. Защиту обеспечивают ферменты, гены которых транскрибируются при участии NRF2. Поэтому между накоплением NRF2 и ростом содержания ферментов проходит время: нужны транскрипция и трансляция.NRF2 усиливает транскрипцию генов ферментов синтеза глутатиона (GCLC и GCLM), восстановления хинонов (NQO1), тиоредоксиновой системы (TXNRD1), расщепления гема (HO-1) и др.Глутатионпероксидаза катализирует реакцию 2 GSH + H₂O₂ → GSSG + 2 H₂O, а глутатионредуктаза — реакцию GSSG + NADPH + H⁺ → 2 GSH + NADP⁺.Защитный эффект возникает после синтеза новых молекул ферментов и зависит от доступности их субстратов, в том числе NADPH.Связавшийся с ARE гетеродимер NRF2–малый Maf усиливает транскрипцию генов-мишеней. Набор таких генов широк: ферменты синтеза и использования глутатиона, тиоредоксиновой системы, обезвреживания чужеродных веществ, образования NADPH и обмена гема. Для объяснения достаточно нескольких примеров. GCLC и GCLM — каталитическая и модифицирующая субъединицы глутамат-цистеин-лигазы, фермента первой стадии синтеза глутатиона. NQO1 восстанавливает хиноны. TXNRD1 восстанавливает тиоредоксин за счёт NADPH. HO-1 (продукт гена HMOX1) расщепляет гем; её ген регулируется не только NRF2, и рост HO-1 не означает защиты от любого повреждения.Глутатион (GSH) — трипептид γ-глутамилцистеинилглицин; его тиоловая группа служит донором электронов. Глутатионпероксидаза восстанавливает H₂O₂ до воды: 2 GSH + H₂O₂ → GSSG + 2 H₂O. Две молекулы глутатиона при этом окисляются и образуют дисульфид GSSG. Это первая реакция; пероксид в ней восстанавливается, а не превращается в глутатион.Вторая, отдельная реакция возвращает глутатион в восстановленную форму. Глутатионредуктаза восстанавливает GSSG: GSSG + NADPH + H⁺ → 2 GSH + NADP⁺. Источником электронов служит именно NADPH; NADH в этой реакции его не заменяет. Поэтому защита зависит и от путей образования NADPH, которые рассматривались в семинаре 8.Из этих реакций видно место NRF2. Он не участвует в химических превращениях, а меняет количество ферментов. Сначала растёт содержание NRF2 в ядре, затем — мРНК генов-мишеней, и лишь после трансляции — содержание ферментов. Поэтому ранний и поздний сроки эксперимента дают разные показания, и усиление транскрипции не означает автоматического уменьшения всех активных форм кислорода.Типичная ошибка Глутатион «превращается» в пероксид или пероксид — в GSSG: это одна реакция цикла.Реакций две. Глутатионпероксидаза восстанавливает H₂O₂ до воды, окисляя две молекулы GSH в GSSG; глутатионредуктаза затем восстанавливает GSSG до GSH за счёт NADPH.NRF2 накопился в ядре и связался с ARE в составе соответствующего комплекса. Какое событие связывает это с увеличением содержания защитных ферментов?А. Связанный с ДНК NRF2 непосредственно катализирует удаление пероксидов. (неверный вариант)NRF2 регулирует транскрипцию; каталитические реакции выполняют продукты соответствующих генов.Б. Изменение транскрипции генов-мишеней и последующий синтез соответствующих белков. (верный вариант)NRF2 действует через экспрессию генов; появление новых молекул ферментов отделено во времени от связывания фактора с ДНК.В. Ядерный NRF2 немедленно увеличивает количество уже существующих ферментов без синтеза новых молекул. (неверный вариант)Изменение содержания фермента требует изменения его синтеза или распада; само связывание регулятора с ДНК не создаёт новые молекулы фермента.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Ulasov A.V. et al. Nrf2/Keap1/ARE signaling: Towards specific regulation. Life Sci. 2022;291:120111; online 2021.Tonelli C., Chio I. I. C., Tuveson D. A. Transcriptional regulation by Nrf2. Antioxid Redox Signal. 2018;29:1727–1745.Схема механизма; ранний и поздний сроки показаны качественно, без часов. Набор генов-мишеней зависит от клетки и ткани; приведены примеры, описанные в обзорах Tonelli 2018 (по аннотации), Liu 2022 и Ulasov 2022. Стехиометрия реакций глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы — общепринятая биохимическая. Утверждение, что ген глутатионпероксидазы регулируется NRF2, здесь не делается.
KEAP1–NRF2 · шаг 19 из 30Как p62 связывает NRF2 с селективной аутофагиейp62/SQSTM1 — рецептор селективной аутофагии, который может связываться с KEAP1 и тем самым ослаблять разрушение NRF2. NRF2 в свою очередь усиливает транскрипцию гена SQSTM1, кодирующего p62. Так замыкается положительная обратная связь.NRF2 вместе с малым Maf связывается с ARE в промоторе SQSTM1 и усиливает синтез p62.p62 связывается с доменом Kelch белка KEAP1 мотивом KIR и мешает связыванию NRF2; комплексы p62–KEAP1 удаляются аутофагией.Оба действия поддерживают исходное изменение — накопление NRF2, поэтому петля положительная, хотя в ней есть звено торможения.p62 знаком по семинару 7: этот белок связывает убиквитинированные грузы и белок LC3 мембраны аутофагосомы и вместе с грузом удаляется аутофагией. Кроме того, p62 содержит мотив KIR, сходный с мотивом ETGE белка NRF2. Через этот мотив p62 связывается с доменом Kelch белка KEAP1 — тем же доменом, с которым связывается NRF2. Поэтому при большом количестве p62 часть KEAP1 оказывается занята и не направляет NRF2 на разрушение. Кроме того, комплексы p62–KEAP1 удаляются аутофагией; по данным обзоров, именно аутофагия, а не протеасома — основной путь разрушения KEAP1.Ген SQSTM1 содержит ARE, с которым связывается NRF2 в комплексе с малым Maf. Значит, NRF2 усиливает синтез p62, а p62 ослабляет KEAP1-зависимое разрушение NRF2. Чтобы определить знак петли, нужно проследить действие на исходный узел: рост NRF2 → больше p62 → меньше свободного KEAP1 → медленнее разрушение NRF2 → ещё больше NRF2. Звено торможения в цепи есть, но оно подавляет разрушение NRF2, поэтому итоговое действие на NRF2 положительное.Повышенное содержание p62 не всегда означает усиленный синтез. При нарушении аутофагии p62 перестаёт удаляться и накапливается; в печени мышей с выключенным геном Atg7 это сопровождалось стабилизацией Nrf2 и усилением транскрипции его генов-мишеней. Чтобы различить синтез и удаление, используют прослеживание меченой популяции белка во времени, а необходимость p62 проверяют выключением гена и восстановлением его функции.Эта петля — не единственное объяснение накопления NRF2. NRF2 разрушается и без KEAP1: киназа GSK3 фосфорилирует участок домена Neh6, и лигаза с β-TrCP убиквитинирует NRF2. При сравнении генотипов нужно указывать, какие пути разрушения в них сохранены.Типичная ошибка Высокое содержание p62 всегда означает, что NRF2 усилил транскрипцию гена SQSTM1.p62 накапливается и при нарушенной аутофагии, когда он перестаёт удаляться. Синтез и удаление различают прослеживанием меченой популяции белка во времени.В условной системе увеличение p62 уменьшает KEAP1-зависимое разрушение NRF2, а NRF2 усиливает экспрессию SQSTM1. Какой тип связи образуют эти события?А. Положительную обратную связь, способную усиливать накопление NRF2. (верный вариант)Усиление NRF2 повышает количество фактора, который ослабляет его разрушение; оба действия поддерживают исходное изменение.Б. Отрицательную обратную связь, поскольку в схеме есть этап торможения. (неверный вариант)Тип петли определяют по суммарному действию на исходный узел, а не по наличию отдельного тормозящего взаимодействия.В. Только однонаправленный ответ: выход NRF2 не влияет на предшествующий регулятор. (неверный вариант)Через индукцию SQSTM1 выход возвращается к регуляции KEAP1, поэтому петля замыкается.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Komatsu M. et al. The selective autophagy substrate p62 activates the stress responsive transcription factor Nrf2 through inactivation of Keap1. Nat Cell Biol. 2010;12:213–23.Jain A. et al. p62/SQSTM1 is a target gene for transcription factor NRF2 and creates a positive feedback loop by inducing antioxidant response element-driven gene transcription. J Biol Chem. 2010;285:22576–22591.Ulasov A.V. et al. Nrf2/Keap1/ARE signaling: Towards specific regulation. Life Sci. 2022;291:120111; online 2021.Схема механизма, качественные состояния; шкалы условные. Ген SQSTM1 как мишень NRF2 и связывание p62 с Kelch через мотив KIR — Jain 2010 (клетки человека и мыши в культуре, по аннотации); конкуренция p62 с NRF2 и стабилизация Nrf2 при нарушении аутофагии — Komatsu 2010 (печень мышей с выключенным Atg7, клетки в культуре; по аннотации). Аутофагия как основной путь разрушения KEAP1 и петля KEAP1 ⊣ NRF2 → p62 ⊣ KEAP1 — обзор Liu 2022 (клетки Hepa-1c1c7 и HepG2 в цитируемых экспериментах). Путь GSK3–β-TrCP — обзор Ulasov 2022. Схемы методов — принцип, а не результаты эксперимента.
KEAP1–NRF2 · шаг 20 из 30Почему кратковременная защита и постоянная активность NRF2 имеют разные последствияКратковременный ответ NRF2 на электрофил и постоянная активность NRF2 при нарушенном KEAP1 различаются прежде всего длительностью и зависимостью от внешнего стимула. Поэтому одна и та же защитная программа может способствовать адаптации нормальной клетки и поддерживать выживание опухолевой.В нормальной клетке электрофил временно ослабляет KEAP1-зависимое разрушение NRF2; после удаления электрофила разрушение восстанавливается, и программа ослабевает.Мутации и утрата гена KEAP1 в опухолевых клетках ослабляют разрушение NRF2 постоянно, и NRF2-зависимая транскрипция сохраняется без внешнего стимула.Биологическое значение постоянной активности зависит от типа клетки и этапа процесса; его нельзя свести к оценке «полезно» или «вредно».В нормальной клетке ответ NRF2 ограничен во времени. Электрофил модифицирует KEAP1, разрушение NRF2 замедляется, и транскрипция генов-мишеней усиливается. Ферменты-мишени ускоряют обезвреживание электрофила; когда воздействие заканчивается, вновь синтезированный KEAP1 и разрушение модифицированного KEAP1 восстанавливают исходное разрушение NRF2. Так программа включается на время действия стимула и затем ослабевает.В опухолевых клетках регуляция может быть нарушена постоянно. Singh и соавт. (2006) секвенировали ген KEAP1 в 12 линиях клеток и 54 образцах немелкоклеточного рака лёгкого. Соматические мутации нашли в шести линиях и в десяти опухолях; все они затрагивали домен Kelch или промежуточную область, а утрата второго аллеля была частой. В клетках со сниженной активностью KEAP1 NRF2 накапливался в ядре, и транскрипция генов антиоксидантной защиты, обезвреживания чужеродных веществ и выведения лекарств усиливалась. В такой клетке программа работает и без внешнего стимула.Отсюда следует, что одна и та же программа имеет разные последствия в разных условиях. Кратковременный ответ облегчает адаптацию к электрофилам и окислителям. Постоянная активность в опухолевой клетке может поддерживать её выживание; авторы связывают её с устойчивостью к химиотерапевтическим веществам. Это наблюдение о молекулярном механизме, а не прогноз для больного и не основание для выбора лечения.Похожие решения встречаются у далёких организмов. У кишечной палочки транскрипционный фактор OxyR активируется при образовании дисульфидной связи между его цистеинами под действием пероксида водорода и усиливает транскрипцию генов антиоксидантной защиты. Это функциональная аналогия с KEAP1–NRF2 — регуляция через тиоловые группы цистеинов, — а не доказательство общего происхождения этих систем: молекулярные участники и механизмы у них разные.Типичная ошибка Активация NRF2 всегда защищает организм, поэтому чем её больше и дольше, тем лучше.Последствия зависят от клетки и длительности. Кратковременный ответ помогает адаптации, а постоянная активность при нарушенном KEAP1 может поддерживать выживание опухолевых клеток.Какое различие важно при сравнении ответа нормальной клетки на краткий электрофильный стимул и опухолевой клетки с устойчиво нарушенной функцией KEAP1?А. В обеих клетках NRF2-зависимая программа прекращается вскоре после удаления электрофила. (неверный вариант)Стойкий дефект регулятора может поддерживать программу и после удаления внешнего воздействия.Б. Устойчивая активация NRF2 подавляет рост опухолевой клетки, как и краткий защитный ответ. (неверный вариант)Защитная программа может поддерживать выживание опухолевой клетки; результат нельзя переносить с одних клеток на другие без проверки.В. Во втором случае NRF2-зависимая программа может сохраняться без внешнего стимула. (верный вариант)Постоянное нарушение контроля отличается от ограниченного во времени действия индуктора.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Singh A. et al. Dysfunctional KEAP1-NRF2 interaction in non-small-cell lung cancer. PLoS Med. 2006;3:e420.Ulasov A.V. et al. Nrf2/Keap1/ARE signaling: Towards specific regulation. Life Sci. 2022;291:120111; online 2021.Zheng M., Åslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation. Science. 1998;279:1718–1721.Временные кривые — качественная учебная схема, а не данные эксперимента. Singh 2006: 12 линий клеток и 54 образца немелкоклеточного рака лёгкого человека; соматические мутации KEAP1 — в 6 линиях и 10 опухолях, утрата гетерозиготности 19p13.2 — в 61 % линий и 41 % опухолей (по аннотации). Связь с устойчивостью к химиотерапии — интерпретация авторов. OxyR — Escherichia coli, активация образованием дисульфидной связи под действием H₂O₂ (Zheng 1998, по аннотации).
KEAP1–NRF2 · шаг 21 из 30Как отличить накопление NRF2 от изменения его функцииНакопление NRF2, его ядерная локализация, связывание с ARE и изменение мРНК генов-мишеней — разные величины, и каждую измеряют своим методом. Изменение одного показателя, например мРНК HMOX1, не доказывает, что оно вызвано именно NRF2.Содержание белка NRF2 определяют иммуноблотом, а скорость его распада — прослеживанием меченой популяции во времени.Ядерную долю определяют иммунофлуоресценцией или разделением клеточных фракций; транскрипционный эффект — ARE-репортёром и ОТ-ПЦР мРНК генов-мишеней.Зависимость ответа от NRF2 проверяют выключением гена NFE2L2 и восстановлением его функции.Каждый метод отвечает на свой вопрос. Иммуноблот показывает количество белка NRF2 в образце к моменту взятия пробы. Если NRF2 стало больше, это может быть следствием и усиленного синтеза, и замедленного распада; различить их позволяет прослеживание меченой популяции белка во времени. Иммунофлуоресценция и фракционирование показывают, где NRF2 находится, но не то, связался ли он с ARE.Транскрипционный эффект измеряют по-другому. ARE-репортёр показывает, может ли данный элемент усиливать экспрессию в этих клетках, а ОТ-ПЦР — содержание мРНК эндогенного гена-мишени. Содержание мРНК определяется и синтезом, и распадом РНК, поэтому его не следует называть скоростью транскрипции.Ген HMOX1 — удобный, но неоднозначный показатель. Его транскрипцию регулирует не только NRF2: в клетках HaCaT арсенит индуцировал HMOX1 после удаления репрессора BACH1 из ядра, ещё до заметного накопления NRF2 в ядре. Поэтому рост мРНК HMOX1 сам по себе не доказывает, что изменение вызвано NRF2.Причинную зависимость проверяют генетически. Ген NFE2L2 выключают с помощью RNAi или редактирования генома, проверяют уменьшение РНК и белка и повторяют то же воздействие. Если без NRF2 рост мРНК гена-мишени исчезает, а возвращение NRF2 восстанавливает его, вывод о зависимости надёжен для этой системы. Для каждого эксперимента нужно указывать клетки, срок, контроль загрузки или чистоты фракций и эффективность выключения гена.Типичная ошибка Если иммунофлуоресценция показала NRF2 в ядре, транскрипция его генов-мишеней обязательно усилена.Ядерная локализация — отдельная величина. Связывание NRF2 с участками ARE проверяют, например, методом ChIP. Функциональный выход регуляторной конструкции оценивают ARE-репортёром, а содержание мРНК генов-мишеней — ОТ-ПЦР.После воздействия повысилось содержание мРНК HMOX1. Какой вывод допускает одно это наблюдение?А. Это наблюдение прямо отражает количество белка NRF2 в клетках. (неверный вариант)Количество мРНК гена-мишени не является прямым измерением белка NRF2 и не устанавливает единственный регулятор.Б. Связь с NRF2 возможна, но её проверяют выключением и восстановлением NRF2. (верный вариант)Сравнение с нарушением и восстановлением регулятора позволяет проверить причинную зависимость в выбранной системе.В. Это наблюдение доказывает, что воздействие действует через ARE и NRF2. (неверный вариант)Экспрессия HMOX1 зависит и от других регуляторов (например, BACH1), от типа клеток и воздействия; без проверки зависимости от NRF2 такой вывод преждевременен.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Ulasov A.V. et al. Nrf2/Keap1/ARE signaling: Towards specific regulation. Life Sci. 2022;291:120111; online 2021.Схемы методов — принцип, а не результаты эксперимента. Пример HMOX1: клетки HaCaT, арсенит, выход BACH1 из ядра через 30 мин, накопление NRF2 в ядре к 3 ч — эксперимент, описанный в обзоре Liu 2022 (первичная работа в этой подготовке не прочитана). Состав методов — план шага (M01, M03, M07, M08, M09, M12). Флуоресцентные зонды на окислители здесь не рассматриваются: для них нужна отдельная схема реакции каждого зонда.
PHD–pVHL–HIF · шаг 22 из 30Почему HIF-α накапливается при недостатке кислородаHIF — транскрипционный комплекс из регулируемой α-субъединицы и постоянно присутствующего партнёра ARNT. При достаточном O₂ α-субъединица синтезируется непрерывно и так же непрерывно разрушается. При недостатке кислорода разрушение замедляется, и содержание HIF-α растёт даже тогда, когда скорость его синтеза не меняется.Содержание белка HIF-1α определяется соотношением скоростей его синтеза и распада.При достаточном O₂ пролилгидроксилазы PHD гидроксилируют HIF-1α; гидроксилированный белок распознаётся комплексом с pVHL, убиквитинируется и разрушается протеасомой.При сниженном O₂ гидроксилирование замедляется, вновь синтезированный HIF-1α накапливается, связывается с ARNT и активирует транскрипцию генов-мишеней.HIF (фактор, индуцируемый гипоксией) — семейство гетеродимерных транскрипционных факторов. Каждый комплекс состоит из α-субъединицы и β-субъединицы ARNT, которую называют также HIF-1β. У человека лучше всего изучены HIF-1α и HIF-2α, продукты генов HIF1A и EPAS1; они регулируют частично разные наборы генов. Основная схема этого раздела построена для HIF-1α человека, а различия изоформ разобраны отдельно.Содержание любого белка складывается из двух потоков — синтеза новых молекул и удаления существующих. В клетках HeLa и Hep3B мРНК HIF1A и ARNT выявлялись постоянно и при гипоксии заметно не менялись, а белок HIF-1α в нормоксии почти не определялся (Huang 1996). Его быстрый распад задаёт центральный кислород-зависимый домен деградации: через него белок направляется в убиквитин-протеасомный путь (Huang 1998).При достаточном O₂ PHD присоединяют гидроксильные группы к двум остаткам пролина HIF-1α. Белок pVHL в составе E3-комплекса распознаёт гидроксилированный HIF-1α, комплекс присоединяет к нему убиквитин, и протеасома разрушает белок. Когда кислорода становится меньше, PHD гидроксилируют HIF-1α медленнее, вновь синтезированные молекулы чаще избегают распознавания, и белок накапливается. Он связывается с ARNT, комплекс связывается с элементами ответа на гипоксию (HRE) в регуляторных областях генов-мишеней и активирует их транскрипцию.Накопление HIF-1α не требует обязательного усиления транскрипции HIF1A. Однако синтез белка тоже регулируется: в клетках рака молочной железы MCF-7 сигнал рецептора HER2 повышал скорость синтеза HIF-1α через путь PI3K–AKT–mTOR, не меняя периода его полужизни (Laughner 2001). На схеме синтез постоянен, чтобы отделить изменение распада от изменения синтеза. «Достаточный» и «сниженный» O₂ задаются условиями конкретной культуры или ткани: 21 % O₂ в газовой фазе инкубатора не является универсальной нормой для клеток организма.Типичная ошибка Раз HIF-1α при достаточном O₂ почти не выявляется, ген HIF1A в этих условиях не работает.мРНК HIF1A присутствует и белок синтезируется, но так же быстро разрушается. Низкое содержание белка отражает быстрый распад, а не отсутствие экспрессии гена.Скорость синтеза HIF-1α не изменилась, но в гипоксии его pVHL-зависимое разрушение замедлилось. Что может объяснить рост содержания HIF-1α?А. Стабилизация белка при продолжающемся синтезе. (верный вариант)Для накопления белка достаточно уменьшить скорость его удаления; увеличение транскрипции не является обязательным условием.Б. Обязательное увеличение количества мРНК HIF1A. (неверный вариант)Условие допускает накопление за счёт распада при неизменном синтезе; дополнительное изменение мРНК не требуется.В. Усиление разрушения HIF-1α при прежнем синтезе. (неверный вариант)Усиление удаления действовало бы в противоположном направлении: при прежнем синтезе содержание белка уменьшалось бы.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKaelin W.G. Jr, Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 2008;30:393–402.Maxwell PH. et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature. 1999;399:271–5.Huang L. E., Arany Z., Livingston D. M., Bunn H. F. Activation of hypoxia-inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stabilization of its alpha subunit. J Biol Chem. 1996;271:32253–32259.Huang L. E., Gu J., Schau M., Bunn H. F. Regulation of hypoxia-inducible factor 1α is mediated by an O₂-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:7987–7992.Laughner E., Taghavi P., Chiles K., Mahon P. C., Semenza G. L. HER2 (neu) signaling increases the rate of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) synthesis: novel mechanism for HIF-1-mediated vascular endothelial growth factor expression. Mol Cell Biol. 2001;21:3995–4004.Схема механизма: качественные состояния при фиксированной скорости синтеза HIF-1α. Постоянство мРНК HIF1A при гипоксии показано для клеток HeLa и Hep3B (Huang 1996); регуляция синтеза HIF-1α сигналом HER2 — для клеток MCF-7 и фибробластов мыши 3T3 (Laughner 2001). Уровни O₂ на схеме условные: «нормоксия» определяется условиями конкретной культуры или ткани.
PHD–pVHL–HIF · шаг 23 из 30Как PHD используют кислород при гидроксилировании HIF-αПролилгидроксилазы HIF (PHD) используют молекулярный кислород как субстрат: один атом O₂ входит в гидроксильную группу пролина, второй — в сукцинат. Поэтому скорость гидроксилирования HIF-α непосредственно зависит от доступности O₂, а не только от энергетического обмена клетки.PHD — Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимые диоксигеназы: в одной реакции они гидроксилируют остаток пролина и окислительно декарбоксилируют 2-оксоглутарат до сукцината и CO₂.O₂ и 2-оксоглутарат расходуются в каждом обороте, Fe(II) находится в активном центре и не расходуется, аскорбат повышает активность фермента, но в уравнение реакции не входит.В HIF-1α человека гидроксилируются Pro402 и Pro564; пролилгидроксилирование создаёт участок, который распознаёт pVHL.Суммарная реакция PHD записывается так: остаток пролина в HIF-α + O₂ + 2-оксоглутарат → остаток 4-гидроксипролина + сукцинат + CO₂. Фермент относится к Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимым диоксигеназам: оба атома молекулы O₂ входят в продукты. Один присоединяется к атому C4 пирролидинового кольца пролина и образует группу OH, второй входит в карбоксильную группу сукцината, который образуется при окислительном декарбоксилировании 2-оксоглутарата. Гидроксилирование Pro564 требовало O₂ и железа (Jaakkola 2001).Участники реакции играют разную роль. O₂ и 2-оксоглутарат расходуются в каждом обороте. Ион Fe(II) находится в активном центре и не входит в продукты, но без него реакция не идёт: поэтому хелаторы железа вызывают накопление HIF-α в нормоксии. Аскорбат повышал начальную скорость и полноту гидроксилирования очищенной PHD2 (Flashman 2010); в уравнение реакции он не входит.У человека три фермента: PHD1 (ген EGLN2), PHD2 (EGLN1) и PHD3 (EGLN3). В клетках человека подавление PHD2 с помощью малых интерферирующих РНК было достаточно, чтобы HIF-1α стабилизировался при нормоксии, а подавление PHD1 или PHD3 — нет (Berra 2003). Вклад изоформ зависит от клеток. Номера Pro402 и Pro564 относятся к HIF-1α человека; каждый из двух участков может самостоятельно направлять белок к убиквитинированию с участием pVHL (Masson 2001).Связь с метаболизмом идёт через 2-оксоглутарат — промежуточный продукт цикла трикарбоновых кислот. Сукцинат и фумарат по строению близки к нему и тормозят PHD. В клетках с подавленной сукцинатдегидрогеназой накапливался сукцинат и стабилизировался HIF-1α (Selak 2005); в опухолевых клетках почки без фумаратгидратазы фумарат вёл себя как конкурентный ингибитор PHD (Isaacs 2005). Такое торможение возникает при накоплении этих метаболитов, а не при любом изменении работы цикла.Типичная ошибка Аскорбат — такой же расходуемый субстрат PHD, как O₂ и 2-оксоглутарат.В уравнение реакции входят остаток пролина, O₂ и 2-оксоглутарат; продукты — гидроксипролин, сукцинат и CO₂. Аскорбат повышает активность фермента, но в продукты не входит.Какова непосредственная роль O₂ в реакции PHD, гидроксилирующей HIF-α?А. O₂ является субстратом реакции гидроксилирования, которую катализирует PHD. (верный вариант)Зависимость реакции от доступности молекулярного кислорода связывает гидроксилирование со снабжением клетки O₂.Б. O₂ нужен клеточному дыханию и влияет на PHD через образование ATP. (неверный вариант)Зависимость PHD от O₂ непосредственная: кислород участвует в реакции гидроксилирования, а не только в энергетическом обмене клетки.В. O₂ нужен на стадии распознавания гидроксилированного HIF белком pVHL. (неверный вариант)В показанной последовательности кислород нужен на предшествующей ферментативной стадии, которая создаёт гидроксилированный субстрат.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKaelin W.G. Jr, Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 2008;30:393–402.Jaakkola P. et al. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science. 2001;292:468–72.Ivan M. et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science. 2001;292:464–8.Flashman E., Davies S. L., Yeoh K. K., Schofield C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem J. 2010;427:135–142.Berra E., Benizri E., Ginouvès A., Volmat V., Roux D., Pouysségur J. HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1α in normoxia. EMBO J. 2003;22:4082–4090.Masson N., Willam C., Maxwell P. H., Pugh C. W., Ratcliffe P. J. Independent function of two destruction domains in hypoxia-inducible factor-α chains activated by prolyl hydroxylation. EMBO J. 2001;20:5197–5206.Selak M. A., Armour S. M., MacKenzie E. D. et al. Succinate links TCA cycle dysfunction to oncogenesis by inhibiting HIF-α prolyl hydroxylase. Cancer Cell. 2005;7:77–85.Isaacs J. S., Jung Y. J., Mole D. R. et al. HIF overexpression correlates with biallelic loss of fumarate hydratase in renal cancer: novel role of fumarate in regulation of HIF stability. Cancer Cell. 2005;8:143–153.Схема реакции; состояния качественные, без единого порога O₂ и без константы Михаэлиса для клетки. Нумерация Pro402, Pro564 — HIF-1α человека. Потребность в O₂ и железе — эксперименты Jaakkola 2001 и Ivan 2001 (HIF-1α человека, клетки и бесклеточные системы); роль PHD2 — подавление siRNA в клетках человека (Berra 2003); влияние аскорбата — очищенная PHD2 in vitro (Flashman 2010); сукцинат — клетки с подавленной SDH (Selak 2005); фумарат — клетки рака почки с утратой FH и эксперименты с ферментом (Isaacs 2005). Структурные формулы показывают остаток пролина и остаток 4-гидроксипролина в полипептидной цепи без обозначения стереохимии; 2-оксоглутарат и сукцинат показаны в виде анионов, преобладающих при pH около 7.
PHD–pVHL–HIF · шаг 24 из 30Что распознаёт pVHL и почему его потеря стабилизирует HIF-αpVHL не гидроксилирует HIF-α, а распознаёт уже гидроксилированный белок. Он входит в E3-комплекс с элонгинами B и C, CUL2 и RBX1, который присоединяет к HIF-α убиквитин. Поэтому без pVHL гидроксилирование может продолжаться, а быстрое разрушение HIF-α нарушается.PHD создают модификацию — гидроксилированные остатки пролина в HIF-α; pVHL связывает именно модифицированный участок.В составе комплекса pVHL–элонгины B/C–CUL2–RBX1 это связывание ведёт к убиквитинированию HIF-α и его протеасомной деградации.При отсутствии pVHL гидроксилирование сохраняется, но HIF-α не подвергается быстрому распаду и накапливается при любом содержании O₂.В кислород-зависимом распаде HIF-α участвуют два разных звена. Первое — реакция: PHD присоединяют гидроксильную группу к остаткам пролина. Второе — распознавание: белок pVHL, продукт гена-супрессора опухолей VHL, связывает участок HIF-α, содержащий гидроксипролин. Короткий пептид HIF связывался с pVHL только тогда, когда центральный остаток пролина был гидроксилирован (Ivan 2001; Jaakkola 2001).Сам pVHL не присоединяет убиквитин. Он входит в E3-комплекс вместе с элонгинами B и C, куллином CUL2 и белком RBX1. pVHL связывает субстрат, элонгины соединяют его с CUL2, а RBX1 привлекает фермент, который несёт активированный убиквитин. Полиубиквитинированный HIF-α разрушается протеасомой.Значение pVHL показали генетическим сравнением. В клеточных линиях рака почки с дефектом VHL субъединицы HIF-α были стабильны при любом содержании O₂, а после введения функционального гена VHL кислород-зависимая нестабильность восстанавливалась (Maxwell 1999). В клетках RCC4 без pVHL HIF-1α при нормоксии гидроксилирован по Pro402 и Pro564 почти полностью (Tian 2011): реакция PHD идёт, а отсутствует следующий этап. Медленный распад HIF-α по путям, не зависящим от pVHL, при этом возможен, поэтому корректнее говорить о нарушении быстрого кислород-зависимого распада, а не о полной неразрушимости белка.Архитектура комплекса напоминает систему KEAP1–CUL3 из предыдущего раздела: белок, связывающий субстрат, соединён с куллином и RBX1. Различается то, что распознаётся. pVHL связывает HIF-α после модификации, которая зависит от O₂; KEAP1 связывает NRF2 без такой модификации, а электрофилы изменяют работу самого KEAP1.Типичная ошибка pVHL — это фермент, который сам разрушает HIF-α.pVHL связывает гидроксилированный HIF-α в составе E3-комплекса; присоединение убиквитина обеспечивает весь комплекс с CUL2 и RBX1, а разрушает белок протеасома.В клетке отсутствует pVHL, но PHD активны и кислорода достаточно. Какое сочетание возможно?А. HIF-α не гидроксилируется, потому что именно pVHL катализирует эту реакцию. (неверный вариант)Гидроксилирование катализируют PHD; pVHL участвует в распознавании продукта реакции.Б. HIF-α разрушается через pVHL с прежней скоростью, поскольку PHD сохранены. (неверный вариант)Сохранение предшествующей реакции не восстанавливает отсутствующий компонент следующего этапа.В. Гидроксилирование HIF-α сохраняется, но его быстрое pVHL-зависимое разрушение нарушено. (верный вариант)Модификация и её распознавание относятся к разным звеньям; нарушение второго не требует исчезновения первого.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаMaxwell PH. et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature. 1999;399:271–5.Jaakkola P. et al. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science. 2001;292:468–72.Ivan M. et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science. 2001;292:464–8.Tian YM. et al. Differential sensitivity of hypoxia inducible factor hydroxylation sites to hypoxia and hydroxylase inhibitors. J Biol Chem. 2011;286:13041–51.Kaelin W.G. Jr, Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 2008;30:393–402.Схема механизма; состояния качественные. Распознавание гидроксилированного пептида — эксперименты с HIF-1α человека и очищенными компонентами (Ivan 2001; Jaakkola 2001); стабилизация HIF-α и её устранение после введения VHL — клеточные линии рака почки человека с дефектом VHL (Maxwell 1999); почти полное гидроксилирование Pro402, Pro564 и Asn803 при нормоксии — клетки RCC4 без pVHL, антитела к гидроксилированным остаткам и масс-спектрометрия (Tian 2011). Сравнение с KEAP1–CUL3 касается устройства комплекса, а не происхождения белков.
PHD–pVHL–HIF · шаг 25 из 30Почему содержание HIF-α и его транскрипционная активность различаютсяНакопление HIF-α ещё не означает его полной транскрипционной активности. Вторая гидроксилаза, FIH, модифицирует остаток аспарагина в домене активации и тем самым мешает связыванию коактиваторов p300/CBP. Пролилгидроксилирование регулирует содержание HIF-α, а гидроксилирование аспарагина — его взаимодействие с коактиваторами.FIH — Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимая гидроксилаза; в HIF-1α человека она гидроксилирует Asn803 C-концевого домена активации.Группа OH при Asn803 препятствует связыванию этого домена с p300/CBP; на распознавание pVHL она не влияет.Содержание HIF-α и его транскрипционная активность регулируются разными модификациями и могут меняться неодинаково.HIF-α модифицируется в двух разных областях. Остатки Pro402 и Pro564 HIF-1α человека находятся в кислород-зависимом домене деградации; их гидроксилируют PHD, и от этого зависит распознавание pVHL и распад. Остаток Asn803 находится в C-концевом домене активации транскрипции; его гидроксилирует FIH (фактор, подавляющий HIF). FIH, как и PHD, относится к Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимым диоксигеназам и использует O₂ как субстрат.C-концевой домен активации стимулирует транскрипцию, связывая коактиваторы p300 и CBP. Гидроксилированный Asn803 такому связыванию препятствует. Ингибиторы Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ предотвращали гидроксилирование этого аспарагина и позволяли домену связывать p300, а замена аспарагина на аланин давала постоянное связывание p300 и высокую транскрипционную активность (Lando 2002). В клетке с функциональным pVHL ограничение пролилгидроксилирования стабилизирует HIF-α, а уменьшение гидроксилирования Asn803 дополнительно облегчает связывание p300/CBP. Это разные этапы регуляции.Поэтому накопившийся HIF-1α может иметь разную удельную активность. В экспериментах Tian 2011 при 1 % O₂ (5 ч) HIF-1α накапливался в клетках разных типов, но остаток Asn803 у значительной части молекул оставался гидроксилированным: в фибробластах кожи человека — более чем на 90 %, в клетках рака предстательной железы PC3 — примерно на 50 %. При 0,2 % O₂ гидроксилирование Asn803 было сильно подавлено. Чувствительность двух реакций к недостатку O₂ различается и зависит от клеток, поэтому единой ступенчатой «шкалы» O₂ для всех тканей нет.Отсутствие связывания p300/CBP C-концевым доменом не означает отсутствия любых эффектов HIF: у HIF-α есть и другой, N-концевой домен активации, а набор генов, чувствительных к FIH, ограничен. Для объяснения важно другое: равное содержание HIF-1α ещё не означает равной транскрипционной активности.Типичная ошибка Если HIF-1α много, гены-мишени HIF работают в полную силу: содержание белка и его активность — одно и то же.Содержание HIF-1α определяется пролилгидроксилированием и распадом, а связывание коактиваторов — гидроксилированием Asn803. При одинаковом содержании белка его транскрипционная активность может различаться.Содержание HIF-1α одинаково в двух условных состояниях. В одном Asn803 гидроксилирован, в другом нет. Какое различие непосредственно относится к действию FIH?А. pVHL распознаёт Asn803-OH вместо гидроксилированных пролинов. (неверный вариант)Для pVHL-зависимого пути важны пролиновые модификации; подмена остатка смешивает разные уровни регуляции.Б. Связывание p300/CBP C-концевым доменом затруднено в состоянии с Asn803-OH. (верный вариант)Именно взаимодействие домена активации с коактиваторами является непосредственным выходом этой модификации.В. Asn803-OH усиливает распад белка тем же способом, что Pro402-OH и Pro564-OH. (неверный вариант)Asn- и Pro-гидроксилирование имеют разные непосредственные последствия; эффект FIH относится к взаимодействию с коактиватором.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаLando D. et al. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science. 2002;295:858–61.Tian YM. et al. Differential sensitivity of hypoxia inducible factor hydroxylation sites to hypoxia and hydroxylase inhibitors. J Biol Chem. 2011;286:13041–51.Kaelin W.G. Jr, Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 2008;30:393–402.Схема механизма; нумерация Asn803 — HIF-1α человека. Связывание p300 и мутация Asn → Ala — Lando 2002 (клеточные линии, конструкции HIF-1α и HIF-2α). Доли Asn803-OH при 1 % O₂ (5 ч): фибробласты кожи человека — более 90 %, клетки PC3 — около 50 %; подавление при 0,2 % O₂; избирательный ингибитор FIH (соединение E) в клетках RCC4 с восстановленным pVHL, 5 ч, гипоксия 1 % O₂ последние 2 ч (Tian 2011, иммуноблот с антителами к гидроксилированным остаткам, калибровка масс-спектрометрией). Состояния схемы качественные.
PHD–pVHL–HIF · шаг 26 из 30Как изменяется ответ HIF при гипоксии и реоксигенацииПри переходе к гипоксии доля молекул HIF-α с гидроксилированным пролином может снижаться за счёт обновления пула: новые молекулы поступают без этой модификации, а ранее гидроксилированные разрушаются. При реоксигенации PHD гидроксилируют накопившиеся молекулы HIF-α. Поэтому снижение доли гидроксилированного HIF-α не требует реакции, которая удаляла бы группу OH.При снижении доступности O₂ замедляется образование новых гидроксилированных молекул HIF-α, а уже гидроксилированные продолжают разрушаться.После восстановления O₂ гидроксилирование имеющихся молекул возобновляется, и HIF-α быстро исчезает через pVHL-зависимый распад.мРНК и белки генов-мишеней, синтезированные при гипоксии, исчезают со своими скоростями; HIF индуцирует и PHD2, PHD3, что ускоряет распад HIF-α после реоксигенации.Пролилгидроксилирование HIF-α считают практически необратимым: фермента, который снимал бы группу OH с остатка пролина HIF, не описано. Молекула, получившая Pro-OH, остаётся гидроксилированной до своего распада. Поэтому важно различать две величины: химическое состояние отдельной молекулы и долю модифицированных молекул в пуле, который постоянно обновляется за счёт синтеза и распада.При переходе к гипоксии PHD гидроксилируют новые молекулы медленнее. Уже гидроксилированные молекулы продолжают распознаваться pVHL и разрушаться, а новые чаще остаются без Pro-OH. Доля гидроксилированного HIF-α падает, содержание белка растёт, и через какое-то время пул почти целиком состоит из молекул, синтезированных при гипоксии. Asn803 в части этих молекул может оставаться гидроксилированным: при умеренной гипоксии FIH сохраняет активность дольше, чем PHD (Tian 2011).При восстановлении O₂ гидроксилирование возобновляется на уже накопленных молекулах. В клетках RCC4 после 4 ч при 0,1 % O₂ гидроксилирование Pro564 и Asn803 завершалось в течение 1 мин после возврата к 21 % O₂, а Pro402 гидроксилировался с задержкой (Tian 2011). В клетках HeLa и Hep3B HIF-1α после резкого повышения O₂ быстро исчезал (Huang 1996). Распаду помогает обратная связь: HIF индуцирует гены PHD2 и PHD3 (Berra 2003), и после гипоксии этих ферментов в клетке больше, чем до неё.Белок HIF-1α исчезает быстрее, чем следствия его действия. мРНК генов-мишеней и синтезированные при гипоксии белки разрушаются со своими скоростями, поэтому транскрипционный ответ затухает постепенно. Конкретные минуты и часы зависят от клеток, глубины гипоксии и способа подачи газа к клеткам, поэтому на схеме показан только порядок событий.Типичная ошибка После восстановления O₂ гипоксический ответ исчезает мгновенно, потому что быстро исчезает HIF-1α.Белок HIF-1α действительно разрушается быстро, но мРНК и белки генов-мишеней, синтезированные при гипоксии, исчезают со своими скоростями, поэтому ответ затухает постепенно.При переходе к гипоксии доля гидроксилированного HIF-α в обновляющемся пуле уменьшилась. Требует ли это предположения, что с каждой ранее модифицированной молекулы удалили гидроксильную группу?А. Нет: новые молекулы могут поступать без модификации, а ранее модифицированные — разрушаться. (верный вариант)Обновление молекул меняет состав пула без необходимости вводить обратную реакцию гидроксилирования.Б. Да: уменьшение доли всегда означает обратную химическую реакцию на тех же молекулах. (неверный вариант)Доля может измениться при обновлении пула, даже если модификация каждой отдельной молекулы сохраняется.В. Да: иначе снижение доступности O₂ не могло бы повлиять на последующие реакции. (неверный вариант)Недостаток субстрата влияет на образование новых модифицированных молекул, не требуя удаления уже имеющихся групп.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаTian YM. et al. Differential sensitivity of hypoxia inducible factor hydroxylation sites to hypoxia and hydroxylase inhibitors. J Biol Chem. 2011;286:13041–51.Kaelin W.G. Jr, Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 2008;30:393–402.Huang L. E., Arany Z., Livingston D. M., Bunn H. F. Activation of hypoxia-inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stabilization of its alpha subunit. J Biol Chem. 1996;271:32253–32259.Berra E., Benizri E., Ginouvès A., Volmat V., Roux D., Pouysségur J. HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1α in normoxia. EMBO J. 2003;22:4082–4090.Учебная схема без числовой кинетики: число значков не равно числу молекул. Реоксигенация: клетки RCC4 без pVHL, 4 ч при 0,1 % O₂ в чашках с газопроницаемым дном, затем 21 % O₂, иммуноблот с антителами к Hyp402, Hyp564 и Asn803-OH (Tian 2011). Быстрое исчезновение HIF-1α после повышения O₂ — клетки HeLa и Hep3B (Huang 1996). Индукция PHD2 при гипоксии — клетки человека (Berra 2003); индукция PHD2 и PHD3 — клетки HeLa и HT1080 (Tian 2011). Необратимость пролилгидроксилирования принята как допущение схемы: обратной реакции в использованных работах не описано.
PHD–pVHL–HIF · шаг 27 из 30Как программы HIF зависят от изоформы и тканиHIF-1 и HIF-2 регулируют частично общие, а частично разные наборы генов, и результат зависит от ткани. HIF-1 связан прежде всего с переходом на гликолиз, а физиологическая регуляция эритропоэтина — преимущественно с HIF-2.HIF-1 повышает экспрессию генов транспорта глюкозы и гликолиза (SLC2A1, LDHA) и гена киназы пируватдегидрогеназы PDK1.Регуляция эритропоэтина (EPO) у мышей зависит преимущественно от HIF-2 и связана с клетками почки и печени.При потере pVHL HIF-α стабилен без снижения O₂ — это псевдогипоксический ответ, и его мишени зависят от того, какая изоформа преобладает.Обе изоформы, HIF-1α и HIF-2α, образуют комплекс с ARNT и связываются с HRE, но наборы активируемых генов совпадают лишь частично. Для HIF-1 хорошо изучена метаболическая программа: он связывается с HRE в промоторах генов ферментов гликолиза, в том числе LDHA (Semenza 1996), повышает экспрессию транспортёра глюкозы GLUT1 (ген SLC2A1) и гена VEGFA — фактора роста эндотелия сосудов (Forsythe 1996).К этой программе относится и киназа пируватдегидрогеназы 1 (PDK1). Её не следует путать с PDPK1, которую в литературе о пути PI3K–AKT тоже сокращают как PDK1. PDK1 фосфорилирует и подавляет пируватдегидрогеназу, поэтому пируват реже превращается в ацетил-CoA и меньше окисляется в митохондриях; в фибробластах без HIF-1α принудительная экспрессия PDK1 повышала содержание ATP и выживаемость при гипоксии (Kim 2006). Так связаны темы семинаров 8 и 10.Эритропоэтин удобно приводить как пример тканевой специфичности. У взрослых мышей почка — основной источник эритропоэтина; гипоксическая индукция Epo в почке полностью зависела от Hif-2, а при удалении Hif-2 в почке основным регулятором становился Hif-2 печени (Kapitsinou 2010). Поэтому EPO нельзя считать универсальной мишенью HIF-1 в любой клетке.Псевдогипоксический ответ возникает, когда часть гипоксической регуляции включается без снижения O₂, например при потере pVHL или при накоплении сукцината и фумарата. Это не синоним эффекта Варбурга. В клетках рака почки с дефектом VHL изоформы различались по мишеням: VEGFA, который в других клетках индуцирует и HIF-1 (Forsythe 1996), здесь отвечал преимущественно на HIF-2α (Raval 2005). Система HIF консервативна от нематоды Caenorhabditis elegans до позвоночных (Berra 2003); сходство функции у разных животных само по себе не говорит о времени её возникновения.Типичная ошибка PDK1 в программе HIF-1 — та же киназа, которая фосфорилирует AKT в пути PI3K.Мишень HIF-1 — киназа пируватдегидрогеназы 1, которая подавляет пируватдегидрогеназный комплекс. Киназу пути PI3K–AKT называют PDPK1; одинаковое сокращение не означает одного белка.Как корректно включить EPO в объяснение семейства HIF?А. Связать регуляцию EPO в организме преимущественно с HIF-2 и указать ткани. (верный вариант)Так сохраняется роль семейства HIF и различаются его изоформы и условия действия.Б. Описать EPO как прямую мишень HIF-1, общую для клеток разных тканей. (неверный вариант)Так теряются различия изоформ и тканей; этот вывод шире приведённых оснований.В. Исключить EPO, поскольку его синтез регулируется без участия HIF. (неверный вариант)HIF-зависимая регуляция EPO установлена; ограничение касается конкретной изоформы и типа клеток.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKaelin W.G. Jr, Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 2008;30:393–402.Kapitsinou PP. et al. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. 2010;116:3039–48.Semenza G. L., Jiang B. H., Leung S. W. et al. Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 1996;271:32529–32537.Forsythe J. A., Jiang B. H., Iyer N. V. et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol. 1996;16:4604–4613.Kim J. W., Tchernyshyov I., Semenza G. L., Dang C. V. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab. 2006;3:177–185.Raval R. R., Lau K. W., Tran M. G. B. et al. Contrasting properties of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindau-associated renal cell carcinoma. Mol Cell Biol. 2005;25:5675–5686.Berra E., Benizri E., Ginouvès A., Volmat V., Roux D., Pouysségur J. HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1α in normoxia. EMBO J. 2003;22:4082–4090.Схема механизма: качественные состояния, ткани подписаны по источникам. Гены гликолиза — клетки человека, HRE промоторов ALDOA, ENO1, LDHA (Semenza 1996); VEGF — клетки Hep3B, репортёрные конструкции (Forsythe 1996); PDK1 — фибробласты мыши без HIF-1α и клетки человека (Kim 2006); EPO — мыши с удалением Hif-2α в почке или печени (Kapitsinou 2010); различия изоформ — клетки рака почки с дефектом VHL и ксенотрансплантаты (Raval 2005). Схема не описывает лечение и не предсказывает ответ конкретного пациента.
PHD–pVHL–HIF · шаг 28 из 30Как различить гидроксилирование, стабильность и транскрипционный эффект HIFГидроксилирование HIF-α, его распознавание pVHL, стабильность белка и транскрипционный ответ — разные этапы, и для каждого нужен свой способ измерения. Ни одно измерение не заменяет остальные: одинаковое содержание HIF-1α может сочетаться с разной модификацией и разной активностью.Антитело к общему HIF-1α и антитела к Pro564-OH или Asn803-OH определяют разные формы белка; быстрый распад уменьшает видимое количество гидроксилированной формы.Связывание гидроксилированного пептида с pVHL и прослеживание меченого белка во времени проверяют распознавание и скорость распада отдельно от содержания белка.Репортёр с HRE и мРНК генов-мишеней характеризуют транскрипционный ответ, а генетические и фармакологические вмешательства — необходимость отдельных звеньев.Иммуноблот с антителами к общему HIF-1α показывает, сколько белка в образце в данный момент. Антитела, распознающие только гидроксилированный Pro402, Pro564 или Asn803, позволяют увидеть соответствующую модифицированную форму; их специфичность в экспериментах Tian 2011 проверяли масс-спектрометрией и мутантными белками. Но сигнал модифицированной формы зависит не только от скорости гидроксилирования. В клетках с работающим pVHL гидроксилированный HIF-1α быстро разрушается, и полоса Pro564-OH слабая, хотя реакция идёт. Поэтому для сравнения сайтов использовали клетки RCC4 без pVHL или ингибитор протеасомы MG132.Распознавание проверяют отдельно: очищенный pVHL связывал пептид HIF только при гидроксилированном пролине, а пептид без гидроксильной группы служил контролем (Ivan 2001; Jaakkola 2001). Скорость распада оценивают по исчезновению меченой популяции белка во времени: содержание в одной временной точке не отделяет синтез от распада.Вещества, которые называют «миметиками гипоксии», не равнозначны гипоксии и друг другу. В клетках RCC4 DMOG сильнее подавлял гидроксилирование Asn803, хелаторы железа — пролилгидроксилирование, а ионы кобальта подавляли пролилгидроксилирование, почти не затрагивая Asn803 (Tian 2011). Генетическое сравнение дополняет фармакологию: клетки без pVHL и те же клетки с восстановленным pVHL (Maxwell 1999) отделяют гидроксилирование от быстрого распада, хотя длительная потеря pVHL меняет и другие свойства клетки.Транскрипционный эффект измеряют по мРНК генов-мишеней или по репортёру, в котором HRE управляет синтезом белка с удобно регистрируемым сигналом. Мутантный HRE служит контролем (Forsythe 1996). Такой репортёр показывает работу выбранного элемента ДНК, но не всю программу HIF в клетке.Типичная ошибка Любое вещество, повышающее содержание HIF-1α, действует так же, как недостаток O₂.DMOG, хелаторы железа и ионы кобальта повышают содержание HIF-1α, но по-разному меняют гидроксилирование Pro и Asn803 и затрагивают другие ферменты. Совпадение одного показателя не означает одного механизма.При одинаковом содержании общего HIF-1α изменился сигнал антитела к Pro564-OH. Какой вывод непосредственно относится к такому измерению?А. Транскрипция HRE-зависимых генов изменилась в той же пропорции, что и этот сигнал. (неверный вариант)Между модификацией одного остатка и ответами разных генов есть дополнительные уровни регуляции.Б. Изменился сигнал Pro564-OH-формы; транскрипционную активность HIF нужно оценить отдельно. (верный вариант)Антитело характеризует конкретный эпитоп, а не суммарный функциональный выход транскрипционного комплекса.В. Установлена скорость гидроксилирования без дополнительных временных измерений. (неверный вариант)Количество модифицированной формы в выбранный момент зависит также от синтеза и распада, а не только от скорости реакции.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаTian YM. et al. Differential sensitivity of hypoxia inducible factor hydroxylation sites to hypoxia and hydroxylase inhibitors. J Biol Chem. 2011;286:13041–51.Jaakkola P. et al. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science. 2001;292:468–72.Maxwell PH. et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature. 1999;399:271–5.Ivan M. et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science. 2001;292:464–8.Berra E., Benizri E., Ginouvès A., Volmat V., Roux D., Pouysségur J. HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1α in normoxia. EMBO J. 2003;22:4082–4090.Forsythe J. A., Jiang B. H., Iyer N. V. et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol. 1996;16:4604–4613.Схемы принципа методов и учебный рисунок иммуноблота: полосы показывают ожидаемое направление различий, а не измеренные величины. Данные экспериментов: клетки RCC4 и RCC4 с восстановленным pVHL, иммуноблот с антителами к Hyp402, Hyp564 и Asn803-OH, DMOG 1 мМ, хелаторы железа и ионы металлов, 4–5 ч (Tian 2011); связывание пептидов HIF-1α человека с pVHL (Ivan 2001; Jaakkola 2001); клеточные линии рака почки с дефектом VHL и введение VHL, коиммунопреципитация (Maxwell 1999); siRNA к PHD1–3 в клетках человека (Berra 2003); репортёр с HRE гена VEGF в клетках Hep3B (Forsythe 1996). Этот шаг — дополнительный материал о методах.
Исследование · шаг 29 из 30Как соотнести молекулярное событие, измерение и контрольВ каждом из четырёх путей можно различить изменение сенсора или фермента, изменение регулятора и последующее изменение синтеза белков-мишеней. Конкретные молекулярные события на этих этапах различаются. Каждый этап характеризуется своей величиной, и каждую величину измеряют своим методом с собственным контролем.Метод регистрирует определённое свойство объекта: содержание формы белка, долю модификации, локализацию, связывание, содержание РНК или скорость синтеза.Сходный результат может возникнуть разными путями: рост содержания NRF2 или HIF-α — из-за замедления распада или ускорения синтеза.Набор согласованных показателей и контролей, включая генетическое выключение звена, ограничивает число возможных объяснений.Четыре пути этого семинара устроены сходно. Сначала изменяется сенсор или фермент: киназа фосфорилирует eIF2α, IRE1α разрезает мРНК XBP1, электрофил модифицирует цистеины KEAP1, недостаток O₂ ограничивает работу PHD. Далее пути расходятся: снижение обменной активности eIF2B изменяет синтез ATF4; со сплайсированной мРНК XBP1s синтезируется белок XBP1s, а после протеолиза ATF6 образуется его N-концевой фрагмент. Замедление распада NRF2 или HIF-α повышает их содержание. Транскрипцию генов-мишеней в ядре регулируют белки ATF4, XBP1s, N-концевой фрагмент ATF6, NRF2 и комплекс HIF-α с ARNT. В результате меняется синтез белков-мишеней.На каждом этапе нужно сначала выбрать величину, а уже потом метод. Содержание, доля модификации и активность — разные величины. Иммуноблот показывает содержание определённой формы белка в образце, но не скорость реакции. Репортёрная конструкция показывает свойство участка мРНК или ДНК, но не всю регуляцию эндогенного гена. Количественная ОТ-ПЦР даёт содержание мРНК, но не количество белка. Масс-спектрометрия пептидов показывает химическое состояние остатка, но не его функцию.Каждое измерение требует контроля, который исключает другие объяснения. Для фосфоформы это общий белок на той же мембране, для репортёра — вариант с изменённым регуляторным элементом, для коиммунопреципитации — контрольное антитело. Причинную роль звена проверяют генетическим выключением: если ответ исчезает в клетках без PERK, pVHL или NRF2 и возвращается после восстановления белка, звено необходимо в этих условиях.Схема шага сводит события, величины, методы, контроли и границы вывода в одну таблицу. Рисунки этапов показывают порядок операций, а не результаты экспериментов. Подробные схемы методов с учебными рисунками сигналов даны в последних шагах четырёх разделов.Типичная ошибка Если два метода показали рост одного белка, неважно, какую величину измерил каждый из них.Иммуноблот общего белка, его ядерная доля и транскрипция мишеней — разные величины. Совпадение направления изменений не означает, что все этапы пути проверены.Что непосредственно покажет иммуноблот с антителом к общему NRF2 в суммарном клеточном лизате при корректном контроле загрузки?А. Относительное содержание белка NRF2 в этом образце. (верный вариант)Такое измерение относится к содержанию белка; его локализация и функция требуют отдельных подходов.Б. Скорость транскрипции каждого гена с ARE. (неверный вариант)Для транскрипционного выхода нужны другие показатели; общий белок в лизате их не измеряет.В. Абсолютную скорость KEAP1-зависимого разрушения NRF2. (неверный вариант)Одно измерение содержания не разделяет вклад синтеза и распада и не задаёт скорость удаления.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаWek R.C., Anthony T.G., Staschke K.A. Surviving and Adapting to Stress: Translational Control and the Integrated Stress Response. Antioxid Redox Signal. 2023.Acosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Liu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Tian YM. et al. Differential sensitivity of hypoxia inducible factor hydroxylation sites to hypoxia and hydroxylase inhibitors. J Biol Chem. 2011;286:13041–51.Schoof M. et al. eIF2B conformation and assembly state regulate the integrated stress response. eLife. 2021;10:e65703.Vattem KM., Wek RC. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:11269–74.Ye J., Rawson R. B., Komuro R. et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 2000;6:1355–1364.Zhang DD., Hannink M. Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1-dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress. Mol Cell Biol. 2003;23:8137–51.Ivan M. et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science. 2001;292:464–8.Lando D. et al. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science. 2002;295:858–61.Методический шаг: сопоставление методов, а не экспериментальный результат. Рисунки этапов — схемы операций без численных значений. Примеры результатов взяты из работ с указанными в соответствующих шагах условиями: Schoof 2021 (очищенные белки человека, обмен нуклеотидов), Vattem 2004 и Lu 2004 (репортёр с 5′-областью ATF4, клетки млекопитающих), Ye 2000 (клетки CHO без S1P или S2P), Zhang 2003 (замены цистеинов KEAP1), Ivan 2001 и Jaakkola 2001 (связывание pVHL с пептидами HIF-1α), Lando 2002 (Asn803 и p300), Tian 2011 (иммуноблот форм HIF-1α). Число повторов, концентрации и сроки переносятся только из конкретной статьи.
Исследование · шаг 30 из 30Как четыре механизма различаются при сочетании воздействийВ условной клетке можно по отдельности изменить нагрузку на ЭПР, добавить электрофил и снизить O₂, а также убрать PERK или pVHL. Каждое воздействие действует через собственный первичный вход, поэтому ответ на их сочетание объясняют по состоянию каждого звена, а не как одну общую «активацию стрессовых путей».Нарушение сворачивания в ЭПР активирует PERK, IRE1α и ATF6; электрофил модифицирует цистеины KEAP1; недостаток O₂ ограничивает гидроксилирование HIF-α ферментами PHD.Отсутствие PERK устраняет PERK-зависимое фосфорилирование eIF2α, но не образование мРНК XBP1s и фрагмента ATF6; отсутствие pVHL замедляет распад HIF-α и при достаточном O₂.Совпадение выходов (например, общие гены-мишени) или перекрёстная регуляция не делает пути тождественными и не означает, что любое воздействие активирует все четыре пути.Рассмотрим условную клетку, в которой три входа управляются независимо: нагрузка на ЭПР, электрофильное воздействие и содержание O₂. Другие киназы eIF2α не активированы, а IRE1α, ATF6, KEAP1, PHD и pVHL работают нормально, пока их не убирает переключатель. Такая система — учебная модель: она показывает канонический качественный результат, а не измерения в определённых клетках.Для каждого входа причинная цепь своя. Нарушение сворачивания в ЭПР активирует PERK, и фосфорилирование eIF2α усиливает синтез ATF4; та же нагрузка активирует IRE1α, который вместе с RtcB образует мРНК XBP1s, с которой синтезируется белок XBP1s, и ATF6α, который после протеолиза в аппарате Гольджи даёт N-концевой фрагмент. Электрофил модифицирует цистеины KEAP1, и распад NRF2 замедляется. При недостатке O₂ PHD образуют меньше гидроксилированного HIF-α, pVHL распознаёт меньше молекул, и HIF-α накапливается.Генетическое выключение звена проверяет его необходимость. Без PERK стресс ЭПР не повышает p-eIF2α в этой системе, но IRE1α и ATF6 активируются собственными путями. Без pVHL HIF-α накапливается и при достаточном O₂, хотя PHD продолжают его гидроксилировать. Каждое такое сравнение отвечает на вопрос об одном звене и при одних условиях.Между путями есть перекрёстная регуляция: например, PERK может фосфорилировать NRF2, а ATF4 и NRF2 регулируют часть общих генов. Модель эти связи не рассчитывает. Из их существования не следует, что любое воздействие обязательно активирует все четыре пути: при каждом сочетании нужно проверять состояние каждого звена отдельно.Типичная ошибка Если пути связаны перекрёстной регуляцией, любое стрессовое воздействие активирует все четыре пути сразу.В этой учебной модели каждому пути задан собственный первичный вход: действие электрофила на сворачивание в ЭПР и влияние недостатка O₂ на KEAP1 не рассчитываются. В клетках перекрёстные связи существуют, а их вклад зависит от условий и проверяется отдельно.В условной системе стресс ЭПР активировал IRE1 и ATF6, но PERK отсутствует, а другие киназы eIF2α не активированы. Какое сочетание согласуется с этими условиями?А. XBP1s и активный фрагмент ATF6 образуются только после обязательного повышения p-eIF2α. (неверный вариант)В условии собственные входы IRE1 и ATF6 активированы; их выходы не требуют предварительного прохождения через PERK.Б. Без PERK исчезают все выходы UPR, включая XBP1s и фрагмент ATF6. (неверный вариант)Отсутствие одной ветви не тождественно выключению остальных сенсоров.В. XBP1s и активный фрагмент ATF6 могут образоваться без PERK-зависимого повышения p-eIF2α. (верный вариант)Раздельные молекулярные ветви допускают такое сочетание; это не утверждение об универсальном отсутствии перекрёстной регуляции.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаCosta-Mattioli M., Walter P. The integrated stress response: From mechanism to disease. Science. 2020.Acosta-Alvear D. et al. Homeostasis control in health and disease by the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025.Liu S., Pi J., Zhang Q. Signal amplification in the KEAP1-NRF2-ARE antioxidant response pathway. Redox Biol. 2022;54:102389.Kaelin W.G. Jr, Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 2008;30:393–402.Cullinan S. B. et al. Nrf2 is a direct PERK substrate and effector of PERK-dependent cell survival. Mol Cell Biol. 2003;23:7198–7209.Явно условная система: учебная модель, качественные канонические состояния, без расчёта межпутевых эффектов. Другие киназы eIF2α не активированы; IRE1α, ATF6, KEAP1, PHD и pVHL работают, если не выключены переключателем. Связи путей описаны по обзорам Costa-Mattioli 2020 (ISR), Acosta-Alvear 2025 (UPR), Liu 2022 (KEAP1–NRF2) и Kaelin 2008 (HIF). Фосфорилирование NRF2 киназой PERK показано в клетках млекопитающих при стрессе ЭПР (Cullinan 2003, прочитана аннотация) и в модель не включено.
