Цикл Hsp70 · шаг 1 из 26Как цикл ATP и ADP меняет сродство Hsp70 к субстратуHsp70 связывает открытые гидрофобные участки развёрнутых белков, но прочность связывания зависит от нуклеотида в его нуклеотид-связывающем домене. Гидролиз ATP закрывает крышку над субстратом, а замена ADP на ATP её открывает.Hsp70 в комплексе с ATP: субстрат-связывающий домен (SBD) открыт, субстрат связывается и отходит быстро.Гидролиз ATP в NBD через линкер передаётся на SBD: крышка закрывается, и субстрат отходит медленно.Выход ADP и связывание новой молекулы ATP открывают SBD, и субстрат освобождается.Hsp70 — шаперон, который связывает короткие гидрофобные участки полипептида. В нативном белке такие участки спрятаны внутри глобулы, а у развёрнутых, неправильно свёрнутых и ещё не достроенных молекул они открыты. Связывание с Hsp70 не даёт таким молекулам слипаться друг с другом.Молекула Hsp70 состоит из двух доменов, соединённых линкером. Нуклеотид-связывающий домен (NBD) связывает и гидролизует ATP. Субстрат-связывающий домен (SBD) несёт карман для полипептида и α-спиральную крышку. Когда в NBD находится ATP, карман открыт: субстрат связывается быстро, но так же быстро и отходит. После гидролиза ATP до ADP конформация обоих доменов меняется, крышка закрывается, и субстрат отходит во много раз медленнее.Цикл замыкается, когда ADP выходит из NBD и его место занимает ATP, которого в цитоплазме много. SBD снова открывается, и субстрат освобождается. Освобождённая молекула может свернуться сама или снова связаться с Hsp70.Сочетание двух состояний даёт выигрыш, недоступный ни одному из них по отдельности: субстрат быстро захватывается в ATP-состоянии и медленно отходит в ADP-состоянии. Расчёты показывают, что за счёт расхода ATP эффективное сродство может быть на порядки выше равновесного; такое сродство называют неравновесным, или «сверхсродством». Hsp70 при этом не задаёт белку готовую нативную структуру. Связывание с шапероном может изменять конформацию субстрата и устранять ошибочно свёрнутые состояния; после освобождения часть молекул приобретает нативную структуру (Imamoglu 2020).Типичная ошибка Hsp70 сворачивает белок за счёт энергии ATP, как мотор, придающий цепи правильную форму.Энергия ATP расходуется на смену состояний Hsp70 — прочное связывание и освобождение субстрата. Правильная укладка цепи после освобождения определяется её аминокислотной последовательностью; за один цикл сворачивается лишь часть молекул, поэтому нужны повторные циклы.Hsp70 находится в ATP-состоянии и связал гидрофобный участок субстрата. Затем ATP в NBD гидролизовался до ADP. Как изменится скорость отхода субстрата от SBD?А. Не изменится: нуклеотид связан с другим доменом. (неверный вариант)Домены связаны аллостерически через линкер: смена нуклеотида в NBD меняет конформацию SBD и положение крышки.Б. Снизится: крышка закроется над субстратом. (верный вариант)После гидролиза ATP крышка SBD закрывается, и субстрат отходит во много раз медленнее, чем в ATP-состоянии.В. Возрастёт: ADP вытеснит субстрат из кармана. (неверный вариант)ADP связывается в NBD, а не в кармане SBD; вытеснения субстрата нет — наоборот, ADP-состояние удерживает его прочнее.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаRosenzweig R., Nillegoda N.B., Mayer M.P., Bukau B. The Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:665–680Wentink A., Rosenzweig R., Kampinga H., Bukau B. Mechanisms and regulation of the Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27:110–128. PMID 41145833. Связанные исправления: Publisher Correction, 2026;27:172, doi:10.1038/s41580-025-00932-2, PMID 41198871; Author Correction, 2026;27:875, doi:10.1038/s41580-026-01029-0, PMID 42716998 (рис. 1a: добавлен HSPA6, в семействе 11 белков вместо 10)De Los Rios P., Barducci A. Hsp70 chaperones are non-equilibrium machines that achieve ultra-affinity by energy consumption. eLife. 2014;3:e02218Imamoglu R., Balchin D., Hayer-Hartl M., Hartl F.U. Bacterial Hsp70 resolves misfolded states and accelerates productive folding of a multi-domain protein. Nat Commun. 2020;11:365Схема механизма, качественные состояния. Строение доменов и смена конформаций обобщены по обзорам Rosenzweig 2019 (реферат) и Wentink 2026 (полный текст). Неравновесное «сверхсродство» — вывод теоретической модели De Los Rios 2014 (реферат), а не прямое измерение в клетке. Устранение ошибочно свёрнутых промежуточных состояний люциферазы при связывании с DnaK — Imamoglu 2020 (in vitro, DnaK, DnaJ, GrpE; реферат). Слова «быстро», «медленно», «высокое», «низкое» на схеме не являются измерениями.
Цикл Hsp70 · шаг 2 из 26Как J-белок выбирает субстрат и запускает гидролиз ATPСобственный гидролиз ATP у Hsp70 медленный. J-доменный белок связывает субстрат и одновременно через мотив HPD стимулирует гидролиз ATP — так захват субстрата и закрытие крышки происходят вместе.J-белок связывает развёрнутый белок своими субстрат-связывающими доменами и подводит его к Hsp70.J-домен с мотивом His-Pro-Asp (HPD) взаимодействует с NBD и линкером Hsp70 и стимулирует гидролиз ATP.Стимуляция сильнее всего, когда субстрат одновременно находится в SBD: гидролиз совпадает по времени с захватом.У человека около 50 J-доменных белков (JDP, прежнее название — Hsp40) и лишь 11 белков Hsp70. Разнообразие J-белков определяет, к каким субстратам и комплексам будет привлечён Hsp70. Одни J-белки узнают гидрофобные участки любых развёрнутых белков, другие связывают определённые белки, третьи прикрепляют Hsp70 к рибосоме или транслокону.Общая часть всех J-белков — J-домен из примерно 70 остатков с консервативным мотивом His-Pro-Asp (HPD). J-домен связывается с Hsp70 в области NBD и линкера и запускает конформационную перестройку, ускоряющую гидролиз ATP. В экспериментах с бактериальными DnaK и DnaJ гидролиз ускорялся более чем в 1000 раз, но при низкой концентрации DnaJ — только в присутствии белкового субстрата. Значит, наибольший эффект дают одновременно связанные J-белок и субстрат.Такое сопряжение имеет смысл для захвата субстрата. Если гидролиз произойдёт, пока субстрат находится в открытом кармане, крышка закроется именно над ним. Без стимуляции субстрат чаще отходит раньше, чем ATP будет гидролизован.Замена гистидина мотива HPD (например, H32Q у J-белка DNAJB1 человека) лишает J-домен способности стимулировать гидролиз. Такой белок может связывать субстрат, но Hsp70 прочно его не захватывает. Поэтому замена в мотиве HPD показывает, что для работы системы нужна именно стимуляция гидролиза, а не только доставка субстрата.Типичная ошибка J-белок — фактор обмена нуклеотидов: он заменяет ADP на ATP и освобождает субстрат.J-белок ускоряет другую стадию цикла — гидролиз ATP, после которого субстрат удерживается прочно. Выход ADP и освобождение субстрата ускоряют факторы обмена нуклеотидов (NEF).В пробирке Hsp70, ATP и белковый субстрат. Добавили J-белок с заменой H→Q в мотиве HPD в той же концентрации, что и J-белок дикого типа в контроле. Как изменится скорость гидролиза ATP по сравнению с контролем?А. Будет выше: мутантный J-белок прочнее связывает субстрат. (неверный вариант)Прочность связывания субстрата J-белком не заменяет стимуляцию: гидролиз ATP у Hsp70 ускоряет именно J-домен с мотивом HPD.Б. Будет такой же: субстрат сам стимулирует гидролиз. (неверный вариант)Субстрат один ускоряет гидролиз слабо; сильная стимуляция требует одновременного действия субстрата и J-домена с мотивом HPD.В. Будет ниже: мотив HPD нужен для стимуляции гидролиза. (верный вариант)Замена гистидина в мотиве HPD лишает J-домен способности стимулировать гидролиз ATP, поэтому скорость будет близка к скорости без J-белка.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаLaufen T., Mayer M.P., Beisel C. et al. Mechanism of regulation of hsp70 chaperones by DnaJ cochaperones. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:5452–5457Kityk R., Kopp J., Mayer M.P. Molecular mechanism of J-domain-triggered ATP hydrolysis by Hsp70 chaperones. Mol Cell. 2018;69:227–237Wentink A., Rosenzweig R., Kampinga H., Bukau B. Mechanisms and regulation of the Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27:110–128. PMID 41145833. Связанные исправления: Publisher Correction, 2026;27:172, doi:10.1038/s41580-025-00932-2, PMID 41198871; Author Correction, 2026;27:875, doi:10.1038/s41580-026-01029-0, PMID 42716998 (рис. 1a: добавлен HSPA6, в семействе 11 белков вместо 10)Схема механизма, качественные состояния. Числа стимуляции получены in vitro на бактериальных белках DnaK и DnaJ (Laufen 1999, реферат); структурная основа роли мотива HPD — кристаллическая структура комплекса DnaK с J-доменом (Kityk 2018, реферат). Число J-белков и Hsp70 у человека — по обзору Wentink 2026 (полный текст) с исправлением авторов 2026 г.: в рис. 1a добавлен HSPA6, в семействе Hsp70 11 белков, а не 10. Обозначения «низкий», «высокий» на схеме не являются измерениями.
Цикл Hsp70 · шаг 3 из 26Почему для освобождения субстрата нужен фактор обмена нуклеотидовВ ADP-состоянии Hsp70 удерживает субстрат, пока ADP не выйдет из NBD. Фактор обмена нуклеотидов ускоряет этот выход и тем самым определяет, как долго длится связывание.NEF связывается с NBD Hsp70 в ADP-состоянии и снижает его сродство к ADP.ADP выходит, карман NBD занимает ATP, крышка SBD открывается, и субстрат освобождается.Количество и тип NEF задают время удержания: и недостаток, и избыток NEF снижают выход сворачивания in vitro.Без NEF ADP выходит из NBD медленно, и комплекс Hsp70·ADP·субстрат существует долго. Субстрат защищён от агрегации, но не может свернуться: чтобы получить такую возможность, он должен быть освобождён.NEF связывается с NBD и раскрывает карман нуклеотида. Структурно факторы обмена очень разные: у бактерий это GrpE, у человека — 13 белков четырёх семейств: GrpE-подобные белки митохондрий, Hsp110, белки с повторами армадилло (HspBP1 и SIL1 в ЭПР) и белки BAG. Несмотря на разное происхождение, все они действуют на один и тот же участок NBD. Эффективность различается: белки с повторами армадилло ускоряют выход ADP лишь в 5–10 раз, а BAG-1M в экспериментах in vitro ускорял выход ADP из Hsc70 до 900 раз.Освобождение субстрата должно происходить вовремя. В экспериментах in vitro BAG-1M в высокой концентрации в отсутствие фосфата подавлял сворачивание люциферазы, а в низкой концентрации в присутствии фосфата усиливал его. Одно из объяснений: при слишком быстром обмене субстрат освобождается раньше, чем Hsp70 успевает изменить его конформацию. Противоположно NEF действует белок Hip: он стабилизирует ADP-состояние и продлевает связывание.Значит, скорость и результат цикла определяются соотношением J-белков и NEF, а не одним из них.Типичная ошибка Чем больше фактора обмена нуклеотидов, тем эффективнее сворачивание: больше циклов — больше попыток.Число циклов растёт, но при избытке NEF освобождение становится преждевременным, и доля молекул, свернувшихся после освобождения, падает. In vitro зависимость от количества NEF колоколообразная (Gässler 2001).В пробирке Hsp70, J-белок, ATP и развёрнутая люцифераза; NEF нет, и большая часть люциферазы находится в комплексе Hsp70·ADP. Добавили BAG1 в небольшом количестве. Как изменится время удержания люциферазы в одном цикле?А. Сократится: BAG1 ускорит выход ADP. (верный вариант)BAG1 связывается с NBD и ускоряет выход ADP; после связывания ATP крышка открывается, и люцифераза освобождается раньше.Б. Увеличится: BAG1 стабилизирует ADP-состояние. (неверный вариант)ADP-состояние стабилизирует белок Hip; BAG1 действует противоположно — ускоряет выход ADP.В. Не изменится: BAG1 действует только на гидролиз ATP. (неверный вариант)Гидролиз ATP ускоряет J-белок. BAG1 — фактор обмена нуклеотидов: он действует на следующую стадию, выход ADP.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWentink A., Rosenzweig R., Kampinga H., Bukau B. Mechanisms and regulation of the Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27:110–128. PMID 41145833. Связанные исправления: Publisher Correction, 2026;27:172, doi:10.1038/s41580-025-00932-2, PMID 41198871; Author Correction, 2026;27:875, doi:10.1038/s41580-026-01029-0, PMID 42716998 (рис. 1a: добавлен HSPA6, в семействе 11 белков вместо 10)Gässler C.S., Wiederkehr T., Brehmer D., Bukau B., Mayer M.P. Bag-1M accelerates nucleotide release for human Hsc70 and Hsp70 and can act concentration-dependent as positive and negative cofactor. J Biol Chem. 2001;276:32538–32544Схема механизма, качественные состояния. Семейства NEF, диапазоны ускорения и действие Hip — по обзору Wentink 2026 (полный текст); ускорение выхода ADP до 900 раз и концентрационная зависимость сворачивания люциферазы — эксперименты in vitro с очищенными Hsc70/Hsp70 человека и BAG-1M (Gässler 2001, реферат). Состояние «избыток NEF» — качественная иллюстрация, а не измерение.
Цикл Hsp70 · шаг 4 из 26Как решается судьба субстрата: новая попытка, передача Hsp90 или деградацияHsp70 не «решает», что делать с субстратом: судьба белка определяется конкуренцией процессов. Белок, который свернулся, перестаёт связываться; белок, который долго остаётся развёрнутым, связывают Hsp90 или убиквитинлигаза CHIP.После освобождения субстрат либо сворачивается и прячет гидрофобные участки, либо снова связывается с Hsp70.Белок HOP связывает Hsp70 и Hsp90 и помогает передать субстрат Hsp90; для передачи нужен NEF.CHIP связывается с C-концевым мотивом EEVD Hsp70 и Hsp90 и убиквитинирует связанный субстрат — он направляется в протеасому.За один цикл связывания и освобождения сворачивается лишь часть молекул субстрата. Это показали ещё на бактериальной системе DnaK, DnaJ и GrpE: для полного восстановления активности люциферазы нужны многие циклы. Каждый цикл даёт молекуле новую попытку.Белок, который свернулся, прячет гидрофобные участки внутрь глобулы и больше не узнаётся шаперонами. Белок, который остаётся развёрнутым, связывается снова и снова. Поэтому выбор между сворачиванием и деградацией описывают как кинетическую конкуренцию: участки, узнаваемые Hsp70, могут служить и сигналами деградации, если остаются открытыми долго.Ход конкуренции смещают кошапероны. HOP связывается с C-концами Hsp70 и Hsp90 и помогает передать субстрат от одного шаперона другому. Убиквитинлигаза CHIP (STUB1) содержит домен TPR, которым связывается с теми же C-концевыми мотивами EEVD, и U-бокс, который переносит убиквитин на субстрат. В экспериментах CHIP вызывал убиквитинирование и протеасомную деградацию глюкокортикоидного рецептора — клиента Hsp90. Белок BAG1 своим убиквитиноподобным доменом связывается с протеасомой, а BAG3 направляет связанные с Hsp70 белки к аутофагии.Так шаперонная система соединена с системами деградации: о протеасоме — вопрос 2 семинара, об аутофагии — вопрос 4.Типичная ошибка Hsp70 сам разрушает неправильно свёрнутые белки.У Hsp70 нет протеолитической активности. Неисправимый субстрат убиквитинирует связанная с шапероном лигаза CHIP, а расщепляет 26S-протеасома; часть субстратов направляется к аутофагии через BAG3.Развёрнутый белок прошёл много циклов связывания с Hsp70, но так и не свернулся. С Hsp70 связана убиквитинлигаза CHIP. Какое событие ожидается для этого белка?А. Hsp70 расщепит его в своём субстрат-связывающем домене. (неверный вариант)У Hsp70 нет протеолитического центра: SBD связывает полипептид, но не расщепляет его.Б. CHIP присоединит к нему убиквитин, и белок разрушит протеасома. (верный вариант)CHIP связывается с C-концом Hsp70 доменом TPR и через U-бокс убиквитинирует субстрат; убиквитинированный белок разрушает 26S-протеасома.В. CHIP ускорит гидролиз ATP, и белок свернётся. (неверный вариант)Гидролиз ATP у Hsp70 стимулируют J-белки; CHIP — убиквитинлигаза, она направляет субстрат на деградацию, а не на сворачивание.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаSzabo A., Langer T., Schröder H. et al. The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91:10345–10349Wentink A., Rosenzweig R., Kampinga H., Bukau B. Mechanisms and regulation of the Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27:110–128. PMID 41145833. Связанные исправления: Publisher Correction, 2026;27:172, doi:10.1038/s41580-025-00932-2, PMID 41198871; Author Correction, 2026;27:875, doi:10.1038/s41580-026-01029-0, PMID 42716998 (рис. 1a: добавлен HSPA6, в семействе 11 белков вместо 10)Connell P., Ballinger C.A., Jiang J. et al. The co-chaperone CHIP regulates protein triage decisions mediated by heat-shock proteins. Nat Cell Biol. 2001;3:93–96Схема механизма, качественные состояния. Многократные циклы — эксперименты in vitro с DnaK, DnaJ, GrpE и люциферазой (Szabo 1994, реферат). Роль HOP, CHIP, BAG1 и BAG3 и представление о кинетической конкуренции — по обзору Wentink 2026 (полный текст); убиквитинирование глюкокортикоидного рецептора CHIP — клетки COS (Connell 2001, реферат). На схеме один субстрат показан в трёх вариантах судьбы; вероятности не указаны.
Цикл Hsp70 · шаг 5 из 26Где ещё работает цикл Hsp70 и что меняется при стрессеОдин и тот же цикл ATP и ADP служит разным задачам: J-белок определяет, где и с каким субстратом работает Hsp70. При стрессе HSF1 усиливает синтез компонентов системы.В ЭПР BiP с J-белком DNAJC23 (Sec63) связывает входящую цепь у транслокона Sec61.В цитоплазме HSPA8 с J-белком ауксилином (DNAJC6) снимает клатриновую оболочку с пузырьков.У животных Hsp70 с J-белками классов A и B и Hsp110 растворяет белковые агрегаты.Hsp70 связывает гидрофобные участки почти любой последовательности, поэтому специфичность ему задают J-белки. В ЭПР BiP вместе с J-белком DNAJC23 (Sec63) связывает цепь, входящую через транслокон Sec61, и не даёт ей вернуться в цитоплазму. В митохондриях mtHsp70 (HSPA9) вместе с J-белками, закреплёнными в комплексе TIM, обеспечивает вход белков в матрикс. В цитоплазме HSPA8 с J-белком ауксилином (DNAJC6) разбирает клатриновую оболочку эндоцитозных пузырьков.У бактерий, грибов и растений агрегаты растворяет AAA+-белок Hsp100 вместе с Hsp70, а в цитозоле животных дезагрегаз семейства Hsp100 нет. Вместо них работает комплекс Hsp70, J-белков классов A и B и Hsp110 в роли NEF: in vitro он растворял агрегаты люциферазы и других белков после нагревания, а у нематоды снижение содержания Hsp110 нарушало растворение агрегатов после теплового шока.При тепловом шоке и других воздействиях, нарушающих сворачивание белков, транскрипционный фактор HSF1 усиливает синтез Hsp70, J-белков и NEF; локальные программы того же рода действуют в ЭПР (UPR) и в митохондриях. С возрастом ёмкость сети протеостаза снижается, а неправильно свёрнутые белки накапливаются, особенно в постмитотических клетках, например в нейронах.Общее во всех случаях одно: ATP-зависимый цикл связывания и освобождения, направленный J-белком и завершённый NEF.Типичная ошибка Hsp70 нужен клетке только при тепловом шоке, поэтому его называют белком теплового шока.Многие Hsp70 синтезируются постоянно (Hsc70, BiP, mtHsp70) и работают и без стресса: в транслокации белков, снятии клатриновой оболочки, сворачивании новых цепей. При тепловом шоке HSF1 дополнительно усиливает синтез индуцибельных форм и кошаперонов.В клетках нематоды снизили содержание Hsp110, затем подвергли их тепловому шоку. Как изменится растворение образовавшихся белковых агрегатов по сравнению с контролем?А. Ускорится: Hsp110 конкурирует с Hsp70 за субстрат. (неверный вариант)Hsp110 у животных работает вместе с Hsp70 как фактор обмена нуклеотидов; без него растворение агрегатов ослабевает, а не ускоряется.Б. Не изменится: агрегаты растворяет Hsp100. (неверный вариант)В цитозоле животных нет дезагрегаз семейства Hsp100 (Hsp104 дрожжей, ClpB бактерий); эту функцию выполняет комплекс Hsp70 с J-белками и Hsp110.В. Замедлится: Hsp110 нужен Hsp70 для растворения агрегатов. (верный вариант)Hsp110 как фактор обмена нуклеотидов поддерживает работу Hsp70 и J-белков на агрегатах; у нематоды снижение его содержания нарушало растворение агрегатов после теплового шока (Rampelt 2012).Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWentink A., Rosenzweig R., Kampinga H., Bukau B. Mechanisms and regulation of the Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27:110–128. PMID 41145833. Связанные исправления: Publisher Correction, 2026;27:172, doi:10.1038/s41580-025-00932-2, PMID 41198871; Author Correction, 2026;27:875, doi:10.1038/s41580-026-01029-0, PMID 42716998 (рис. 1a: добавлен HSPA6, в семействе 11 белков вместо 10)Rampelt H., Kirstein-Miles J., Nillegoda N.B. et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 2012;31:4221–4235Nillegoda N.B., Kirstein J., Szlachcic A. et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 2015;524:247–251Hipp M.S., Kasturi P., Hartl F.U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:421–435Схема механизма, качественные состояния. Функции BiP и DNAJC23, mtHsp70 и TIM, HSPA8 и ауксилина, роль HSF1 — по обзору Wentink 2026 (полный текст). Растворение агрегатов комплексом Hsp70, J-белков классов A и B и Hsp110: эксперименты in vitro с белками человека и эксперименты на C. elegans (Rampelt 2012; Nillegoda 2015, рефераты). Снижение ёмкости сети протеостаза при старении — обзор Hipp 2019 (полный текст).
Цикл Hsp70 · шаг 6 из 26Как проверить работу цикла: сворачивание люциферазы in vitroРаботу шаперонной системы проверяют на модельном белке: люцифераза после нагревания теряет активность, а свет при окислении люциферина излучают только вновь свернувшиеся молекулы.Люциферазу разворачивают нагреванием или денатурирующим веществом и переносят в смесь с Hsp70, J-белком, NEF и ATP.Через разные промежутки времени из смеси отбирают одинаковые пробы, разводят в регистрационной смеси с люциферином, ATP и Mg²⁺ и сразу измеряют свечение — долю активности от нативной люциферазы.Контрольные смеси без одного компонента или с мутантным белком показывают, какая стадия цикла нужна для восстановления активности.Сворачивание белка в клетке трудно наблюдать непосредственно, поэтому механизм цикла Hsp70 изучали на очищенных белках. Удобный субстрат — люцифераза светлячка: её активность легко измерить, а развёрнутая люцифераза быстро агрегирует, если шаперонов нет. Восстановление свечения показывает, какая доля молекул вернулась в нативное состояние.Полная смесь содержит Hsp70, J-белок, NEF и ATP. Её сравнивают с контролями: без ATP, без J-белка или с J-белком, у которого заменён мотив HPD, без NEF, с Hsp70 без гидролиза ATP (Hsc70 K71M связывает ATP, но не гидролизует его). Если активность не восстанавливается в одном из контролей, значит, соответствующая стадия необходима. Именно так было показано, что сворачивание требует многих циклов связывания и освобождения, а избыток BAG-1M подавляет сворачивание. Сворачивание и измерение разделены: ATP нужен и самой люциферазе для реакции свечения, поэтому все пробы измеряют в одинаковой регистрационной смеси с ATP, а в контроле «без ATP» его нет только на стадии сворачивания. Пробу измеряют сразу после разведения, чтобы стадия регистрации не стала дополнительным временем сворачивания. Полезно сравнивать кривые во времени, а не одну точку: в учебной модели без NEF активность растёт медленно, а без стимуляции гидролиза почти не растёт.Метод имеет пределы. Концентрации белков подбирают экспериментаторы, люцифераза — не естественный субстрат, а условия (температура, ионы, фосфат) меняют результат. Поэтому вывод «компонент необходим in vitro» нельзя напрямую переносить на клетку: в клетках его проверяют отдельно.Типичная ошибка Если полная смесь восстановила активность люциферазы, то в клетке этот белок сворачивается так же.Эксперимент in vitro показывает, что выбранных компонентов достаточно в выбранных концентрациях. В клетке состав сети шаперонов, концентрации и субстраты другие; вывод требует проверки в клетках.Люциферазу развернули нагреванием и поместили в смесь Hsc70, J-белка, NEF и ATP. В контрольной смеси Hsc70 дикого типа заменили на Hsc70 K71M. Какой результат контроля ожидается?А. Активность почти не восстановится: без гидролиза ATP нет прочного захвата. (верный вариант)Hsc70 K71M связывает ATP, но не гидролизует его; крышка SBD не закрывается над субстратом, и люцифераза агрегирует почти как без шаперона.Б. Активность восстановится быстрее: ATP не будет тратиться впустую. (неверный вариант)Расход ATP не потеря: гидролиз нужен для прочного захвата субстрата; без него восстановления почти нет.В. Активность восстановится так же: связывания ATP достаточно. (неверный вариант)Связывание ATP оставляет Hsp70 в открытом состоянии с быстрым отходом субстрата; для захвата нужен гидролиз ATP.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаSzabo A., Langer T., Schröder H. et al. The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91:10345–10349O'Brien M.C., Flaherty K.M., McKay D.B. Lysine 71 of the chaperone protein Hsc70 is essential for ATP hydrolysis. J Biol Chem. 1996;271:15874–15878Gässler C.S., Wiederkehr T., Brehmer D., Bukau B., Mayer M.P. Bag-1M accelerates nucleotide release for human Hsc70 and Hsp70 and can act concentration-dependent as positive and negative cofactor. J Biol Chem. 2001;276:32538–32544Imamoglu R., Balchin D., Hayer-Hartl M., Hartl F.U. Bacterial Hsp70 resolves misfolded states and accelerates productive folding of a multi-domain protein. Nat Commun. 2020;11:365Схема метода · условные пиктограммы. Кривые на второй карточке рассчитаны по учебной модели практикума (вопрос 1, продвинутый уровень), а не взяты из статьи. Многократные циклы — DnaK, DnaJ, GrpE и люцифераза in vitro (Szabo 1994, реферат); разведение проб в регистрационной смеси и измерение в течение 2 с — Imamoglu 2020 (раздел Methods); Hsc70 K71M — ATPазный фрагмент Hsc70 быка, ATP связан, гидролиза нет (O'Brien 1996, реферат); подавление сворачивания избытком BAG-1M — Gässler 2001 (реферат).
Дегрон и 26S-протеасома · шаг 7 из 26Как каскад E1–E2–E3 присоединяет убиквитин к субстратуУбиквитин присоединяется к белку-мишени не одним ферментом, а цепочкой из трёх: E1 активирует его за счёт ATP, E2 переносит, а убиквитинлигаза E3 выбирает субстрат.E1 расходует ATP: образует аденилат убиквитина и присоединяет убиквитин тиоэфирной связью к собственному цистеину.E1 передаёт убиквитин на цистеин E2, и E2·убиквитин связывается с убиквитинлигазой E3.E3 связывает субстрат и обеспечивает перенос убиквитина на ε-аминогруппу остатка лизина субстрата.Убиквитин — белок из 76 аминокислот. Его C-концевой глицин может образовать связь с остатком лизина другого белка. Сам по себе убиквитин к белкам не присоединяется: его нужно активировать.Активацию выполняет фермент E1 (у человека в основном UBA1). E1 использует энергию ATP: сначала образуется аденилат убиквитина и освобождается пирофосфат, затем убиквитин присоединяется тиоэфирной связью к цистеину активного центра E1. Далее убиквитин переходит на цистеин фермента E2 — у человека около 40 генов E2.Выбор субстрата — работа убиквитинлигазы E3; таких генов у человека около 600. E3 одновременно связывает E2·убиквитин и субстрат. RING-лигазы сближают их, и убиквитин переходит прямо с E2 на лизин субстрата. HECT-лигазы сначала принимают убиквитин на собственный цистеин и уже затем переносят его на субстрат; RBR-лигазы сочетают оба способа.Повторные циклы удлиняют цепь: следующий убиквитин присоединяется к лизину уже присоединённого убиквитина. Если ингибировать E1, например соединением TAK-243, остановится убиквитинирование всех субстратов, а если устранить одну E3 — только её субстратов. Поэтому избирательность системы определяется прежде всего многообразием E3.Типичная ошибка Протеасома сама находит белки, которые нужно разрушить, а убиквитин — лишь кофактор протеасомы.Белок выбирает убиквитинлигаза E3, узнающая его дегрон; протеасома связывает уже присоединённую цепь убиквитина и почти не различает субстраты по их последовательности.В клетках ингибировали одну убиквитинлигазу E3, а E1 и E2 продолжают работать. Как изменится убиквитинирование белков клетки?А. Остановится для всех белков клетки (неверный вариант)Общая стадия каскада — E1; ингибирование одной E3 не мешает другим лигазам переносить убиквитин на свои субстраты.Б. Нарушится только для субстратов этой E3 (верный вариант)Каждая E3 узнаёт свои дегроны; остальные лигазы продолжают работу, поэтому затронуты только её субстраты.В. Не изменится ни для одного белка (неверный вариант)У субстратов этой E3 убиквитинирование снизится: другие лигазы обычно не узнают их дегрон.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаZhang Z., Mena E.L., Timms R.T., Koren I., Elledge S.J. Degrons: defining the rules of protein degradation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:868–883. doi:10.1038/s41580-025-00870-zHyer M.L., Milhollen M.A., Ciavarri J. et al. A small-molecule inhibitor of the ubiquitin activating enzyme for cancer treatment. Nat Med. 2018;24:186–193. doi:10.1038/nm.4474Collins G.A., Goldberg A.L. The logic of the 26S proteasome. Cell. 2017;169:792–806. doi:10.1016/j.cell.2017.04.023Схема механизма, качественные состояния. Число E3 у человека — по обзору Zhang 2025 (полный текст); число E2 — около 40, по обзорам. Действие TAK-243 показано на клетках опухолевых линий человека: ингибитор E1 снижал содержание убиквитиновых конъюгатов (Hyer 2018, реферат). Обозначения «работает», «остановлено» на схеме не являются измерениями.
Дегрон и 26S-протеасома · шаг 8 из 26Что такое дегрон и как убиквитинлигаза узнаёт субстратДегрон — участок белка, который узнаёт убиквитинлигаза E3. Он может существовать всегда, а может возникать после модификации белка, например после фосфорилирования.Убиквитинлигаза E3 связывает дегрон субстрата своим узнающим модулем, например F-бокс-белком βTrCP в составе SCF.Киназа фосфорилирует остатки мотива, и только фосфорилированный мотив связывается с βTrCP — так сигнал создаёт дегрон.Замена ключевых остатков дегрона может лишить E3 возможности связать субстрат: тогда белок перестаёт убиквитинироваться и становится устойчивым.Дегроны разнообразны. N-дегрон — дестабилизирующий N-концевой остаток, который узнают специальные E3; C-дегрон — короткий мотив на C-конце. Внутренние дегроны — короткие мотивы внутри последовательности или гидрофобные участки, открывающиеся при нарушении сворачивания. У циклина B дегрон — D-бокс, его узнаёт лигаза APC/C.Многие дегроны возникают по сигналу. В IκBα — ингибиторе транскрипционного фактора NF-κB — мотив DSGΨxS становится дегроном после фосфорилирования S32 и S36 киназой IKK. Фосфорилированный мотив связывает F-бокс-белок βTrCP в составе куллиновой лигазы SCF; такой же фосфодегрон есть у β-катенина. Замены S32A/S36A в IκBα не позволяют IKK фосфорилировать эти остатки, и IκBα не разрушается после стимула.Дегрон и цепь убиквитина — разные сигналы. Дегрон узнаёт E3, и от этого узнавания зависит, будет ли белок убиквитинирован. Цепь убиквитина затем узнаёт протеасома. Поэтому замена ключевых остатков дегрона стабилизирует белок, хотя его последовательность почти не изменилась.Дегроны известны лишь для небольшой части из примерно 600 E3 человека. Их ищут, систематически заменяя участки белков и измеряя устойчивость репортёров. Один и тот же белок может иметь несколько дегронов, которые узнают разные лигазы в разных условиях.Типичная ошибка Дегрон — это и есть цепь убиквитина на белке.Дегрон — участок самого субстрата, который узнаёт E3. Цепь убиквитина появляется после узнавания дегрона и служит сигналом уже для протеасомы.IκBα дикого типа и IκBα S32A/S36A экспрессируют в клетках и добавляют TNFα, который активирует IKK. Связывание с βTrCP какой формы IκBα усилится после стимула?А. Только формы дикого типа (верный вариант)У IκBα дикого типа IKK фосфорилирует S32 и S36, и фосфорилированный мотив связывается с βTrCP; у мутанта эти остатки заменены аланином.Б. Только мутантной формы (неверный вариант)Мутант S32A/S36A не может быть фосфорилирован по этим остаткам, а βTrCP связывает именно фосфорилированный мотив.В. Обеих форм в равной мере (неверный вариант)Связывание βTrCP требует фосфорилирования S32 и S36, поэтому две формы ведут себя по-разному.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаZhang Z., Mena E.L., Timms R.T., Koren I., Elledge S.J. Degrons: defining the rules of protein degradation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:868–883. doi:10.1038/s41580-025-00870-zVarshavsky A. N-degron and C-degron pathways of protein degradation. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116:358–366. doi:10.1073/pnas.1816596116Winston J.T., Strack P., Beer-Romero P. et al. The SCFβ-TRCP-ubiquitin ligase complex associates specifically with phosphorylated destruction motifs in IκBα and β-catenin and stimulates IκBα ubiquitination in vitro. Genes Dev. 1999;13:270–283. doi:10.1101/gad.13.3.270. Исправление: Genes Dev. 1999;13:1050 (заново напечатан рис. 3a)Brown K., Gerstberger S., Carlson L., Franzoso G., Siebenlist U. Control of IκB-α proteolysis by site-specific, signal-induced phosphorylation. Science. 1995;267:1485–1488. doi:10.1126/science.7878466Glotzer M., Murray A.W., Kirschner M.W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 1991;349:132–138. doi:10.1038/349132a0Схема механизма, качественные состояния. Фосфодегрон IκBα и β-катенина и его связывание с SCF(βTrCP) — по Winston 1999 (реферат; белки человека, клетки и in vitro); устойчивость мутанта S32A/S36A после стимула — по Brown 1995 и Chen 1995 (рефераты; клеточные линии человека). Классы дегронов — по обзорам Varshavsky 2019 (реферат) и Zhang 2025 (полный текст); D-бокс циклина — Glotzer 1991 (реферат через обзор).
Дегрон и 26S-протеасома · шаг 9 из 26Какая цепь убиквитина направляет белок в протеасомуУбиквитин сам содержит семь остатков лизина, поэтому цепи бывают разными. Классический сигнал для протеасомы — цепь, связанная через K48; в экспериментах in vitro эффективной оказалась цепь из четырёх и более молекул убиквитина.Следующий убиквитин присоединяется к одному из лизинов предыдущего; при связывании через K48 цепь узнают рецепторы 19S-частицы.В экспериментах с модельными субстратами in vitro эффективным сигналом была цепь K48 из четырёх убиквитинов: более короткая цепь связывалась с протеасомой во много раз слабее.Моноубиквитинирование и цепи K63 чаще служат сигналами эндоцитоза, репарации ДНК и сборки сигнальных комплексов; деубиквитиназы снимают убиквитин.Убиквитин может присоединиться к белку одной молекулой (моноубиквитинирование), несколькими отдельными молекулами или цепью. В цепи каждый следующий убиквитин связан с одним из семи лизинов или с N-концевым метионином предыдущего. Тип связи определяет форму цепи и то, какие белки её узнают.Классический сигнал протеасомного разрушения — цепь, связанная через K48. В экспериментах с однородными модельными субстратами эффективным сигналом была цепь из четырёх убиквитинов: укорочение цепи на две молекулы снижало её сродство к протеасоме примерно в 100 раз. Разветвлённые цепи K11/K48, которые строит лигаза APC/C, ускоряют разрушение ещё сильнее. Четыре убиквитина — не универсальный порог: часть белков клетки разрушается протеасомой и после присоединения отдельных молекул убиквитина, не связанных в цепь (Braten 2016); значение имеют и число меток, и их расположение, и свойства самого субстрата.Цепи K63 и моноубиквитин обычно не направляют белок в протеасому. Они участвуют в эндоцитозе мембранных белков, в репарации ДНК и в сборке сигнальных комплексов, например в пути NF-κB. Поэтому формула «убиквитин — метка смерти» неточна.Убиквитинирование обратимо. Деубиквитиназы отщепляют убиквитин и могут спасти белок от разрушения, а в протеасоме они отщепляют цепь перед расщеплением, и убиквитин используется снова. Итоговая судьба белка зависит от соотношения скоростей присоединения и снятия цепи.Типичная ошибка Любой убиквитин на белке означает, что белок будет разрушен протеасомой.Судьба белка зависит от типа и длины цепи: классический сигнал протеасомы — цепь K48, а моноубиквитинирование и цепи K63 обычно служат другим целям, хотя некоторые белки разрушаются протеасомой и после моноубиквитинирования.Модельный субстрат несёт одну молекулу убиквитина. Лигазу заменили на такую, которая присоединяет к нему цепь из четырёх убиквитинов, связанных через K48. Как изменится связывание субстрата с 26S-протеасомой?А. Ослабнет: длинная цепь мешает связыванию (неверный вариант)Рецепторы 19S связывают именно цепи K48; удлинение цепи до четырёх убиквитинов усиливает, а не ослабляет связывание.Б. Не изменится: важен сам факт убиквитинирования (неверный вариант)Для модельного субстрата важны длина и тип цепи: одиночный убиквитин связывается с протеасомой слабо, а цепь из четырёх убиквитинов K48 — эффективный сигнал.В. Усилится: такая цепь — эффективный сигнал протеасомы (верный вариант)В экспериментах in vitro цепь K48 из четырёх убиквитинов связывалась с протеасомой намного прочнее, чем одиночный убиквитин.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаThrower J.S., Hoffman L., Rechsteiner M., Pickart C.M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. EMBO J. 2000;19:94–102. doi:10.1093/emboj/19.1.94Meyer H.-J., Rape M. Enhanced protein degradation by branched ubiquitin chains. Cell. 2014;157:910–921. doi:10.1016/j.cell.2014.03.037Collins G.A., Goldberg A.L. The logic of the 26S proteasome. Cell. 2017;169:792–806. doi:10.1016/j.cell.2017.04.023Braten O., Livneh I., Ziv T. et al. Numerous proteins with unique characteristics are degraded by the 26S proteasome following monoubiquitination. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113:E4639–E4647. doi:10.1073/pnas.1608644113Схема механизма, качественные состояния. Минимальный сигнал из четырёх убиквитинов и снижение сродства при укорочении цепи — по Thrower 2000 (реферат; in vitro, однородные цепи K48 и модельные субстраты, очищенная протеасома). Разветвлённые цепи K11/K48 — Meyer 2014 (реферат; клетки человека и in vitro, субстраты APC/C). Разрушение после моноубиквитинирования — Braten 2016 (реферат; клетки человека и дрожжей, убиквитин, не образующий цепей). Функции цепей K63 — по обзорам. Подписи «сильное», «слабое» на схеме не являются измерениями.
Дегрон и 26S-протеасома · шаг 10 из 26Как 26S-протеасома узнаёт, разворачивает и расщепляет субстрат26S-протеасома состоит из 20S-частицы с протеолитическими центрами внутри и 19S-частиц, которые связывают цепь убиквитина, отщепляют её и за счёт ATP разворачивают белок.Рецепторы 19S-частицы (Rpn1, Rpn10, Rpn13) связывают цепь K48, а кольцо ATPаз Rpt захватывает неструктурированный участок субстрата.Когда белок уже захвачен, металлопротеаза Rpn11 отщепляет цепь целиком, и убиквитин используется снова.ATPазы разворачивают белок и продвигают его в 20S-частицу, где центры β1, β2 и β5 расщепляют его до коротких пептидов.20S-частица — полый цилиндр из четырёх колец: два внешних α-кольца и два внутренних β-кольца. Протеолитические центры находятся внутри, в β-субъединицах: β1 расщепляет связи после кислых остатков, β2 — после основных, β5 — после гидрофобных. Вход в камеру узкий, и свёрнутый белок пройти в неё не может.19S-частица решает эту задачу. Её рецепторы Rpn1, Rpn10 и Rpn13 связывают цепь убиквитина. Для начала расщепления нужен ещё неструктурированный участок субстрата: его захватывает кольцо из шести ATPаз Rpt. Модельный белок с цепью убиквитина, но без такого участка, разрушается медленно.Цепь убиквитина в камеру не попадает: её целиком отщепляет металлопротеаза Rpn11, причём это происходит, когда белок уже захвачен. Деубиквитиназа UCH37, напротив, связана с Rpn13 и может укорачивать цепь до захвата. ATPазы Rpt за счёт гидролиза ATP разворачивают белок и протягивают его в 20S-частицу.Продукты 26S-протеасомы — пептиды длиной от 3 до 22 остатков; их расщепляют до аминокислот цитоплазматические пептидазы. Ингибиторы бортезомиб и карфилзомиб связываются прежде всего с центрами β5; в клетках при этом накапливаются полиубиквитинированные белки.Типичная ошибка Цепь убиквитина разрушается в протеасоме вместе с белком.Rpn11 отщепляет цепь убиквитина до того, как белок входит в 20S-частицу; убиквитин освобождается и используется снова.К тесно свёрнутому модельному белку присоединили цепь из четырёх убиквитинов K48, но у него нет неструктурированного участка. Как изменится скорость его расщепления 26S-протеасомой по сравнению с таким же белком, к которому добавлен неструктурированный хвост?А. Будет ниже (верный вариант)Цепь убиквитина обеспечивает связывание, но захват и разворачивание начинаются с неструктурированного участка; без него расщепление идёт медленно.Б. Будет выше (неверный вариант)Неструктурированный участок не мешает расщеплению, а нужен для его начала: без него белок разрушается медленнее, а не быстрее.В. Будет такой же (неверный вариант)Одной цепи недостаточно для эффективного расщепления свёрнутого белка: протеасоме нужен ещё участок инициации.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаPrakash S., Tian L., Ratliff K.S., Lehotzky R.E., Matouschek A. An unstructured initiation site is required for efficient proteasome-mediated degradation. Nat Struct Mol Biol. 2004;11:830–837. doi:10.1038/nsmb814Verma R., Aravind L., Oania R. et al. Role of Rpn11 metalloprotease in deubiquitination and degradation by the 26S proteasome. Science. 2002;298:611–615. doi:10.1126/science.1075898Yao T., Cohen R.E. A cryptic protease couples deubiquitination and degradation by the proteasome. Nature. 2002;419:403–407. doi:10.1038/nature01071Qiu X.-B., Ouyang S.-Y., Li C.-J. et al. hRpn13/ADRM1/GP110 is a novel proteasome subunit that binds the deubiquitinating enzyme, UCH37. EMBO J. 2006;25:5742–5753. doi:10.1038/sj.emboj.7601450de la Peña A.H., Goodall E.A., Gates S.N., Lander G.C., Martin A. Substrate-engaged 26S proteasome structures reveal mechanisms for ATP-hydrolysis-driven translocation. Science. 2018;362:eaav0725. doi:10.1126/science.aav0725Kisselev A.F., Akopian T.N., Woo K.M., Goldberg A.L. The sizes of peptides generated from protein by mammalian 26 and 20 S proteasomes. J Biol Chem. 1999;274:3363–3371. doi:10.1074/jbc.274.6.3363Схема механизма, качественные состояния. Роль неструктурированного участка — Prakash 2004 (реферат; модельные белки с цепью убиквитина, очищенная протеасома). Rpn11 — Verma 2002 (дрожжи) и Yao 2002 (реферат); связь UCH37 с Rpn13 — Qiu 2006 (реферат; клетки человека). Работа ATPаз — крио-ЭМ структуры дрожжевой 26S-протеасомы с субстратом (de la Peña 2018, реферат). Длина пептидов — Kisselev 1999 (реферат; протеасомы из мышц кролика, денатурированные белки).
Дегрон и 26S-протеасома · шаг 11 из 26Как сигнал превращается в разрушение регулятораРазрушение белка-ингибитора — быстрый способ включить ответ без синтеза новых белков. Путь NF-κB показывает, как сигнал рецептора создаёт дегрон, и как разные препараты останавливают этот путь на разных звеньях.TNFα активирует IKK; IKK фосфорилирует IκBα по S32 и S36, и SCF(βTrCP) строит на IκBα цепь K48.26S-протеасома расщепляет IκBα, и освобождённый NF-κB перемещается в ядро.Активность куллиновых лигаз, в том числе SCF, требует присоединения NEDD8 к куллину; MLN4924 блокирует этот шаг.В покое NF-κB связан с IκBα и находится в цитоплазме. После связывания TNFα с рецептором активируется киназа IKK. Она фосфорилирует IκBα, лигаза SCF(βTrCP) убиквитинирует его, и 26S-протеасома расщепляет IκBα, ещё связанный с NF-κB. В клетках HeLa IκBα после стимула разрушается за десятки минут; ингибиторы протеаз этот распад предотвращали.Порядок событий проверяют воздействиями на отдельные звенья. Замены S32A/S36A убирают сайты фосфорилирования. Ингибитор протеасомы не мешает фосфорилированию и убиквитинированию, поэтому накапливается полиубиквитинированный IκBα, а NF-κB не освобождается. MLN4924 ингибирует фермент, активирующий NEDD8: без присоединения NEDD8 к куллину лигаза SCF малоактивна, и в клетках накапливается фосфорилированный IκBα без цепи убиквитина.Протеасомная система регулирует сама себя. При ингибировании протеасомы транскрипционный фактор NRF1 повышает экспрессию генов субъединиц протеасомы, и клетки частично восстанавливают протеолитическую активность.В растущих клетках млекопитающих на 26S-протеасому приходится не меньше 80 % внутриклеточного распада белков. Ингибиторы протеасомы — бортезомиб и карфилзомиб — применяют при множественной миеломе: клетки, синтезирующие много иммуноглобулинов, особенно зависят от протеасомы.Типичная ошибка Фосфорилирование IκBα само отделяет его от NF-κB, и протеасома для активации NF-κB не нужна.Фосфорилированный и даже убиквитинированный IκBα остаётся связанным с NF-κB; NF-κB освобождается только после расщепления IκBα протеасомой, и ингибиторы протеасомы эту активацию блокируют.Клетки 60 мин инкубировали с MLN4924, затем добавили TNFα. Какая форма IκBα накопится через 20 мин?А. Полиубиквитинированный IκBα (неверный вариант)Цепь убиквитина на IκBα строит куллиновая лигаза SCF, которая без NEDD8 малоактивна; при MLN4924 цепь почти не образуется.Б. Фосфорилированный IκBα без цепи убиквитина (верный вариант)MLN4924 не действует на IKK: IκBα фосфорилируется, но SCF без NEDD8 почти не убиквитинирует его, и белок не разрушается.В. Никакая: IκBα разрушится, как в контроле (неверный вариант)Разрушение IκBα требует убиквитинирования куллиновой лигазой, а её активность при MLN4924 подавлена.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаHenkel T., Machleidt T., Alkalay I. et al. Rapid proteolysis of IκB-α is necessary for activation of transcription factor NF-κB. Nature. 1993;365:182–185. doi:10.1038/365182a0Chen Z., Hagler J., Palombella V.J. et al. Signal-induced site-specific phosphorylation targets IκBα to the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev. 1995;9:1586–1597. doi:10.1101/gad.9.13.1586Palombella V.J., Rando O.J., Goldberg A.L., Maniatis T. The ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-κB1 precursor protein and the activation of NF-κB. Cell. 1994;78:773–785. doi:10.1016/s0092-8674(94)90482-0Milhollen M.A., Traore T., Adams-Duffy J. et al. MLN4924, a NEDD8-activating enzyme inhibitor, is active in diffuse large B-cell lymphoma models: rationale for treatment of NF-κB-dependent lymphoma. Blood. 2010;116:1515–1523. doi:10.1182/blood-2010-03-272567Soucy T.A., Smith P.G., Milhollen M.A. et al. An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer. Nature. 2009;458:732–736. doi:10.1038/nature07884Radhakrishnan S.K., Lee C.S., Young P. et al. Transcription factor Nrf1 mediates the proteasome recovery pathway after proteasome inhibition in mammalian cells. Mol Cell. 2010;38:17–28. doi:10.1016/j.molcel.2010.02.029Collins G.A., Goldberg A.L. The logic of the 26S proteasome. Cell. 2017;169:792–806. doi:10.1016/j.cell.2017.04.023Схема механизма, качественные состояния. Порядок событий — Henkel 1993 (реферат; клетки HeLa и другие линии, разные стимулы), Chen 1995 и Palombella 1994 (рефераты; клеточные линии человека, ингибиторы протеасомы). Накопление фосфорилированного IκBα при MLN4924 — Milhollen 2010 (реферат; клетки B-клеточной лимфомы); механизм MLN4924 — Soucy 2009 (реферат). Восстановление протеасом через NRF1 — Radhakrishnan 2010 (реферат; клетки млекопитающих). Доля протеасомного распада — обзор Collins 2017.
Дегрон и 26S-протеасома · шаг 12 из 26Как измерить скорость распада белкаКоличество белка на блоте не говорит, быстро ли он разрушается. Скорость распада измеряют, остановив синтез циклогексимидом и проследив, как убывает белок; путь распада определяют ингибиторами.Циклогексимид останавливает трансляцию, после чего содержание белка меняется только за счёт его распада.Пробы, взятые через равные промежутки, анализируют иммуноблотом и строят кривую убывания; по ней находят период полужизни.Ингибитор протеасомы или лизосом и замена остатков дегрона показывают, каким путём и по какому сигналу белок разрушается.Стационарное содержание белка определяется соотношением скоростей синтеза и распада, поэтому одна полоса на блоте не различает «много синтезируется» и «медленно разрушается». Чтобы измерить распад, синтез останавливают. Циклогексимид ингибирует элонгацию трансляции на рибосоме, и новые молекулы перестают появляться.После добавления циклогексимида клетки собирают через равные промежутки, например через 0, 15, 30 и 60 мин, и измеряют содержание белка иммуноблотом. Интенсивности полос, нормированные на контроль нанесения, откладывают на графике; время, за которое остаётся половина исходного количества, называют периодом полужизни.Путь распада определяют ингибиторами. Если бортезомиб замедляет убывание белка, белок разрушается протеасомой; если действует бафиломицин, нарушающий работу лизосом, — участвует лизосомный путь. Замена остатков предполагаемого дегрона, которая стабилизирует белок, указывает на его сигнал узнавания.У метода есть ограничения. Циклогексимид останавливает синтез и короткоживущих регуляторов самой системы деградации и вызывает стресс, поэтому прослеживание ограничивают несколькими часами. Ингибиторы при больших дозах действуют и на другие мишени. Измеренный период полужизни относится к данным клеткам и условиям.Типичная ошибка Если белка на блоте много, значит он медленно разрушается.Содержание белка зависит и от синтеза, и от распада; скорость распада измеряют отдельно, остановив синтез и проследив убывание белка во времени.Клетки обработали циклогексимидом и через 0, 30 и 60 мин измерили белок X. Через 30 мин осталась половина исходного количества. В параллельных чашках с бортезомибом через 60 мин белка X почти столько же, сколько в начале. Какой вывод следует?А. X стабилен, его синтез идёт быстро (неверный вариант)Синтез остановлен циклогексимидом, поэтому сохранение белка не может объясняться синтезом; в контроле X убывает с периодом полужизни 30 мин.Б. X разрушается в основном протеасомой (верный вариант)При остановленном синтезе X убывает с периодом полужизни 30 мин, а ингибитор протеасомы почти останавливает это убывание.В. X разрушается в основном в лизосомах (неверный вариант)Бортезомиб ингибирует протеасому, а не лизосомы; чтобы проверить лизосомный путь, нужен ингибитор лизосом.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаHenkel T., Machleidt T., Alkalay I. et al. Rapid proteolysis of IκB-α is necessary for activation of transcription factor NF-κB. Nature. 1993;365:182–185. doi:10.1038/365182a0Chen Z., Hagler J., Palombella V.J. et al. Signal-induced site-specific phosphorylation targets IκBα to the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev. 1995;9:1586–1597. doi:10.1101/gad.9.13.1586Radhakrishnan S.K., Lee C.S., Young P. et al. Transcription factor Nrf1 mediates the proteasome recovery pathway after proteasome inhibition in mammalian cells. Mol Cell. 2010;38:17–28. doi:10.1016/j.molcel.2010.02.029Схема метода, условные пиктограммы и кривые — не данные конкретного эксперимента. Пример с IκBα — по Henkel 1993 и Chen 1995 (рефераты; клетки HeLa, TNFα, циклогексимид). Ограничения метода — общие для прослеживания с циклогексимидом; восстановление протеасом при их ингибировании — Radhakrishnan 2010 (реферат).
N-гликаны и ERAD · шаг 13 из 26Как N-гликан становится меткой состояния белка в ЭПРПочти каждый белок, поступающий в секреторный путь, получает в ЭПР крупный N-гликан. Его состав меняется по мере сворачивания белка, поэтому гликан служит меткой, по которой ферменты и лектины ЭПР определяют состояние белка.Гликан-предшественник Glc₃Man₉GlcNAc₂ собирается на мембране ЭПР на липидном носителе — долихолпирофосфате (Dol-PP).Олигосахарилтрансфераза переносит его целиком на остаток Asn растущей цепи, если этот Asn входит в секвон Asn–X–Ser/Thr (X — не пролин).Глюкозидазы I и II сразу начинают отщеплять глюкозы, и каждая форма гликана узнаётся своими ферментами и лектинами.Сборка гликана начинается на цитоплазматической стороне мембраны ЭПР. Здесь к долихолфосфату (Dol-P) присоединяется GlcNAc-фосфат, и на образовавшемся долихолпирофосфате (Dol-PP) собирается Man₅GlcNAc₂. Затем он переносится на люминальную сторону, где присоединяются ещё четыре маннозы и три глюкозы; их доноры — Dol-P-Man и Dol-P-Glc. В сборке участвуют более тридцати белков. Готовый предшественник Glc₃Man₉GlcNAc₂ олигосахарилтрансфераза (OST) переносит с Dol-PP на белок одним блоком.Гликан присоединяется только к Asn секвона Asn–X–Ser/Thr; встречается и Asn–X–Cys, а X — любая аминокислота, кроме пролина. У человека два комплекса OST. OST-A с каталитической субъединицей STT3A связан с транслоконом Sec61 и гликозилирует цепь по мере её поступления в ЭПР. OST-B со STT3B гликозилирует посттрансляционно сайты, пропущенные OST-A; для этого сайт должен остаться доступным и не оказаться внутри свёрнутой структуры.Сразу после переноса глюкозидаза I отщепляет крайнюю глюкозу, глюкозидаза II — вторую. Гликан с одной глюкозой связывают лектины-шапероны калнексин и кальретикулин, и с этого момента состав гликана сообщает, на каком этапе находится белок.Схема показывает один гликан, хотя у многих белков их несколько. Сам гликан не меняет судьбу белка: значение метки определяют ферменты, которые её изменяют, и лектины, которые её узнают.Типичная ошибка N-гликан нужен белку прежде всего для растворимости и прикрепляется к любому остатку аспарагина.Гликан переносится только на Asn секвона Asn–X–Ser/Thr (X — не пролин), а в ЭПР он служит меткой сворачивания: отщепление и возвращение глюкозы и отщепление маннозы определяют связывание с лектинами-шаперонами и с лектинами ERAD.В белке, поступающем в ЭПР, последовательность Asn–Ala–Thr заменили на Asn–Pro–Thr. Будет ли OST переносить гликан на этот остаток Asn?А. Нет: в секвоне на месте X не может стоять пролин (верный вариант)Секвон имеет вид Asn–X–Ser/Thr, где X — любая аминокислота, кроме пролина. При Asn–Pro–Thr OST этот Asn не гликозилирует.Б. Да: для переноса достаточно Asn и Thr рядом (неверный вариант)Кроме Asn и Ser/Thr важен и средний остаток: пролин в положении X не допускает гликозилирования.В. Да, но только посттрансляционно, комплексом OST-B (неверный вариант)OST-B гликозилирует посттрансляционно доступные секвоны, пропущенные OST-A. Asn–Pro–Thr секвоном не является ни для OST-A, ни для OST-B.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаGuay K.P., Chou W.-C., Canniff N.P., Paul K.B., Hebert D.N. N-glycan-dependent protein maturation and quality control in the ER. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:926–939Ruiz-Canada C., Kelleher D.J., Gilmore R. Cotranslational and posttranslational N-glycosylation of polypeptides by distinct mammalian OST isoforms. Cell. 2009;136:272–283Hebert D.N., Foellmer B., Helenius A. Glucose trimming and reglucosylation determine glycoprotein association with calnexin in the endoplasmic reticulum. Cell. 1995;81:425–433Ramírez A.S., de Capitani M., Pesciullesi G. et al. Molecular basis for glycan recognition and reaction priming of eukaryotic oligosaccharyltransferase. Nat Commun. 2022;13:7296Схема механизма; клетки млекопитающих. Сборка гликана, секвон и работа OST-A и OST-B описаны по обзору Guay 2025 (полный текст) и работе Ruiz-Canada 2009 (клетки млекопитающих; прочитана аннотация). Донор OST — олигосахарид на Dol-PP (Ramírez 2022, структура OST дрожжей; реферат). Символы гликана — номенклатура SNFG; на схеме показан один гликан из нескольких.
N-гликаны и ERAD · шаг 14 из 26Как глюкоза возвращает несвёрнутый белок к калнексинуКалнексин и кальретикулин узнают не форму белка, а гликан с одной глюкозой. Возвращать глюкозу или нет, определяет UGGT1 — фермент, который различает свёрнутый и несвёрнутый белок.Калнексин и кальретикулин связывают гликан Glc₁Man₉GlcNAc₂; с ними работает оксидоредуктаза ERp57.Глюкозидаза II снимает последнюю глюкозу, и белок отходит от лектина.UGGT1 возвращает одну глюкозу только несвёрнутому белку, и он снова входит в цикл калнексина; свёрнутый белок выходит из ЭПР.Калнексин — мембранный белок ЭПР, кальретикулин — его растворимый гомолог в просвете ЭПР. Оба связывают гликан с одной глюкозой. В экспериментах с микросомами и гемагглютинином вируса гриппа связывание с калнексином было специфичным именно для моноглюкозилированного гликана, а освобождение свёрнутого белка требовало снятия последней глюкозы глюкозидазой II (Hebert 1995).Пока белок связан с лектином, он не агрегирует и находится рядом с ERp57, которая участвует в образовании и перестройке дисульфидных связей. После отщепления глюкозы белок свободен. Если он свернулся, гликан остаётся без глюкозы, и белок покидает ЭПР.Если белок не свёрнут, его узнаёт UGGT1. Этот фермент присоединяет глюкозу к гликанам Man₇₋₉GlcNAc₂ только у белков с открытыми гидрофобными участками, а в экспериментах in vitro лучше всего модифицировал частично свёрнутые формы (Sousa 1995; Caramelo 2003). Так образуется цикл: глюкоза снимается и возвращается, пока белок не свернётся или пока его гликан не изменится иначе — за счёт отщепления маннозы (следующий шаг).Ингибиторы глюкозидаз, например кастаноспермин, не дают образоваться гликану с одной глюкозой, и белок минует цикл калнексина. У человека есть и UGGT2; её роль изучена меньше.Типичная ошибка Калнексин, как и Hsp70, узнаёт гидрофобные участки несвёрнутого белка.Калнексин и кальретикулин — лектины: они узнают гликан с одной глюкозой. Свёрнутость белка «проверяет» UGGT1, которая возвращает глюкозу только несвёрнутому белку.Несвёрнутый гликопротеин отошёл от калнексина после того, как глюкозидаза II сняла последнюю глюкозу. Что произойдёт с его гликаном, если UGGT1 работает?А. UGGT1 вернёт три глюкозы, как у предшественника (неверный вариант)UGGT1 присоединяет к гликану одну глюкозу, а не восстанавливает исходные три. Гликан с одной глюкозой и узнают калнексин и кальретикулин.Б. UGGT1 вернёт одну глюкозу, и белок снова свяжется с калнексином (верный вариант)UGGT1 модифицирует только несвёрнутый белок. Одна глюкоза восстанавливает форму Glc₁Man₉GlcNAc₂, и белок снова входит в цикл калнексина.В. Гликан останется без глюкозы, и белок выйдет в аппарат Гольджи (неверный вариант)Так происходит со свёрнутым белком: UGGT1 его не узнаёт. Несвёрнутый белок с открытыми гидрофобными участками UGGT1 узнаёт.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаHebert D.N., Foellmer B., Helenius A. Glucose trimming and reglucosylation determine glycoprotein association with calnexin in the endoplasmic reticulum. Cell. 1995;81:425–433Sousa M., Parodi A.J. The molecular basis for the recognition of misfolded glycoproteins by the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase. EMBO J. 1995;14:4196–4203Caramelo J.J., Castro O.A., Alonso L.G., De Prat-Gay G., Parodi A.J. UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase recognizes structured and solvent accessible hydrophobic patches in molten globule-like folding intermediates. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:86–91Guay K.P., Chou W.-C., Canniff N.P., Paul K.B., Hebert D.N. N-glycan-dependent protein maturation and quality control in the ER. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:926–939Схема механизма, качественные состояния. Специфичность калнексина к моноглюкозилированному гликану — Hebert 1995 (микросомы поджелудочной железы собаки, гемагглютинин; прочитана аннотация). Узнавание несвёрнутого белка UGGT — Sousa 1995 и Caramelo 2003 (очищенный фермент и модельные белки in vitro; прочитаны аннотации). UGGT1 и UGGT2 у человека — обзор Guay 2025.
N-гликаны и ERAD · шаг 15 из 26Как отщепление маннозы направляет белок на деградациюПока глюкоза возвращается и снимается, медленно идёт и другой процесс — отщепление маннозы. Белок, который долго не сворачивается, теряет маннозы, и его гликан становится сигналом для лектинов ERAD.EDEM2 в комплексе с TXNDC11 отщепляет маннозу ветви B: образуется Man₈B.EDEM3 и EDEM1 отщепляют маннозу ветви C, и на гликане открывается α1,6-связанная манноза.Такой гликан узнают лектины OS-9 и XTP3-B в просвете ЭПР и передают белок мембранному комплексу SEL1L–HRD1, через который начнётся перенос цепи в цитозоль; кифунензин подавляет отщепление маннозы.Отщепление глюкозы и её возвращение идут быстро, а отщепление маннозы — медленно. Поэтому в ЭПР одновременно работают два «часовых механизма»: быстрый цикл глюкозы даёт белку новые попытки свернуться, а медленное отщепление маннозы ограничивает время, которое белок может провести в ЭПР.По современной модели первую маннозу — на ветви B — отщепляет EDEM2, связанная дисульфидной связью с оксидоредуктазой TXNDC11 (Ninagawa 2014, клетки HCT116 и DT40; Guay 2025). Затем EDEM3 и EDEM1 удаляют маннозу ветви C и открывают α1,6-связанную маннозу. Активность EDEM1 и EDEM2 выше у несвёрнутых белков, поэтому отщепление маннозы касается прежде всего белков, которые долго не сворачиваются.Гликан с открытой α1,6-маннозой узнаёт домен MRH лектина OS-9 (Hosokawa 2009, клетки человека, субстрат NHK). OS-9 и XTP3-B через SEL1L передают субстрат мембранному комплексу с убиквитинлигазой HRD1 (Christianson 2008); с этого комплекса начинается перенос цепи в цитозоль (следующий шаг). У дрожжей такой сигнал создаёт маннозидаза Htm1, а распознаёт лектин Yos9 (Quan 2008).Кифунензин подавляет α1,2-маннозидазы класса I. В клетках гепатомы он останавливал распад несвёрнутого α1-антитрипсина (Liu 1999). Это показывает, что для ERAD этого гликопротеина отщепление маннозы необходимо, хотя и не доказывает, какой именно фермент его выполняет.Типичная ошибка Белок отправляется на ERAD сразу, как только калнексин обнаружил, что он не свёрнут.Несвёрнутый белок сначала проходит цикл калнексина. Сигналом к ERAD становится медленное отщепление маннозы: Man₇ с открытой α1,6-маннозой узнаёт OS-9, и только тогда белок передаётся SEL1L–HRD1.Клетки, в которых синтезируется несвёрнутый NHK, обработали кифунензином. Как изменится скорость распада NHK?А. Возрастёт: несвёрнутый белок быстрее покинет цикл калнексина (неверный вариант)Выход из цикла калнексина на ERAD зависит от отщепления маннозы, а кифунензин его подавляет. Ускориться распад не может.Б. Не изменится: NHK узнаётся по гидрофобным участкам, а не по гликану (неверный вариант)Для ERAD гликопротеина NHK нужен гликан с отщеплёнными маннозами: без него распад тормозится (Liu 1999).В. Снизится: гликан Man₇ с открытой α1,6-маннозой почти не образуется (верный вариант)Кифунензин подавляет α1,2-маннозидазы. Без отщепления маннозы не возникает сигнал для OS-9, белок остаётся в цикле калнексина, и распад замедляется.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаNinagawa S., Okada T., Sumitomo Y. et al. EDEM2 initiates mammalian glycoprotein ERAD by catalyzing the first mannose trimming step. J Cell Biol. 2014;206:347–356Guay K.P., Chou W.-C., Canniff N.P., Paul K.B., Hebert D.N. N-glycan-dependent protein maturation and quality control in the ER. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:926–939Hosokawa N., Kamiya Y., Kamiya D., Kato K., Nagata K. Human OS-9, a lectin required for glycoprotein endoplasmic reticulum-associated degradation, recognizes mannose-trimmed N-glycans. J Biol Chem. 2009;284:17061–17068Christianson J.C., Shaler T.A., Tyler R.E., Kopito R.R. OS-9 and GRP94 deliver mutant α1-antitrypsin to the Hrd1–SEL1L ubiquitin ligase complex for ERAD. Nat Cell Biol. 2008;10:272–282Quan E.M., Kamiya Y., Kamiya D. et al. Defining the glycan destruction signal for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol Cell. 2008;32:870–877Liu Y., Choudhury P., Cabral C.M., Sifers R.N. Oligosaccharide modification in the early secretory pathway directs the selection of a misfolded glycoprotein for degradation by the proteasome. J Biol Chem. 1999;274:5861–5867Схема механизма; символы SNFG. Первый шаг EDEM2 — Ninagawa 2014 (нокауты в клетках HCT116 человека и DT40 курицы; прочитана аннотация); последовательность EDEM2 → EDEM3/EDEM1 и узнавание OS-9 и XTP3-B — обзор Guay 2025 (полный текст). Узнавание открытой α1,6-маннозы OS-9 — Hosokawa 2009, передача субстрата Hrd1–SEL1L — Christianson 2008 (клетки человека, субстрат NHK; аннотации). Кифунензин — Liu 1999 (клетки гепатомы; аннотация). Число отщепляемых маннозных остатков у разных субстратов различается; схема упрощена.
N-гликаны и ERAD · шаг 16 из 26Как дефектный белок покидает ЭПР и разрушается в цитозолеПротеасома находится в цитозоле, а дефектный гликопротеин — в просвете ЭПР. ERAD сначала проводит через мембрану первый участок его цепи, затем убиквитинирует белок, извлекает его из мембраны и передаёт протеасоме.Лектины OS-9 и XTP3-B в просвете ЭПР через SEL1L передают субстрат мембранному комплексу SEL1L–HRD1, в который, вероятно, входят и белки семейства Derlin.Развёрнутая петля субстрата входит в этот комплекс со стороны просвета, а аутоубиквитинирование HRD1 открывает путь: первый участок цепи оказывается в цитозоле ещё до работы p97, так как в реконструкции из очищенных белков дрожжей этот этап не требует Cdc48.Когда участок цепи выходит в цитозоль, HRD1 вместе с ферментами E2 строит на нём цепь убиквитина; ATPаза p97 с UFD1–NPL4 связывает цепь и за счёт гидролиза ATP извлекает остальной белок из мембраны.NGLY1 снимает с белка гликан, и его разрушает 26S-протеасома — та же, что разрушает белки цитозоля.Перенос белка из просвета ЭПР в цитозоль называют ретротранслокацией. Для растворимых субстратов с повреждением в просвете ЭПР главный путь проходит через мембранный комплекс с убиквитинлигазой HRD1, и в нём участвуют три группы белков. Лектины OS-9 и XTP3-B в просвете ЭПР узнают гликан и через SEL1L передают субстрат комплексу, но сами через мембрану не проходят. Мембранная часть комплекса, где находится HRD1, создаёт путь, по которому цепь субстрата пересекает липидный бислой. Извлекает белок на цитозольной стороне p97 с кофакторами.Как первый участок цепи оказывается по другую сторону мембраны, лучше всего изучено у дрожжей. Крио-ЭМ-структуры показали, что Hrd1 и рамбоидоподобный белок Der1 образуют два соседних «полуканала»: полость Der1 открыта в просвет ЭПР, полость Hrd1 — в цитозоль, а боковые затворы обоих белков обращены друг к другу в истончённом участке мембраны (Wu 2020; ранее была получена структура Hrd1 с Hrd3 — Schoebel 2017). По этой модели развёрнутая петля субстрата входит в комплекс со стороны просвета, проходит между затворами и достигает цитозольной полости Hrd1.Что открывает этот путь, показали опыты с очищенными белками. В реконструированной системе из белков дрожжей перенос люминального домена мембранного субстрата запускает аутоубиквитинирование Hrd1; убиквитинирование самого субстрата происходит позже, а ATPаза Cdc48 для этого этапа не нужна (Baldridge, Rapoport 2016). Очищенный Hrd1 в модельных мембранах после аутоубиквитинирования открывает пору, а связывание субстрата её расширяет (Vasic 2020). Авторы предполагают, что начальное движение цепи обеспечивает разница сродства: сайт связывания в просвете слабый, а цитоплазматический сайт, возникающий после аутоубиквитинирования, прочный. Это гипотеза, а не установленный механизм для клеток человека.Как только участок цепи оказывается в цитозоле, HRD1 с ферментами E2 присоединяет к нему убиквитин. Только после этого включается p97 (VCP; у дрожжей Cdc48): с кофакторами UFD1 и NPL4 он связывает убиквитиновую цепь и за счёт гидролиза ATP протягивает белок через свою центральную пору, разворачивая его (Bodnar 2017, реконструкция с дрожжевыми белками). Поэтому p97 не нужен, чтобы белок начал пересекать мембрану: к началу его работы часть цепи уже находится в цитозоле, и p97 завершает извлечение остальной части. Эту последовательность — вход петли, убиквитинирование, действие p97, снятие гликана, протеасома — следует понимать как грубую схему: реакции не обязательно разделены во времени и могут частично перекрываться.В цитозоле NGLY1 отщепляет гликан, и 26S-протеасома разрушает белок. Если звено нарушено, белок накапливается в разной форме. При сниженном содержании HRD1 перенос цепи через мембрану не начинается: белок задерживается в ЭПР с гликаном и почти без убиквитина. При блоке p97 цитозольный участок уже убиквитинирован, но белок остаётся связанным с мембраной и несёт гликан. При блоке протеасомы белок оказывается в цитозоле без гликана. Эти различия позволяют предположить, какое звено нарушено, но для конкретного субстрата и клеточной модели вывод проверяют отдельно. Ингибиторы при этом действуют не только на ERAD: CB-5083 и бортезомиб вызывают накопление многих убиквитинированных белков и стресс ЭПР.Границы вывода. Структуры и реконструкции, на которых построена эта модель, получены для белков дрожжей. У млекопитающих участие DERL1–3 и HERP в мембранном канале предполагают по сходству с дрожжевыми белками (Christianson 2023), а функции SEL1L–HRD1 в значительной мере зависят от субстрата (Wang 2025). Поэтому нельзя считать, что один и тот же канал обслуживает любые субстраты: пути ERAD-L, ERAD-M и ERAD-C частично различаются набором убиквитинлигазных комплексов (Carvalho 2006, дрожжи).Типичная ошибка Дефектный белок разрушается прямо в просвете ЭПР, где он и обнаружен.В ЭПР нет протеасом. Первый участок цепи проходит через мембранный комплекс с HRD1 ещё до работы p97; после убиквитинирования p97 извлекает остальной белок, и в цитозоле его разрушает 26S-протеасома.В клетках с NHK снизили содержание HRD1. В какой форме NHK будет накапливаться?А. В цитозоле без гликана, в убиквитинированной форме (неверный вариант)Так выглядит блок протеасомы: белок уже прошёл мембрану и потерял гликан. Без HRD1 белок через мембрану не проходит.Б. В просвете ЭПР с гликаном и почти без убиквитина (верный вариант)HRD1 нужен и для ретротранслокации, и для убиквитинирования. Без него NHK узнаётся OS-9, но остаётся в ЭПР с высокоманнозным гликаном и почти не убиквитинируется.В. В среде: NHK будет секретирован вместо распада (неверный вариант)Нарушение ERAD не делает несвёрнутый белок свёрнутым. NHK по-прежнему не проходит контроль качества и в аппарат Гольджи не выходит.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаChristianson J.C., Jarosch E., Sommer T. Mechanisms of substrate processing during ER-associated protein degradation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:777–796Schoebel S., Mi W., Stein A. et al. Cryo-EM structure of the protein-conducting ERAD channel Hrd1 in complex with Hrd3. Nature. 2017;548:352–355Wu X., Siggel M., Ovchinnikov S. et al. Structural basis of ER-associated protein degradation mediated by the Hrd1 ubiquitin ligase complex. Science. 2020;368:eaaz2449Baldridge R.D., Rapoport T.A. Autoubiquitination of the Hrd1 ligase triggers protein retrotranslocation in ERAD. Cell. 2016;166:394–407Vasic V., Denkert N., Schmidt C.C. et al. Hrd1 forms the retrotranslocation pore regulated by auto-ubiquitination and binding of misfolded proteins. Nat Cell Biol. 2020;22:274–281Bodnar N.O., Rapoport T.A. Molecular mechanism of substrate processing by the Cdc48 ATPase complex. Cell. 2017;169:722–735Christianson J.C., Shaler T.A., Tyler R.E., Kopito R.R. OS-9 and GRP94 deliver mutant α1-antitrypsin to the Hrd1–SEL1L ubiquitin ligase complex for ERAD. Nat Cell Biol. 2008;10:272–282Anderson D.J., Le Moigne R., Djakovic S. et al. Targeting the AAA ATPase p97 as an approach to treat cancer through disruption of protein homeostasis. Cancer Cell. 2015;28:653–665Carvalho P., Goder V., Rapoport T.A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 2006;126:361–373Wang H.H., Biunno I., Sun S., Qi L. SEL1L–HRD1-mediated ERAD in mammals. Nat Cell Biol. 2025;27:1063–1073Схема механизма, качественные состояния; клетки млекопитающих. Структуры и реконструкции — белки дрожжей: Hrd1 с Hrd3 (Schoebel 2017; аннотация), комплекс Hrd1–Der1 с двумя «полуканалами» (Wu 2020; аннотация), запуск ретротранслокации аутоубиквитинированием Hrd1 в системе из очищенных белков (Baldridge 2016; аннотация), пора Hrd1 в модельных мембранах (Vasic 2020; аннотация). Состав канала у млекопитающих и порядок событий — обзоры Christianson 2023 (полный текст) и Wang 2025 (аннотация). Работа p97 — реконструкция с дрожжевыми белками (Bodnar 2017; аннотация). Роль HRD1–SEL1L в распаде NHK — клетки человека (Christianson 2008); CB-5083 — опухолевые клетки (Anderson 2015). Пути ERAD-L/-M/-C определены у дрожжей (Carvalho 2006). «Участок NHK в цитозоле» на схеме — промежуточное состояние: остальная часть цепи ещё в ЭПР. Интерпретации блоков условны для конкретного субстрата и клеточной модели.
N-гликаны и ERAD · шаг 17 из 26Что происходит при нарушениях контроля качества в ЭПРКонтроль качества ЭПР защищает клетку от несвёрнутых белков, но тот же механизм может лишить её белка, который частично работал бы. В разных случаях нарушается разное звено.Мутация в гене секреторного белка может нарушить его сворачивание: он задерживается в ЭПР и разрушается по пути ERAD, как NHK.Белок со сниженной способностью сворачиваться (ΔF508-CFTR) тоже разрушается; корректоры, связывая его, повышают долю свёрнутого белка.Нарушение самого ERAD (дефицит NGLY1) или его использование вирусом (US11 цитомегаловируса) меняет судьбу белков, проходящих этот путь.NHK — укороченный вариант α1-антитрипсина, который не может свернуться. В клетках гепатомы мыши он задерживался в ЭПР и не секретировался (Sifers 1988), а затем разрушался протеасомой (Liu 1999). У носителя такого аллеля α1-антитрипсина в сыворотке не обнаружено. Этот пример показывает, что контроль качества задерживает белок, который не может свернуться, ещё до секреции.Белок CFTR при мутации ΔF508 сворачивается плохо. Его незрелая форма разрушается по убиквитин-протеасомному пути, а при ингибировании протеасом накапливается в полиубиквитинированной форме (Ward 1995). Однако ингибирование ERAD не выводит на мембрану работающий канал: белок остаётся несвёрнутым. Корректоры люмакафтор и тезакафтор связываются с трансмембранным доменом TMD1 и стабилизируют его (Fiedorczuk 2022), поэтому до мембраны доходит больше свёрнутого белка.При мутациях NGLY1 у больных отмечали задержку развития, нарушения движений, гипотонию и сниженное слёзоотделение (Enns 2014). Механизм этих проявлений обсуждается.Белок US11 цитомегаловируса человека направляет тяжёлые цепи MHC I из ЭПР в цитозоль, где их гликан снимается и они разрушаются протеасомой (Wiertz 1996). В результате меньше молекул MHC I достигает поверхности клетки.Типичная ошибка При нарушении сворачивания белка в ЭПР достаточно ингибировать ERAD, и белок дойдёт до мембраны работоспособным.Ингибирование ERAD сохраняет несвёрнутый белок в ЭПР, но не сворачивает его. Количество функционального CFTR на мембране повышают корректоры, которые стабилизируют его структуру.В культуре клеток с ΔF508-CFTR надо увеличить количество свёрнутого CFTR на плазматической мембране. Какое воздействие действует именно в этом направлении?А. Корректор, стабилизирующий структуру CFTR (верный вариант)Корректоры связываются с CFTR и повышают долю свёрнутого белка, который проходит контроль качества и доходит до мембраны (Fiedorczuk 2022).Б. Ингибитор протеасомы, останавливающий распад CFTR (неверный вариант)Ингибитор протеасомы сохраняет незрелую форму, но она остаётся несвёрнутой и накапливается в полиубиквитинированном виде, а не на мембране (Ward 1995).В. Ингибитор p97, задерживающий CFTR в мембране ЭПР (неверный вариант)Задержка извлечения не исправляет сворачивание. Несвёрнутый CFTR не проходит контроль качества и не выходит из ЭПР.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаSifers R.N., Brashears-Macatee S., Kidd V.J., Muensch H., Woo S.L. A frameshift mutation results in a truncated α1-antitrypsin that is retained within the rough endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 1988;263:7330–7335Liu Y., Choudhury P., Cabral C.M., Sifers R.N. Oligosaccharide modification in the early secretory pathway directs the selection of a misfolded glycoprotein for degradation by the proteasome. J Biol Chem. 1999;274:5861–5867Ward C.L., Omura S., Kopito R.R. Degradation of CFTR by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 1995;83:121–127Fiedorczuk K., Chen J. Mechanism of CFTR correction by type I folding correctors. Cell. 2022;185:158–168Enns G.M., Shashi V., Bainbridge M. et al. Mutations in NGLY1 cause an inherited disorder of the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Genet Med. 2014;16:751–758. Исправление: Genet Med. 2014;16:568, doi:10.1038/gim.2014.61 (добавлен автор)Wiertz E.J., Jones T.R., Sun L. et al. The human cytomegalovirus US11 gene product dislocates MHC class I heavy chains from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Cell. 1996;84:769–779Описания случаев по первичным работам (аннотации): NHK — клетки гепатомы мыши (Sifers 1988; Liu 1999); ΔF508-CFTR — культуры клеток (Ward 1995); механизм корректоров — криоэлектронная микроскопия очищенного CFTR (Fiedorczuk 2022); дефицит NGLY1 — описание 8 больных (Enns 2014); US11 — трансфицированные клетки человека (Wiertz 1996). Это примеры механизмов, а не рекомендации по лечению.
N-гликаны и ERAD · шаг 18 из 26Как проследить судьбу гликопротеина: импульсная метка и Endo HЧтобы отличить задержку белка в ЭПР от его секреции или распада, прослеживают судьбу одной когорты меченых молекул и проверяют, какой у них гликан.Короткий импульс с ³⁵S-метионином и ³⁵S-цистеином метит только молекулы, синтезированные за эти минуты; затем метку «гасят» немечеными аминокислотами.Через разное время белок осаждают антителами из клеток и среды и разделяют электрофорезом.Endo H отщепляет высокоманнозные и часть гибридных гликанов, но не комплексные: устойчивость к ней показывает, что белок прошёл medial-Гольджи; PNGase F снимает почти все N-гликаны.При импульсной метке клетки несколько минут инкубируют с радиоактивными аминокислотами, затем переносят в среду с избытком немеченых. Поэтому на геле видна только когорта, синтезированная во время импульса, и её можно прослеживать часами. Убывание полосы в клетках с одновременным появлением её в среде означает секрецию, а убывание без появления в среде — разрушение.Чтобы узнать, где находится белок, половину каждой пробы обрабатывают Endo H. Этот фермент отщепляет высокоманнозные гликаны, характерные для ЭПР и cis-Гольджи, и часть гибридных, но не комплексные, которые образуются в medial-Гольджи. Сдвиг полосы вниз после Endo H показывает, что белок ещё не прошёл medial-Гольджи. Если полоса не сдвигается после Endo H, но сдвигается после PNGase F, гликан комплексный.Ингибиторы отдельных звеньев уточняют путь. Кифунензин замедляет распад гликопротеинов, если для него нужно отщепление маннозы. Ингибитор протеасомы показывает, что белок разрушается в цитозоле, а появление формы без гликана говорит, что он уже выведен из ЭПР.Ограничения: метод показывает поведение всей когорты, Endo H не различает ЭПР и cis-Гольджи, а сами ингибиторы меняют клетку — например, кифунензин подавляет и маннозидазу I аппарата Гольджи, и тогда секретированный белок остаётся чувствительным к Endo H (Elbein 1990).Типичная ошибка Если белок чувствителен к Endo H, значит, он находится в ЭПР, а если устойчив — значит, он уже на поверхности клетки.Чувствительность к Endo H показывает только, что гликан высокоманнозный или гибридный, то есть ещё не комплексный: белок может быть и в ЭПР, и в cis-Гольджи. Устойчивость означает прохождение medial-Гольджи, а не обязательно выход на поверхность.Через 2 ч прослеживания полоса меченого гликопротеина из клеток не сдвигается после обработки Endo H, но сдвигается после обработки PNGase F. Что можно заключить?А. Белок находится в ЭПР: гликан высокоманнозный (неверный вариант)Высокоманнозный гликан Endo H отщепила бы, и полоса сдвинулась бы. Устойчивость к Endo H говорит о другом.Б. Белок потерял гликан в цитозоле после ERAD (неверный вариант)Белок без гликана не сдвигался бы и после PNGase F. Сдвиг после PNGase F показывает, что гликан на белке есть.В. Белок прошёл medial-Гольджи: гликан стал комплексным (верный вариант)Комплексный гликан Endo H не отщепляет, а PNGase F снимает. Значит, белок прошёл medial-Гольджи; где он сейчас — в Гольджи или дальше, — этот тест не показывает.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLiu Y., Choudhury P., Cabral C.M., Sifers R.N. Oligosaccharide modification in the early secretory pathway directs the selection of a misfolded glycoprotein for degradation by the proteasome. J Biol Chem. 1999;274:5861–5867Elbein A. D., Tropea J. E., Mitchell M., Kaushal G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 1990;265:15599–15605Guay K.P., Chou W.-C., Canniff N.P., Paul K.B., Hebert D.N. N-glycan-dependent protein maturation and quality control in the ER. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:926–939Схемы методов, условные пиктограммы, а не данные эксперимента. Принцип Endo H и PNGase F — общепринятый биохимический метод. Применение к NHK — Liu 1999 (клетки гепатомы; аннотация). Действие кифунензина на маннозидазу I аппарата Гольджи — Elbein 1990 (клетки MDCK и микросомы печени крысы; аннотация).
Аутофагический поток · шаг 19 из 26Что называют аутофагическим потокомПри макроаутофагии участок цитоплазмы заключается в мембрану аутофагосомы, доставляется в лизосому и там расщепляется. Аутофагический поток — скорость всего этого пути, а не число структур, видимых в клетке в данный момент.Комплекс ULK1 начинает образование изолирующей мембраны; мембрана растёт, захватывает участок цитоплазмы и замыкается в аутофагосому.Аутофагосома сливается с лизосомой и превращается в аутолизосому, где в кислой среде гидролазы расщепляют груз и внутреннюю мембрану.Продукты расщепления — аминокислоты, жирные кислоты, нуклеозиды — переносятся в цитозоль и снова используются клеткой.Аутофагия — путь доставки компонентов цитоплазмы в лизосому. В этом разделе речь идёт о макроаутофагии: груз заключается в двойную мембрану аутофагосомы. Другие формы (микроаутофагия, шаперон-опосредованная аутофагия) устроены иначе, а избирательное удаление органелл будет предметом следующего семинара.Путь состоит из последовательных этапов: инициация, образование и рост изолирующей мембраны, её замыкание, слияние аутофагосомы с лизосомой и расщепление содержимого. Каждый этап можно нарушить отдельно, и тогда структуры, образовавшиеся до места блока, накапливаются. Например, при подавлении лизосомных протеаз путь останавливается на последнем этапе, и в клетке накапливаются аутолизосомы с нерасщеплённым грузом.Поэтому число аутофагосом в клетке — это содержание (пул), которое зависит от двух скоростей: образования и удаления. Пул растёт и при усилении образования, и при задержке слияния или расщепления. Аутофагическим потоком называют скорость доставки материала в лизосомы и его расщепления (Klionsky 2021).Отсюда главное правило измерения: одного снимка структур недостаточно. Нужно сравнение с условием, в котором удаление заблокировано, или прямая оценка расщепления. Как это делают на практике, разобрано в последнем шаге раздела.Типичная ошибка Чем больше аутофагосом в клетке, тем сильнее аутофагия.Число аутофагосом — это пул: оно растёт и при усиленном образовании, и при нарушенном слиянии или расщеплении. Об аутофагии судят по потоку — скорости доставки и расщепления материала в лизосомах.В клетках через 2 ч после воздействия число аутофагосом в 3 раза больше, чем в контроле. Других измерений нет. Какой вывод об аутофагическом потоке допустим?А. Поток вырос примерно в 3 раза вслед за числом аутофагосом (неверный вариант)Число аутофагосом — пул. Его утроение возможно и при неизменном или сниженном потоке, если задержано слияние или расщепление.Б. Поток снизился, потому что аутофагосомы не сливаются (неверный вариант)Задержка слияния — лишь одно из возможных объяснений. Тот же пул дало бы и усиленное образование при сохранённом слиянии.В. По этим данным изменение потока определить нельзя (верный вариант)Рост пула возможен и при усилении образования, и при блоке позднего этапа. Нужен второй показатель: сравнение с условием, где удаление заблокировано, или оценка расщепления.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKlionsky D.J., Abdel-Aziz A.K., Abdelfatah S. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382.Nakatogawa H. Mechanisms governing autophagosome biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:439–458.Схема механизма, качественные состояния; клетки млекопитающих в культуре, макроаутофагия. Определение потока и требования к его измерению — по руководству Klionsky 2021 (полный текст, разделы о LC3 и о распаде долгоживущих белков). Этапы образования аутофагосомы — по обзору Nakatogawa 2020. Уровни «мало / много» на схеме не являются измерениями.
Аутофагический поток · шаг 20 из 26Как ULK1 и VPS34 начинают образование аутофагосомыОбразование аутофагосомы начинается с киназного комплекса ULK1. Когда mTORC1 перестаёт его подавлять, ULK1 фосфорилирует субъединицы комплекса VPS34, и на мембране появляется PI3P — сигнал для следующих белков аутофагии.При достатке аминокислот mTORC1 фосфорилирует ULK1 по S758 у человека (S757 у мыши) и ATG13, и комплекс ULK1 неактивен.При снижении активности mTORC1 комплекс ULK1 (ULK1, ATG13, FIP200, ATG101) активируется и фосфорилирует BECN1 в составе комплекса VPS34 с ATG14.VPS34 фосфорилирует фосфатидилинозитол и образует на изолирующей мембране фосфатидилинозитол-3-фосфат (PI3P), с которым связываются белки следующего этапа.Комплекс ULK1 состоит из киназы ULK1 (у млекопитающих есть и близкая ULK2) и белков ATG13, FIP200 и ATG101 (Zachari 2017). Он собирается в месте будущей изолирующей мембраны, часто рядом с ЭПР, и служит платформой для других белков аутофагии.При достатке аминокислот активный mTORC1 фосфорилирует ULK1 по S758 у человека (S757 у мыши) и ATG13; в таком состоянии комплекс почти не запускает аутофагию (Kim 2011). Когда аминокислот нет, активность mTORC1 снижается, ингибирующее фосфорилирование уменьшается, и ULK1 активируется. AMPK фосфорилирует другие сайты ULK1. По классической схеме это стимулирует аутофагию; в новых работах при дефиците энергии AMPK скорее сдерживает её (Park 2023). Эффект зависит от вида стресса, его длительности и типа клеток.Активная ULK1 фосфорилирует BECN1 по S15 у человека (S14 у мыши) и усиливает активность комплекса фосфатидилинозитол-3-киназы класса III, содержащего VPS34, VPS15, BECN1 и ATG14 (Russell 2013). Этот комплекс образует на изолирующей мембране PI3P. Без ATG14 те же белки входят в комплексы эндоцитарного пути, поэтому VPS34 работает не только в аутофагии.Ингибиторы помогают проверить последовательность этапов. При подавлении ULK1 препаратом MRT68921 аутофагия блокируется, а в клетках накапливаются незавершённые ранние структуры (Petherick 2015). SAR405 подавляет VPS34 и аутофагию, но нарушает и работу поздних эндосом и лизосом (Ronan 2014).Кроме быстрого переключения ULK1, есть медленный, транскрипционный уровень регуляции. Активный mTORC1 фосфорилирует транскрипционный фактор TFEB (в частности, по S211); фосфорилированный TFEB связывается с белками 14-3-3 и остаётся в цитоплазме (Martina 2012; Roczniak-Ferguson 2012). При снижении активности mTORC1 TFEB переходит в ядро и усиливает транскрипцию генов лизосомных белков (Sardiello 2009) и белков аутофагии (Martina 2012). Близкий фактор TFE3 регулируется сходным образом (Martina 2014). Фосфорилирование ULK1 меняется за минуты, а новые белки лизосом и аутофагии появляются позже, после транскрипции и трансляции. В результате при длительном голодании клетка не только запускает аутофагию, но и увеличивает ёмкость лизосом, в которые доставляется материал.Типичная ошибка ULK1 сама строит мембрану аутофагосомы, перенося на неё липиды.ULK1 — протеинкиназа: она фосфорилирует белки, в том числе BECN1 в комплексе VPS34. Липид PI3P образует VPS34, а рост мембраны обеспечивают другие белки — ATG9, ATG2 и система присоединения LC3.Клетки находятся в среде без аминокислот; активность mTORC1 снижена. В среду добавили MRT68921 — ингибитор киназы ULK1. Как изменится образование PI3P на изолирующей мембране?А. Усилится: ULK1 больше не конкурирует с VPS34 (неверный вариант)ULK1 не конкурирует с VPS34, а стимулирует её: фосфорилирование BECN1 повышает активность комплекса VPS34 с ATG14.Б. Снизится: ULK1 не активирует комплекс VPS34 (верный вариант)Активная ULK1 фосфорилирует BECN1 и усиливает работу комплекса VPS34 с ATG14. При подавлении ULK1 PI3P на изолирующей мембране образуется меньше, и инициация аутофагии нарушается.В. Не изменится: VPS34 активируется только mTORC1 (неверный вариант)mTORC1 действует на этот этап через ULK1, подавляя её; без активной ULK1 снижение активности mTORC1 не приводит к усилению работы VPS34.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаZachari M., Ganley I.G. The mammalian ULK1 complex and autophagy initiation. Essays Biochem. 2017;61:585–596.Kim J., Kundu M., Viollet B., Guan K.-L. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1. Nat Cell Biol. 2011;13:132–141.Park J.-M., Lee D.-H., Kim D.-H. Redefining the role of AMPK in autophagy and the energy stress response. Nat Commun. 2023;14:2994.Russell R.C., Tian Y., Yuan H. et al. ULK1 induces autophagy by phosphorylating Beclin-1 and activating VPS34 lipid kinase. Nat Cell Biol. 2013;15:741–750.Petherick K.J., Conway O.J., Mpamhanga C. et al. Pharmacological inhibition of ULK1 kinase blocks mammalian target of rapamycin (mTOR)-dependent autophagy. J Biol Chem. 2015;290:11376–11383. Исправление: J Biol Chem. 2015;290:28726, doi:10.1074/jbc.A114.627778, PMID 26614783 (исправлены структурные формулы MRT67307 и MRT68921 на рис. 1A).Ronan B., Flamand O., Vescovi L. et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 2014;10:1013–1019.Sardiello M., Palmieri M., di Ronza A. et al. A gene network regulating lysosomal biogenesis and function. Science. 2009;325:473–477.Martina J.A., Chen Y., Gucek M., Puertollano R. MTORC1 functions as a transcriptional regulator of autophagy by preventing nuclear transport of TFEB. Autophagy. 2012;8:903–914.Roczniak-Ferguson A., Petit C.S., Froehlich F. et al. The transcription factor TFEB links mTORC1 signaling to transcriptional control of lysosome homeostasis. Sci Signal. 2012;5:ra42.Martina J.A., Diab H.I., Lishu L. et al. The nutrient-responsive transcription factor TFE3 promotes autophagy, lysosomal biogenesis, and clearance of cellular debris. Sci Signal. 2014;7:ra9.Схема механизма, качественные состояния; клетки млекопитающих в культуре, дефицит аминокислот или подавление mTORC1. Сайты фосфорилирования: ULK1 S758 человека (S757 мыши; Kim 2011, клетки мыши и человека), BECN1 S15 человека (S14 мыши; Russell 2013). Противоречивая роль AMPK — Park 2023 (экспериментальная работа на культурах клеток: при дефиците глюкозы или нарушении работы митохондрий AMPK подавляла активацию ULK1 и аутофагию, вызванные отсутствием аминокислот; реферат). При других воздействиях и в других клетках результат может быть иным. Ингибиторы: MRT68921 — Petherick 2015 (клетки мыши и человека, указаны рефераты); SAR405 — Ronan 2014. Транскрипционная регуляция через TFEB и TFE3 — Sardiello 2009, Martina 2012, Roczniak-Ferguson 2012, Martina 2014 (клетки человека и мыши; рефераты); на схеме этот уровень не показан. Уровни на схеме не являются измерениями.
Аутофагический поток · шаг 21 из 26Как LC3 присоединяется к мембране и что означает LC3-IILC3 присоединяется к липиду мембраны с помощью ферментов, похожих на ферменты убиквитинирования. Образующийся LC3-II — главный белковый признак мембран аутофагосом, но не абсолютный.Протеаза ATG4 отщепляет C-концевой фрагмент предшественника LC3 и открывает остаток глицина: образуется растворимый LC3-I.ATG7 (E1-подобный фермент) и ATG3 (E2-подобный) присоединяют LC3-I к фосфатидилэтаноламину мембраны; так образуется LC3-II.WIPI2 связывается с PI3P и привлекает комплекс ATG12–ATG5–ATG16L1, который направляет и ускоряет перенос LC3 именно на изолирующую мембрану.LC3 — белок семейства ATG8 размером около 15 кДа. Предшественник LC3 разрезается протеазой ATG4, и на C-конце открывается остаток глицина; эту растворимую форму называют LC3-I. Цепь реакций присоединения напоминает убиквитинирование: ATG7 активирует LC3-I, затратив ATP, и передаёт его на ATG3, а ATG3 переносит LC3 на аминогруппу фосфатидилэтаноламина. ATG7 участвует и во второй системе — образовании конъюгата ATG12–ATG5, где роль E2-подобного фермента выполняет ATG10.Место реакции задаёт предыдущий этап. WIPI2 связывается с PI3P на изолирующей мембране и привлекает комплекс ATG12–ATG5–ATG16L1 (Dooley 2014). Этот комплекс работает как E3-подобный фермент: он ускоряет перенос LC3 с ATG3 на липид. Так LC3-II появляется на обеих поверхностях растущей мембраны, а после замыкания — на наружной и внутренней мембранах аутофагосомы (само замыкание разобрано в следующем шаге).LC3-II на внутренней мембране разрушается в аутолизосоме вместе с грузом, а с наружной мембраны может отщепляться протеазой ATG4. На блоте LC3-II движется быстрее LC3-I. У мышей без Atg7 нарушены обе системы конъюгации и образование аутофагосом, а в клетках накапливаются убиквитин-положительные агрегаты (Komatsu 2005).Граница вывода: LC3-II бывает не только на аутофагосомах. При неканоническом присоединении (CASM) белки ATG8 присоединяются к одинарным мембранам эндолизосомного пути, в том числе к фосфатидилсерину (Durgan 2021). Поэтому LC3-II — показатель присоединения LC3, а не прямое число аутофагосом.Типичная ошибка LC3-II — это особый белок, который синтезируется только при аутофагии.LC3-II — тот же LC3, но присоединённый к липиду мембраны. Его образование зависит от ATG7 и ATG3, а содержание LC3-II отражает баланс между присоединением и разрушением, а не только синтез.В клетках нокаутирован ген ATG7. Клетки 2 ч держат в среде без аминокислот и снимают блот на LC3. Какой результат ожидается?А. Полоса LC3-II сильнее, чем в клетках дикого типа (неверный вариант)Сильная полоса LC3-II означала бы, что присоединение LC3 к мембране идёт. Без ATG7 нет E1-подобного фермента этой реакции.Б. Полоса LC3-I есть, полосы LC3-II нет (верный вариант)ATG7 активирует LC3-I для переноса на фосфатидилэтаноламин. Без него LC3 остаётся в растворимой форме LC3-I, а LC3-II не образуется.В. Нет ни полосы LC3-I, ни полосы LC3-II (неверный вариант)Без ATG7 не идёт присоединение LC3 к липиду, но сам белок LC3 синтезируется и разрезается ATG4; полоса LC3-I сохраняется.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаNakatogawa H. Mechanisms governing autophagosome biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:439–458.Dooley H.C., Razi M., Polson H.E. et al. WIPI2 links LC3 conjugation with PI3P, autophagosome formation, and pathogen clearance by recruiting Atg12–5-16L1. Mol Cell. 2014;55:238–252.Komatsu M., Waguri S., Ueno T. et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 2005;169:425–434.Durgan J., Lystad A.H., Sloan K. et al. Non-canonical autophagy drives alternative ATG8 conjugation to phosphatidylserine. Mol Cell. 2021;81:2031–2040.Схема механизма, качественные состояния; клетки млекопитающих. Последовательность реакций — по обзору Nakatogawa 2020 (полный текст). WIPI2 и ATG16L1 — Dooley 2014 (клетки человека, реферат). Мыши с условным нокаутом Atg7 — Komatsu 2005 (реферат). Неканоническое присоединение ATG8 к фосфатидилсерину — Durgan 2021 (клетки млекопитающих, реферат). Уровни на схеме условны.
Аутофагический поток · шаг 22 из 26Как аутофагосома сливается с лизосомой и где расщепляется её содержимоеМежду ростом фагофора и его слиянием с лизосомой стоит ещё одно событие — герметичное замыкание. Слияние, закисление и расщепление идут уже после замыкания; их нарушают разные воздействия, и каждое оставляет свой след.Края растущего фагофора сближаются, и ESCRT-III (в частности, CHMP2A) с АТФазой VPS4 разделяют внутреннюю и наружную мембраны у края: образуется замкнутая аутофагосома с изолированным грузом.STX17 встраивается в наружную мембрану замкнутой аутофагосомы и вместе с SNAP29 и лизосомным VAMP8 образует комплекс SNARE, сближающий мембраны.После слияния V-ATPase лизосомной мембраны поддерживает кислую среду, нужную лизосомным гидролазам.Катепсины и другие гидролазы расщепляют груз и внутреннюю мембрану вместе с LC3-II; продукты переносятся в цитозоль.Рост фагофора, его замыкание и слияние с лизосомой — три разных события. Растущий фагофор — открытая двухмембранная цистерна: его внутренняя и наружная мембраны непрерывно переходят одна в другую по краю, и груз ещё связан с цитоплазмой. Приток липидов (ATG2, ATG9) увеличивает площадь цистерны, но груз не изолирует. При замыкании края сближаются, непрерывность между внутренней и наружной мембранами у края прекращается, и груз оказывается внутри замкнутой аутофагосомы. Речь идёт о двух мембранах, а не о листках одного бислоя: каждая из них остаётся целым липидным бислоем со своими двумя листками. В клетках HeLa CHMP2A, компонент ESCRT-III, перемещается к фагофору, а подавление АТФазы VPS4 нарушает завершение аутофагосом; по данным авторов, замыкание нужно и для того, чтобы лизосомный белок LAMP1 не попадал на внутреннюю мембрану (Takahashi 2018). Это показано в изученных системах и не означает, что ESCRT-III — единственный путь замыкания у всех эукариот. Подробнее: семинар 7, шаг 24.STX17 появляется на наружной мембране аутофагосомы после её замыкания и отсутствует на незамкнутой изолирующей мембране (Itakura 2012). Какой сигнал привлекает STX17 именно к замкнутой аутофагосоме, до конца не выяснено; установлено лишь, что на готовых аутофагосомах он есть, а на открытой изолирующей мембране его нет. Наблюдаемая очерёдность — сначала замыкание, затем слияние — показывает, что эти события нельзя объединять одной стрелкой: слияние следует за замыканием и не заменяет его. С SNAP29 и VAMP8 он образует комплекс SNARE, который участвует в слиянии с лизосомой. При снижении содержания STX17 аутофагосомы накапливаются, а их содержимое не расщепляется. Слияние может идти и без STX17: описан второй комплекс SNARE с YKT6, поэтому в клетках, нокаутных по STX17, слияние сохраняется частично (Matsui 2018).В аутолизосоме V-ATPase переносит протоны в просвет и поддерживает кислую среду. Катепсины активны именно в ней. Бафиломицин A1 ингибирует V-ATPase и нарушает закисление. В жировом теле дрозофилы закисление и слияние удалось разделить: лизосомы без V-ATPase сливались с аутофагосомами, а бафиломицин слияние блокировал — через побочную мишень, Ca²⁺-насос SERCA (Mauvezin 2015).Хлорохин накапливается в кислых органеллах; в клетках он нарушает прежде всего слияние аутофагосом с лизосомами, а не закисление (Mauthe 2018). E64d и пепстатин A ингибируют лизосомные протеазы: слияние и закисление сохраняются, но белки груза не расщепляются.Эти воздействия часто называют одним словом «ингибиторы лизосом», но они блокируют разные этапы. Поэтому вывод «аутофагия заблокирована» нужно сопровождать указанием, какой именно этап нарушен.Типичная ошибка Бафиломицин, хлорохин и ингибиторы протеаз одинаково «выключают лизосому».Они действуют на разные этапы: бафиломицин подавляет закисление (и в некоторых клетках слияние), хлорохин прежде всего нарушает слияние, ингибиторы протеаз — расщепление при сохранённом закислении.Клетки без аминокислот с тандемным репортёром mCherry-GFP-LC3 обработали E64d и пепстатином A — ингибиторами лизосомных протеаз. Что произойдёт с закислением аутолизосом?А. Закисление прекратится, как при бафиломицине (неверный вариант)Бафиломицин ингибирует V-ATPase. Ингибиторы протеаз действуют на ферменты внутри аутолизосомы и протонную помпу не затрагивают.Б. Закисление не начнётся, потому что слияние нарушено (неверный вариант)Нарушение слияния характерно для хлорохина или снижения содержания STX17. Ингибиторы протеаз действуют после слияния.В. Закисление сохранится, но груз не будет расщепляться (верный вариант)V-ATPase продолжает работать, среда в аутолизосомах кислая (красные точки репортёра), но протеазы подавлены, поэтому груз и LC3-II накапливаются.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаTakahashi Y., He H., Tang Z. et al. An autophagy assay reveals the ESCRT-III component CHMP2A as a regulator of phagophore closure. Nat Commun. 2018;9:2855Itakura E., Kishi-Itakura C., Mizushima N. The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes. Cell. 2012;151:1256–1269.Matsui T., Jiang P., Nakano S. et al. Autophagosomal YKT6 is required for fusion with lysosomes independently of syntaxin 17. J Cell Biol. 2018;217:2633–2645.Mauvezin C., Nagy P., Juhász G., Neufeld T.P. Autophagosome–lysosome fusion is independent of V-ATPase-mediated acidification. Nat Commun. 2015;6:7007.Mauthe M., Orhon I., Rocchi C. et al. Chloroquine inhibits autophagic flux by decreasing autophagosome–lysosome fusion. Autophagy. 2018;14:1435–1455.Схема механизма, качественные состояния. STX17 — клетки млекопитающих (HeLa, MEF; Itakura 2012); YKT6 и частичное слияние без STX17 — клетки HeLa (Matsui 2018). Разделение закисления и слияния — жировое тело дрозофилы и клетки млекопитающих (Mauvezin 2015). Хлорохин — клетки человека и мыши, ткани мышей (Mauthe 2018). Замыкание фагофора — клетки HeLa (Takahashi 2018); роль ESCRT-III в замыкании показана в изученных системах. Указаны рефераты; уровни на схеме не являются измерениями.
Аутофагический поток · шаг 23 из 26Для чего клетке аутофагия и что происходит при её нарушенииАутофагия поставляет мономеры при дефиците питательных веществ и удаляет то, что не может разрушить протеасома, — крупные агрегаты и органеллы. Её нарушение проявляется прежде всего в долгоживущих клетках.При дефиците аминокислот аутофагия расщепляет часть собственных белков; освобождённые аминокислоты снова активируют mTORC1, который ограничивает аутофагию и запускает восстановление лизосом.Адаптер p62 связывает убиквитинированные белки и LC3 и вместе с грузом попадает в аутофагосому, где разрушается.При нарушении аутофагии p62 и убиквитинированные белки накапливаются в агрегатах; в нейронах и гепатоцитах это сопровождается повреждением клеток.При отсутствии аминокислот в среде аутофагия становится их внутренним источником. В клетках NRK после удаления сыворотки и глутамина активность mTORC1 сначала падала, а затем восстанавливалась за счёт продуктов аутофагического расщепления; повторная активация mTORC1 ограничивала аутофагию и запускала восстановление лизосом из аутолизосом (Yu 2010).Второе назначение — контроль качества. Белок p62 (SQSTM1) связывает убиквитинированные белки своим UBA-доменом, а LC3 — мотивом LIR, и тем самым связывает груз с мембраной аутофагосомы; сам p62 разрушается вместе с грузом (Bjørkøy 2005). Так удаляются белковые агрегаты, которые не проходят в узкий канал протеасомы.У мышей с условным нокаутом Atg7 в печени аутофагия при голодании нарушалась, а в гепатоцитах накапливались убиквитин-положительные агрегаты и деформированные митохондрии (Komatsu 2005). В таких клетках накапливается и p62; при одновременном удалении гена p62 агрегаты в гепатоцитах и нейронах почти не образуются, а повреждение печени ослабевает (Komatsu 2007). Нарушения системы аутофагия–лизосома описаны при нескольких нейродегенеративных болезнях; во многих случаях первично поражается лизосома, а не образование аутофагосом (Nixon 2024).Граница вывода: связь нарушения аутофагии с болезнью не означает, что усиление аутофагии лечит болезнь. Это вопрос клинических исследований, а не механизма. Избирательное удаление повреждённых органелл с помощью рецепторов будет предметом следующего семинара.Типичная ошибка Аутофагия нужна клетке только при голодании.Аутофагия идёт и в полной среде на базальном уровне: она постоянно обновляет часть белков и органелл и удаляет агрегаты. Без неё убиквитинированные белки и p62 накапливаются даже без голодания.В гепатоцитах мыши удалён ген Atg7; мыши получают корм без ограничений. Как изменится содержание p62 в гепатоцитах по сравнению с мышами дикого типа?А. Повысится: p62 перестаёт разрушаться в лизосомах (верный вариант)p62 разрушается вместе с грузом при аутофагии. Без Atg7 канонического образования аутофагосом нет, и p62 вместе с убиквитинированными белками накапливается (Komatsu 2007).Б. Снизится: без аутофагии p62 некуда связываться (неверный вариант)p62 связывает убиквитинированные белки и без аутофагосом; отсутствие LC3-II мешает не связыванию, а доставке p62 в лизосому.В. Не изменится, потому что голодания нет (неверный вариант)Аутофагия идёт и без голодания, на базальном уровне; её отсутствие сказывается и без голодания.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаYu L., McPhee C.K., Zheng L. et al. Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR. Nature. 2010;465:942–946.Bjørkøy G., Lamark T., Brech A. et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 2005;171:603–614.Komatsu M., Waguri S., Ueno T. et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 2005;169:425–434.Komatsu M., Waguri S., Koike M. et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 2007;131:1149–1163.Nixon R.A., Rubinsztein D.C. Mechanisms of autophagy–lysosome dysfunction in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25:926–946.Схема механизма, качественные состояния. Повторная активация mTORC1 и восстановление лизосом — клетки NRK, среда без сыворотки и глутамина (Yu 2010, реферат). p62 и агрегаты — клетки человека и мыши (Bjørkøy 2005, реферат). Мыши с условным нокаутом Atg7 в печени и мозге — Komatsu 2005 и Komatsu 2007 (рефераты). Нарушения при нейродегенерации — обзор Nixon 2024 (полный текст). Уровни на схеме не являются измерениями.
Аутофагический поток · шаг 24 из 26Как измерить аутофагический потокПоток оценивают по тому, что исчезает, а не по тому, что видно. Для этого сравнивают клетки с заблокированным удалением и без блока или прямо измеряют расщепление.Вестерн-блот LC3-II в двух чашках — без бафиломицина и с ним — показывает, сколько LC3-II разрушилось бы за время действия препарата.Тандемный репортёр mCherry-GFP-LC3 различает некислые аутофагосомы (жёлтые точки) и кислые аутолизосомы (красные точки).Распад долгоживущих белков, меченных аминокислотой, измеряет само расщепление; аутофагическую часть выделяют с помощью блока аутофагии.Основной биохимический тест — оборот LC3-II. Клетки делят на две чашки; в одну за короткое время до измерения (обычно 2–4 ч) добавляют бафиломицин A1 или другой ингибитор лизосомного расщепления. Если поток идёт, LC3-II во второй чашке накапливается сильнее. Прибавка — не чистый поток: сам препарат может менять образование аутофагосом, а длительная обработка токсична (Klionsky 2021).Содержание p62 обычно снижается при активной аутофагии и растёт при её блоке. Но ген SQSTM1 регулируется транскрипционно, в том числе фактором NRF2, поэтому одно содержание p62 поток не определяет (Klionsky 2021).Тандемный репортёр mCherry-GFP-LC3 различает этапы: в кислой аутолизосоме GFP гаснет, а mCherry сохраняется (Kimura 2007). Жёлтые точки накапливаются при замедленном слиянии или нарушенном закислении, красные — при усиленной доставке в кислые компартменты или замедленном расщеплении. Поэтому цвет и число точек сами по себе не определяют скорость расщепления. Отношение красных точек к жёлтым показывает созревание, но не пропорционально потоку. Количественно удобнее зонд GFP-LC3-RFP-LC3ΔG: ATG4 разрезает его на две части, GFP-LC3 разрушается при аутофагии, а RFP-LC3ΔG остаётся внутренним контролем (Kaizuka 2016).Прямой метод — распад долгоживущих белков: белки метят аминокислотой, затем измеряют освобождение метки. Значительная часть распада неаутофагическая, поэтому параллельно ставят пробы с блоком аутофагии и вычитают их (Klionsky 2021).Типичная ошибка Высокий LC3-II в одной пробе означает усиленную аутофагию.Высокий LC3-II возникает и при усиленном образовании аутофагосом, и при нарушенном расщеплении. Поток оценивают по разнице между пробами с ингибитором лизосомного расщепления и без него или по распаду меченых белков.В клетках с тандемным репортёром mCherry-GFP-LC3 после воздействия красных точек стало вдвое больше, а жёлтых — столько же. Какой вывод следует только из этих данных?А. Аутофагический поток вырос примерно вдвое (неверный вариант)Красные точки говорят о слиянии и закислении, но не о расщеплении: их накопление возможно и при блоке протеаз. Отношение точек не пропорционально потоку.Б. Больше кислых аутолизосом; расщепление не измерено (верный вариант)Красный сигнал без GFP означает кислую среду после слияния. Сохраняется ли расщепление, по этим данным не определить: нужен оборот LC3-II или распад меченых белков.В. Слияние аутофагосом с лизосомами нарушено (неверный вариант)При нарушении слияния накапливались бы жёлтые точки — аутофагосомы с некислой средой. Здесь растёт число красных точек.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKlionsky D.J., Abdel-Aziz A.K., Abdelfatah S. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382.Kimura S., Noda T., Yoshimori T. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy. 2007;3:452–460.Kaizuka T., Morishita H., Hama Y. et al. An autophagic flux probe that releases an internal control. Mol Cell. 2016;64:835–849.Схема метода, условные пиктограммы: значения полос, точек и кривых нарисованы для объяснения и не являются данными конкретного эксперимента. Требования к тестам — руководство Klionsky 2021 (полный текст, разделы о LC3, p62, тандемных репортёрах и распаде долгоживущих белков). Тандемный репортёр — Kimura 2007; зонд GFP-LC3-RFP-LC3ΔG — Kaizuka 2016 (клетки, рыбки данио, мыши; рефераты).
Исследование · шаг 25 из 26Как выбрать измеряемую величину, метод и контрольЧетыре системы протеостаза отвечают на разные вопросы, поэтому и измеряют в них разное: долю свернувшихся молекул, скорость распада, прохождение по секреторному пути, поток через лизосому. Вывод надёжен, только если измеряемая величина и контроль выбраны под вопрос.Сначала формулируют, что изменилось: доля нативного белка, скорость распада, место в клетке или скорость доставки в лизосому.Затем выбирают метод, который измеряет именно эту величину, и контроль, который отделяет её от соседних процессов.Граница вывода задаётся условиями: in vitro или клетки, доза и время воздействия, побочные эффекты препарата.Для цикла Hsp70 удобна система in vitro: денатурированную люциферазу смешивают с очищенными белками и измеряют восстановление её активности. Контроли — смесь для сворачивания без ATP, Hsp70 без гидролиза (K71M) и J-белок с заменой в мотиве HPD. Вывод относится к очищенным белкам; в клетке концентрации и партнёры другие.Для убиквитин-протеасомной системы главная величина — скорость распада. Её измеряют, остановив синтез циклогексимидом, а путь распада определяют ингибиторами: бортезомиб для протеасомы, бафиломицин для лизосом. Замена остатков дегрона проверяет, какой участок узнаёт лигаза.В ЭПР важно, где находится белок и что с ним стало. Импульсная метка выделяет когорту молекул, синтезированных за короткое время, а обработка Endo H показывает, прошли ли они medial-Гольджи. Сумма белка в клетках и в среде, убывающая со временем, указывает на распад.Для аутофагии измеряют не число структур, а поток: сравнивают LC3-II в чашках с бафиломицином и без него, считают жёлтые и красные точки тандемного репортёра, измеряют распад долгоживущих белков. Ни один показатель не достаточен сам по себе, поэтому выводы делают по согласию нескольких.Типичная ошибка Количество белка или число структур на снимке достаточно, чтобы судить о скорости процесса.Количество — результат баланса образования и удаления. Скорость измеряют отдельно: при остановленном синтезе, в когорте меченых молекул или по разнице между чашками с ингибитором и без него.В клетках без белка Y содержание LC3-II на блоте выросло вдвое. Какое дополнительное измерение позволит выяснить, ускорилось ли образование аутофагосом или замедлилось их удаление?А. Добавить бафиломицин только к клеткам без Y и оценить прибавку LC3-II (неверный вариант)Прибавка в одних клетках без Y показывает, что оборот LC3-II сохраняется, но не говорит, изменилось ли образование: без контрольной пары частичное нарушение удаления не отличить от усиленного образования.Б. Сравнить прибавку LC3-II с бафиломицином в клетках без Y и в контроле (верный вариант)Нужны четыре чашки: контрольные клетки и клетки без Y, каждые без бафиломицина и с ним, при одинаковом времени обработки. Прибавка показывает, что оборот LC3-II сохраняется; об изменении образования судят, сравнивая её с прибавкой в контроле. Если прибавка такая же или меньше, а LC3-II без бафиломицина выше, чем в контроле, удаление нарушено; если прибавка больше, образование, скорее всего, усилено.В. Измерить в клетках без Y содержание мРНК LC3 (неверный вариант)Количество мРНК не говорит о скорости образования и удаления аутофагосом; LC3-II — липидированная форма белка, её количество зависит от потока.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаSzabo A., Langer T., Schröder H. et al. The ATP hydrolysis-dependent reaction cycle of the Escherichia coli Hsp70 system DnaK, DnaJ, and GrpE. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91:10345–10349Henkel T., Machleidt T., Alkalay I. et al. Rapid proteolysis of IκB-α is necessary for activation of transcription factor NF-κB. Nature. 1993;365:182–185. doi:10.1038/365182a0Liu Y., Choudhury P., Cabral C.M., Sifers R.N. Oligosaccharide modification in the early secretory pathway directs the selection of a misfolded glycoprotein for degradation by the proteasome. J Biol Chem. 1999;274:5861–5867Klionsky D.J., Abdel-Aziz A.K., Abdelfatah S. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382.Схема выбора методов; пиктограммы условны. Методы и их ограничения описаны в шагах «Как проверить работу цикла», «Как измерить скорость распада белка», «Как проследить судьбу гликопротеина» и «Как измерить аутофагический поток» с источниками там же: Szabo 1994, Henkel 1993, Liu 1999, Klionsky 2021.
Исследование · шаг 26 из 26Судьба одного белка: от Hsp70 до протеасомы и лизосомыПротеостаз — это сеть, в которой судьба разных повреждённых белков определяется по-разному: цитозольный белок получает повторные попытки свернуться, белок ЭПР проходит гликановый контроль, а агрегат удаляется аутофагией. Схема объединяет четыре механизма семинара.Hsp70 с J-белком связывает открытые гидрофобные участки; NEF освобождает белок для новой попытки свернуться.Если попытки неудачны, CHIP убиквитинирует белок, связанный с Hsp70, и цепь K48 направляет его в 26S-протеасому; в ЭПР тот же итог даёт ERAD.Агрегаты, недоступные протеасоме, связывает p62, и они удаляются аутофагией в лизосоме.Предположим, тепловой стресс развернул часть белков клетки. Открытые гидрофобные участки связывают J-белки и Hsp70. Каждый цикл ATP и ADP даёт белку попытку свернуться; за одну попытку сворачивается лишь часть молекул, поэтому нужны повторные циклы, а факторы обмена нуклеотидов определяют их скорость. Если открытые участки остаются доступными долго, они служат сигналом для систем деградации; так происходит сортировка белков.Убиквитинлигаза CHIP связывается с C-концом Hsp70 и Hsp90 и убиквитинирует удерживаемый ими белок; цепь K48 направляет его в 26S-протеасому. Так шаперон и протеасома конкурируют за один и тот же белок: исход определяется тем, что произойдёт раньше — сворачивание или убиквитинирование.Белок, синтезированный в ЭПР, проходит другой контроль: глюкоза на N-гликане возвращает его к калнексину, отщепление маннозы направляет к SEL1L–HRD1. После выведения в цитозоль такой белок разрушает та же 26S-протеасома.Крупные агрегаты протеасома разрушить не может: её канал пропускает только развёрнутую цепь. Убиквитинированные агрегаты связывает p62, который взаимодействует с LC3 на мембране аутофагосомы; после слияния с лизосомой агрегат расщепляется. Если нарушено одно звено, нагрузка на соседние растёт: при ингибировании протеасомы усиливается синтез её субъединиц через NRF1, а белки могут перенаправляться в аутофагию.Типичная ошибка Шапероны, протеасома и аутофагия — три независимые системы, каждая со своими субстратами.Это связанная сеть: Hsp70 и CHIP передают белок в протеасому, ERAD заканчивается в протеасоме, а убиквитинированные агрегаты через p62 попадают в аутофагию; нарушение одного звена перераспределяет нагрузку на другие.Неисправимый цитозольный белок связан с Hsp70 и убиквитинируется лигазой CHIP. Клетки обработали бортезомибом. Как изменится этот белок в первые часы?А. Накопится в полиубиквитинированной форме (верный вариант)Убиквитинирование продолжается, а расщепление в протеасоме остановлено, поэтому полиубиквитинированный белок накапливается.Б. Свернётся благодаря новым циклам Hsp70 (неверный вариант)Ингибирование протеасомы не исправляет дефект сворачивания; неисправимый белок остаётся несвёрнутым и убиквитинированным.В. Полностью разрушится в лизосомах (неверный вариант)Перенаправление части белков в аутофагию при ингибировании протеасомы описано, но оно медленнее и не полное; в первые часы полиубиквитинированный белок накапливается.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаWentink A., Rosenzweig R., Kampinga H., Bukau B. Mechanisms and regulation of the Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27:110–128. PMID 41145833. Связанные исправления: Publisher Correction, 2026;27:172, doi:10.1038/s41580-025-00932-2, PMID 41198871; Author Correction, 2026;27:875, doi:10.1038/s41580-026-01029-0, PMID 42716998 (рис. 1a: добавлен HSPA6, в семействе 11 белков вместо 10)Connell P., Ballinger C.A., Jiang J. et al. The co-chaperone CHIP regulates protein triage decisions mediated by heat-shock proteins. Nat Cell Biol. 2001;3:93–96Christianson J.C., Jarosch E., Sommer T. Mechanisms of substrate processing during ER-associated protein degradation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:777–796Bjørkøy G., Lamark T., Brech A. et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 2005;171:603–614.Radhakrishnan S.K., Lee C.S., Young P. et al. Transcription factor Nrf1 mediates the proteasome recovery pathway after proteasome inhibition in mammalian cells. Mol Cell. 2010;38:17–28. doi:10.1016/j.molcel.2010.02.029Hipp M.S., Kasturi P., Hartl F.U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:421–435Схема механизма, качественные состояния; объединяет данные шагов разделов 1–4. Передача белков от Hsp70 к CHIP — Connell 2001 (реферат) и обзор Wentink 2026; ERAD — Christianson 2023; p62 в агрегатах — Bjørkøy 2005; восстановление протеасом — Radhakrishnan 2010. Последовательность «сначала шапероны, затем деградация» — схема кинетической конкуренции, а не жёсткий порядок.
