Рецепторы селективной аутофагии · шаг 1 из 26Что делает рецептор селективной аутофагииСелективная аутофагия упаковывает в аутофагосому не любой участок цитоплазмы, а помеченный груз: белковые агрегаты, повреждённые органеллы, бактерии. Отбор выполняют рецепторы селективной аутофагии: каждый из них связывает груз и белки ATG8 на мембране фагофора, а многие ещё и привлекают к грузу комплекс ULK1–FIP200.Что показывает схема. Схема показывает груз с метками убиквитина, модули рецептора (UBD, LIR, FIR) и их партнёров: белки ATG8 на мембране и комплекс ULK1–FIP200. Четыре состояния: рецептор цел, нет UBD, нет LIR, нет участка связывания FIP200.Груз несёт метку, чаще всего цепи убиквитина; растворимые рецепторы p62, NBR1, TAX1BP1, NDP52 и OPTN узнают её убиквитин-связывающим доменом.Тот же рецептор связывает белки ATG8 мотивом LIR, и мембрана фагофора оказывается рядом с грузом.Участком FIR или SKICH рецептор связывает FIP200 и привлекает комплекс ULK1–FIP200, поэтому построение аутофагосомы начинается у груза.При голодании подавление киназы mTOR запускает неселективную аутофагию, которой рецепторы не нужны. Селективная аутофагия может идти и при активном mTOR: аутофагосому у груза строят рецепторы, которые связывают груз и привлекают белки аутофагии (Adriaenssens 2022). Почему локального привлечения комплекса ULK1–FIP200 достаточно для запуска при активном mTORC1, разбирает шаг 4.Рецептором называют белок, который связывает груз и белки ATG8 на фагофоре. Рецептор, как правило, разрушается вместе с грузом: p62 прямо связывается с LC3 и GABARAP, а p62-положительные тельца разрушаются в аутолизосомах (Pankiv 2007).Растворимые рецепторы p62, NBR1, TAX1BP1, NDP52 и OPTN узнают убиквитин на грузе. Мембранные рецепторы BNIP3, NIX и FUNDC1 встроены в наружную мембрану митохондрии и запускают путь без убиквитинирования её поверхности, а FAM134B встроен в мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭПР) (Adriaenssens 2022).Рецептор не только связывает груз и ATG8, но и привлекает к грузу комплекс ULK1–FIP200. Для NDP52 это показано при его принудительной посадке на митохондрию в клетках HeLa: без домена SKICH FIP200 не привлекался, и митофагия не наступала (Vargas 2019). Поэтому аутофагосома строится у груза, а не пристыковывается к готовой.Граница вывода: сведения получены в культивируемых клетках человека, чаще в HeLa; набор рецепторов зависит от типа клеток, например NDP52 не экспрессируется в нейронах (Adriaenssens 2022).Типичная ошибка Рецептор лишь стыкует помеченный груз с готовой аутофагосомой.Рецепторы NDP52 и OPTN привлекали ULK1 к митохондриям независимо от связи с белками ATG8 (Lazarou 2015; Vargas 2019). Связь с ATG8 — лишь одна из функций рецептора.Рецептор находится на грузе; его убиквитин-связывающий домен и мотив LIR сохранены, а участок связывания FIP200 удалён. Какое звено цепи нарушается в первую очередь?А. Связь рецептора с убиквитином на грузе. (неверный вариант)Убиквитин рецептор связывает своим UBD, а он по условию сохранён. NDP52 без SKICH сохранял взаимодействие с белками LC3/GABARAP, но терял связь с FIP200 (Vargas 2019).Б. Привлечение комплекса ULK1–FIP200 к грузу. (верный вариант)Участок связывания FIP200 передаёт сигнал от рецептора к комплексу инициации. NDP52 без SKICH не привлекал FIP200 к митохондрии и не запускал митофагию (Vargas 2019).В. Связь рецептора с белками ATG8. (неверный вариант)За эту связь отвечает мотив LIR, а он сохранён. В модели без FIR нарушена не она, а привлечение инициирующего комплекса.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаAdriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Pankiv S., Clausen T.H., Lamark T. et al. p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy. J Biol Chem. 2007;282:24131–24145Vargas J.N.S., Wang C., Bunker E. et al. Spatiotemporal control of ULK1 activation by NDP52 and TBK1 during selective autophagy. Mol Cell. 2019;74:347–362Lazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Padman B.S., Nguyen T.N., Uoselis L. et al. LC3/GABARAPs drive ubiquitin-independent recruitment of Optineurin and NDP52 to amplify mitophagy. Nat Commun. 2019;10:408Определения даны по обзору Adriaenssens 2022. Привлечение FIP200 доменом SKICH показано в клетках HeLa при принудительной посадке NDP52 на митохондрию (метод описан в последнем шаге раздела; Vargas 2019); для p62 данные получены в клетках HeLa (Pankiv 2007); мутанты UBD и LIR изучали в клетках HeLa с Parkin (Lazarou 2015; Padman 2019). Схема качественная: показаны модули рецептора и звенья цепи, без трёхмерного строения.
Рецепторы селективной аутофагии · шаг 2 из 26Из каких частей собран рецепторРецептор селективной аутофагии — многодоменный белок: одни модули связывают груз, другие — белки ATG8, третьи — белки инициации. У каждого рецептора набор модулей свой, поэтому рецепторы выполняют разные функции.Что показывает схема. Схема показывает модули рецептора (PB1, UBD, LIR, FIR или SKICH) и их партнёров: другую копию рецептора, убиквитин на грузе, белки ATG8 и комплекс ULK1–FIP200. Можно выбрать p62, NDP52 или OPTN.Рецептор состоит из независимых модулей: UBD связывает убиквитин на грузе, LIR — белки ATG8.Участок FIR или SKICH связывает FIP200 комплекса ULK1–FIP200; у p62 он перекрывается с LIR.Киназа TBK1 фосфорилирует модули рецепторов и усиливает их связывание.Убиквитин-связывающие домены у рецепторов разные: UBA у p62 и NBR1, UBZ у TAX1BP1, UBAN у OPTN, цинковые пальцы у NDP52. Домен PB1 есть у p62 и NBR1: у p62 он собирает олигомеры, а PB1 NBR1 сам полимеризоваться не может (Adriaenssens 2022).LIR — короткая последовательность длиной 15–20 аминокислот; она связывается с LIR-связывающим участком (LDS) белков ATG8 на мембране фагофора. Известны и нетипичные взаимодействия с этим участком, а также взаимодействие, не зависящее от LIR (Johansen & Lamark 2020).Связывание FIP200 устроено по-разному. NDP52 связывает FIP200 доменом SKICH (Vargas 2019). У p62 FIP200 узнаёт участок из остатков 326–380, перекрывающийся с LIR, поэтому ATG8 и FIP200 конкурируют за p62 (Turco 2019). У OPTN способ связывания FIP200 не определён, известно лишь, что оно зависит от активности киназы TBK1 (Adriaenssens 2022).Киназа TBK1 фосфорилирует OPTN, NDP52, TAX1BP1 и p62, в том числе убиквитин- и LC3-связывающие домены OPTN и p62 и домены SKICH у NDP52 и TAX1BP1. Фосфорилирование UBAN у OPTN по Ser473 расширяет набор цепей убиквитина, которые он связывает (Richter 2016).Граница вывода: номера остатков даны для белков человека; схема не передаёт трёхмерного строения, а порядок модулей упрощён.Типичная ошибка У всех рецепторов один и тот же набор модулей, поэтому любой из них может выполнять функции другого.Наборы модулей различаются: PB1 есть у p62 и NBR1, у p62 участок связывания FIP200 перекрывается с LIR, а у OPTN способ связывания FIP200 не определён (Adriaenssens 2022; Turco 2019).Киназа TBK1 фосфорилирует UBAN-домен OPTN по Ser473. Как изменится способность OPTN связывать цепи убиквитина?А. Сузится: OPTN будет связывать меньше типов цепей. (неверный вариант)Наоборот: фосфорилирование расширяет набор цепей, которые связывает UBAN (Richter 2016).Б. Не изменится: фосфорилирование влияет на связь с ATG8, а не с убиквитином. (неверный вариант)Фосфорилирование влияет и на связывание убиквитина: по Ser473 оно расширяет набор цепей, которые узнаёт UBAN (Richter 2016).В. Расширится: OPTN свяжет более разнообразные цепи убиквитина. (верный вариант)TBK1-зависимое фосфорилирование UBAN по Ser473 расширяет связывающую способность OPTN; это часть положительной обратной связи при митофагии (Richter 2016).Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаAdriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Johansen T., Lamark T. Selective autophagy: ATG8 family proteins, LIR motifs and cargo receptors. J Mol Biol. 2020;432:80–103Turco E., Witt M., Abert C. et al. FIP200 claw domain binding to p62 promotes autophagosome formation at ubiquitin condensates. Mol Cell. 2019;74:330–346Vargas J.N.S., Wang C., Bunker E. et al. Spatiotemporal control of ULK1 activation by NDP52 and TBK1 during selective autophagy. Mol Cell. 2019;74:347–362Richter B., Sliter D.A., Herhaus L. et al. Phosphorylation of OPTN by TBK1 enhances its binding to Ub chains and promotes selective autophagy of damaged mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113:4039–4044Состав модулей — по обзору Adriaenssens 2022 и работам Vargas 2019, Turco 2019, Richter 2016 (клетки человека, in vitro). Нумерация остатков — для белков человека. Схема показывает только p62, NDP52 и OPTN; NBR1 и TAX1BP1 рассмотрены в других шагах.
Рецепторы селективной аутофагии · шаг 3 из 26Почему слабые связи дают избирательностьОдиночный модуль рецептора связывает убиквитин или белок ATG8 слабо и обратимо. Избирательность возникает из сочетания многих таких контактов: авидность частицы растёт, а сродство каждого контакта остаётся прежним.Что показывает схема. Схема показывает груз с метками убиквитина, рецептор p62 и белки ATG8 на мембране фагофора. Можно сравнить олигомер p62 и p62 без домена PB1 при одной молекуле убиквитина и при нескольких длинных цепях.Один UBD слабо и обратимо связывает одну молекулу убиквитина, а один LIR — один белок ATG8.Домен PB1 собирает p62 в олигомеры, и на одной частице оказывается много модулей UBA и LIR.Олигомер удерживается там, где метки и ATG8 расположены плотно: на грузе с несколькими цепями и на мембране фагофора.Сродство одиночного UBA p62 к убиквитину очень низкое (Wurzer 2015). Такая слабость полезна: p62 связывается преимущественно с грузом, на котором метки сгруппированы, и не вмешивается в другие процессы с участием убиквитина (Adriaenssens 2022).Домен PB1 собирает p62 в олигомеры: рекомбинантный p62 дикого типа состоял в среднем из 24 молекул, а вариант без PB1 — из трёх. Олигомеризация не повышала сродства отдельного LIR к LC3B, но снижала скорость отсоединения частицы от поверхности, плотно покрытой LC3B или убиквитином (Wurzer 2015).После разведения раствора p62 дикого типа оставался на частицах с LC3B до 1,5 ч, а p62 без PB1 отсоединялся сразу. При снижении плотности LC3B на поверхности обмен p62 дикого типа ускорялся, а у p62 без PB1 не менялся (Wurzer 2015).Имеет значение и устройство метки. В системе из очищенных белков p62 и убиквитинированные субстраты собирались в скопления, если у субстрата было не менее двух цепей длиной больше трёх убиквитинов (Zaffagnini 2018). Цепь K63 индуцировала фазовое разделение p62 с образованием жидкоподобных капель в пробирке (Sun 2018).Граница вывода: предпочтение цепей K63 или K48 в основном показано при сверхэкспрессии и in vitro (Adriaenssens 2022).Типичная ошибка Чем прочнее один контакт рецептора с меткой, тем точнее выбор груза.Избирательность определяется числом одновременных слабых контактов: олигомер p62 с множеством UBA и LIR удерживается на плотной поверхности с метками и ATG8, но не на одиночной молекуле убиквитина (Wurzer 2015; Adriaenssens 2022).Очищенный p62 дикого типа и p62 без домена PB1 удерживаются на гранулах, плотно покрытых LC3B. Плотность LC3B на гранулах снизили в 10 раз. Как изменится скорость обмена p62 между гранулами и раствором?А. У p62 дикого типа вырастет, у p62 без PB1 почти не изменится. (верный вариант)Олигомер удерживается множеством одновременных контактов, поэтому при снижении плотности LC3B число контактов падает, и обмен ускоряется. Вариант без PB1 держится на одиночных контактах и от плотности почти не зависит (Wurzer 2015).Б. У обоих вариантов вырастет примерно в одинаковой степени. (неверный вариант)У p62 без PB1 скорость обмена не менялась даже при снижении плотности LC3B в 10 раз: одновременных контактов у него и так немного (Wurzer 2015).В. У p62 дикого типа не изменится, у p62 без PB1 вырастет. (неверный вариант)Зависимость обратная: именно у p62 дикого типа обмен ускорялся при снижении плотности LC3B, потому что уменьшалось число одновременных контактов олигомера (Wurzer 2015).Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWurzer B., Zaffagnini G., Fracchiolla D. et al. Oligomerization of p62 allows for selection of ubiquitinated cargo and isolation membrane during selective autophagy. eLife. 2015;4:e08941Zaffagnini G., Savova A., Danieli A. et al. p62 filaments capture and present ubiquitinated cargos for autophagy. EMBO J. 2018;37:e98308Sun D., Wu R., Zheng J., Li P., Yu L. Polyubiquitin chain-induced p62 phase separation drives autophagic cargo segregation. Cell Res. 2018;28:405–415Adriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Данные Wurzer 2015 получены в пробирке на рекомбинантных белках и поверхностях, покрытых LC3B или убиквитином, а также в клетках HeLa; Zaffagnini 2018 — в системе из очищенных белков; Sun 2018 — в пробирке и в клетках. Количества контактов на схеме условные, числа молекул в частице взяты из Wurzer 2015.
Рецепторы селективной аутофагии · шаг 4 из 26Рецептор как организатор аутофагосомыРецептор не только связывает груз и белки ATG8, но и привлекает к грузу комплекс ULK1–FIP200. Так построение аутофагосомы начинается у груза, а белки ATG8 усиливают процесс и нужны для слияния с лизосомой.Что показывает схема. Схема показывает цепь событий: рецептор на грузе, комплекс ULK1–FIP200 у груза, активацию ULK1 с образованием PI3P в зоне у мембраны груза, построение фагофора, белки ATG8 на мембране и слияние с лизосомой. Отдельно показаны mTORC1 и ULK1 вне груза. Можно сравнить три состояния: все модули на месте, нет участка связывания FIP200, нет всех шести белков ATG8. Во всех трёх состояниях mTORC1 остаётся активным.Рецептор на грузе связывает FIP200 участком FIR или SKICH; киназа TBK1 облегчает эту связь, и комплекс ULK1–FIP200 накапливается у мембраны груза.Локальное накопление активирует ULK1 у груза (для этого нужна киназная активность ULK1); затем к этому месту приходят компоненты раннего фагофора, и образуется PI3P.У груза строится фагофор; белки ATG8 появляются на его мембране.Через LIR белки ATG8 привлекают ещё рецепторы, а после замыкания аутофагосомы нужны для слияния с лизосомой.Глобальную и локальную регуляцию ULK1 нужно различать. Глобально активность комплекса задаёт состояние клетки: при достатке аминокислот активный mTORC1 фосфорилирует ULK1 (S758 у человека, S757 у мыши) и ATG13 и тормозит запуск; при удалении аминокислот это торможение ослабевает, а роль AMPK описана противоречиво (см. шаг 23 семинара 7). При селективной аутофагии запуск у груза идёт иначе: рецептор не снимает общий тормоз во всей клетке, а собирает комплекс ULK1–FIP200 в одном месте, на мембране груза, и ULK1 активируется там, где комплекс сосредоточен (Adriaenssens 2022; Vargas 2019). Поэтому построение аутофагосомы у повреждённой митохондрии может начаться, пока mTORC1 в клетке активен.Для изученной модели митофагии цепь такова: убиквитинированный груз → OPTN или NDP52 на метке → связь NDP52 с FIP200 через домен SKICH при участии TBK1 → накопление комплекса ULK1–FIP200 у мембраны груза → активация ULK1 → приход компонентов раннего фагофора и образование PI3P (по общей схеме канонической аутофагии: ULK1 фосфорилирует компоненты комплекса VPS34; см. шаг 23 семинара 7) → рост фагофора → белки ATG8 на растущей мембране. Привлечение комплекса идёт ещё до появления ATG8 на мембране и не зависит от связи рецептора с LC3. В клетках HeLa без пяти рецепторов NDP52 и OPTN привлекали ULK1 к митохондриям; при посадке PINK1 на митохондрию замена F178A в LIR OPTN привлечению ULK1 не мешала, поэтому оно идёт выше по цепи, чем связь с LC3 (Lazarou 2015). DFCP1, связывающий PI3P, и WIPI1 появлялись у метки до LC3 (Lazarou 2015).Опыты с принудительной посадкой показывают, что для запуска достаточно собрать комплекс на грузе. В клетках человека с химически индуцируемой димеризацией (CID) к наружной мембране митохондрии или к пероксисоме приводили NDP52, TBK1, ULK1 или короткий пептид, связывающий FIP200. NDP52 без домена SKICH, который по-прежнему связывал LC3 и GABARAP, митофагию не запускал. ULK1, посаженный на митохондрию непосредственно, запускал её и без рецепторов, и без TBK1. Такой запуск шёл в клетках без AMPK; ингибитор mTOR Torin1 сам по себе митофагию не вызывал, а при избытке mTOR, сохранявшем фосфорилирование ULK1 по S757, посаженный на митохондрию пептид, связывающий FIP200, всё равно запускал митофагию. Локально активированный ULK1 при этом остаётся ферментом: при замене T180 на аланин в петле киназы или при ингибировании ULK1/2 митофагия не наступала (Vargas 2019).Часть того, что происходит с самим комплексом, показана in vitro. По данным масс-спектрометрии с водородно-дейтериевым обменом, электронной микроскопии и реконструкции на гигантских однослойных везикулах (GUV), NDP52 аллостерически усиливает связывание FIP200 и комплекса ULK1 с мембраной: подвижнее становится мембраносвязывающий участок суперспирали FIP200 (Shi 2020). В клетках человека при инфекции бактерией Salmonella NDP52 образует с FIP200 и SINTBAD/NAP1 тройной комплекс, и ксенофагия идёт только при наличии обоих партнёров (Ravenhill 2019). Эти работы сделаны на очищенных белках и на другом грузе; для повреждённой митохондрии в клетке аллостерическое действие NDP52 прямо не показано.Без всех шести белков ATG8 аутофагосомы вокруг митохондрий образуются, но не сливаются с лизосомами (Nguyen 2016). Белки ATG8 привлекают к растущей мембране ещё OPTN и NDP52 через LIR и усиливают митофагию; мутации LIR снижали эффективность митофагии (Padman 2019).Граница вывода: данные получены в клетках человека (HeLa, U2OS), в нокаутных линиях и при принудительной посадке белков на митохондрии или пероксисомы; в разных системах вклад LIR оценивают по-разному (Padman 2019; Vargas 2019). Эти данные показывают, что локального сбора комплекса достаточно для запуска при активном mTORC1 в изученных клетках. Они не означают, что аутофагия нечувствительна к mTORC1 во всех тканях: неселективную аутофагию по-прежнему регулируют mTORC1 и AMPK.Типичная ошибка Без белков ATG8 аутофагосома не образуется, а отбор груза обеспечивает только связь LIR с ATG8.В клетках HeLa без всех шести белков ATG8 аутофагосомы образуются, но не сливаются с лизосомами (Nguyen 2016). Привлечение ULK1 рецепторами идёт выше по цепи, чем белки ATG8 (Lazarou 2015; Vargas 2019); ATG8 усиливают привлечение рецепторов (Padman 2019).В клетках HeLa с Parkin нет всех шести белков ATG8. В них запускают митофагию деполяризацией митохондрий. Что произойдёт с аутофагосомами вокруг повреждённых митохондрий?А. Не образуются: без ATG8 комплекс ULK1–FIP200 не привлекается к грузу. (неверный вариант)Привлечение ULK1 рецепторами идёт выше по цепи, чем белки ATG8, и не зависит от связи с LC3 (Lazarou 2015; Vargas 2019).Б. Образуются вокруг митохондрий, но не сливаются с лизосомами. (верный вариант)В клетках без всех шести белков ATG8 аутофагосомы вокруг митохондрий образуются, но слияние с лизосомой нарушено (Nguyen 2016). Они мельче, а начальная скорость образования ниже.В. Образуются и сливаются с лизосомами с прежней скоростью. (неверный вариант)Белки ATG8 нужны для слияния с лизосомой, и без них оно нарушено (Nguyen 2016); привлечение рецепторов к растущей мембране тоже ослаблено (Padman 2019).Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаAdriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Lazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Vargas J.N.S., Wang C., Bunker E. et al. Spatiotemporal control of ULK1 activation by NDP52 and TBK1 during selective autophagy. Mol Cell. 2019;74:347–362Padman B.S., Nguyen T.N., Uoselis L. et al. LC3/GABARAPs drive ubiquitin-independent recruitment of Optineurin and NDP52 to amplify mitophagy. Nat Commun. 2019;10:408Nguyen T.N., Padman B.S., Usher J., Oorschot V., Ramm G., Lazarou M. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome–lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. 2016;215:857–874Ravenhill B.J., Boyle K.B., von Muhlinen N. et al. The cargo receptor NDP52 initiates selective autophagy by recruiting the ULK complex to cytosol-invading bacteria. Mol Cell. 2019;74:320–329Shi X., Chang C., Yokom A.L., Jensen L.E., Hurley J.H. The autophagy adaptor NDP52 and the FIP200 coiled-coil allosterically activate ULK1 complex membrane recruitment. eLife. 2020;9:e59099Клетки HeLa: нокаут пяти рецепторов и митофагия при повреждении митохондрий в клетках с Parkin; мутация F178A в LIR OPTN (Lazarou 2015; Padman 2019), принудительная посадка PINK1 или NDP52 на митохондрию (метод описан в последнем шаге раздела; Lazarou 2015; Vargas 2019), линии без белков ATG8 (Nguyen 2016). Сроки: часы после воздействия. Схема качественная. Принудительная посадка NDP52, TBK1, ULK1 или FIP200-связывающего пептида (CID) на митохондрии и пероксисомы — клетки человека (HeLa; независимость от AMPK проверена в линии U2OS с двойным нокаутом AMPK; Vargas 2019). Аллостерическое действие NDP52 — in vitro, очищенные белки и GUV (Shi 2020). Ксенофагия — клетки человека, Salmonella (Ravenhill 2019).
Рецепторы селективной аутофагии · шаг 5 из 26Какие рецепторы работают на каком грузеОдин и тот же рецептор работает на разных грузах, а один груз обслуживает несколько рецепторов. Какой рецептор ведущий, зависит от груза, метки и типа клеток.Что показывает схема. Схема показывает груз и рецепторы: пять растворимых и два вида мембранных. Для пяти грузов отмечено, какие рецепторы ведущие.Растворимые рецепторы p62, NBR1, TAX1BP1, NDP52 и OPTN узнают убиквитин на грузе, но на разных грузах ведущие разные.Мембранные рецепторы BNIP3, NIX, FUNDC1 на митохондриях и FAM134B в ЭПР встроены в мембрану органеллы и не требуют убиквитинирования её поверхности.Метка может быть и не убиквитином: N-концевой аргинин белка BiP связывается с ZZ-доменом p62.Основными рецепторами для агрегатов названы p62, NBR1 и TAX1BP1, для митохондрий в системе PINK1–Parkin — OPTN и NDP52 (Adriaenssens 2022). У мышей с нарушенной аутофагией p62 нужен для появления убиквитин-положительных включений в гепатоцитах и нейронах (Komatsu 2007).В клетках HeLa с Parkin и без пяти растворимых рецепторов митофагия останавливалась; восстанавливали её OPTN и NDP52, TAX1BP1 слабее. p62 и NBR1 приходили к митохондриям, но митофагию не восстанавливали, а нокаут одного NDP52 или одного OPTN дефекта не вызывал (Lazarou 2015).Мембранные рецепторы BNIP3, NIX и FUNDC1 описаны при гипоксии, а BNIP3 и NIX — и при созревании эритроцитов; при потере железа вклад отдельных рецепторов не установлен. BNIP3 и NIX включаются димеризацией, FUNDC1 — дефосфорилированием (Adriaenssens 2022). FAM134B — рецептор ЭПР: при его подавлении ЭПР расширяется, при избытке фрагментируется и разрушается в лизосоме (Khaminets 2015).BiP с N-концевым аргинином связывался с ZZ-доменом p62, вызывал олигомеризацию p62, усиливал его связь с LC3 и разрушался вместе с p62 (Cha-Molstad 2015).Граница вывода: набор рецепторов зависит от типа клеток; NDP52 не экспрессируется в нейронах, и там OPTN особенно важен (Adriaenssens 2022).Типичная ошибка Любой рецептор, пришедший к грузу, может заменить другой.Приход рецептора к грузу не означает, что он ведёт аутофагию: p62 и NBR1 приходили к повреждённым митохондриям, но митофагию не восстанавливали (Lazarou 2015). Взаимозаменяемость зависит от груза и типа клеток (Adriaenssens 2022).В клетках HeLa с Parkin нет пяти растворимых рецепторов, и митофагия при повреждении митохондрий остановлена. В клетки по одному возвращают рецептор. Возвращение какого из перечисленных рецепторов восстановит митофагию?А. p62: связывает убиквитин на повреждённых митохондриях. (неверный вариант)p62 приходил к митохондриям, но митофагию не восстанавливал (Lazarou 2015): приход к грузу ещё не означает запуск аутофагосомы.Б. NBR1: связывает убиквитин и p62 на повреждённых митохондриях. (неверный вариант)NBR1, как и p62, приходил к митохондриям, но митофагию не восстанавливал (Lazarou 2015).В. OPTN: связывает убиквитин на повреждённых митохондриях. (верный вариант)OPTN и NDP52 восстанавливали митофагию, TAX1BP1 — слабее; мутанты OPTN без убиквитин-связывающего домена митофагию не восстанавливали (Lazarou 2015). OPTN, кроме того, привлекает ULK1.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаAdriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Lazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Komatsu M., Waguri S., Koike M. et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 2007;131:1149–1163Khaminets A., Heinrich T., Mari M. et al. Regulation of endoplasmic reticulum turnover by selective autophagy. Nature. 2015;522:354–358Cha-Molstad H., Sung K.S., Hwang J. et al. Amino-terminal arginylation targets endoplasmic reticulum chaperone BiP for autophagy through p62 binding. Nat Cell Biol. 2015;17:917–929Перечень основных рецепторов — по обзору Adriaenssens 2022. Данные для митофагии получены в клетках HeLa с Parkin после повреждения митохондрий (Lazarou 2015); для FAM134B — в клетках человека и у мышей (Khaminets 2015); для BiP — в клетках человека (Cha-Molstad 2015); для p62 — у мышей с нарушенной аутофагией (Komatsu 2007). Оценки «ведущий» и «слабее» качественные.
Рецепторы селективной аутофагии · шаг 6 из 26Как показать, что рецептор связывает груз и ATG8Связывание рецептора с грузом и с белком ATG8 проверяют на уровне белков, клеток и очищенных компонентов. Каждый метод отвечает на свой вопрос и имеет свою границу вывода.Что показывает схема. Схема описывает пять методов: иммунопреципитацию, колокализацию, реконструкцию из очищенных компонентов, возврат рецептора в клетки без рецепторов и принудительную посадку на органеллу. Для каждого метода указаны: что измеряют, как, контроль и граница вывода.Совместная иммунопреципитация и pull-down показывают связывание белков в лизате или в пробирке, колокализация — положение в клетке.Возврат рецептора или его мутанта в клетки без рецепторов проверяет функцию; реконструкция из очищенных компонентов и принудительная посадка на органеллу проверяют достаточность.Контроли — мутация LIR, мутация UBD и клетки без рецептора; связывание не равно работе рецептора на грузе.Связывание проверяют так: белок-наживку на гранулах инкубируют с лизатом клеток или с очищенным рецептором, промывают гранулы и выявляют связанный белок иммуноблотом. Эндогенный p62 в клетках подавляют, чтобы анализировать только вариант с мутацией, а специфичность проверяют мутацией LIR или UBD и гранулами с одним GST или GFP (Wurzer 2015).Промывка сохраняет лишь контакты, которые не успевают распасться, поэтому слабые обратимые взаимодействия этим методом выявляются плохо (Wurzer 2015). Колокализация показывает общее положение сигналов, но не контакт: к митохондриям приходили все пять рецепторов, а митофагию восстанавливали не все (Lazarou 2015).Функцию проверяют в клетках без рецепторов: возвращают целый рецептор или его мутанты и измеряют митофагию (Lazarou 2015). Достаточность проверяют принудительной посадкой рецептора на органеллу (Vargas 2019) и в реконструированной системе из очищенных белков (Zaffagnini 2018).Граница вывода: различия между цепями K63 и K48 во многом получены при сверхэкспрессии и in vitro (Adriaenssens 2022); связывание в пробирке не показывает работу рецептора в клетке без проверки функции.Типичная ошибка Если белки связываются при совместной иммунопреципитации, значит, рецептор ведёт аутофагию этого груза.Связывание показывает физическое взаимодействие, но не функцию: p62 и NBR1 приходили к повреждённым митохондриям, но митофагию не восстанавливали (Lazarou 2015). Функцию проверяют возвратом рецептора и его мутантов в клетки без рецепторов.В клетках HeLa p62 без домена PB1 после иммунопреципитации GFP-LC3B дал на блоте едва заметную полосу, хотя его LIR цел. Какое объяснение согласуется с этим результатом?А. Одиночный LIR связывает LC3B слабо и обратимо, поэтому связь частично теряется при промывке гранул. (верный вариант)Олигомеризация не меняет сродство отдельного LIR, но снижает скорость отсоединения. По интерпретации авторов, у варианта без PB1 слабые контакты частично теряются при промывке, и взаимодействие видно лишь при долгой экспозиции блота (Wurzer 2015).Б. LIR цел, поэтому связь с LC3B так же прочна, как у белка дикого типа, а слабая полоса случайна. (неверный вариант)Цельный LIR не делает связь такой же: у p62 дикого типа взаимодействие с LC3B сильнее, чем у варианта без PB1 (Wurzer 2015).В. Связи p62 без PB1 с LC3B нет совсем, так как для связи с LC3B необходим домен PB1, а не LIR. (неверный вариант)Связь есть: полоса p62 без PB1 становилась заметной при долгой экспозиции блота (Wurzer 2015). Слабая полоса не означает полного отсутствия связи.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWurzer B., Zaffagnini G., Fracchiolla D. et al. Oligomerization of p62 allows for selection of ubiquitinated cargo and isolation membrane during selective autophagy. eLife. 2015;4:e08941Zaffagnini G., Savova A., Danieli A. et al. p62 filaments capture and present ubiquitinated cargos for autophagy. EMBO J. 2018;37:e98308Lazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Vargas J.N.S., Wang C., Bunker E. et al. Spatiotemporal control of ULK1 activation by NDP52 and TBK1 during selective autophagy. Mol Cell. 2019;74:347–362Adriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Описаны методы иммунопреципитации, колокализации, реконструкции, возврата в нокаутные клетки и принудительной посадки (клетки HeLa, очищенные белки, гигантские везикулы). Пиктограммы условные: это не данные экспериментов.
PINK1 и Parkin · шаг 7 из 26Как PINK1 служит датчиком импорта в митохондриюPINK1 постоянно синтезируется в цитозоле и импортируется в митохондрию. Пока импорт идёт, белок разрезается и быстро разрушается, поэтому в здоровой митохондрии PINK1 почти нет.Предшественник PINK1 проходит через TOM и TIM23; движущей силой служит потенциал на внутренней мембране.Протеаза PARL разрезает PINK1 во внутренней мембране перед F104, и фрагмент выходит в цитозоль.N-дегрон нового N-конца узнают UBR1, UBR2 и UBR4, после чего протеасома разрушает фрагмент.PINK1 синтезируется в цитозоле постоянно. На его N-конце находится митохондриальная сигнальная последовательность, поэтому предшественник направляется к транслоказе внешней мембраны TOM, а затем к транслоказе внутренней мембраны TIM17/TIM23. Положительно заряженный N-конец втягивается в митохондрию потенциалом на внутренней мембране: основной движущей силой служит отрицательный заряд со стороны матрикса.Пока потенциал сохранён, импорт доходит до внутренней мембраны. Протеаза матрикса MPP снимает сигнальную последовательность, а ромбоидная протеаза PARL разрезает PINK1 в трансмембранном сегменте непосредственно перед F104. Образовавшийся фрагмент выходит в цитозоль. Его новый N-концевой остаток фенилаланина служит N-дегроном: фрагмент узнают убиквитинлигазы UBR1, UBR2 и UBR4, и его разрушает протеасома (Yamano & Youle 2013).Поэтому PINK1 в здоровой митохондрии очень мало. Период её полужизни составляет около 27 мин, а в клетке HEK293 оценено около 490 молекул, то есть около трёх на 10 000 комплексов TOM (Narendra & Youle 2024). Если PARL отсутствует, PINK1 не разрезается, не разрушается и остаётся внутри митохондрии в форме около 60 кДа (Jin 2010).Схема качественная. Числа получены на культивируемых клетках человека; для других клеток и тканей они могут отличаться. Импорт PINK1 зависит от потенциала сильнее, чем от самого TIM23 (Sekine 2019), поэтому «потенциал» и «работа TIM23» не равнозначны.Типичная ошибка PINK1 появляется на митохондрии только при повреждении: повреждение запускает её синтез.PINK1 синтезируется постоянно. Повреждение, снижающее потенциал, не запускает синтез, а останавливает импорт и разрез PARL, поэтому PINK1 накапливается.Потенциал на внутренней мембране сохранён, и PINK1 на митохондриях почти не обнаруживается. Из клеток убрали протеазу PARL. Что произойдёт с PINK1?А. PINK1 накопится на внешней мембране, как после потери потенциала. (неверный вариант)Накопление на внешней мембране связано с остановкой импорта. Здесь импорт идёт, поэтому PINK1 проходит к внутренней мембране и остаётся внутри.Б. PINK1 не будет разрезаться и разрушаться и останется внутри митохондрии. (верный вариант)Без PARL нет разреза перед F104, нет фрагмента с N-дегроном, и PINK1 стабилизируется внутри митохондрии в форме около 60 кДа (Jin 2010).В. PINK1 исчезнет совсем: без PARL протеасома разрушает её быстрее. (неверный вариант)Протеасома разрушает фрагмент, который образовал PARL. Без разреза нет N-дегрона, и разрушение, наоборот, подавлено.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаYamano K., Youle R.J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 2013;9:1758–1769Jin S.M., Lazarou M., Wang C., Kane L.A., Narendra D.P., Youle R.J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. J Cell Biol. 2010;191:933–942Sekine S., Wang C., Sideris D.P., Bunker E., Zhang Z., Youle R.J. Reciprocal roles of Tom7 and OMA1 during mitochondrial import and activation of PINK1. Mol Cell. 2019;73:1028–1043Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Схема механизма, качественные состояния; размеры и расстояния не в масштабе. Клетки человека (HeLa, HEK293) и мыши. Yamano & Youle 2013, Jin 2010 и Sekine 2019 — прочитаны рефераты; период полужизни 27 мин и оценка 490 молекул (клетки HEK293) взяты из обзора Narendra & Youle 2024 (полный текст); порядок MPP, затем PARL и положение разреза перед F104 — по тому же обзору. Нумерация остатков дана для PINK1 человека.
PINK1 и Parkin · шаг 8 из 26Что происходит с PINK1, когда импорт нарушенЕсли на внутренней мембране нет потенциала, PINK1 не доходит до PARL и остаётся на внешней мембране. Там она образует димеры, автофосфорилируется и становится киназой убиквитина.При утрате потенциала N-конец PINK1 остаётся продетым через TOM и удержанным у TIM17/TIM23, а киназный домен — в цитозоле.Молекулы PINK1 на димере TOM фосфорилируют друг друга по S228 и S402 и активируются.Активная PINK1 фосфорилирует убиквитин по S65; после отмывки CCCP импорт возобновляется, и PINK1 быстро исчезает.Потеря потенциала, например при добавлении протонофора CCCP, останавливает втягивание N-конца PINK1. Белок не доходит до PARL, не разрезается и не получает N-дегрон, поэтому разрушение прекращается. Полноразмерная форма PINK1 (около 63 кДа) накапливается на внешней мембране: в клетках HeLa её рост заметен через 30 мин и продолжается не менее 3 ч (Narendra 2010).Остановленный PINK1 образует с TOM комплекс около 700 кДа (Lazarou 2012). Его N-конец продет через пору TOM, а киназный домен обращён в цитозоль. Молекулы PINK1 образуют димеры и фосфорилируют друг друга (транс-автофосфорилирование) по S228 и S402; замена этих остатков на аланин лишает PINK1 способности привлекать Parkin (Okatsu 2012). Активная киназа фосфорилирует по S65 убиквитин на белках внешней мембраны (Koyano 2014).Накопление PINK1 начинается через несколько минут после потери потенциала, а активация Parkin запаздывает примерно на 30 мин. Авторы обзора предполагают, что для активации на одном димере TOM должны оказаться две молекулы PINK1, а в норме их около трёх на 10 000 комплексов; предварительное повышение содержания PINK1 эту задержку устраняет (Narendra & Youle 2024). Это гипотеза о механизме.Состояние обратимо: после отмывки CCCP в клетках HeLa полноразмерный PINK1 резко убывает в течение 30 мин, потому что расщепление возобновляется (Narendra 2010). Сохраняет ли митохондрия «память» о недавней деполяризации, не известно; гистерезис — гипотеза, данных для вывода недостаточно.Типичная ошибка PINK1 сама распознаёт повреждение митохондрии, например окисленные белки.PINK1 служит датчиком собственного импорта: при потере потенциала она остаётся на внешней мембране. Путь запускает прежде всего потеря потенциала; в обзоре упомянуты и агрегированные белки, но этот вариант на схеме не показан.Клетки HeLa 3 ч выдерживали с CCCP: полноразмерный PINK1 накоплен на митохондриях. Затем CCCP отмыли. Как изменится количество полноразмерного PINK1 через 30 мин?А. Останется высоким: накопленный PINK1 стабилен и не разрезается даже при восстановленном потенциале. (неверный вариант)Стабильность PINK1 зависит от потенциала. После отмывки импорт и расщепление возобновляются, и содержание PINK1 резко убывает (Narendra 2010).Б. Снизится только потому, что перестанет синтезироваться новый PINK1. (неверный вариант)Остановка синтеза уже накопленный PINK1 не убирает: циклогексимид его уровень почти не менял (Narendra 2010). Убыль даёт возобновившееся расщепление.В. Резко снизится: импорт и расщепление PINK1 возобновились. (верный вариант)Потенциал восстановился, PINK1 снова импортируется, PARL его разрезает, и фрагмент разрушается. Так показана обратимость состояния.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаNarendra D.P., Jin S.M., Tanaka A. et al. PINK1 is selectively stabilized on impaired mitochondria to activate Parkin. PLoS Biol. 2010;8:e1000298Lazarou M., Jin S.M., Kane L.A., Youle R.J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Dev Cell. 2012;22:320–333Okatsu K., Oka T., Iguchi M. et al. PINK1 autophosphorylation upon membrane potential dissipation is essential for Parkin recruitment to damaged mitochondria. Nat Commun. 2012;3:1016Koyano F., Okatsu K., Kosako H. et al. Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin. Nature. 2014;510:162–166Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Схема механизма, качественные состояния; «первые минуты» и «30 мин и дольше» взяты из обзора Narendra & Youle 2024 (полный текст), точные сроки зависят от клеток и условий. Narendra 2010 — клетки HeLa, CCCP 3 ч и отмывка (полный текст); Lazarou 2012 — клетки HeLa, комплекс около 700 кДа (реферат); Okatsu 2012 — клетки HeLa, замены S228A и S402A (реферат); Koyano 2014 — клетки HeLa, in vitro (реферат). Гипотеза о подсчёте молекул PINK1 принадлежит авторам обзора.
PINK1 и Parkin · шаг 9 из 26Как pS65-убиквитин и PINK1 включают ParkinВ цитозоле Parkin находится в аутоингибированном состоянии. Его включают два события, которые обеспечивает PINK1: фосфорилирование убиквитина на внешней мембране и фосфорилирование самого Parkin.pS65-убиквитин связывается с RING1 Parkin и освобождает его домен UBL.PINK1 фосфорилирует S65 в освобождённом UBL; фосфо-UBL связывается с RING0 и открывает RING2 с каталитическим C431.Активный Parkin присоединяет убиквитин к белкам внешней мембраны, новые цепи фосфорилирует PINK1: возникает положительная обратная связь.Без PINK1 Parkin находится в закрытой конформации. Домены UBL, RING0 и REP загораживают сайт связывания E2 и активный центр с остатком C431 в домене RING2, поэтому активность Parkin in vitro низка (Narendra & Youle 2024). Сама по себе близость к митохондрии Parkin не включает.Первый шаг — убиквитин. PINK1 фосфорилирует по S65 убиквитин на белках внешней мембраны. pS65-убиквитин связывается с Parkin в консервативном фосфатном кармане; связывание выпрямляет спираль в домене RING1, и UBL высвобождается из ядра белка (Wauer 2015). Одновременно освобождается REP, и сайт связывания E2 открывается (Narendra & Youle 2024). Такой убиквитин активирует in vitro даже Parkin без домена UBL, а немодифицированный убиквитин — нет (Kazlauskaite 2014).Второй шаг — сам Parkin. Высвобождение UBL усиливает его фосфорилирование PINK1 (Wauer 2015). Фосфо-UBL связывается с доменом RING0 и высвобождает каталитический RING2 (Gladkova 2018). По данным in vitro, фосфорилирование S65 в UBL подготавливает Parkin к активации убиквитином (Kazlauskaite 2014).Активный Parkin присоединяет убиквитин в основном к белкам внешней мембраны. Эти цепи тоже фосфорилирует PINK1, и новый pS65-убиквитин привлекает и активирует новые молекулы Parkin: обратная связь ускоряет покрытие мембраны меткой (Ordureau 2014). Для этого нужны PINK1 и убиквитинированные белки на той же мембране, поэтому активация остаётся на повреждённой митохондрии и не затрагивает соседние здоровые (Narendra & Youle 2024).Типичная ошибка Parkin активен с того момента, как пришёл на митохондрию.Приход и активация — разные события. pS65-убиквитин привлекает Parkin и освобождает UBL и REP, но активный центр остаётся закрытым, пока фосфо-UBL не свяжется с RING0 и не высвободит RING2 (Gladkova 2018). Для полного включения Parkin с доменом UBL нужны оба события.К очищенному Parkin без домена UBL (в нём нет S65) в пробирке с E1, E2 и ATP добавили убиквитин, фосфорилированный по S65, вместо обычного убиквитина. Как изменится убиквитинлигазная активность Parkin?А. Возрастёт: pS65-убиквитин связывается с RING1 и включает Parkin без участия UBL. (верный вариант)pS65-убиквитин активирует Parkin и без UBL, а немодифицированный убиквитин — нет (Kazlauskaite 2014): связывание в RING1 само ослабляет автоингибирование.Б. Не изменится: в таком Parkin нет S65 в UBL, поэтому включить его нечем. (неверный вариант)Фосфорилирование UBL усиливает активацию, но не единственный путь. pS65-убиквитин действует через RING1 независимо от UBL.В. Возрастёт так же, как при добавлении немодифицированного убиквитина. (неверный вариант)Обычный убиквитин Parkin без UBL не активирует. Нужен фосфат на S65 убиквитина.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаKazlauskaite A., Kondapalli C., Gourlay R. et al. Parkin is activated by PINK1-dependent phosphorylation of ubiquitin at Ser65. Biochem J. 2014;460:127–139Wauer T., Simicek M., Schubert A., Komander D. Mechanism of phospho-ubiquitin-induced PARKIN activation. Nature. 2015;524:370–374Gladkova C., Maslen S.L., Skehel J.M., Komander D. Mechanism of parkin activation by PINK1. Nature. 2018;559:410–414Ordureau A., Sarraf S.A., Duda D.M. et al. Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis. Mol Cell. 2014;56:360–375Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Схема механизма, качественные состояния; домены показаны условно, без структуры. Kazlauskaite 2014 — очищенные белки in vitro и клетки HEK293 (реферат); Wauer 2015 — кристаллическая структура Parkin насекомого Pediculus humanus с pS65-убиквитином (реферат); Gladkova 2018 — обмен водорода на дейтерий и структура Parkin человека (реферат); Ordureau 2014 — клетки HeLa с Parkin, количественная протеомика. Обзор Narendra & Youle 2024 (полный текст) — общая схема. Нумерация S65 и C431 дана для Parkin человека.
PINK1 и Parkin · шаг 10 из 26Что Parkin метит и как метка превращается в сигналАктивный Parkin метит убиквитином много белков внешней мембраны. Часть из них разрушается, а остальные остаются на мембране как метка, к которой присоединяются рецепторы аутофагии.Parkin присоединяет цепи убиквитина к VDAC1/2, MFN1/2, RHOT1/2 и другим белкам внешней мембраны; часть цепей фосфорилирует PINK1.p97 извлекает MFN1/2 и RHOT1/2, и их разрушает протеасома; деубиквитиназа USP30 снимает метку.OPTN и NDP52 связывают цепи с pS65-убиквитином и привлекают ULK1 и TBK1: аутофагосома начинает строиться у самой метки.Активный Parkin убиквитинирует преимущественно белки внешней мембраны. В нейронах наиболее сильно помечены VDAC1 и VDAC2, MFN1 и MFN2, RHOT1 и RHOT2, CISD1. Занятость сайтов при этом мала: для любого сайта VDAC1 и VDAC2 убиквитинировано менее 2 % молекул (Narendra & Youle 2024).Часть субстратов убиквитинируется предпочтительно и удаляется. MFN1/2 и RHOT1/2 извлекает из мембраны p97 с кофакторами UFD1–NPL4, а протеасома их разрушает, даже если митофагия заблокирована. В клетках HeLa с избытком Parkin ингибиторы протеасомы подавляли убыль MFN1, MFN2, VDAC1 и TOMM20 (Tanaka 2010; Chan 2011). В нейронах с эндогенным Parkin белки VDAC1 и VDAC2, как правило, не удаляются из мембраны, а служат меткой (Narendra & Youle 2024). Поэтому потеря одного белка внешней мембраны не означает удаления митохондрии.Часть белков, например VDAC1/2, остаётся на мембране как метка. Цепи с pS65-убиквитином связывают рецепторы OPTN и NDP52; они привлекают ULK1, DFCP1 и WIPI1 к участкам рядом с митохондрией ещё до присоединения LC3 (Lazarou 2015). В клетках без пяти рецепторов Parkin приходит на митохондрии, а MFN1 и TOMM20 разрушаются протеасомой, но митофагии нет.Деубиквитиназа USP30 во внешней мембране снимает убиквитин, поставленный Parkin: при избытке USP30 метка исчезает и митофагия подавлена, а при снижении её активности в нейронах деградация митохондрий усиливается (Bingol 2014). Вывод о составе метки основан в основном на клетках с избыточным Parkin.Типичная ошибка Parkin метит один белок, поэтому достаточно разрушения MFN2.Parkin метит множество белков внешней мембраны. Часть из них, прежде всего MFN1/2 и RHOT1/2, извлекает p97 и разрушает протеасома; многие остаются на мембране как метка для рецепторов. Убыль MFN2 показывает работу Parkin и протеасомы, но не удаление митохондрии.В клетках с активным Parkin на повреждённых митохондриях избыточно экспрессировали деубиквитиназу USP30. Как изменится убиквитин, поставленный Parkin на внешней мембране?А. Станет больше: USP30 присоединяет убиквитин к белкам внешней мембраны. (неверный вариант)USP30 — деубиквитиназа: она снимает убиквитин, а не присоединяет. Цепи ставит Parkin.Б. Не изменится: USP30 снимает убиквитин только внутри матрикса. (неверный вариант)USP30 закреплена во внешней мембране и действует на белки, которые метит Parkin (Bingol 2014).В. Станет меньше: USP30 снимает убиквитин, поставленный Parkin. (верный вариант)При избытке USP30 убиквитин на повреждённых митохондриях исчезает, и Parkin хуже запускает митофагию (Bingol 2014).Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаChan N.C., Salazar A.M., Pham A.H. et al. Broad activation of the ubiquitin-proteasome system by Parkin is critical for mitophagy. Hum Mol Genet. 2011;20:1726–1737Tanaka A., Cleland M.M., Xu S. et al. Proteasome and p97 mediate mitophagy and degradation of mitofusins induced by Parkin. J Cell Biol. 2010;191:1367–1380Lazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Bingol B., Tea J.S., Phu L. et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 2014;510:370–375Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Схема механизма, качественные состояния. Chan 2011 и Tanaka 2010 — клетки HeLa с Parkin, CCCP, ингибиторы протеасомы (рефераты и фрагменты полного текста); Lazarou 2015 — клетки HeLa, нокаут пяти рецепторов, олигомицин с антимицином A (полный текст); Bingol 2014 — клетки, нейроны крысы и дрозофила, избыточная экспрессия и нокдаун USP30 (реферат). Занятость сайтов VDAC — по обзору Narendra & Youle 2024 (культивируемые нейроны с эндогенным Parkin). Роль TBK1 показана схематично.
PINK1 и Parkin · шаг 11 из 26Другие пути митофагии и значение PINK1–ParkinPINK1–Parkin — самый изученный, но не единственный способ запустить митофагию. Другие воздействия включают рецепторы, которым убиквитин не нужен, или иной путь, а PINK1 нужна не везде.При гипоксии и созревании эритроцитов митохондрии удаляют рецепторы BNIP3 и NIX во внешней мембране; убиквитин и PINK1–Parkin не требуются.Хелатор железа деферипрон запускает митофагию, не зависящую от PINK1 и Parkin.В большинстве исследованных тканей мыши базальная митофагия идёт без PINK1; PINK1 и Parkin вносят вклад при стрессе и в части тканей.Рецепторы BNIP3 и NIX (BNIP3L) расположены во внешней мембране и сами несут мотив LIR, поэтому связывают белки ATG8 без убиквитина. При гипоксии их образование усиливает HIF1A, а NIX необходим для удаления митохондрий при созревании эритроидных клеток; PINK1 и Parkin для этого не нужны (Terešak 2022).Другой пример — потеря железа. В клетках U2OS и SH-SY5Y деферипрон за 24 ч вызывал митофагию: митохондриальный белок внешней мембраны доставлялся в кислые лизосомы. Подавление PINK1 эффект не меняло, а сама PINK1 при этом не стабилизировалась; подавление BNIP3 эффект тоже не меняло (Allen 2013). Рецептор, который работает в этом случае, остаётся неизвестным.Третий путь — митохондриальные пузырьки. При окислительном стрессе от митохондрий отпочковываются пузырьки с отобранным грузом, которые затем доставляются в лизосомы; для них нужны PINK1 и Parkin, но путь отличается от канонической митофагии (McLelland 2014).У мышей с нокаутом Pink1 базальная митофагия в большинстве исследованных тканей, в том числе с высоким расходом энергии, сохранялась; исключением были островки поджелудочной железы, где при потере PINK1 митофагия, напротив, повышалась (McWilliams 2018). По обзору Narendra & Youle 2024, в печени часть базальной митофагии, вероятно, зависит от BNIP3 и NIX, в скелетной мышце и сердце PINK1–Parkin, по-видимому, вносят вклад, а в мозге преобладающий путь не установлен. Значение PINK1–Parkin зависит от ткани и воздействия. Потеря обоих аллелей PINK1 или PRKN вызывает рецессивную форму болезни Паркинсона с ранним началом (Narendra & Youle 2024).Типичная ошибка PINK1–Parkin — единственный путь митофагии.Есть пути, не зависящие от PINK1 и Parkin: рецепторы BNIP3 и NIX при гипоксии и созревании эритроцитов, ответ на потерю железа. В исследованных тканях мыши базальная митофагия часто идёт без PINK1. Значение PINK1–Parkin зависит от ткани и воздействия.В клетках U2OS подавили PINK1 с помощью siRNA, затем добавили хелатор железа деферипрон на 24 ч. Как изменится доставка митохондриального белка внешней мембраны в лизосомы по сравнению с клетками без деферипрона?А. Возрастёт: потеря железа запускает митофагию, для которой PINK1 не нужна. (верный вариант)Деферипрон вызывал митофагию в клетках U2OS и SH-SY5Y, а подавление PINK1 эффект не меняло (Allen 2013).Б. Не изменится: без PINK1 никакое воздействие не запускает митофагию. (неверный вариант)Это неверно: помимо PINK1–Parkin есть пути, которые включаются гипоксией или потерей железа и не требуют PINK1.В. Снизится: хелатор железа блокирует доставку митохондрий в лизосомы. (неверный вариант)Деферипрон не блокирует доставку, а запускает митофагию, не зависящую от PINK1.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаTerešak P., Lapao A., Subic N., Boya P., Elazar Z., Simonsen A. Regulation of PRKN-independent mitophagy. Autophagy. 2022;18:24–39Allen G.F.G., Toth R., James J., Ganley I.G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Rep. 2013;14:1127–1135McLelland G.-L., Soubannier V., Chen C.X., McBride H.M., Fon E.A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. EMBO J. 2014;33:282–295McWilliams T.G., Prescott A.R., Montava-Garriga L. et al. Basal mitophagy occurs independently of PINK1 in mouse tissues of high metabolic demand. Cell Metab. 2018;27:439–449Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Схема маршрутов, качественные состояния. Terešak 2022 и Narendra & Youle 2024 — обзоры (полный текст); Allen 2013 — клетки U2OS и SH-SY5Y, деферипрон 24 ч, подавление PINK1 и BNIP3 siRNA, репортёр на внешней мембране (прочитан текст статьи); McLelland 2014 — клетки HeLa, антимицин A (реферат); McWilliams 2018 — мыши с репортёром mito-QC, ткани и первичные клетки (прочитан текст статьи). Различия между тканями приведены по обзору Narendra & Youle 2024, а не по собственным данным.
PINK1 и Parkin · шаг 12 из 26Как измерить митофагиюМитофагию измеряют по доставке митохондриального материала в кислые лизосомы и по исчезновению митохондриальных белков. Ни один показатель сам по себе не подтверждает митофагию, поэтому их сочетают и проверяют контролями.Репортёры mt-Keima и mito-QC меняют сигнал в кислой среде лизосомы и показывают доставку митохондрий.Иммуноблот сравнивает белок внешней мембраны, который может разрушать протеасома, и белок внутренней мембраны.Контроли — клетки без PINK1, без рецепторов или без аутофагии, бафиломицин A1 и сравнение воздействий по срокам.Репортёр mt-Keima направлен в матрикс митохондрии. Он устойчив к кислой среде, а цвет его сигнала зависит от pH, поэтому митохондрии в цитозоле и в лизосоме различаются (Katayama 2011). mito-QC — тандем mCherry–GFP на внешней мембране: в лизосоме кислая среда гасит GFP, а mCherry остаётся, и возникают красные точки без зелёного (McWilliams 2016).На иммуноблоте сравнивают белок внешней мембраны и белок внутренней мембраны. После деполяризации в клетках HeLa с Parkin белки внешней мембраны MFN1 и TOMM20 разрушает протеасома: в клетках без пяти рецепторов они исчезают так же, как в клетках дикого типа, а белок внутренней мембраны COX II сохраняется, потому что митофагии нет (Lazarou 2015). Работу самого пути проверяют по накоплению полноразмерной PINK1 и по появлению pS65-убиквитина.У репортёров есть границы. Доставка в кислый отсек происходит не только при митофагии, но и при неселективной аутофагии и гетерофагии, поэтому нужны блоки аутофагии (Narendra & Youle 2024). Бафиломицин A1 повышает pH лизосом и убирает красный сигнал mCherry–GFP-репортёра (Allen 2013). Keima несовместим с фиксацией и его измеряют в живых клетках и тканях, а сигнал mito-QC при фиксации сохраняется. Кроме того, Keima выявляет и доставку в лизосомы, не зависящую от ATG5 (Katayama 2011), поэтому блок одного звена аутофагии не исключает остаточный сигнал.Типичная ошибка Если белок внешней мембраны исчез, значит, митохондрию удалила митофагия.Белки внешней мембраны, помеченные Parkin, разрушает протеасома, в том числе при заблокированной митофагии. Митофагию подтверждают белок внутренней мембраны или матрикса, репортёр и контроль с блокадой аутофагии.В клетках HeLa с Parkin после деполяризации исчезают белок внешней мембраны TOMM20 и белок внутренней мембраны COX II. Взяли такие же клетки без пяти рецепторов аутофагии (митофагия в них не идёт). Что покажет иммуноблот?А. TOMM20 и COX II сохранятся: без митофагии митохондриальные белки не разрушаются. (неверный вариант)Белки внешней мембраны, помеченные Parkin, разрушает и протеасома, поэтому TOMM20 убывает и без митофагии (Lazarou 2015).Б. TOMM20 убудет, как в клетках дикого типа, а COX II сохранится. (верный вариант)TOMM20 разрушает протеасома, COX II находится внутри митохондрии, поэтому его убыль служит показателем митофагии (Lazarou 2015).В. TOMM20 и COX II убудут так же, как в клетках дикого типа, их разрушает протеасома. (неверный вариант)Протеасома разрушает белки внешней мембраны, но до COX II во внутренней мембране не добирается: его убыль указывает на митофагию.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаKatayama H., Kogure T., Mizushima N., Yoshimori T., Miyawaki A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 2011;18:1042–1052McWilliams T.G., Prescott A.R., Allen G.F.G. et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 2016;214:333–345Lazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Allen G.F.G., Toth R., James J., Ganley I.G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Rep. 2013;14:1127–1135Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Схема метода, условные пиктограммы: число точек, интенсивность полос и цвета не являются данными эксперимента. Katayama 2011 — культивируемые клетки, Keima (реферат); McWilliams 2016 — репортёр mito-QC в клетках и тканях мыши (прочитан текст статьи); Lazarou 2015 — клетки HeLa с Parkin, нокаут пяти рецепторов, олигомицин с антимицином A (полный текст); Allen 2013 — клетки U2OS и SH-SY5Y, репортёр mCherry–GFP на внешней мембране, бафиломицин A1 (прочитан текст статьи). Narendra & Youle 2024 — обзор (полный текст). Для mt-Keima контроль блокадой лизосомного закисления в первоисточниках раздела отдельно не проверялся; приведён нокаут ATG5 по обзору Narendra & Youle 2024.
Повреждение лизосомы · шаг 13 из 26Чем и как повреждается лизосомная мембранаПроницаемость лизосомной мембраны — потеря мембраной барьерной функции: из кислой лизосомы с десятками гидролаз выходят протоны, ионы Ca²⁺ и ферменты. Повреждение бывает малым и крупным, и от его размера зависит, какие сигналы возникнут.Детергент-подобные вещества и продукты окисления липидов нарушают упаковку липидов лизосомной мембраны; кристаллы и агрегаты, как предполагают, разрывают её механически, а бактерии образуют поры.LLOMe проникает в лизосому, и катепсин C превращает его в полилейцины, которые и нарушают мембрану.Малое повреждение пропускает протоны и Ca²⁺; при крупном наружу выходят катепсины, а белки цитозоля получают доступ к гликанам внутренней стороны мембраны.Лизосома окружена одной мембраной. Внутри pH около 4,5–5 и более 50 гидролаз, а внутренняя поверхность мембраны выстлана гликанами, которые защищают её от ферментов. Концентрация Ca²⁺ в просвете высока, в цитозоле мала.Проницаемость растёт тремя путями, которые зависят от вида и силы воздействия: диффузией через плохо упакованный бислой, временными тороидальными порами и осмотическими разрывами. Так действуют вещества с детергентными свойствами и продукты перекисного окисления липидов (лизосомы богаты железом, и в них легко образуются активные формы кислорода). Для фагоцитированных кристаллов и нейротоксичных агрегатов (тау, α-синуклеин, β-амилоид) предполагают механический разрыв мембраны; наночастицы кремнезёма, напротив, действуют через перекисное окисление липидов. Бактерии образуют поры или разрывают мембрану.В эксперименте мембрану повреждают LLOMe. Он пассивно проникает в лизосому, протонируется и остаётся в ней; катепсин C конденсирует его в полилейцины со средней длиной около шести остатков. Поэтому чувствительность клеток к LLOMe зависит от уровня катепсина C.Сначала через слабо упакованную мембрану проходят вода и протоны: pH просвета растёт и мембранный потенциал теряется, а это косвенно активирует каналы лизосомы, через которые выходит Ca²⁺ (Ca²⁺ выходит и через временные поры). Крупный разрыв или осмотический взрыв выпускает катепсины, а в просвет проникают сахар-связывающие белки цитозоля. Клетки способны пережить ограниченное повреждение, но утечка протонов и гидролаз при тяжёлом повреждении может запустить гибель клетки или воспаление. Как цитозольные белки получают доступ к гликанам при повреждении без разрыва, неизвестно.Типичная ошибка LLOMe повреждает любую мембрану одинаково, потому что сам является детергентом.LLOMe — предшественник. Он накапливается в кислых отсеках, где катепсин C превращает его в полилейцины; эти продукты нарушают мембрану, поэтому действие вещества зависит от уровня катепсина C.Клетки с нокаутом катепсина C обработали той же дозой LLOMe, которая повреждает лизосомы контрольных клеток. Какое изменение ожидается по сравнению с контролем?А. Повреждение выражено так же, потому что LLOMe нарушает мембрану без превращений. (неверный вариант)LLOMe — предшественник: мембрану нарушают полилейцины, а для их образования нужен катепсин C.Б. Повреждение выражено слабее, потому что полилейцины образуются в меньшем количестве. (верный вариант)Верно: токсичность LLOMe зависит от уровня катепсина C, поскольку мембрану повреждают продукты превращения, а не сам эфир.В. Повреждение выражено сильнее, потому что LLOMe не расходуется на образование полилейцинов. (неверный вариант)Токсичность зависит от катепсина C; мембрану, как считают, нарушают продукты конденсации (полилейцины), действие самого эфира не показано, поэтому избыток эфира без катепсина C не усиливает повреждение.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMeyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Papadopoulos C., Meyer H. Detection and clearance of damaged lysosomes by the endo-lysosomal damage response and lysophagy. Curr Biol. 2017;27:R1330–R1341Aits S., Kricker J., Liu B. et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 2015;11:1408–1424Skowyra M.L., Schlesinger P.H., Naismith T.V., Hanson P.I. Triggered recruitment of ESCRT machinery promotes endolysosomal repair. Science. 2018;360:eaar5078Схема механизма; состояния качественные. Сведения об LLOMe и о путях повышения проницаемости взяты из обзора Meyer & Kravic 2024; эксперименты с LLOMe выполнены в основном на культивируемых клетках человека (HeLa и другие). Действие кристаллов, агрегатов и бактерий показано по обзорным данным; относительный вклад путей в тканях при болезнях изучен слабо.
Повреждение лизосомы · шаг 14 из 26Какие сигналы сообщают о поврежденииПовреждение лизосомной мембраны сопровождается несколькими физическими изменениями: выходом Ca²⁺, утечкой протонов, перемещением липидов и открытием гликанов. Каждое изменение узнаёт свой белок, поэтому сигналы различаются по чувствительности к размеру повреждения.Ca²⁺, вышедший в цитозоль, связывается с ALG-2, и тот привлекает компоненты ESCRT.V-ATPase при потере протонов и сфингомиелин на цитозольной стороне привлекают ATG16L1 и TECPR1, которые присоединяют ATG8 к самой мембране (CASM).Галектины 3, 8 и 9 связывают гликаны внутренней стороны мембраны, открытые при крупном повреждении.В неповреждённой лизосоме Ca²⁺ и протоны находятся в просвете, сфингомиелин преобладает в слое мембраны, обращённом к просвету, а гликаны скрыты внутри. Для белков цитозоля все эти признаки недоступны.Выход Ca²⁺ — ранний и очень чувствительный сигнал: Ca²⁺ покидает лизосому через временные поры и через каналы, которые активируют рост pH, потеря мембранного потенциала и рост активных форм кислорода, поэтому сигнал возникает даже при малом повреждении. Утечка протонов и рост активных форм кислорода заставляют V-ATPase привлечь комплекс ATG16L1. Сфингомиелин перемещается на цитозольную сторону и узнаётся белком TECPR1. Оба пути присоединяют белки ATG8 к самой мембране. При крупном повреждении гликопротеины и гликолипиды просвета обращены к цитозолю, и их связывают галектины.Галектины не только метки. Галектин-3 помогает привлечь ALIX и TRIM16, галектин-8 способствует отсоединению mTORC1 от лизосомы, галектин-9 привлекает киназу TAK1. Но галектины связывают сахара, а не убиквитин: мост между убиквитином и ATG8 при лизофагии строят другие рецепторы.Отсюда граница вывода: крупное повреждение выявляют по галектинам, а малое, которое быстро ремонтируется, остаётся без галектина. Отсутствие галектина-3 на лизосоме не означает отсутствия повреждения. Как цитозольные сенсоры получают доступ к гликанам при повреждении без разрыва, не решено.Типичная ошибка Галектин-3 — рецептор лизофагии.Рецептором селективной аутофагии называют белок, который соединяет метку на грузе с белком ATG8. В лизофагии эту роль выполняют TAX1BP1, p62, OPTN и NDP52, узнающие убиквитин. Галектины узнают открытые гликаны и привлекают другие белки ответа; галектин-3 удобен как метка крупного повреждения.Лизосома получила малое повреждение: временные поры пропускают ионы, но содержимое просвета остаётся внутри. Какой из перечисленных сигналов возникнет?А. Связывание галектина-3 с гликанами внутренней стороны мембраны. (неверный вариант)Гликаны остаются скрытыми, пока просвет не открыт цитозолю; этот сигнал связывают с более обширным повреждением.Б. Присоединение цепей убиквитина K48 и извлечение белков с помощью VCP/p97. (неверный вариант)Цепи K48 появляются позже K63, на этапе лизофагии, а не в первые минуты после малого повреждения.В. Связывание Ca²⁺, вышедшего в цитозоль, с белком ALG-2. (верный вариант)Верно: выход Ca²⁺ чувствителен даже к малому повреждению, и ALG-2 привлекает ESCRT уже в первые минуты.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMeyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Jia J., Claude-Taupin A., Gu Y. et al. Galectin-3 coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Dev Cell. 2020;52:69–87Boyle K.B., Ellison C.J., Elliott P.R. et al. TECPR1 conjugates LC3 to damaged endomembranes upon detection of sphingomyelin exposure. EMBO J. 2023;42:e113012Fischer T.D., Wang C., Padman B.S., Lazarou M., Youle R.J. STING induces LC3B lipidation onto single-membrane vesicles via the V-ATPase and ATG16L1-WD40 domain. J Cell Biol. 2020;219:e202009128Aits S., Kricker J., Liu B. et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 2015;11:1408–1424Схема механизма; состояния качественные. Ca²⁺ возникает даже при малом повреждении, галектины — при более обширном (Meyer & Kravic 2024); пороги для V-ATPase и сфингомиелина не определены, поэтому на схеме они показаны при любом повреждении — это учебное упрощение. Функции TECPR1 изучены в основном на мембранах, повреждённых бактериями (Boyle 2023), а путь V-ATPase–ATG16L1 — на одномембранных пузырьках (Fischer 2020). Регистрация галектина-3 показана условной пиктограммой.
Повреждение лизосомы · шаг 15 из 26Как лизосома ремонтируетсяНебольшое повреждение лизосомы не требует удаления органеллы: мембрану ремонтируют за минуты. Известны два способа ремонта: сузить место повреждения и убрать его в просвет, а также пополнить мембрану липидами; для более крупных повреждений нужны ещё аннексины.ALG-2 с Ca²⁺ привлекает ESCRT-III к цитозольной стороне мембраны, и его полимеры вместе с VPS4 сужают место повреждения.Ca²⁺ включает PI4K2A, а PI4P привлекает белки OSBP и ORP: они переносят холестерол и фосфатидилсерин из ЭПР, затем ATG2 и VPS13C переносят большие количества липидов (PITT).Аннексины A1 и A2 садятся на повреждённую мембрану независимо от ESCRT и участвуют в ремонте более крупных повреждений.После небольшого повреждения лизосома ещё сохраняет форму, но её мембрана стала проницаемой, и Ca²⁺ вышел в цитозоль. Этот сигнал запускает ремонт раньше, чем появляются метки для удаления.ESCRT-III привлекают в течение минут: ALG-2 с Ca²⁺ садится на мембрану и вызывает сборку ESCRT через ESCRT-I (TSG101) и непосредственно через ALIX; для ремонта лизосом при осмотическом повреждении ALG-2 необходим (Hurley 2025). Эта сборка предшествует появлению галектина-3 и аппарата лизофагии. ESCRT-III вместе с АТФазой VPS4 осуществляет разделение мембран с «обратной» топологией: полимеры собираются внутри шейки, окружённой цитозолем (Olmos 2022). На повреждённой лизосоме они сужают место повреждения; по одной гипотезе, повреждённый участок уходит в просвет внутрипросветным пузырьком, по другой — разрыв временно закупоривается, но точный механизм не известен.Параллельно Ca²⁺ активирует PI4K2A. PI4P на лизосомной мембране привлекает OSBP и ORP9, ORP10, ORP11; они создают контакты с ЭПР и переносят в мембрану холестерол и фосфатидилсерин в обмен на PI4P. Фосфатидилсерин привлекает ATG2. Недавно показано, что в ремонте участвуют домены ЭПР с PI3P: белок DFCP1 собирает на них канал для липидов VPS13C.Пути отчасти независимы: контакты с ЭПР включаются параллельно ESCRT, а при подавлении ESCRT клетки хуже переживают повреждение (Radulovic 2018). Как пути согласованы между собой и что ограничивает размер ремонтируемого повреждения, неизвестно.Типичная ошибка ESCRT-III запечатывает разрыв изнутри лизосомы, как заплата.ESCRT-III собирается на цитозольной стороне мембраны. Для его действия обсуждают несколько гипотез: втягивание повреждённого участка в просвет с образованием внутрипросветных пузырьков, временную закупорку разрыва и привлечение других белков ремонта. Точный механизм изучается.На лизосоме с небольшим повреждением подавили сборку ESCRT-III; остальные пути ремонта сохранены. Что ожидается в первые минуты?А. Ремонт ослаблен, хотя пути, не зависящие от ESCRT, продолжают работать. (верный вариант)Верно: ESCRT-III нужен для ремонта малых повреждений, а контакты с ЭПР и перенос липидов включаются параллельно и не заменяют его полностью.Б. Ремонт не нарушен, потому что ESCRT-III нужен только для лизофагии. (неверный вариант)ESCRT-III собирается на лизосоме в течение минут и работает до лизофагии: сборка не зависит от аппарата лизофагии.В. Мембрана восстанавливается полностью за счёт аннексинов. (неверный вариант)Аннексины A1 и A2 привлекаются к повреждениям с более крупными порами, а не заменяют ESCRT-III при малом повреждении.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMeyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Radulovic M., Schink K.O., Wenzel E.M. et al. ESCRT-mediated lysosome repair precedes lysophagy and promotes cell survival. EMBO J. 2018;37:e99753Tan J.X., Finkel T. A phosphoinositide signalling pathway mediates rapid lysosomal repair. Nature. 2022;609:815–821Radulovic M., Pust S., Kournoutis A. et al. DFCP1-containing ER microdomains mediate lysosomal membrane repair. Nat Cell Biol. 2026;28:2036–2053Burigotto M., Carlton J.G. ESCRT-III function in membrane fission and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27:297–315Hurley J.H., Coyne A.N., Miączyńska M., Stenmark H. The expanding repertoire of ESCRT functions in cell biology and disease. Nature. 2025 (опубликовано онлайн 25 июня 2025)Olmos Y. The ESCRT machinery: remodeling, repairing, and sealing membranes. Membranes (Basel). 2022;12:633Схема механизма; состояния качественные. Основные данные получены на культивируемых клетках человека (HeLa и другие) при повреждении LLOMe: сборка ESCRT-III и её последствия — Radulovic 2018; PI4K2A, PI4P и перенос липидов — Tan 2022; DFCP1 и VPS13C — Radulovic 2026; аннексины и сроки сборки ESCRT-III — обзор Meyer & Kravic 2024. Механизм действия ESCRT-III обсуждается (Burigotto 2026; Hurley 2025); топология ESCRT-III-разделения мембран — по обзору Olmos 2022. Размер повреждения на схеме — качественное различие.
Повреждение лизосомы · шаг 16 из 26Как удаляют лизосому, которую не удалось починитьЕсли ремонт не удался или повреждение слишком велико, лизосому разрушают целиком: этот процесс — лизофагия, разновидность селективной макроаутофагии. Он занимает часы и опирается на убиквитиновую метку на поверхности органеллы.Убиквитин-лигазы метят повреждённую лизосому цепями убиквитина — сначала K63, позже K48; VCP/p97 извлекает часть меченых белков.Рецепторы (TAX1BP1 с доминирующей ролью; на лизосомах найдены также p62, OPTN и NDP52) связывают убиквитин и белки ATG8; TBK1 усиливает это связывание.Рецепторы привлекают ULK1–FIP200, фагофор охватывает лизосому, и аутофагосома сливается с неповреждённой лизосомой.Если ремонт не удался, проницаемая лизосома остаётся источником протонов и ферментов. Убиквитин на ней служит сигналом для удаления: рецепторы аутофагии узнают именно его, а блокада убиквитинирования подавляет лизофагию.Метка ставится двумя волнами: сначала преобладают цепи K63, которые рецепторы аутофагии, как правило, связывают лучше цепей K48, позже появляются цепи K48, и подключается VCP/p97. Связь с ремонтом описана для белка спартина: он узнаёт IST1 из ESCRT-III и участки разупорядоченных липидов и привлекает лигазу ITCH, ставящую цепи K63 (Hurley 2025). Лигаза, начинающая процесс в целом, и сигнал, который её запускает, не установлены (Meyer & Kravic 2024), поэтому не известно, что именно отличает лизосому для удаления от лизосомы для ремонта.В систематическом нокауте рецепторов доминирующая роль принадлежит TAX1BP1: вместе с TBK1 он необходим для лизофагического потока в клетках HeLa и в индуцированных нейронах, тогда как при отсутствии OPTN или NDP52 поток в HeLa сохраняется. Более ранние работы показывали снижение лизофагии и при истощении p62. TAX1BP1 связывает TBK1 и FIP200 через домен SKICH. ULK1-комплекс запускает фагофор, который строится вплотную к метке на лизосоме.CASM — не лизофагия: ATG8 присоединяются к самой мембране повреждённой лизосомы без фагофора. Распознавание гликанов особенно важно при повреждении, которое вызывают бактерии, разрывающие мембрану. Результаты получены при остром повреждении в культивируемых клетках; вклад рецепторов в других клетках и при хроническом повреждении может отличаться.Типичная ошибка CASM упаковывает повреждённую лизосому в аутофагосому.При CASM белки ATG8 присоединяются к мембране самой лизосомы — через V-ATPase и ATG16L1 или через TECPR1 — без образования фагофора вокруг неё; следствия — микроаутофагия места повреждения, активация TFEB и образование трубчатых выпячиваний. Фагофор вокруг лизосомы строит ULK1–FIP200 по убиквитиновой метке, и это лизофагия.Ремонт лизосомы не удался; в клетках нет TAX1BP1, убиквитинирование и остальные рецепторы сохранены. Что ожидается?А. Лизофагический поток не меняется, потому что рецепторы взаимозаменяемы без ограничений. (неверный вариант)При отсутствии OPTN или NDP52 поток в HeLa сохраняется, а основная роль принадлежит TAX1BP1; взаимозаменяемость неполная.Б. Лизосомы не получают убиквитин, потому что TAX1BP1 ставит метку. (неверный вариант)TAX1BP1 — рецептор: он узнаёт готовую метку и связывает TBK1 и FIP200, но не является убиквитин-лигазой.В. Метка поставлена, но лизофагический поток снижен, потому что ослаблен мост между убиквитином и ATG8. (верный вариант)Верно: рецептор соединяет убиквитин на лизосоме с аппаратом аутофагосомы, и без основного рецептора поток снижается.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMeyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Papadopoulos C., Meyer H. Detection and clearance of damaged lysosomes by the endo-lysosomal damage response and lysophagy. Curr Biol. 2017;27:R1330–R1341Eapen V.V., Swarup S., Hoyer M.J., Paulo J.A., Harper J.W. Quantitative proteomics reveals the selectivity of ubiquitin-binding autophagy receptors in the turnover of damaged lysosomes by lysophagy. eLife. 2021;10:e72328Maejima I., Takahashi A., Omori H. et al. Autophagy sequesters damaged lysosomes to control lysosomal biogenesis and kidney injury. EMBO J. 2013;32:2336–2347Boyle K.B., Ellison C.J., Elliott P.R. et al. TECPR1 conjugates LC3 to damaged endomembranes upon detection of sphingomyelin exposure. EMBO J. 2023;42:e113012Hurley J.H., Coyne A.N., Miączyńska M., Stenmark H. The expanding repertoire of ESCRT functions in cell biology and disease. Nature. 2025 (опубликовано онлайн 25 июня 2025)Схема механизма; состояния качественные. Роль TAX1BP1 и TBK1 установлена в клетках HeLa и индуцированных нейронах человека при остром повреждении (Eapen 2021). Две волны убиквитинирования описаны по окраске цепь-специфичными антителами (Papadopoulos 2017, Meyer & Kravic 2024); ранние данные об аутофагическом захвате повреждённых лизосом — Maejima 2013. Начальная E3-лигаза и критерий выбора между ремонтом и удалением не определены; связь спартин–ITCH — по обзору Hurley 2025.
Повреждение лизосомы · шаг 17 из 26Как восстанавливается пул лизосомУдаление повреждённых лизосом уменьшает их число, поэтому повреждение одновременно запускает программу восстановления пула. Её главный регулятор — транскрипционный фактор TFEB (а также TFE3). Новые лизосомы образуются двумя путями: из вновь синтезированных компонентов под контролем TFEB и из материала повреждённых лизосом.mTORC1 на лизосоме фосфорилирует TFEB, и белки 14-3-3 удерживают его в цитозоле.При повреждении mTORC1 отходит от лизосомы, а Ca²⁺ через TRPML1 активирует кальциневрин; ATG8 на мембране (CASM) усиливают выход Ca²⁺, и TFEB дефосфорилируется.TFEB уходит в ядро и включает гены лизосомных и аутофагических белков; он не закреплён там навсегда: при восстановлении условий его экспорт из ядра ускоряется, и в цитозоле он вновь доступен лизосомному mTORC1.Параллельно идёт LYTL: LRRK2 фосфорилирует RAB, pRAB привлекают адаптер JIP4, тот связывает мембрану с моторами на микротрубочках, и из повреждённой лизосомы вытягиваются трубочки.В неповреждённой клетке лизосомный mTORC1 фосфорилирует TFEB, и тот остаётся в цитозоле в комплексе с белками 14-3-3. Поэтому программа биогенеза выключена. Это удержание обратимо: TFEB не закреплён ни в цитозоле, ни в ядре, его положение отражает баланс импорта и экспорта (Napolitano 2018).Повреждение лизосомы включает программу несколькими путями. mTORC1 отсоединяется от лизосомы: ATG8 на мембране связывает FLCN (на неповреждённой лизосоме FLCN и RAG C/D нужны для фосфорилирования TFEB), а Ca²⁺ активирует кальциневрин. Присоединение ATG8 к мембране усиливает сигнал: липидированный LC3 взаимодействует с TRPML1 и усиливает выход Ca²⁺; без системы конъюгации LC3 активация TFEB при повреждении в клетках HeLa и в почке мыши нарушена, а ATG8 на мембране также связывает FLCN. TFEB дефосфорилируется, уходит в ядро, связывается с мотивом CLEAR и включает гены лизосомных и аутофагических белков.Ядерная локализация TFEB после повреждения тоже не окончательна. Пока лизосома повреждена, mTORC1 отсоединён от неё, а кальциневрин дефосфорилирует TFEB: связь с 14-3-3 слабеет, экспорт замедляется, и доля ядерного TFEB растёт. Когда функция лизосомы восстанавливается и mTORC1 возвращается на мембрану, условия меняются в обратную сторону. Сигнал ядерного экспорта TFEB узнаёт экспортин XPO1 (CRM1), и экспорт ускоряет фосфорилирование серинов S142 и S138 рядом с этим сигналом; вклад киназ зависит от условий (Napolitano 2018). Вышедший в цитозоль TFEB связывается с RagC/D в GDP-форме на цитозольной поверхности лизосомы, лизосомный mTORC1 фосфорилирует его по S211, и белки 14-3-3 удерживают его вне ядра (Napolitano 2020; Roczniak 2012). Экспорт из ядра (S142, S138, XPO1) и удержание в цитозоле (S211, 14-3-3) — разные механизмы. Лизосомному mTORC1 не нужно проникать в ядро: S211 он фосфорилирует у TFEB, который вышел в цитозоль и связан с RagC/D–GDP на лизосоме. Полный цикл TFEB разобран в шаге 6 семинара 7. Границы: эти переходы описаны при смене питания в культивируемых клетках; при восстановлении после повреждения лизосомы их скорость прямо не измеряли, поэтому схема переносит механизм по аналогии.Эта программа занимает часы: нужно накопить мРНК и белки и доставить их к эндосомам, которые созревают в лизосомы. В клетках без аутофагии при повреждении биогенез лизосом подавлен. TFEB-зависимый путь даёт новые лизосомные белки, а LYTL и ALR восстанавливают и перераспределяют уже имеющуюся мембрану.При LYTL (LYsosomal Tubulation/sorting driven by LRRK2) можно выделить три физически разных события. Сначала киназа LRRK2 на мембране повреждённой лизосомы фосфорилирует белки RAB35 и RAB10, и фосфорилированные RAB (pRAB) связывают адаптер JIP4: он оказывается на лизосоме. Затем JIP4 соединяет мембрану с моторной системой на микротрубочках, и мембрана вытягивается в трубочку без LAMP1, от которой отделяются пузырьки (Bonet-Ponce 2020). JIP4 не движется по микротрубочке сам: это адаптер, а силу создаёт мотор. JIP4 способствует удлинению трубочек к плюс-концам микротрубочек. Вероятно, их тянет кинезин, но какой именно, не установлено: подавление KIF5B, KIF1A и KIF1B удлинение не нарушало. В противоположную сторону действует другой адаптер, RILPL1: он тоже привлекается pRAB, связывает p150Glued (субъединицу динактина) и ретрагирует трубочки к минус-концам; прямого связывания RILPL1 с JIP4 не обнаружено. Баланс двух сил делает трубочку метастабильной (Bonet-Ponce 2025). В местах отделения пузырьков находили эндоплазматический ретикулум (Bonet-Ponce 2022). Данные получены в культивируемых клетках после повреждения LLOMe.Не следует смешивать разные программы: LYTL перераспределяет мембрану повреждённой лизосомы через трубочки, ALR (регенерация лизосом после аутофагии) отделяет протолизосомы от автолизосом, биогенез под контролем TFEB создаёт новые лизосомные белки, а лизофагия удаляет лизосому целиком.Границы вывода. B-fission, при котором DRP1 отщепляет почки от повреждённых лизосом, описан в клетках HeLa при гипоксии–реоксигенации; в этой работе повреждение LLOMe не использовали. Неизвестно, насколько регенерированные лизосомы нуждаются в новых гидролазах и как согласованы пути.Типичная ошибка TFEB активируется только при голодании, когда выключается mTORC1.Повреждение лизосом тоже активирует TFEB: mTORC1 отсоединяется, а Ca²⁺ через TRPML1 и кальциневрин дефосфорилируют TFEB, причём присоединение ATG8 к лизосомной мембране усиливает этот сигнал. Сигнал идёт с самой повреждённой лизосомы.В клетках нарушена система присоединения LC3 к липидам (нет ATG5). Лизосомы повредили, остальные процессы не изменены. Что ожидается с активацией TFEB?А. Активация TFEB не меняется, потому что её регулирует только mTORC1. (неверный вариант)При повреждении активация TFEB зависит и от Ca²⁺, и от присоединения LC3 к лизосомной мембране: без него TFEB активируется хуже.Б. Активация TFEB ослаблена, потому что нет присоединения LC3, усиливающего выход Ca²⁺ через TRPML1. (верный вариант)Верно: липидированный LC3 взаимодействует с TRPML1 и усиливает выход Ca²⁺, нужный для активации TFEB.В. Активация TFEB усилена, потому что без присоединения LC3 освобождается FLCN. (неверный вариант)Свободный FLCN, наоборот, помогает mTORC1 фосфорилировать TFEB и удерживать его в цитозоле, поэтому активация слабее.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMeyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Nakamura S., Shigeyama S., Minami S. et al. LC3 lipidation is essential for TFEB activation during the lysosomal damage response to kidney injury. Nat Cell Biol. 2020;22:1252–1263Medina D.L., Di Paola S., Peluso I. et al. Lysosomal calcium signalling regulates autophagy through calcineurin and TFEB. Nat Cell Biol. 2015;17:288–299Bonet-Ponce L., Beilina A., Williamson C.D. et al. LRRK2 mediates tubulation and vesicle sorting from lysosomes. Sci Adv. 2020;6:eabb2454Luo Y., Yu J., Li Z. et al. Mitochondrial-derived vesicles drive budding-type fission of damaged lysosomes. Nat Cell Biol. 2026;28:1686–1699Bonet-Ponce L., Cookson M.R. The endoplasmic reticulum contributes to lysosomal tubulation/sorting driven by LRRK2. Mol Biol Cell. 2022;33:ar124Bonet-Ponce L., Tegicho T., Fernandez-Martinez N. et al. JIP4 and RILPL1 utilize opposing motor force to dynamically regulate lysosomal tubulation. J Cell Biol. 2025;224(11)Napolitano G., Esposito A., Choi H. et al. mTOR-dependent phosphorylation controls TFEB nuclear export. Nat Commun. 2018;9:3312Napolitano G. et al. A substrate-specific mTORC1 pathway underlies Birt–Hogg–Dubé syndrome. Nature. 2020;585:597–602Roczniak-Ferguson A. et al. The transcription factor TFEB links mTORC1 signaling to transcriptional control of lysosome homeostasis. Sci Signal. 2012;5:ra42Схема механизма; состояния качественные. Роль CASM и LC3 в активации TFEB показана в клетках HeLa и в модели повреждения почки у мыши (Nakamura 2020); роль Ca²⁺ и кальциневрина впервые показана при голодании (Medina 2015); влияние аутофагии на биогенез — Maejima 2013; LYTL — Bonet-Ponce 2020 (клетки после LLOMe); B-fission — Luo 2026 (HeLa, гипоксия–реоксигенация). Значение путей регенерации в тканях неясно; время «часы» — качественная оценка. Динамика TFEB (челночное перемещение, экспорт через XPO1) — культивируемые клетки человека при смене питания (Napolitano 2018); Rag-зависимое фосфорилирование по S211 — Napolitano 2020, Roczniak 2012. JIP4 и RILPL1 — клетки U2OS и HEK293 после LLOMe (Bonet-Ponce 2025); роль ЭПР в сортировке — Bonet-Ponce 2022. Прямое участие конкретного кинезина не доказано.
Повреждение лизосомы · шаг 18 из 26Как зарегистрировать повреждение и ремонтПовреждение лизосомы и ответ на него оценивают по разным признакам: появлению галектина-3 на лизосомах, утрате сигнала красителя, переходу TFEB в ядро и динамике этих показателей. Каждый признак отвечает на свой вопрос и имеет ограничения, поэтому выводы строят по нескольким признакам сразу.Галектин-3 из цитозоля связывается с открытыми гликанами и образует точки на лизосомах с крупным повреждением.LysoTracker накапливается в кислых отсеках, и повреждённые лизосомы теряют его сигнал.TFEB переходит в ядро после повреждения, а динамику показателей получают, фиксируя клетки через разные сроки после импульса LLOMe.Для воспроизводимого повреждения клетки обрабатывают LLOMe коротким импульсом, отмывают вещество и фиксируют или снимают клетки через разные сроки. Так отделяют быстрые события (минуты: выход Ca²⁺, сборка ESCRT) от медленных (часы: лизофагия, ядерный TFEB, восстановление пула).Метка галектина-3 показывает лизосомы с открытыми гликанами, то есть с крупным повреждением; точки считают на клетку в нескольких полях. LysoTracker показывает, сохранилась ли кислая среда; сигнал теряют лизосомы и с малым, и с крупным повреждением. Поэтому по галектину-3 повреждение может быть занижено, а по красителю не различить размер и причину. Ядерный TFEB показывает запуск программы биогенеза, но не образование лизосом.Каждый показатель сопровождают контролем: клетки без LLOMe, клетки без катепсина C, нокауты и ингибиторы отдельных ступеней ответа. Число точек не равно числу повреждённых лизосом: малые повреждения, как правило, точек не дают (для малых повреждений вывод не установлен), а спад числа точек может отражать и ремонт, и удаление; близкие друг к другу лизосомы на изображении могут слиться в одну точку (предел разрешения микроскопа). Кривые на пиктограммах условные.Граница вывода: все показатели косвенные, и ни один сам по себе не различает ремонт и удаление. Для этого сравнивают показатели при подавлении отдельных процессов.Типичная ошибка Число точек галектина-3 равно числу повреждённых лизосом.Точка отмечает отдельную лизосому с открытыми гликанами (Aits 2015), но малые повреждения, как правило, точек не дают (для малых повреждений вывод не установлен), а спад числа точек отражает и ремонт, и удаление. Поэтому число точек — показатель крупных повреждений, а не счётчик всех повреждённых лизосом.После короткого импульса LLOMe точек галектина-3 мало, но сигнал LysoTracker утрачен у большинства лизосом. Какое объяснение согласуется с обоими наблюдениями?А. Повреждения в основном малые: кислая среда потеряна, а гликаны остались закрытыми. (верный вариант)Верно: краситель теряют и лизосомы с малым повреждением, у которых нарушен протонный градиент, а галектин-3 связывается с гликанами, открытыми при более крупном повреждении.Б. Галектин-3 в этих клетках не экспрессируется, поэтому повреждений нет. (неверный вариант)Утрата сигнала LysoTracker уже показывает потерю кислой среды; отсутствие точек не означает отсутствия повреждений.В. Краситель выходит из лизосом при любой обработке, поэтому его сигнал ничего не показывает. (неверный вариант)У красителя есть ограничения, но он остаётся показателем сохранности кислой среды при контроле без LLOMe.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаAits S., Kricker J., Liu B. et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 2015;11:1408–1424Barral D.C., Staiano L., Guimas Almeida C. et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 2022;23:238–269Medina D.L., Di Paola S., Peluso I. et al. Lysosomal calcium signalling regulates autophagy through calcineurin and TFEB. Nat Cell Biol. 2015;17:288–299Meyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Схема метода; пиктограммы условные, не данные эксперимента. Метод точек галектина описан в работе Aits 2015 (клетки человека и мыши, ткани); ограничения LysoTracker изложены в обзоре Barral 2022; ядерная локализация TFEB как показатель — Medina 2015; динамика ответа — по обзору Meyer & Kravic 2024.
Выбор маршрута · шаг 19 из 26Чем определяется судьба повреждённого белкаПовреждённый белок может свернуться повторно, быть разрушен протеасомой, выведен через ERAD или удалён аутофагией. Распределение между этими маршрутами задают физические свойства субстрата и доступность общих молекул, а не оценка степени повреждения.Одиночный развёрнутый полипептид — проходит в узкий канал протеасомы или повторно сворачивается с участием Hsp70.Агрегат, крупный комплекс или органелла — не проходят в канал и удаляются аутофагией; растворимый белок просвета ЭПР сначала передаётся ERAD.Маршруты используют общие молекулы — Hsp70, убиквитин, p62, p97, — поэтому снижение ёмкости одного звена меняет нагрузку на остальные.Повреждённый белок потерял нативную структуру. Он может быть несвёрнутым полипептидом, агрегатом или белком мембраны органеллы. Для таких молекул есть четыре маршрута: повторное сворачивание шаперонами, 26S-протеасома, ERAD для белков эндоплазматического ретикулума и аутофагия.Распределение молекул между маршрутами называют триажем белков. Центральной системы, которая оценивала бы степень повреждения и выбирала путь, нет: убиквитин-протеасомная система и аутофагия управляются сродством связывания, локальными концентрациями, авидностью и разделением на отсеки (Pohl, Dikic 2019). Главный параметр — размер субстрата. Протеасома разрушает преимущественно одиночные развёрнутые полипептиды, а аутофагия — более крупные структуры: комплексы, агрегаты, органеллы.Отсек тоже ограничивает доступ. Белки просвета ЭПР отделены мембраной от цитозольных протеасом, поэтому их сначала передаёт ERAD (Christianson 2023). Общие компоненты — шапероны, убиквитин, p97 и протеасомы — ограничены, и маршруты конкурируют за них. При старении и хронической экспрессии агрегирующих белков ёмкость этих звеньев снижается, агрегаты захватывают шапероны и протеасомы, и несвёрнутых молекул становится больше (Hipp 2019).Схема качественная: она показывает, какие маршруты доступны, но не доли молекул. Доли зависят от вида, ткани и воздействия, и общих значений в источниках нет. Агрегат или органелла — не «более тяжёлое повреждение» того же белка, а другая физическая форма субстрата.Типичная ошибка Маршрут повреждённого белка определяется тем, насколько сильно он повреждён: слабо повреждённые молекулы сворачиваются, сильно повреждённые уходят в аутофагию.Сама степень повреждения маршрут не задаёт. Судьбу определяют размер и олигомерное состояние субстрата, отсек, тип убиквитиновой метки и концентрации общих компонентов; маршруты конкурируют по скорости, а центрального механизма выбора нет (Pohl, Dikic 2019).Белок X в цитозоле существует в виде одиночных развёрнутых полипептидов. Затем молекулы X объединяются в крупный агрегат. Как изменится доступность X для 26S-протеасомы и для аутофагии?А. Протеасома продолжит принимать агрегат, но медленнее, пропорционально степени повреждения. (неверный вариант)Размер определяет не скорость, а возможность входа: агрегат в узкий канал протеасомы не проходит.Б. Протеасома перестанет принимать молекулу, а доступным основным маршрутом останется аутофагия. (верный вариант)Протеасома принимает преимущественно одиночные развёрнутые полипептиды, а агрегаты удаляет аутофагия (Pohl, Dikic 2019).В. Обе системы останутся одинаково доступными, потому что маршрут задаёт только степень повреждения. (неверный вариант)Степень повреждения сама маршрут не задаёт: доступность определяют размер, отсек и метка.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаPohl C., Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Science. 2019;366:818–822Hipp M.S., Kasturi P., Hartl F.U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:421–435Christianson J.C., Jarosch E., Sommer T. Mechanisms of substrate processing during ER-associated protein degradation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:777–796Rosenzweig R., Nillegoda N.B., Mayer M.P., Bukau B. The Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:665–680Chan N.C., Salazar A.M., Pham A.H. et al. Broad activation of the ubiquitin-proteasome system by Parkin is critical for mitophagy. Hum Mol Genet. 2011;20:1726–1737Схема механизма, качественные состояния; клетки эукариот. Основа — обзоры Pohl, Dikic 2019 и Hipp 2019 (полные тексты) и Christianson 2023 (полный текст; ERAD: распознавание субстратов в просвете ЭПР, рис. 2); реферат Rosenzweig 2019 (шапероны); Chan 2011 (митохондрии, клетки HeLa, SH-SY5Y и мыши; полный текст). Рамка из точек означает, что маршрут возможен, но в источниках не назван основным для этого субстрата; доли молекул на схеме не показаны. Состояние «общие компоненты заняты» показано качественно по Hipp 2019, количественно не оценено.
Выбор маршрута · шаг 20 из 26Рефолдинг и передача на деградациюHsp70 помогает несвёрнутому белку свернуться, а если свёртывание не удаётся, те же шапероны передают его на деградацию. Куда пойдёт субстрат, зависит от ко-шаперонов, присоединившихся к Hsp70.Hsp70 — связывает несвёрнутый субстрат; J-белки и факторы обмена нуклеотида регулируют цикл АТФазы.CHIP — присоединяется к Hsp70 и убиквитинирует субстрат, не способный свернуться, что направляет его в протеасому.BAG1 ведёт убиквитинированные белки в протеасому, BAG3 с HSPB8 и p62 — в аутофагию (CASA).Hsp70 участвует во всех этапах жизни белка — от синтеза до деградации (Rosenzweig 2019). Он связывает несвёрнутые полипептиды. Цикл связывания и освобождения субстрата регулируют J-белки и факторы обмена нуклеотида; вместе с Hsp70 они составляют сеть шаперонов. Если белок принимает нативную структуру, он покидает комплекс: это рефолдинг.Субстрат, который не может свернуться, долго остаётся в комплексе с шаперонами. Исход зависит от времени пребывания в комплексе. К такому комплексу присоединяется CHIP — убиквитинлигаза, связывающаяся с С-концом Hsp70 или Hsp90 (Hipp 2019). Она убиквитинирует субстрат и этим направляет его в протеасому. Для рецептора глюкокортикоидов показано, что CHIP смещает баланс от свёртывания к деградации (Connell 2001).Дальнейший путь зависит от ко-шаперона. В культивируемых клетках BAG1 связан с протеасомной деградацией полиубиквитинированных белков, а BAG3 — с макроаутофагией; в моделях клеточного старения и в мозге грызунов доля BAG3 растёт (Gamerdinger 2009). BAG3 с Hsc70, HSPB8, CHIP и адаптером p62 образует комплекс CASA, который удаляет повреждённые белки Z-диска мышц (Arndt 2010). Как строится аутофагосома, разобрано в семинаре 11.Схема описывает установленные комплексы. Как часто субстрат попадает в каждый из них, зависит от ткани и условий, и общей доли в источниках нет.Типичная ошибка Шапероны помогают белкам свернуться, а на деградацию их направляют другие системы без участия шаперонов.Те же шапероны участвуют в передаче на деградацию: CHIP присоединяется к Hsp70 и убиквитинирует субстрат, а BAG1 и BAG3 направляют его в протеасому или в аутофагию (Connell 2001; Gamerdinger 2009; Arndt 2010).В культивируемых клетках маршрут полиубиквитинированных белков зависит от соотношения BAG3 и BAG1. Соотношение BAG3 к BAG1 возрастает, как при клеточном старении. Как изменится доля макроаутофагии в удалении этих белков?А. Доля макроаутофагии снизится, потому что BAG3 усиливает передачу в протеасому. (неверный вариант)BAG3, а не BAG1, связан с макроаутофагией; BAG1 связан с протеасомным путём (Gamerdinger 2009).Б. Доля макроаутофагии не изменится, потому что маршрут задаёт только тип убиквитиновой цепи. (неверный вариант)Тип цепи важен, но не единственный фактор: при смещении к BAG3 чаще используется макроаутофагия.В. Доля макроаутофагии возрастёт, а доля протеасомного пути относительно уменьшится. (верный вариант)Переход от BAG1 к BAG3 означает более частое использование макроаутофагии для оборота полиубиквитинированных белков (Gamerdinger 2009).Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRosenzweig R., Nillegoda N.B., Mayer M.P., Bukau B. The Hsp70 chaperone network. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:665–680Connell P., Ballinger C.A., Jiang J. et al. The co-chaperone CHIP regulates protein triage decisions mediated by heat-shock proteins. Nat Cell Biol. 2001;3:93–96Hipp M.S., Kasturi P., Hartl F.U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:421–435Gamerdinger M., Hajieva P., Kaya A.M., Wolfrum U., Hartl F.U., Behl C. Protein quality control during aging involves recruitment of the macroautophagy pathway by BAG3. EMBO J. 2009;28:889–901Arndt V., Dick N., Tawo R. et al. Chaperone-assisted selective autophagy is essential for muscle maintenance. Curr Biol. 2010;20:143–148Схема механизма, качественные состояния. Данные: клетки COS (CHIP и рецептор глюкокортикоидов; Connell 2001, реферат); культивируемые клетки и мозг грызунов (BAG1 и BAG3; Gamerdinger 2009, реферат); Drosophila, мышь и мышечные клетки (CASA; Arndt 2010, реферат); сеть Hsp70 и CHIP — обзоры Rosenzweig 2019 (реферат) и Hipp 2019. Роль BAG1 и BAG3 как жёстких переключателей источники не утверждают.
Выбор маршрута · шаг 21 из 26Что может разрушить протеасома и что нет26S-протеасома разрушает убиквитинированные полипептиды, которые проходят в её узкий канал. Агрегаты, крупные комплексы и целые органеллы она не принимает, но участвует в разрушении отдельных белков органелл.Цепь K48 — распространённый сигнал для протеасомы; в экспериментах с модельными субстратами эффективное узнавание требовало цепи из четырёх убиквитинов, но универсального порога нет.p97 — извлекает убиквитинированный белок из мембраны или комплекса и подаёт его в протеасому.Протеасома — разворачивает субстрат и расщепляет его в канале; при её подавлении растёт синтез субъединиц через Nrf1.Убиквитинированный белок узнают убиквитиновые рецепторы протеасомы или челночные белки, одновременно связывающие убиквитин и протеасому. Перед расщеплением внутри бочонка протеасомы субстрат деубиквитинируется и разворачивается (Pohl, Dikic 2019). Распространённый сигнал — цепь убиквитина на Lys48. Для модельных субстратов in vitro минимальным сигналом эффективной доставки оказался тетраубиквитин (Thrower 2000), однако часть белков в клетках человека и дрожжей разрушается протеасомой после присоединения отдельных молекул убиквитина, не связанных в цепь (Braten 2016). Ветвящиеся цепи K11–K48 относят к самым сильным сигналам для протеасомы (Pohl, Dikic 2019).Размер ограничивает этот путь: в узкий канал проходят одиночные развёрнутые полипептиды, а агрегаты, комплексы и органеллы удаляет аутофагия. Целая органелла в канал не помещается, но протеасома участвует в её очищении. После деполяризации митохондрий Parkin убиквитинирует белки наружной мембраны; на митохондриях растёт доля цепей K48, привлекается 26S-протеасома, и, по данным Chan 2011, разрушаются многие белки наружной мембраны, причём независимо от аутофагии. Митофузины Mfn1 и Mfn2 извлекает p97 (Chan 2011; Tanaka 2010). Обзор Narendra, Youle (2024) оценивает это иначе: большинство субстратов Parkin остаётся на мембране и удаляется вместе с органеллой, а независимо от митофагии извлекаются и разрушаются немногие, среди них MFN1/2 и RHOT1/2.Если протеасома подавлена, Parkin-зависимая митофагия не идёт в клетках HeLa, SH-SY5Y и мыши с экспрессией Parkin (Chan 2011); сходный результат получен при подавлении p97 (Tanaka 2010). Протеасома служит и мишенью: при голодании её удаляет аутофагия (протеафагия). При подавлении протеасомы клетки повышают транскрипцию её субъединиц через Nrf1 (Radhakrishnan 2010).Схема качественная; данные получены в клетках с экспрессией Parkin и при деполяризации митохондрий, на других органеллах они не проверены.Типичная ошибка Органеллы удаляет аутофагия, а протеасома в этом не участвует.Целую органеллу протеасома не принимает, но белки наружной мембраны митохондрий, помеченные Parkin, извлекает p97 и разрушает протеасома. В клетках с избытком Parkin после деполяризации подавление протеасомы или p97 блокировало Parkin-зависимую митофагию (Chan 2011; Tanaka 2010); для нейронов с эндогенным Parkin такие данные в источниках шага не приведены.В клетках HeLa с избытком Parkin митохондрии деполяризованы, белки наружной мембраны убиквитинированы. Активность 26S-протеасомы подавлена. Что ожидается для Parkin-зависимой митофагии в этой системе?А. Митофагия не пойдёт, так как ей нужна протеасомная очистка наружной мембраны от помеченных белков. (верный вариант)В клетках HeLa, SH-SY5Y и мыши с избытком Parkin подавление протеасомы блокировало Parkin-зависимую митофагию (Chan 2011). Для нейронов с эндогенным Parkin такие данные в источниках шага не приведены, поэтому переносить вывод на них нельзя.Б. Митофагия усилится, так как аутофагия полностью заменяет протеасому при любом нарушении. (неверный вариант)В клетках с избытком Parkin замены нет: для митофагии нужно разрушение белков наружной мембраны протеасомой (Chan 2011). Для других систем вывод требует отдельной проверки.В. Митофагия не изменится, так как органеллу удаляет аутофагия независимо от протеасомы. (неверный вариант)Эксперименты с подавлением протеасомы и p97 показывают противоположное (Tanaka 2010; Chan 2011).Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаPohl C., Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Science. 2019;366:818–822Thrower J.S., Hoffman L., Rechsteiner M., Pickart C.M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. EMBO J. 2000;19:94–102Chan N.C., Salazar A.M., Pham A.H. et al. Broad activation of the ubiquitin-proteasome system by Parkin is critical for mitophagy. Hum Mol Genet. 2011;20:1726–1737Tanaka A., Cleland M.M., Xu S. et al. Proteasome and p97 mediate mitophagy and degradation of mitofusins induced by Parkin. J Cell Biol. 2010;191:1367–1380Radhakrishnan S.K., Lee C.S., Young P. et al. Transcription factor Nrf1 mediates the proteasome recovery pathway after proteasome inhibition in mammalian cells. Mol Cell. 2010;38:17–28Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Braten O., Livneh I., Ziv T. et al. Numerous proteins with unique characteristics are degraded by the 26S proteasome following monoubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E4639–E4647Схема механизма, качественные состояния. Митохондрии: клетки HeLa, SH-SY5Y и мыши, деполяризация и Parkin (Chan 2011; Tanaka 2010, полные тексты); минимальный сигнал — очищенные модельные субстраты с определённым составом цепей (Thrower 2000, реферат); деградация после моноубиквитинирования — клетки человека и дрожжей (Braten 2016, реферат); Nrf1 — фибробласты мыши (Radhakrishnan 2010, реферат); размер субстрата и протеафагия — обзор Pohl, Dikic 2019; судьба белков наружной мембраны — обзор Narendra, Youle 2024 (полный текст). Обзор и первичные работы различаются по оценке числа белков наружной мембраны, разрушаемых независимо от митофагии (Chan 2011: многие; Narendra 2024: немногие). Подавление протеасомы на схеме показано как исходное воздействие без последующей компенсации: при длительном воздействии усиливается аутофагия.
Выбор маршрута · шаг 22 из 26Маршруты из ЭПР: ERAD и ER-фагияБелок, неправильно свёрнутый в просвете ЭПР, отделён мембраной от цитозольных протеасом. Растворимые субстраты выводит ERAD, а ERAD-устойчивые агрегаты удаляются в лизосому.Комплекс HRD1–SEL1L — убиквитинирует несвёрнутый растворимый белок и выводит его из ЭПР в цитозоль.p97 — вытягивает убиквитинированный белок и подаёт его в протеасому.Калнексин с FAM134B — связывает ERAD-устойчивый агрегат и направляет его в лизосому (ER-фагия и ERLAD).Белки секреторного пути сворачиваются в просвете ЭПР. Для контроля качества служит ERAD: убиквитин- и протеасомзависимый процесс, в котором встроенные в мембрану убиквитинлигазы передают неправильно свёрнутые белки на протеасому. Мутантный α1-антитрипсин передаётся комплексу HRD1–SEL1L, и без этого комплекса он не разрушается (Christianson 2008). Подавление p97 приводит к удержанию субстратов ERAD (Anderson 2015).Агрегация препятствует выведению в цитозоль (дислокации), поэтому такой агрегат ERAD не принимает (Fregno 2018). Полимеры α1-антитрипсина Z (ATZ) и неправильно свёрнутый проколлаген остаются в просвете ЭПР и удаляются лизосомными путями. Рецептор FAM134B вместе с калнексином обеспечивает оборот таких ERAD-устойчивых белков (Forrester 2019; Fregno 2018). Для ATZ описан перенос в одномембранных везикулах, слияние которых с эндолизосомами зависит от STX17 и VAMP8 (ERLAD); в отличие от классической ER-фагии, ЭПР при этом не захватывается аутофагосомой. Авторы связывают это с отсутствием эффекта фармакологического усиления макроаутофагии при некоторых агрегопатиях просвета ЭПР.Один субстрат может использовать оба пути. Мутантный NPC1 (I1061T) накапливается в ЭПР и разрушается двумя независимыми путями: нокдаун BECN1 или FAM134B вызывает накопление мутантного, но не нормального белка (Mochida 2022).Отсюда не следует, что ER-фагия включается при сильном стрессе ЭПР: в источниках маршрут связан со свойствами субстрата, а не с тяжестью стресса.Типичная ошибка ER-фагия включается, когда стресс ЭПР становится сильным, и принимает на себя часть белков ERAD.Маршрут связан со свойствами субстрата: растворимые белки выводит ERAD, а ERAD-устойчивые агрегаты, например полимеры ATZ и проколлаген, распознаёт комплекс FAM134B с калнексином. Стресс ЭПР может усиливать ER-фагию, но для агрегата, который нельзя вывести в цитозоль, маршрут определяет невозможность ERAD; роль тяжести стресса как переключателя между ERAD и ER-фагией источники не показывают (Fregno 2018; Forrester 2019; Mochida 2022).Полимеры ATZ находятся в просвете ЭПР, а активность ERAD подавлена. Как изменится маршрут удаления этого агрегата?А. Агрегат перейдёт в ERAD, так как этот путь принимает любые агрегаты ЭПР. (неверный вариант)Агрегация препятствует выведению в цитозоль, поэтому ERAD такие агрегаты не принимает (Fregno 2018).Б. Агрегат не удалится, так как ER-фагия включается только при сильном стрессе ЭПР. (неверный вариант)Маршрут связан со свойствами субстрата, а не с тяжестью стресса; подавление ERAD лизосомный путь для агрегата не включает и не выключает.В. Маршрут не изменится: агрегат и так удаляется в лизосому с участием калнексина и FAM134B. (верный вариант)Полимеры ATZ устойчивы к протеасоме и в цитозоль не выводятся; их удаляет лизосомный путь ERLAD с участием калнексина и FAM134B (Fregno 2018), поэтому подавление ERAD его не меняет.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаChristianson J.C., Shaler T.A., Tyler R.E., Kopito R.R. OS-9 and GRP94 deliver mutant α1-antitrypsin to the Hrd1–SEL1L ubiquitin ligase complex for ERAD. Nat Cell Biol. 2008;10:272–282Anderson D.J., Le Moigne R., Djakovic S. et al. Targeting the AAA ATPase p97 as an approach to treat cancer through disruption of protein homeostasis. Cancer Cell. 2015;28:653–665Fregno I., Fasana E., Bergmann T.J. et al. ER-to-lysosome-associated degradation of proteasome-resistant ATZ polymers occurs via receptor-mediated vesicular transport. EMBO J. 2018;37:e99259Forrester A., De Leonibus C., Grumati P. et al. A selective ER-phagy exerts procollagen quality control via a Calnexin-FAM134B complex. EMBO J. 2019;38:e99847Mochida K., Nakatogawa H. ER-phagy: selective autophagy of the endoplasmic reticulum. EMBO Rep. 2022;23:e55192Схема механизма, качественные состояния; культивируемые клетки млекопитающих. Комплекс HRD1–SEL1L и мутантный α1-антитрипсин — Christianson 2008 (реферат); p97 — Anderson 2015 (реферат, опухолевые клетки); ATZ — Fregno 2018 (реферат); проколлаген — Forrester 2019 (реферат); NPC1 I1061T — обзор Mochida 2022 (полный текст). ERLAD и ER-фагия на схеме объединены в один лизосомный маршрут; в источниках у них разные способы доставки. Вклад каждого пути на схеме не показан.
Выбор маршрута · шаг 23 из 26Как p62 и убиквитин переключают маршрутОдин и тот же белок p62 может вести субстрат и к протеасоме, и к аутофагии. Направление зависит от олигомерного состояния p62, а оно — от типа цепей убиквитина, концентрации свободного убиквитина и N-дегрона на субстрате.Димер p62 — узнаёт доменом UBA одиночные молекулы с цепью K48 и через PB1 подаёт их на протеасому.Олигомер p62 — образуется на цепях K63, при избытке свободного убиквитина (убиквитиновый стресс) или на N-дегроне и ведёт груз в аутофагию через LIR.Предпочтение цепей K48 и K63 не абсолютно: результат определяют авидность и концентрации, а не одна метка.p62 связывает убиквитинированные субстраты доменом UBA, протеасому — доменом PB1, а мембраны аутофагии — мотивом LIR. Поэтому p62 служит и челноком к протеасоме, и рецептором аутофагии (Pohl, Dikic 2019).Направление зависит от состояния p62: конкуренцию протеасомного и лизосомного путей определяет авидность комплекса, а не сродство отдельного рецептора к убиквитину. Димер узнаёт одиночные молекулы с цепями K48 и подаёт их на протеасому. Цепи K63 вызывают олигомеризацию p62 по домену PB1 и фазовое разделение; образуются тельца p62, которые привлекают мембраны аутофагии. Фазовое разделение p62 с полиубиквитином показано in vitro (Sun 2018). В реконструированной системе скопления p62 формируются на субстратах, имеющих не менее двух цепей длиннее трёх убиквитинов (Zaffagnini 2018).Олигомеризацию вызывают и другие воздействия. При высокой концентрации свободного убиквитина, например после теплового шока или при длительном подавлении протеасомы, убиквитинируется сам p62, димеризация нарушается, и груз направляется в аутофагию (Pohl, Dikic 2019). В реконструированной системе свободный убиквитин, напротив, подавлял образование скоплений p62 с субстратом (Zaffagnini 2018): направление эффекта зависит от условий. N-дегрон, например аргинилированный BiP, связывается с доменом ZZ (Cha-Molstad 2015) и вызывает олигомеры p62, связанные дисульфидными мостиками (Pohl, Dikic 2019).Данные получены в основном при сверхэкспрессии и in vitro; неясно, определяет ли судьбу субстрата тип цепи, его количество или другие сигналы (Adriaenssens 2022).Типичная ошибка Цепь K48 всегда ведёт к протеасоме, а цепь K63 — к аутофагии.Это предпочтения, а не правила: они показаны в основном при сверхэкспрессии и in vitro и не абсолютны (Adriaenssens 2022). Направление зависит и от состояния p62 (димер или олигомер), и от концентрации свободного убиквитина, и от N-дегрона (Pohl, Dikic 2019).Субстрат с цепями K48 доставляет к протеасоме димер p62. Концентрация свободного убиквитина в клетке длительно повышена (убиквитиновый стресс). Какое изменение ожидается для p62?А. Димеров p62 станет больше, и весь груз будет направляться только к протеасоме. (неверный вариант)При избытке свободного убиквитина димеризация нарушается, а не усиливается (Pohl, Dikic 2019).Б. Димеризация нарушится, олигомеров p62 станет больше, и груз чаще пойдёт в аутофагию. (верный вариант)Убиквитинирование p62 при высокой концентрации свободного убиквитина блокирует димеризацию по UBA и способствует олигомеризации (Pohl, Dikic 2019).В. Состояние p62 не изменится, так как оно задаётся только числом звеньев в цепи. (неверный вариант)Число звеньев важно, но состояние p62 меняют и концентрация свободного убиквитина, и N-дегрон.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаPohl C., Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Science. 2019;366:818–822Sun D., Wu R., Zheng J., Li P., Yu L. Polyubiquitin chain-induced p62 phase separation drives autophagic cargo segregation. Cell Res. 2018;28:405–415Zaffagnini G., Savova A., Danieli A. et al. p62 filaments capture and present ubiquitinated cargos for autophagy. EMBO J. 2018;37:e98308Cha-Molstad H., Sung K.S., Hwang J. et al. Amino-terminal arginylation targets endoplasmic reticulum chaperone BiP for autophagy through p62 binding. Nat Cell Biol. 2015;17:917–929Adriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Схема механизма, качественные состояния. Фазовое разделение p62 с полиубиквитином — in vitro (Sun 2018, реферат); образование скоплений p62 на субстратах — реконструкция in vitro (Zaffagnini 2018, реферат); аргинилированный BiP и ZZ-домен — культивируемые клетки (Cha-Molstad 2015, реферат); убиквитиновый стресс и дисульфидные олигомеры — обзор Pohl, Dikic 2019. Влияние свободного убиквитина в обзоре (повышение олигомеризации) и в реконструкции in vitro (подавление образования скоплений) описано по-разному; на схеме показано положение обзора. Длительное подавление протеасомы на схеме приводит к аутофагии сразу; в клетках этот переход развивается при длительном воздействии.
Выбор маршрута · шаг 24 из 26Как определить маршрут конкретного белкаМаршрут белка определяют сравнением: как меняются его количество и скорость исчезновения, когда маршруты выключают по очереди. Один препарат показывает, что маршрут участвует, но не его долю.Период полужизни — измеряют по убыли белка после остановки синтеза циклогексимидом.Ингибиторы протеасомы, лизосомы, p97 и маннозидазы ЭПР — закрывают маршруты по очереди; накопление белка указывает, какой маршрут вносит вклад в его удаление.Генетические контроли — клетки ATG7⁻/⁻ и нокаут рецептора — проверяют специфичность, потому что препараты действуют не только на свою мишень.Исходный вопрос: каким путём удаляется белок X. Сначала измеряют период полужизни: синтез белка останавливают циклогексимидом и определяют X на иммуноблоте в нескольких точках; скорость спада даёт период полужизни. Для субстратов убиквитин-протеасомной системы периоды полужизни лежат в диапазоне от секунд до часов (Pohl, Dikic 2019).Затем измерение повторяют с ингибиторами. Накопление X при подавлении протеасомы (MG132, бортезомиб) согласуется с вкладом протеасомы; накопление при бафиломицине A1 или SAR405 согласуется с вкладом лизосомного пути. Кифунензин останавливает оборот белков ЭПР, зависящих от маннозидазы (Liu 1999), а CB-5083 подавляет p97 (Anderson 2015). Клетки без ATG7 или без рецептора подтверждают результат независимо от препарата.Каждый препарат действует шире мишени. MG132 in vitro подавляет и кальпаин (Tsubuki 1996); SAR405 — ингибитор VPS34: подавляет образование аутофагосом и транспорт поздних эндосом и лизосом (Ronan 2014); бафиломицин A1 в клетках Drosophila блокирует слияние аутофагосом с лизосомами независимо от pH (Mauvezin 2015); CB-5083 вызывает общий протеотоксический стресс (Anderson 2015). Для слитых с HaloTag белков есть альтернатива циклогексимиду — импульс-погоня, которую авторы описали как нетоксичную (Merrill 2019).Подавление одного маршрута усиливает другие, поэтому при длительной обработке накопление отражает уже перестроенную систему (Pohl, Dikic 2019). Вывод «X удаляет протеасома» становится надёжнее, если его подтверждают вторым препаратом и нокаутом; доля маршрута таким сравнением не определяется.Типичная ошибка Если белок накапливается при добавлении MG132, его удаляет протеасома и никакой другой путь.Накопление при MG132 согласуется с участием протеасомы, но MG132 подавляет и кальпаин (Tsubuki 1996), а при длительном воздействии усиливаются другие маршруты (Pohl, Dikic 2019). Мишень подтверждают ингибитором другого класса и генетическим контролем, а долю маршрута измеряют отдельно.В клетках на фоне циклогексимида уровень белка X за 6 ч упал, а при добавлении MG132 остался близким к исходному. Какой вывод допустим?А. Исчезновение X чувствительно к MG132, что согласуется с вкладом протеасомы; мишень и доли других маршрутов этим сравнением не установлены. (верный вариант)Результат совместим с участием протеасомы, но MG132 действует и на другие протеазы (Tsubuki 1996). Мишень подтверждают ингибитором другого класса или генетически.Б. X удаляется только протеасомой, так как MG132 действует исключительно на протеасому. (неверный вариант)MG132 — пептидный альдегид: in vitro он подавляет и кальпаин (Tsubuki 1996), поэтому одного такого результата для вывода «только протеасома» недостаточно.В. X удаляется аутофагией, так как при MG132 лизосомный путь всегда подавляется. (неверный вариант)Подавление протеасомы, напротив, может усиливать аутофагию (Pohl, Dikic 2019), поэтому утверждение «всегда» неверно. Сохранение X при MG132 согласуется с вкладом протеасомы, но само по себе его не доказывает: MG132 подавляет и кальпаин (Tsubuki 1996).Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаPohl C., Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Science. 2019;366:818–822Tsubuki S., Saito Y., Tomioka M., Ito H., Kawashima S. Differential inhibition of calpain and proteasome activities by peptidyl aldehydes of di-leucine and tri-leucine. J Biochem. 1996;119:572–576Mauvezin C., Nagy P., Juhász G., Neufeld T.P. Autophagosome–lysosome fusion is independent of V-ATPase-mediated acidification. Nat Commun. 2015;6:7007Ronan B., Flamand O., Vescovi L. et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 2014;10:1013–1019Anderson D.J., Le Moigne R., Djakovic S. et al. Targeting the AAA ATPase p97 as an approach to treat cancer through disruption of protein homeostasis. Cancer Cell. 2015;28:653–665Liu Y., Choudhury P., Cabral C.M., Sifers R.N. Oligosaccharide modification in the early secretory pathway directs the selection of a misfolded glycoprotein for degradation by the proteasome. J Biol Chem. 1999;274:5861–5867Merrill R.A., Song J., Kephart R.A., Klomp A.J., Noack C.E., Strack S. A robust and economical pulse-chase protocol to measure the turnover of HaloTag fusion proteins. J Biol Chem. 2019;294:16164–16171Adriaenssens E., Ferrari L., Martens S. Orchestration of selective autophagy by cargo receptors. Curr Biol. 2022;32:R1357–R1371Схема метода, условные пиктограммы: кривые и полосы показывают логику сравнения, а не данные эксперимента. Данные о препаратах: MG132 — очищенные ферменты, клетки PC12 и эритроциты кролика (Tsubuki 1996, реферат); SAR405 — опухолевые клетки (Ronan 2014, реферат); бафиломицин A1 — жировое тело Drosophila (Mauvezin 2015, реферат); CB-5083 — опухолевые клетки (Anderson 2015, реферат); кифунензин — гепатомные клетки, α1-антитрипсин (Liu 1999, реферат); циклогексимид — Merrill 2019 (реферат); избыточность рецепторов — обзор Adriaenssens 2022. Положение блока кифунензином относительно убиквитинирования выведено из порядка этапов и в рефератах прямо не показано.
Исследование · шаг 25 из 26Как выбрать величину, метод и контрольВ каждом из четырёх вопросов семинара наблюдают разное: связывание, положение белка в клетке, доставку в лизосому, скорость исчезновения. Это разные величины, и каждую измеряют своим методом. Вывод о механизме получают только из сочетания величины, метода и контроля, а не из одного показания.Что показывает схема. Схема сопоставляет по одному примеру из каждого вопроса семинара: связывание рецептора, митофагия, повреждение лизосомы и маршрут белка. Для каждого примера указаны величина, метод, контроль и граница вывода.Метод регистрирует определённое свойство: связывание двух белков, положение сигнала, долю доставки в кислый отсек, содержание белка во времени.Одно и то же показание допускает несколько объяснений: исчезновение белка внешней мембраны митохондрии возможно и при митофагии, и при разрушении в протеасоме.Контроль и генетическое выключение звена сужают число объяснений, но вывод остаётся относящимся к данной системе и данным условиям.Сначала выбирают величину, затем метод. Связывание рецептора с убиквитином или с белком ATG8 выявляют иммунопреципитацией или реконструкцией из очищенных компонентов, а нужность рецептора для процесса — возвратом в клетки без рецепторов. Это разные вопросы: полоса на блоте говорит о связывании, но не о том, что рецептор работает на грузе (Lazarou 2015; Wurzer 2015).Доставку митохондрии в лизосому показывают репортёры mt-Keima и mito-QC, работу PINK1 — полноразмерный белок и pS65-убиквитин на блоте. Первые отвечают, дошёл ли материал до кислого отсека, вторые — работает ли киназа; ни то ни другое само по себе не подтверждает, что митофагию запустил именно этот путь (Narendra 2024). Повреждение лизосомы регистрируют по появлению галектина на лизосоме, по утрате сигнала LysoTracker и по переходу TFEB в ядро; первая величина отмечает только крупные повреждения (Aits 2015; Meyer, Kravic 2024).Маршрут конкретного белка устанавливают по скорости его исчезновения после остановки синтеза и по накоплению под ингибиторами: протеасомы, лизосомной деградации, p97. Каждый препарат имеет побочное действие, а подавление одного маршрута усиливает другие, поэтому накопление под препаратом читают вместе с генетическими контролями (Pohl, Dikic 2019).Контроль подбирают так, чтобы исключить другое объяснение: общий белок на той же мембране, мутант без нужного модуля, клетки без звена, ингибитор другого пути. Результат относят к виду, клеткам, воздействию и сроку, в которых он получен.Типичная ошибка Если показание изменилось в ожидаемую сторону, механизм доказан.Показание отвечает только на тот вопрос, для которого выбрана величина. Убыль белка, полоса на блоте или красные точки совместимы с несколькими механизмами; их различают контролями и генетическим выключением звена в данной системе.В клетках HeLa с Parkin после деполяризации белок матрикса исчез. Какой результат лучше всего подтверждает, что он исчез из-за митофагии, зависящей от PINK1?А. Белок внешней мембраны TOMM20 тоже исчез на блоте. (неверный вариант)Белки внешней мембраны, помеченные Parkin, разрушает и протеасома, поэтому их убыль не различает митофагию и разрушение в протеасоме.Б. Убыль белка матрикса отсутствует в клетках без PINK1 и в клетках без пяти рецепторов, а в клетках с восстановленным рецептором возвращается. (верный вариант)Исчезновение эффекта при выключении звена и его возврат при восстановлении согласуются с зависимостью от PINK1 и рецепторов в этой системе; вывод относится к этим клеткам и воздействию.В. На деполяризованных митохондриях выявлен pS65-убиквитин. (неверный вариант)pS65-убиквитин показывает работу PINK1, но не доставку митохондрий в лизосому.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаLazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Wurzer B., Zaffagnini G., Fracchiolla D. et al. Oligomerization of p62 allows for selection of ubiquitinated cargo and isolation membrane during selective autophagy. eLife. 2015;4:e08941Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Aits S., Kricker J., Liu B. et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 2015;11:1408–1424Meyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Pohl C., Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Science. 2019;366:818–822Методический шаг: сопоставление методов, а не результат эксперимента. Пиктограммы — схемы операций без численных значений. Примеры взяты из работ с условиями, названными в шагах 6, 12, 18 и 24: Lazarou 2015 (HeLa с Parkin, клетки без пяти рецепторов), Wurzer 2015 (реконструкция и иммунопреципитация), Aits 2015 (клетки человека, LLOMe), Pohl, Dikic 2019 (обзор).
Исследование · шаг 26 из 26Судьба одного повреждения: от метки до лизосомыПовреждённый белок, агрегат, митохондрия и лизосома удаляются по-разному, но в цепи удаления повторяются одни и те же звенья: метка, молекула, которая её считывает, и аутофагосома. Различия задают размер и отсек субстрата, доступные метки и общие молекулы, за которые конкурируют маршруты.Что показывает схема. Схема сопоставляет четыре субстрата: растворимый белок, агрегат, митохондрию и лизосому. Для каждого указаны метка, молекула, которая её считывает, исход и то, что остаётся неизвестным.Метка (убиквитин, pS65-убиквитин) показывает, что объект изменён; её читает шаперон, протеасома или рецептор. Галектин на лизосоме — признак повреждения: он привлекает белки ответа на повреждение, а мост к ATG8 строят убиквитиновые рецепторы.Рецептор привлекает FIP200 и связывается с белками ATG8: аутофагосома строится у груза и сливается с лизосомой.Выбор между маршрутами определяется кинетической конкуренцией за общие компоненты, а не единым решающим механизмом.Начнём с растворимого белка цитозоля. Его развёрнутые участки узнают шапероны и CHIP: либо белок свёртывается повторно, либо метится убиквитином и уходит в протеасому. Если шапероны и протеасомы перегружены, молекулы агрегируют (Hipp 2019).Агрегат в протеасому не помещается. Убиквитинированный агрегат связывает p62, и рецептор привлекает ULK1–FIP200: аутофагосома строится у груза, а белки ATG8 нужны для слияния с лизосомой (Lazarou 2015; Nguyen 2016). В митохондрии метку создаёт цепочка PINK1 — pS65-убиквитин — Parkin; белки внешней мембраны извлекает p97 в протеасому, а OPTN и NDP52 запускают постройку аутофагосомы (Narendra 2024).Лизосома устроена иначе: небольшое повреждение мембраны чинят ESCRT-III и перенос липидов, а неотремонтированную лизосому метят убиквитином, и рецепторы, в первую очередь TAX1BP1, запускают лизофагию; пул восстанавливает TFEB (Eapen 2021; Meyer, Kravic 2024). Критерий, по которому лизосома оказывается в ремонте или в удалении, неизвестен.Общие молекулы — Hsp70, убиквитин, p62, p97 — связывают маршруты между собой: при подавлении протеасомы нагрузка на аутофагию растёт (Pohl, Dikic 2019). Схема ниже сводит четыре случая в одну таблицу.Типичная ошибка Для каждого типа повреждения у клетки есть собственный отдельный механизм удаления, никак не связанный с остальными.Звенья повторяются: метка, рецептор, FIP200, белки ATG8, лизосома. Субстраты различаются размером, отсеком и меткой, а маршруты конкурируют за общие молекулы.Что общего в удалении убиквитинированного агрегата в цитозоле и неотремонтированной лизосомы?А. В обоих случаях объект помещается в канал протеасомы после развёртывания. (неверный вариант)Агрегат и лизосома слишком велики для канала протеасомы; их удаляет аутофагия.Б. Метка убиквитином считывается рецептором, который привлекает FIP200, и аутофагосома строится у объекта. (верный вариант)Такая цепь описана для агрегатов и для лизофагии; набор рецепторов и метки различается, а критерий выбора лизофагии вместо ремонта неизвестен.В. В обоих случаях решение принимает один общий механизм, оценивающий степень повреждения. (неверный вариант)Такого механизма не описано: маршруты определяются размером и отсеком субстрата, метками и конкуренцией за общие молекулы.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаHipp M.S., Kasturi P., Hartl F.U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:421–435Lazarou M., Sliter D.A., Kane L.A. et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 2015;524:309–314Nguyen T.N., Padman B.S., Usher J., Oorschot V., Ramm G., Lazarou M. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome–lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. 2016;215:857–874Narendra D.P., Youle R.J. The role of PINK1–Parkin in mitochondrial quality control. Nat Cell Biol. 2024;26:1639–1651Eapen V.V., Swarup S., Hoyer M.J., Paulo J.A., Harper J.W. Quantitative proteomics reveals the selectivity of ubiquitin-binding autophagy receptors in the turnover of damaged lysosomes by lysophagy. eLife. 2021;10:e72328Meyer H., Kravic B. The endo-lysosomal damage response. Annu Rev Biochem. 2024;93:367–387Pohl C., Dikic I. Cellular quality control by the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Science. 2019;366:818–822Итоговая схема: качественное сопоставление выводов шагов 1–24. Данные получены на разных объектах: клетки HeLa с Parkin (митофагия, рецепторы), клетки человека с импульсом LLOMe (лизосома), обзоры по протеостазу. Доли молекул, идущих по каждому маршруту, в источниках не заданы.
