Транспорт по цитоскелету · шаг 1 из 30Как трек задаёт направление движения груза в клеткеНаправленный перенос требует линии с направлением — полярного филамента — и мотора, который движется по ней в определённую сторону. Куда в клетке попадёт груз, зависит не только от мотора, но и от того, как в данном участке ориентированы треки.Два конца микротрубочки различаются по строению: плюс-конец обычно обращён к периферии, минус-конец закреплён у центросомы.Мотор движется к определённому концу трека; это свойство мотора, а не клетки.В аксоне почти все плюс-концы обращены к окончанию, в дендрите ориентация смешанная, поэтому один и тот же мотор переносит груз в разные области.Диффузия перемещает молекулы во всех направлениях одинаково и на расстояниях в десятки микрометров слишком медленна для крупного груза. Адресное накопление возможно и без мотора, если в нужном месте груз удерживается связывающим белком (диффузия и захват), но перенос груза на большие расстояния требует линии, обладающей направлением, и белка, который движется по ней в одну сторону. Направление задаёт цитоскелет.Микротрубочка и актиновый филамент структурно полярны: их концы различаются по строению и по скорости сборки. В большинстве животных клеток микротрубочки образуют радиальную систему — минус-концы закреплены у центросомы вблизи ядра, плюс-концы обращены к периферии. Тогда движение к плюс-концу означает движение к периферии, а к минус-концу — к центру клетки.В специализированных клетках геометрия иная. В аксоне нейронов гиппокампа крысы микротрубочки ориентированы однородно — плюс-концом к окончанию; в средней части дендрита примерно половина микротрубочек обращена плюс-концом к телу клетки (Baas 1988). По движению маркера растущих плюс-концов EB3 в проксимальной части дендритов около 65 % плюс-концов направлены наружу (Stepanova 2003). В эпителии и в мышечном волокне значительная часть микротрубочек организуется вне центросомы (Akhmanova 2022).Отсюда главное правило раздела: направление относительно концов филамента задаёт мотор, а направление относительно частей клетки — организация треков. На схеме доли микротрубочек, обращённых плюс-концом наружу, — 100 % для клетки с центросомой, 98 % для аксона и 60 % для дендрита; это учебные значения, согласованные с названными работами.Типичная ошибка Кинезин всегда переносит груз к периферии клетки, а динеин — к ядру.Кинезин-1 движется к плюс-концу, динеин — к минус-концу. Движение к плюс-концу означает движение к периферии только там, где плюс-концы обращены к периферии; на участке со смешанной ориентацией треков мотор, идущий к плюс-концу, переносит груз в обе стороны.Мысленный эксперимент: в средней части дендрита около половины микротрубочек обращены плюс-концом к телу нейрона. Как будут распределены по направлению пробеги груза, принудительно соединённого с кинезином-1?А. Почти все пробеги будут направлены к дальнему концу дендрита (неверный вариант)Так было бы при однородной ориентации, как в аксоне. В дендрите кинезин-1 движется к плюс-концу и по трекам, обращённым плюс-концом к телу клетки.Б. Пробеги будут направлены в обе стороны примерно поровну (верный вариант)Кинезин-1 всегда движется к плюс-концу, а плюс-концы в этой части дендрита обращены в обе стороны примерно поровну, поэтому и пробеги идут в обе стороны. В живом нейроне кинезин-1 переносит грузы преимущественно в аксон (Nakata и Hirokawa 2003), поэтому эксперимент мысленный: он проверяет только роль ориентации треков.В. Почти все пробеги будут направлены к телу нейрона (неверный вариант)Почти все пробеги шли бы к телу нейрона, если бы к нему были обращены плюс-концы почти всех микротрубочек. В этой части дендрита так ориентирована лишь около половины микротрубочек, а кинезин-1 движется к плюс-концу любой из них, поэтому пробеги направлены в обе стороны. При смешанной ориентации и минус-концевой мотор переносил бы грузы в обе стороны.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаBaas P. W. et al. 1988. Polarity orientation of microtubules in hippocampal neurons: uniformity in the axon and nonuniformity in the dendrite. Proc Natl Acad Sci U S AStepanova T. et al. 2003. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP. J NeurosciAkhmanova A., Kapitein L. C. 2022. Mechanisms of microtubule organization in differentiated animal cells. Nat Rev Mol Cell BiolNakata T., Hirokawa N. 2003. Microtubules provide directional cues for polarized axonal transport through interaction with kinesin motor head. J Cell BiolKapitein L. C. et al. 2010. Mixed microtubules steer dynein-driven cargo transport into dendrites. Curr BiolОриентация микротрубочек: Baas 1988 — электронная микроскопия, нейроны гиппокампа крысы в культуре; Stepanova 2003 — EB3-GFP в нейронах гиппокампа мыши в культуре. Организация микротрубочек вне центросомы — обзор Akhmanova и Kapitein 2022. Избирательный перенос кинезином-1 в аксон — Nakata и Hirokawa 2003 (нейроны гиппокампа мыши); при индуцируемом присоединении моторов к грузу в нейронах крысы кинезин переносил груз в аксон, а динеин — в дендриты (Kapitein 2010, Curr Biol). Задача про кинезин-1 в дендрите — мысленный эксперимент. Доли на схеме (100, 98 и 60 %) и распределение грузов по зонам — учебная модель практикума (вопрос 1, базовый уровень).
Транспорт по цитоскелету · шаг 2 из 30Чем различаются кинезины, динеин и миозиныТри семейства моторов превращают энергию гидролиза ATP в направленное перемещение, но по разным трекам и в разные стороны. Для транспорта важна процессивность: способность одной молекулы сделать много шагов, не отсоединяясь от трека.Кинезин-1 движется по микротрубочке к плюс-концу шагами 8 нм; цитоплазматический динеин — к минус-концу.Миозин V движется по актиновому филаменту к оперённому концу шагами около 36 нм и переносит груз на коротком участке у мембраны.Гидролиз ATP сопряжён со сменой сродства головки к треку; у процессивных двуглавых моторов головки ходят попеременно.Общее у трёх семейств моторов — механохимический цикл: связывание ATP, гидролиз и высвобождение продуктов меняют конформацию моторной головки и её сродство к треку. Различаются трек, направление и способ движения. Кинезины (у человека более сорока генов) в большинстве движутся по микротрубочке к плюс-концу; к минус-концу органеллы в животной клетке переносит практически один мотор — цитоплазматический динеин (Reck-Peterson 2018).Кинезин-1 — наиболее изученный представитель. Его две головки по очереди отсоединяются от микротрубочки, смещаются вперёд и вновь связываются, так что в каждый момент хотя бы одна головка связана с треком. Каждый шаг равен 8 нм — периоду решётки микротрубочки; одиночная молекула in vitro делает около ста шагов, то есть проходит около микрометра, со скоростью порядка 1 мкм/с (Yildiz 2025). Скорость и длина пробега задаются кинетикой одного и того же цикла.Миозин V движется по актину шагами около 36 нм, соответствующими полупериоду двойной спирали филамента, и потому идёт вдоль него, не закручиваясь (Sweeney 2018). Миозин II, напротив, непроцессивен: одиночная молекула связана с актином лишь малую часть цикла, и перемещение создаётся ансамблем головок в биполярном филаменте. Попеременная ходьба — свойство отдельных процессивных моторов, а не общий закон всего семейства.Часть кинезинов вообще не переносит груз: кинезины семейств 13 и 8 ускоряют разборку концов микротрубочки. Поэтому принадлежность белка к семейству ещё не говорит о его работе.Типичная ошибка Все моторы одного семейства ходят одинаково, и любой миозин переносит груз.Миозин II непроцессивен и работает в ансамбле; груз переносят процессивные миозины V и VI. Среди кинезинов есть белки, которые не переносят груз, а разбирают концы микротрубочек.Одиночную молекулу миозина II и одиночную молекулу миозина V поместили на актиновый филамент с ATP. Какая из них будет перемещаться вдоль филамента на много шагов, не отсоединяясь?А. Обе: все миозины процессивны (неверный вариант)Процессивность — свойство отдельных моторов, а не всего семейства. Одиночный миозин II связан с актином лишь малую часть цикла.Б. Только миозин II, работающий в мышце (неверный вариант)Миозин II создаёт движение только в ансамбле головок биполярного филамента; одиночная молекула быстро отсоединяется от трека.В. Только миозин V, переносящий груз (верный вариант)Головки миозина V ходят попеременно шагами около 36 нм, и одна из них всегда связана с актином, поэтому одиночная молекула проходит много шагов.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаYildiz A. 2025. Mechanism and regulation of kinesin motors. Nat Rev Mol Cell BiolSweeney H. L., Holzbaur E. L. F. 2018. Motor proteins. Cold Spring Harb Perspect BiolReck-Peterson S. L. et al. 2018. The cytoplasmic dynein transport machinery and its many cargoes. Nat Rev Mol Cell BiolПараметры кинезина-1 (шаг 8 нм, около ста шагов до отсоединения, скорость порядка 1 мкм/с) получены на одиночных молекулах in vitro (обзор Yildiz 2025); в клетке скорость и пробег зависят от груза, числа моторов и модификаций трека. Параметры миозина V и миозина II — обзор Sweeney и Holzbaur 2018. Динеин как практически единственный минус-концевой мотор органелл — обзор Reck-Peterson 2018.
Транспорт по цитоскелету · шаг 3 из 30Как мотор связывается со своим грузом и почему без груза он неактивенОдин динеин переносит почти все грузы к минус-концу, значит, избирательность создаёт не сам мотор. Адаптер груза одновременно определяет, какой груз будет связан с мотором, и активирует мотор.Без груза кинезин-1 автоингибирован и почти не гидролизует ATP; одиночный динеин находится в автоингибированной конформации и процессивно не движется.Динеин движется процессивно только в комплексе с динактином и адаптером (BICD2, HOOK3 и др.).Митохондрия связывается с кинезином-1 и динеином через адаптеры TRAK и белок наружной мембраны Miro.Цитоплазматический динеин в отсутствие партнёров автоингибирован: его моторные головки уложены так, что процессивное движение невозможно. Очищенный динеин млекопитающих в экспериментах in vitro по микротрубочке процессивно не двигался; когда же он образовывал комплекс с динактином и одним из адаптеров груза, комплекс проходил расстояния, сравнимые с пробегами грузов в клетке (McKenney 2014). Динактин сам мотором не является: вместе с адаптером он собирает динеин в активный комплекс.Отсюда понятно, как один мотор переносит множество разных грузов и почти не гидролизует ATP без груза. Адаптер связывается и с грузом, и с комплексом динеин — динактин, поэтому сборка комплекса на грузе одновременно определяет адрес и активирует мотор. Разные адаптеры включают в комплекс одну или две молекулы динеина: BICD2 чаще одну, BICDR1 и HOOK3 — две, и комплекс с двумя динеинами развивает большую силу и скорость (Urnavicius 2018).Кинезин-1 устроен иначе, но логика та же: без груза его хвост складывается на моторные домены и подавляет и гидролиз ATP, и связывание с треком; связывание груза и адаптеров снимает это торможение (Yildiz 2025). Поэтому утверждения «мотор есть в клетке» и «мотор работает» различаются, и второе требует данных об активации.Для митохондрий адаптерная система изучена особенно подробно. Белок наружной мембраны Miro через адаптеры TRAK1/2 (у дрозофилы — Milton) связывает митохондрию с кинезином-1 и с динеином. У Miro есть два Ca²⁺-связывающих EF-мотива; как эта связь управляет остановкой митохондрии, разобрано в шаге об остановке и закреплении.Типичная ошибка Динеин движется по микротрубочке сам, а адаптер лишь прикрепляет к нему груз.Одиночный динеин автоингибирован и процессивно не движется; процессивное движение начинается в комплексе с динактином и адаптером, поэтому адаптер и определяет груз, и активирует мотор.К очищенному динеину на микротрубочке добавили динактин, но без адаптера груза. Как будет двигаться динеин?А. Процессивно к минус-концу, как в составе груза (неверный вариант)Для процессивного движения нужен тройной комплекс: динактин без адаптера не собирает динеин в активную форму.Б. Процессивно к плюс-концу микротрубочки (неверный вариант)Направление динеина задано устройством мотора — к минус-концу; динактин его не меняет.В. Процессивного движения не будет (верный вариант)Только тройной комплекс динеин — динактин — адаптер движется процессивно (McKenney 2014); без адаптера динеин остаётся в неактивном состоянии.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаMcKenney R. J. et al. 2014. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. ScienceUrnavicius L. et al. 2018. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. NatureYildiz A. 2025. Mechanism and regulation of kinesin motors. Nat Rev Mol Cell BiolMisgeld T., Schwarz T. L. 2017. Mitostasis in neurons: maintaining mitochondria in an extended cellular architecture. NeuronАктивация динеина — эксперименты in vitro с очищенными белками млекопитающих (McKenney 2014; Urnavicius 2018: криоэлектронная микроскопия и одиночные молекулы). Автоингибирование кинезина-1 — обзор Yildiz 2025. Комплекс TRAK–Miro — обзор Misgeld и Schwarz 2017. Состояния на схеме — схема механизма, без чисел.
Транспорт по цитоскелету · шаг 4 из 30Почему груз движется то в одну, то в другую сторонуНа одном грузе обычно находятся и кинезины, и динеин, и большинство органелл движутся прерывисто, сменяя направление. Две гипотезы объясняют это по-разному и дают противоположные предсказания для эксперимента с удалением одного мотора.Модель перетягивания: моторы обоих направлений активны одновременно, направление задаёт механически преобладающая группа.Модель согласованного переключения: в каждый момент активна одна группа, а моторы противоположных направлений нужны друг другу.Ослабление динеина в первой модели усиливает движение к плюс-концу, во второй — ослабляет движение в обе стороны.Прижизненное наблюдение показывает, что большинство органелл и рибонуклеопротеиновых частиц движутся прерывисто: короткие пробеги в одну сторону сменяются пробегами в другую и остановками. Такое движение называют двунаправленным; оно связано с тем, что на грузе одновременно находятся моторы обоих направлений.Модель перетягивания предполагает, что моторы обоих направлений активны одновременно, а наблюдаемое направление определяется тем, какая группа механически сильнее. Тогда ослабление динеина должно усиливать антероградное движение: кинезину меньше противодействует мотор противоположного направления. Модель согласованного переключения предполагает, что в каждый момент работает одна группа моторов и что моторы противоположных направлений нужны друг другу для активации. Тогда ослабление динеина должно снижать движение в обе стороны.Во многих системах удаление или подавление одного мотора действительно снижало движение в обе стороны; этот «парадокс взаимной зависимости» разобран в обзоре Hancock (2014). В клетках дрозофилы S2 подавление кинезина-1 прекращало и перенос пероксисом динеином, и наоборот (Ally 2009); в аксонах мотонейронов личинок дрозофилы мутации кинезина-1 нарушали и ретроградный перенос митохондрий, а мутации динеина не меняли и не усиливали перенос к окончанию аксона (Pilling 2006) — простое перетягивание предсказывало бы усиление. Вклад перетягивания в отдельных системах при этом не исключён.Важно не выбрать модель, а уметь сформулировать оба предсказания и назвать эксперимент, который их различает. На схеме те же два предсказания посчитаны по модели практикума: это учебный расчёт, а не данные эксперимента.Типичная ошибка Если убрать динеин, кинезин без противодействия будет переносить груз к плюс-концу ещё активнее.Это предсказание модели перетягивания. Во многих экспериментах удаление одного мотора снижало движение в обе стороны, что говорит о взаимной зависимости моторов.В клетках подавили синтез динеина. Какой результат говорит в пользу модели согласованного переключения?А. Пробеги к плюс-концу стали чаще и длиннее (неверный вариант)Такой результат предсказывает модель перетягивания: динеин больше не противодействует кинезину. По модели согласованного переключения ослабление одного мотора ослабляет и другой.Б. Пробеги к плюс-концу стали реже (верный вариант)Если моторы противоположных направлений нужны друг другу, подавление динеина снижает движение и к минус-, и к плюс-концу.В. Пробеги к плюс-концу не изменились (неверный вариант)Неизменный перенос к плюс-концу означал бы, что моторы независимы. Обе модели предсказывают изменение, но разного знака.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаHancock W. O. 2014. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nat Rev Mol Cell BiolAlly S. et al. 2009. Opposite-polarity motors activate one another to trigger cargo transport in live cells. J Cell BiolPilling A. D. et al. 2006. Kinesin-1 and dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol Biol CellОбзор Hancock 2014; Ally 2009 — клетки дрозофилы S2, пероксисомы, РНК-интерференция и замена моторов; Pilling 2006 — аксоны мотонейронов личинок дрозофилы, мутации кинезина-1 и динеина. Числа на схеме — расчёт по модели практикума (вопрос 1, продвинутый уровень, мысленный эксперимент): путь всех митохондрий участка, мкм за минуту, учебные величины.
Транспорт по цитоскелету · шаг 5 из 30Как митохондрия останавливается у активного синапсаРаспределение органелл задаёт не только перенос, но и остановка и закрепление. В аксоне митохондрия останавливается там, где повышена концентрация Ca²⁺, и закрепляется синтафилином.Ca²⁺ связывается с EF-мотивами Miro, и кинезин-1 перестаёт перемещать митохондрию.Синтафилин закрепляет митохондрию на микротрубочке и подавляет кинезин-1.Без синтафилина доля подвижных митохондрий растёт примерно вдвое, а остановка при активности исчезает.Около трети митохондрий аксона в культуре подвижны, остальные неподвижны (Kang 2008). Остановка — не простое прекращение движения: груз закрепляется якорными белками, связывающими его с цитоскелетом. Поэтому распределение органелл — результат трёх регулируемых процессов: активации моторов, согласования моторов противоположных направлений и закрепления.В участке аксона с активным синапсом концентрация Ca²⁺ повышена. Ca²⁺ связывается с двумя EF-мотивами Miro, и движение митохондрии в обе стороны прекращается. По данным Wang и Schwarz (2009), Miro, связавший Ca²⁺, взаимодействует с моторным доменом кинезина-1 и не даёт ему связаться с микротрубочкой; по данным Macaskill и соавт. (2009), кинезин отделяется от митохондрии. Замены в EF-мотивах, устраняющие связывание Ca²⁺, сохраняют движение, но устраняют остановку при стимуляции глутаматом (нейроны гиппокампа крысы).Закрепление обеспечивает синтафилин — белок наружной мембраны митохондрий аксона. В нейронах гиппокампа мышей без гена Snph доля подвижных митохондрий выросла примерно с трети до трёх четвертей (Kang 2008), а остановка митохондрий при активности нейрона исчезла (Chen и Sheng 2013). Синтафилин закрепляет органеллу на микротрубочке и, связываясь с кинезином-1, подавляет его АТФазную активность, то есть останавливает мотор.Механизм имеет физиологический смысл: митохондрия задерживается там, где расход ATP и поступление Ca²⁺ наибольшие. На схеме показана кимограмма модели практикума; доли подвижных митохондрий в ней подобраны по данным Kang 2008, остальные числа условны.Типичная ошибка Чтобы остановить митохондрию у синапса, достаточно Ca²⁺-сенсора Miro.В экспериментах на нейронах мыши без синтафилина митохондрии продолжали двигаться при активности: для остановки нужны и Ca²⁺-сенсор Miro, и якорный белок синтафилин.Нейроны с белком Miro, у которого заменами в EF-мотивах устранено связывание Ca²⁺, стимулировали глутаматом. Как изменится движение митохондрий в аксоне?А. Митохондрии продолжат двигаться, остановки не будет (верный вариант)Без связывания Ca²⁺ Miro не останавливает кинезин-1, поэтому митохондрии продолжают двигаться при повышении Ca²⁺ (Wang и Schwarz 2009; Macaskill 2009).Б. Митохондрии остановятся быстрее, чем в норме (неверный вариант)Замены в EF-мотивах не усиливают Ca²⁺-зависимую остановку, а устраняют её: Miro перестаёт связывать Ca²⁺.В. Митохондрии перестанут двигаться и без глутамата (неверный вариант)Miro без связывания Ca²⁺ по-прежнему соединяет митохондрию с кинезином-1, и в покое митохондрии движутся как в норме.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWang X., Schwarz T. L. 2009. The mechanism of Ca2+-dependent regulation of kinesin-mediated mitochondrial motility. CellMacaskill A. F. et al. 2009. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. NeuronKang J.-S. et al. 2008. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. CellChen Y., Sheng Z.-H. 2013. Kinesin-1-syntaphilin coupling mediates activity-dependent regulation of axonal mitochondrial transport. J Cell BiolMisgeld T., Schwarz T. L. 2017. Mitostasis in neurons: maintaining mitochondria in an extended cellular architecture. NeuronWang и Schwarz 2009, Macaskill 2009 — нейроны гиппокампа крысы в культуре, замены в EF-мотивах Miro, глутамат или активность. Kang 2008 — нейроны гиппокампа мышей Snph⁻/⁻ в культуре: доля подвижных митохондрий около трети в норме и около трёх четвертей без синтафилина. Chen и Sheng 2013 — нейроны мышей Snph⁻/⁻, остановка при активности. Кимограмма и числа схемы — модель практикума (вопрос 1, продвинутый уровень).
Транспорт по цитоскелету · шаг 6 из 30Как положение органеллы влияет на её функциюПоложение органеллы — не сопутствующее явление, а способ регуляции: один и тот же набор белков даёт разный результат в зависимости от того, куда его перенесли. Нарушение транспорта сильнее всего сказывается на самых длинных отростках.В полной среде лизосомы смещаются к периферии, в среде без питательных веществ собираются вблизи ядра (позиционирование лизосом).Периферическое положение лизосом связано с активностью mTORC1, перинуклеарное — с её снижением и слиянием с автофагосомами.Мутации моторных доменов KIF5A и KIF1A вызывают наследственную спастическую параплегию с поражением длинных аксонов.Лизосомы в клетках HeLa меняют положение в зависимости от питания: в полной среде они распределены по периферии, а в среде без питательных веществ собираются вблизи ядра; перинуклеарное скопление в этих экспериментах было связано с изменением внутриклеточного pH. Активность mTORC1 коррелировала с его присутствием на периферических лизосомах, а положение лизосом влияло и на образование автофагосом, и на скорость их слияния с лизосомами (Korolchuk 2011). Так перемещение органеллы становится частью регуляции питания клетки.Нейрон — предельный случай задачи распределения: длина аксона у человека достигает десятков сантиметров, а потребность в ATP и в связывании Ca²⁺ неодинакова по его длине. Остановка митохондрии у активного синапса обеспечивает такое распределение локально, без участия ядра (шаг об остановке и закреплении).Часть мРНК переносится в составе рибонуклеопротеиновых частиц в отростки нейрона и транслируется там по местному сигналу (локальная трансляция). Доставка мРНК с последующим местным синтезом позволяет изменить белковый состав удалённого участка, не дожидаясь доставки готового белка из тела клетки (обзор Holt 2019).Медицинское значение транспорта показывают генетические данные. Замена в моторном домене KIF5A найдена у семьи с наследственной спастической параплегией SPG10 (Reid 2002), замена в моторном домене KIF1A — у семьи с наследственной спастической параплегией (Erlich 2011). Гены KIF5A и KIF1A экспрессируются во многих типах клеток, но поражаются прежде всего самые длинные аксоны; авторы связывают это с нарушением аксонального транспорта.Типичная ошибка Лизосомы распределены в клетке случайно, и их положение не влияет на сигналы.Положение лизосом меняется с питанием и связано с активностью mTORC1 и аутофагией (Korolchuk 2011); перемещение органеллы меняет её функцию.Клетки HeLa перевели из полной среды в среду без питательных веществ. Как изменится положение лизосом?А. Лизосомы соберутся вблизи ядра (верный вариант)В среде без питательных веществ лизосомы собираются перинуклеарно; это связано со снижением активности mTORC1 и сближением лизосом с автофагосомами (Korolchuk 2011).Б. Лизосомы сместятся к периферии (неверный вариант)Периферическое положение характерно для обилия питательных веществ, когда mTORC1 активен на лизосомах.В. Положение лизосом не изменится (неверный вариант)Положение лизосом зависит от условий питания; именно поэтому его рассматривают как способ регуляции.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаKorolchuk V. I. et al. 2011. Lysosomal positioning coordinates cellular nutrient responses. Nat Cell BiolHolt C. E., Martin K. C., Schuman E. M. 2019. Local translation in neurons: visualization and function. Nat Struct Mol BiolReid E. et al. 2002. A kinesin heavy chain (KIF5A) mutation in hereditary spastic paraplegia (SPG10). Am J Hum GenetErlich Y. et al. 2011. Exome sequencing and disease-network analysis of a single family implicate a mutation in KIF1A in hereditary spastic paraparesis. Genome ResMisgeld T., Schwarz T. L. 2017. Mitostasis in neurons: maintaining mitochondria in an extended cellular architecture. NeuronKorolchuk 2011 — клетки HeLa, полная среда и три протокола голодания (в том числе 5 ч без сыворотки и аминокислот), положение лизосом, mTORC1 и аутофагия; перинуклеарное скопление лизосом при голодании связано с изменением внутриклеточного pH. Локальная трансляция — обзор Holt, Martin и Schuman 2019. Генетика: Reid 2002 (KIF5A, SPG10, одна семья), Erlich 2011 (KIF1A, одна семья) — связь мутации с поражением длинных аксонов предложена авторами как объяснение. Схема — схема механизма без чисел.
Транспорт по цитоскелету · шаг 7 из 30Как измерить направление транспорта и доказать роль мотораУтверждение «груз движется к периферии» требует измерения, а не предположения. Необходимость мотора показывают его удалением, достаточность — искусственным присоединением мотора к грузу.Кимограмма превращает прижизненную съёмку в рисунок: наклон линии даёт скорость и направление, вертикаль — остановку.Ориентацию треков в той же клетке определяют по движению маркеров плюс-концов (EB3).Химически индуцируемая димеризация присоединяет выбранный мотор к выбранному грузу и проверяет достаточность мотора.Базовый приём — прижизненная съёмка с построением кимограммы. Вдоль выбранного участка (например, аксона) проводят линию и для каждого кадра записывают интенсивность вдоль неё; кадры укладывают друг под другом. По горизонтали откладывается положение, по вертикали — время: неподвижный груз даёт вертикальную линию, движущийся — наклонную; наклон даёт скорость, сторона наклона — направление. Так же измеряют долю времени в движении и в остановках.Направление имеет смысл только относительно известной ориентации треков, поэтому в той же клетке определяют полярность микротрубочек — по движению белков, связывающихся с растущими плюс-концами, например EB3-GFP (Stepanova 2003). Без этого контроля вывод о том, какой мотор задействован, сделать нельзя.Причинность проверяют вмешательством. Нокодазол вызывает разборку микротрубочек, латрункулин A препятствует полимеризации актина; остановка груза показывает, что движение зависит от трека, но не указывает мотор. Удаление конкретного мотора или адаптера проверяет его необходимость; при этом нужно помнить о взаимной зависимости моторов (шаг о двунаправленном движении).Наиболее прямой приём — искусственное присоединение мотора к грузу. Белок FKBP прикрепляют к грузу (например, к пероксисоме), а фрагмент FRB — к мотору; добавленный рапалог связывает их. Если груз сразу начинает двигаться в предсказанную сторону, доказана достаточность мотора (Kapitein 2010). Так, N-концевой фрагмент адаптера BICD2, прикреплённый к пероксисомам, вызывал их перенос динеином к минус-концам (Hoogenraad 2003).Типичная ошибка Если нокодазол остановил груз, значит, груз переносит кинезин.Нокодазол разрушает трек для всех моторов микротрубочек. Он показывает зависимость от микротрубочек, но не указывает, какой мотор участвует.К пероксисомам в клетке с центросомой рапалогом присоединили активный фрагмент кинезина. Что покажет эксперимент, если пероксисомы за минуты соберутся на периферии?А. Что этот кинезин необходим для движения пероксисом в норме (неверный вариант)Необходимость проверяют удалением мотора. Присоединение показывает, что мотор может сам перенести груз, но не то, что груз в норме переносит именно он.Б. Что этого мотора достаточно, чтобы перенести груз к периферии (верный вариант)Искусственное присоединение проверяет достаточность: одного выбранного мотора хватает, чтобы перенести груз в сторону плюс-концов (Kapitein 2010).В. Что в клетке нет динеина, способного перенести груз к центру (неверный вариант)Эксперимент ничего не говорит о динеине клетки: он показывает лишь, что присоединённого кинезина хватает для переноса к периферии.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаStepanova T. et al. 2003. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP. J NeurosciKapitein L. C. et al. 2010. Probing intracellular motor protein activity using an inducible cargo trafficking assay. Biophys JHoogenraad C. C. et al. 2003. Bicaudal D induces selective dynein-mediated microtubule minus end-directed transport. EMBO JКимограмма и проверка направления — схема метода. EB3-GFP — Stepanova 2003, нейроны мыши. Индуцируемое присоединение моторов к пероксисомам (FKBP — рапалог — FRB) — Kapitein 2010 (клетки млекопитающих в культуре); BICD2-N на пероксисомах и митохондриях — Hoogenraad 2003. Схемы — схемы методов, без чисел.
Слияние и деление · шаг 8 из 30Почему форма сети митохондрий — стационарное состояние двух процессовЧисло митохондрий и их длину не задаёт ни синтез, ни разрушение: их задают два непрерывно идущих противоположных процесса — слияние и деление. В учебной модели форму сети приближённо задаёт отношение констант скоростей слияния и деления, пока оба процесса идут намного быстрее роста клеток; частота событий зависит ещё и от самих констант и от числа органелл.Деление дробит сеть на более короткие органеллы, слияние объединяет их; оба процесса идут постоянно, даже когда картина не меняется.Неизменная картина — стационарное состояние: за минуту делением возникает почти столько же органелл, сколько исчезает при слиянии; небольшой избыток делений восполняет разбавление сети при росте клеток.Одна и та же картина получается при разных константах: подавление слияния и усиление деления дают одинаковую фрагментацию.В живой клетке митохондрии постоянно сливаются друг с другом и делятся. Поэтому то, что мы видим на снимке, — короткие отдельные органеллы или протяжённая разветвлённая сеть, — не постоянное свойство органеллы, а результат двух противоположных потоков. Пока делений происходит почти столько же, сколько слияний, число органелл и их средняя длина не меняются, хотя каждая митохондрия за несколько минут успевает и слиться, и разделиться.Из этого следует главное правило вопроса. Пока оба процесса идут намного быстрее роста клеток, форму сети задаёт отношение констант скоростей: если слияние ослабить вдвое, то, пока сеть перестраивается, делений больше, чем слияний, органелл становится больше, и средняя длина в учебной модели падает с 4,4 до 2,5 мкм. Ровно ту же картину даёт усиление деления вдвое при неизменном слиянии. А если замедлить вдвое оба процесса сразу, средняя длина почти не изменится, хотя событий слияния и деления станет вдвое меньше: клетки с сильно сниженными скоростями обоих процессов могут сохранять трубчатую сеть, если эти скорости уравновешены (Chen 2005, со ссылкой на Chen 2003). В новом стационарном состоянии деления снова почти уравновешивают слияния, поэтому по снимку нельзя установить и текущую разность частот. Близкое наблюдение есть и в экспериментах на дрожжах: у большинства двойных мутантов dnm1 fzo1, полученных скрещиванием, митохондрии трубчатые, как в норме; при последовательном удалении генов чаще сохранялась картина, сложившаяся до удаления второго гена (Sesaki и Jensen 1999).Поэтому одна и та же морфология сети совместима с разными механизмами: по одному снимку нельзя сказать, какая машина изменена и изменена ли какая-либо из них вообще. Кроме того, на картину влияют образование новых митохондрий, их удаление аутофагией, подвижность органелл и контакты с другими структурами (Giacomello 2020). Чтобы судить о механизме, измеряют не только форму, но и сами процессы — частоту событий слияния и деления, обмен содержимым между органеллами; об этом шаг «Как узнать, какая машина изменена».Меняйте константы на схеме: учебная модель показывает, как их отношение задаёт число органелл, а сами константы вместе с числом органелл — число событий в минуту. Каждое положение ползунков — стационарное состояние, которое установилось бы после долгого ожидания; при очень малых константах заметна заданная в модели поправка на рост клеток. Если остановить обе машины, стационарного состояния нет, и модель сохраняет последнее рассчитанное состояние.Типичная ошибка Фрагментированная сеть означает, что в клетке усилено деление митохондрий.Та же фрагментация возникает при ослабленном слиянии. Форма сети отражает отношение констант двух процессов, поэтому вывод о том, какой процесс изменён, требует измерения самих событий.После воздействия на культуру клеток доля клеток с фрагментированной сетью митохондрий выросла с 20 до 60 %. Какой вывод из этого наблюдения правомерен?А. В клетках усилено деление митохондрий (неверный вариант)Это один из возможных механизмов, но не единственный: ту же картину даёт и ослабление слияния. Чтобы выбрать между ними, нужно измерить сами события.Б. Картина совместима и с усилением деления, и с ослаблением слияния (верный вариант)Оба изменения приводят к фрагментации. По доле клеток с короткими митохондриями нельзя установить ни причину, ни текущую разность частот событий: после перестройки сети деления и слияния снова почти уравновешены. Нужно измерить сами события и учесть образование и удаление митохондрий (Giacomello 2020).В. В клетках нарушено слияние митохондрий (неверный вариант)Ослабленное слияние — лишь одна из возможных причин. Тот же результат даёт усиленное деление при нормальном слиянии.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаGiacomello M. et al. 2020. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell BiolSesaki H., Jensen R. E. 1999. Division versus fusion: Dnm1p and Fzo1p antagonistically regulate mitochondrial shape. J Cell BiolChen H., Chomyn A., Chan D. C. 2005. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction. J Biol ChemChen H. et al. 2003. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. J Cell BiolСхема — учебная модель практикума (вопрос 2, базовый уровень): общая длина сети 120 мкм постоянна, частота делений пропорциональна длине сети, частота слияний — числу органелл; константы условные; каждое положение ползунков — стационарное состояние, переходы во времени не рассчитываются; поправка на рост клеток g = 0,0006 мин⁻¹ существенна при очень малых константах (в практикуме, где ползунки идут с шагом 1 %, при одинаковом положении обоих ползунков на 1, 2 и 50 % средняя длина — 6,7; 5,5 и 4,4 мкм; на этой схеме при 5 % — 4,8 мкм); при нулевых константах обоих процессов модель сохраняет последнее рассчитанное состояние. Двойные мутанты dnm1 fzo1 и зависимость их картины от порядка удаления генов — Sesaki и Jensen 1999 (дрожжи). Многофакторность морфологии — обзор Giacomello 2020.
Слияние и деление · шаг 9 из 30Как сливаются две мембраны митохондрии и почему деполяризованная органелла не сливаетсяУ митохондрии две мембраны, и сливают их две разные машины: наружные — митофузины MFN1 и MFN2, внутренние — OPA1 вместе с кардиолипином. Слияние идёт по шагам: сначала мембраны сближаются, затем сливаются наружные, затем внутренние, и только после этого объединяется матрикс. Длинная форма OPA1 нужна для слияния внутренних мембран; при потере потенциала протеаза OMA1 расщепляет её, и органелла перестаёт сливаться.Митофузины на двух соседних митохондриях связываются друг с другом (в trans) и удерживают наружные мембраны рядом: это сближение, но не слияние. Затем, по данным на митохондриях дрожжей in vitro, гидролиз GTP переводит контакт в слияние, и наружные мембраны становятся одной непрерывной мембраной.По данным реконструкции in vitro, длинная форма OPA1 вместе с кардиолипином сначала сближает внутренние мембраны, а гидролиз GTP запускает их слияние; только после этого матриксы двух органелл объединяются.При потере мембранного потенциала активируется протеаза OMA1 и расщепляет длинную форму OPA1: слияние внутренних мембран прекращается. Сам потенциал мембраны не сближает; связь идёт через протеолиз.Слияние митохондрий идёт в несколько стадий, потому что у органеллы две мембраны и две разные машины. Стадии надо различать. Сближение, или тетеринг, — это удержание двух целых мембран на малом расстоянии: бислои остаются раздельными, содержимое не смешивается. Слияние — перестройка, после которой липидный бислой двух мембран становится непрерывным, а содержимое, ограниченное этой мембраной, может смешиваться. Между ними в общей теории слияния выделяют гемифузию, когда соединены только обращённые друг к другу листки бислоёв; для митофузинов и OPA1 это состояние в источниках шага не разобрано, поэтому на схеме оно не показано. Наружные и внутренние мембраны сливаются раздельными стадиями, которые можно разобщить (см. ниже).Сближение и слияние наружных мембран выполняют митофузины MFN1 и MFN2 — ГТФазы наружной мембраны. Митофузин нужен на обеих соседних митохондриях: участки HR2 двух молекул образуют антипараллельную двойную спираль, концы которой с трансмембранными сегментами лежат в разных мембранах, поэтому такой димер связывает органеллы ещё до слияния (Koshiba 2004). Дальше процесс зависит от гидролиза GTP: на изолированных митохондриях дрожжей методом электронной криотомографии показано, что циклы гидролиза GTP постепенно собирают вокруг области контакта кольцо из белков (docking ring), а последующий гидролиз запускает слияние наружной мембраны на периферии области контакта (Brandt 2016). Эти данные получены на дрожжевых митофузинах in vitro; для клеток млекопитающих такая последовательность служит моделью. Митофузины частично заменяют друг друга: в эмбриональных фибробластах мыши без одного из них слияние резко ослаблено и сеть фрагментирована у большинства клеток (Chen 2003), а без обоих не идёт слияние ни наружных, ни внутренних мембран, и сеть распадается на мелкие фрагменты (Chen 2005; Song 2009).Внутренние мембраны сливает OPA1 — ГТФаза внутренней мембраны, действующая вместе с кардиолипином, липидом, характерным для внутренней мембраны митохондрий. В реконструкции in vitro с очищенным человеческим L-OPA1 было достаточно, чтобы L-OPA1 находился в одной мембране, а кардиолипин — в противоположной: связывание L-OPA1 с кардиолипином, не требующее GTP, сначала удерживает мембраны рядом, а затем гидролиз GTP запускает слияние; эту реакцию может изменять присутствие S-OPA1 (Ban 2017). Это минимальная система in vitro, и выводы о клетке по ней делают с оговоркой. В клетках OPA1 не нужен одновременно на обеих соседних митохондриях, в отличие от митофузинов (Song 2009); это согласуется с моделью, в которой достаточно L-OPA1 на одной из двух мембран, но само по себе её не доказывает. OPA1 существует в двух формах: длинная (L-OPA1) закреплена в мембране, короткая (S-OPA1) образуется при её расщеплении протеазами OMA1 и YME1L. В клетках, где обе протеазы удалены и короткой формы нет, митохондрии сливаются нормально: для слияния достаточно длинной формы (Anand 2014). Раньше при экспрессии отдельных форм в клетках без OPA1 слияние восстанавливала только смесь длинных и коротких форм (Song 2007); эти данные пока не согласованы. В клетках без гена OPA1 наружные мембраны соседних митохондрий сливаются, а внутренние — нет: митохондрии часто содержат несколько матриксных компартментов под общей наружной мембраной (Song 2009); при подавлении OPA1 малыми РНК в гибридах клеток не сливались и наружные мембраны (Chen 2005), так что данные о наружных мембранах расходятся.Принципиально важна связь слияния с состоянием органеллы. Мембранный потенциал сам не сближает мембраны и не удерживает их порознь: связь идёт через протеолиз. При потере потенциала или ATP активируется протеаза OMA1 и расщепляет почти всю длинную форму OPA1 (Head 2009, Ehses 2009). Поэтому, как предполагают, деполяризованная митохондрия не может слить внутреннюю мембрану со здоровой сетью и не смешивает с ней свой матрикс. Протонофор CCCP, снимающий потенциал, одновременно прекращает слияние и сдвигает баланс к делению; саму фрагментацию выполняет DRP1. В клетках HeLa с подавленной OMA1 сеть после CCCP всё равно распадалась, но после отмывания протонофора восстанавливалась быстрее (Head 2009).Переключайте стадии на схеме: видно, какая машина и какое состояние мембран соответствуют каждому шагу — от сближения до общего матрикса — и где цепочку обрывает OMA1.Типичная ошибка Для слияния митохондрий достаточно митофузинов наружной мембраны.Митофузины сближают и сливают только наружные мембраны. Внутренние сливает OPA1; без неё наружные мембраны могут слиться (Song 2009), а матриксы двух органелл остаются раздельными, и обмен содержимым не происходит.В клетках дикого типа митохондрии деполяризовали протонофором CCCP. Почему они перестают сливаться с соседними органеллами?А. Протеаза OMA1 расщепляет длинную форму OPA1 (верный вариант)При потере потенциала активируется OMA1 и переводит длинную форму OPA1 в короткую. Без длинной формы внутренние мембраны не сливаются.Б. CCCP разрушает митофузины наружной мембраны (неверный вариант)CCCP переносит протоны через внутреннюю мембрану и снимает потенциал; митофузины он не разрушает. Слияние останавливается из-за расщепления OPA1 протеазой OMA1.В. Без потенциала DRP1 перестаёт работать (неверный вариант)DRP1 — машина деления, а не слияния, и при деполяризации её на мембране становится скорее больше. Слияние прекращается потому, что OMA1 расщепляет длинную форму OPA1.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаChen H. et al. 2003. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. J Cell BiolChen H., Chomyn A., Chan D. C. 2005. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction. J Biol ChemSong Z. et al. 2007. OPA1 processing controls mitochondrial fusion and is regulated by mRNA splicing, membrane potential, and Yme1L. J Cell BiolSong Z. et al. 2009. Mitofusins and OPA1 mediate sequential steps in mitochondrial membrane fusion. Mol Biol CellAnand R. et al. 2014. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. J Cell BiolHead B. et al. 2009. Inducible proteolytic inactivation of OPA1 mediated by the OMA1 protease in mammalian cells. J Cell BiolEhses S. et al. 2009. Regulation of OPA1 processing and mitochondrial fusion by m-AAA protease isoenzymes and OMA1. J Cell BiolKoshiba T., Detmer S. A., Kaiser J. T., Chen H., McCaffery J. M., Chan D. C. 2004. Structural basis of mitochondrial tethering by mitofusin complexes. ScienceBrandt T., Cavellini L., Kühlbrandt W., Cohen M. M. 2016. A mitofusin-dependent docking ring complex triggers mitochondrial fusion in vitro. eLifeBan T., Ishihara T., Kohno H., Saita S., Ichimura A., Maenaka K., Oka T., Mihara K., Ishihara N. 2017. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nat Cell BiolСхема механизма: порядок стадий обобщён по данным разных систем и не наблюдался целиком в одной из них. Тетеринг митофузинов — структура фрагмента HR2 и митохондрии в клетках (Koshiba 2004, по реферату). Docking ring и слияние наружной мембраны — изолированные митохондрии Saccharomyces cerevisiae in vitro, электронная криотомография (Brandt 2016, по реферату). Слияние внутренних мембран — реконструкция с очищенным человеческим L-OPA1, полученным в клетках шелкопряда, и липосомами; в клетках млекопитающих этот механизм прямо не воспроизведён (Ban 2017, по реферату; полный текст не проверялся). Эксперименты на эмбриональных фибробластах мыши: Mfn1⁻/⁻ и Mfn2⁻/⁻ (Chen 2003 — гибриды клеток, полученные с помощью полиэтиленгликоля, через 7 ч), Mfn1⁻/⁻ Mfn2⁻/⁻ (Chen 2005), клетки без OPA1 (Song 2007; раздельное слияние мембран — Song 2009), без YME1L и OMA1 (Anand 2014 — обмен матриксным фотоактивируемым GFP за 60 мин). Индуцируемое расщепление OPA1 протеазой OMA1 — клетки HeLa, 10 мкМ CCCP, 30 мин, подавление OMA1 малыми интерферирующими РНК (Head 2009); эмбриональные фибробласты мыши, CCCP и олигомицин, снижение OMA1 стабилизировало длинные формы (Ehses 2009, рис. 7).
Слияние и деление · шаг 10 из 30Как DRP1 делит митохондрию и что задаёт место деленияДеление выполняет цитозольная ГТФаза DRP1: рецепторы наружной мембраны привлекают её к митохондрии, где она собирается в кольцо и разделяет органеллу. Место деления заранее размечает трубочка ЭПР, а привлечение и активность DRP1 регулируют число рецепторов и фосфорилирование.Трубочка ЭПР охватывает митохондрию в будущем месте деления и сужает её ещё до сборки DRP1; к сужению добавляется полимеризация актина.Рецепторы MFF, FIS1, MiD49 и MiD51 привлекают DRP1 из цитозоля; DRP1 собирается в кольцо вокруг органеллы и при гидролизе GTP сжимает и разделяет мембраны.Фосфорилирование DRP1 по Ser616 (CDK1 в митозе) усиливает деление, по Ser637 (PKA) — ослабляет; кальциневрин, дефосфорилируя Ser637, усиливает привлечение DRP1 к митохондриям.Большая часть DRP1 находится в цитозоле. На наружную мембрану митохондрии её привлекают рецепторы — MFF, FIS1, MiD49 и MiD51. В эмбриональных фибробластах мыши без MFF на митохондриях меньше скоплений DRP1 и органеллы удлиняются, но оставшееся деление обеспечивают другие рецепторы, в том числе MiD49 и MiD51 (Losón 2013). На мембране DRP1 собирается в кольцо вокруг органеллы и за счёт гидролиза GTP сжимает её. В экспериментах на мембранных трубочках DRP1 сама и сжимает, и разделяет мембрану (Kamerkar 2018).Место деления выбирается не случайно. В клетках COS-7 трубочка ЭПР охватывает митохондрию и сужает её в будущей точке деления ещё до появления DRP1 (Friedman 2011); в сужении участвует и полимеризация актина. Позже на тех же клетках и на кардиомиоцитах мыши описаны два типа деления; оба выполняет DRP1 (Kleele 2021). Деление в средней части органеллы идёт с участием ЭПР, актина и MFF и увеличивает число митохондрий. Деление у края, в пределах четверти длины от конца, регулирует FIS1, и ему почти всегда предшествует контакт с лизосомой. Оно отделяет небольшой фрагмент с пониженным мембранным потенциалом и повышенным уровнем активных форм кислорода; около трети таких фрагментов не содержат мтДНК. На фрагменте накапливается белок Parkin, а сам фрагмент направляется на митофагию; в части случаев его поглощение автофагосомой наблюдали непосредственно. Насколько это разделение универсально, ещё проверяют.Активность DRP1 регулируется фосфорилированием по двум остаткам с противоположным эффектом. CDK1 в начале митоза фосфорилирует Ser616, и митохондрии фрагментируются перед распределением между дочерними клетками (Taguchi 2007). PKA фосфорилирует Ser637, и деление ослабевает; кальциневрин дефосфорилирует этот остаток при длительном повышении Ca²⁺, и DRP1 переходит на митохондрии (Cribbs и Strack 2007, Cereghetti 2008). Номера остатков приведены для изоформы 1 DRP1 человека; в работах на белке крысы те же остатки обозначены как Ser585 и Ser656.Переключайте этапы схемы: видно, какой белок вступает на каждом шаге и где действуют киназы.Типичная ошибка DRP1 постоянно находится на митохондрии и делит её там, где случайно окажется.Большая часть DRP1 — в цитозоле; на наружную мембрану её привлекают рецепторы, а место деления заранее размечают трубочка ЭПР и актин.В клетке повысили активность PKA, и DRP1 фосфорилировалась по Ser637. Как изменится частота деления митохондрий?А. Повысится, как при действии CDK1 в митозе (неверный вариант)CDK1 фосфорилирует другой остаток — Ser616, и это усиливает деление. Фосфорилирование Ser637 киназой PKA действует в противоположную сторону.Б. Снизится, и митохондрии станут длиннее (верный вариант)Фосфорилирование Ser637 протеинкиназой A ослабляет деление; сеть смещается в сторону слияния, и митохондрии удлиняются (Cribbs и Strack 2007).В. Не изменится: важен только рецептор MFF (неверный вариант)Рецепторы определяют, сколько DRP1 попадёт на мембрану, но активность самой DRP1 зависит и от фосфорилирования: по Ser637 оно ослабляет деление.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаLosón O. C. et al. 2013. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol CellKamerkar S. C. et al. 2018. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nat CommunFriedman J. R. et al. 2011. ER tubules mark sites of mitochondrial division. ScienceKleele T. et al. 2021. Distinct fission signatures predict mitochondrial degradation or biogenesis. NatureTaguchi N. et al. 2007. Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase Drp1 participates in mitochondrial fission. J Biol ChemCribbs J. T., Strack S. 2007. Reversible phosphorylation of Drp1 by cyclic AMP-dependent protein kinase and calcineurin regulates mitochondrial fission and cell death. EMBO RepCereghetti G. M. et al. 2008. Dephosphorylation by calcineurin regulates translocation of Drp1 to mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S AСхема механизма. Рецепторы — эмбриональные фибробласты мыши с удалёнными Mff и Fis1 и с подавленными РНК-интерференцией MiD49 и MiD51; любой из MiD49 и MiD51 поддерживал деление в отсутствие Mff и Fis1 (Losón 2013); разделение мембран одной DRP1 — реконструкция на мембранных трубочках и клетки без динаминов (Kamerkar 2018); трубочки ЭПР — клетки COS-7 и дрожжи (Friedman 2011); два типа деления — Kleele 2021, полный текст: клетки COS-7 (положение деления, ЭПР, актин, лизосомы, Parkin, нуклеоиды), постнатальные кардиомиоциты мыши (бимодальное положение делений, стимуляция изопротеренолом), клетки U2OS с эндогенно меченными MFF и FIS1, эмбриональные фибробласты мыши Mff⁻/⁻ и Fis1⁻/⁻ (нокаут Mff снижает только срединные деления, нокаут Fis1 — только периферические). Ser616 (у крысы Ser585) — клетки HeLa в митозе (Taguchi 2007); Ser637 (у крысы Ser656) — культуры клеток (Cribbs и Strack 2007; Cereghetti 2008 — клетки HeLa).
Слияние и деление · шаг 11 из 30Какие функции выполняют слияние и деление митохондрийСлияние объединяет содержимое органелл и позволяет им восполнять недостающие продукты: это комплементация. Деление отделяет повреждённый участок и делает митохондрии достаточно малыми для транспорта по отростку и для аутофагии.После слияния белки, тРНК и метаболиты двух органелл перемешиваются, а молекулы мтДНК остаются в своих нуклеоидах.При делении дочерние органеллы часто различаются по потенциалу; деполяризованная дочерняя органелла редко сливается снова и удаляется митофагией.Деление облегчает перенос митохондрий по узкому отростку и их удаление аутофагией, хотя не во всех случаях обязательно для этого.Слияние нужно прежде всего для обмена содержимым. Митохондриальная ДНК упакована в нуклеоиды — компактные белково-нуклеиновые частицы, основной упаковывающий белок которых TFAM. В клетках человека, несущих две разные мутантные мтДНК с непересекающимися делециями, после слияния клеток синтез митохондриальных белков восстановился, хотя каждая мтДНК по отдельности его не обеспечивала. При этом нуклеоиды не обменивались геномами: продукты обоих геномов — тРНК, рРНК и белки — стали общими, а сами молекулы ДНК остались в своих нуклеоидах (Gilkerson 2008). Комплементация — это обмен продуктами, а не перемешивание геномов.Отсюда понятна гетероплазмия: если часть копий мтДНК несёт мутацию, нормальные копии восполняют недостающие продукты, и дефект проявляется только при доле мутантных копий выше порога. Порог не универсален: он зависит от варианта мтДНК, ткани и числа копий. Без слияния такая комплементация невозможна, и в клетках без обоих митофузинов часть митохондрий теряет потенциал, а дыхание клеток снижается (Chen 2005).Деление выполняет противоположную функцию — разделение. В β-клетках поджелудочной железы при делении дочерние органеллы часто различались по потенциалу; дочерняя органелла с пониженным потенциалом и меньшим количеством OPA1 редко сливалась снова и затем удалялась аутофагией, а подавление деления уменьшало удаление митохондрий (Twig 2008). Деление нужно и механически: оно облегчает распределение митохондрий между дочерними клетками, перенос по узкому аксону и поглощение автофагосомой. Однако клетки Drp1⁻/⁻ делятся, хотя и медленнее (Wakabayashi 2009), а митофагия в клетках млекопитающих может идти и без DRP1 (Yamashita 2016). В нейронах мыши без DRP1 митохондрии скапливались в теле клетки и плохо распределялись по отросткам (Ishihara 2009) — это связь с транспортом из вопроса 1.Переключайте состояния схемы: видно, какие компоненты при слиянии становятся общими и что отделяет деление.Типичная ошибка При слиянии митохондрий их ДНК смешивается и рекомбинирует, поэтому мутация разбавляется.Молекулы мтДНК остаются в своих нуклеоидах; общими становятся продукты геномов — тРНК, рРНК и белки. Комплементация — обмен продуктами, а не геномами.Слили клетки двух линий человека; в каждой мтДНК несёт свою делецию и сама по себе не обеспечивает синтез митохондриальных белков. Синтез восстановился. Что произошло с мтДНК в митохондриях гибридных клеток?А. Две мтДНК рекомбинировали и дали нормальный геном (неверный вариант)Рекомбинация не понадобилась: продукты двух геномов восполнили друг друга, а сами молекулы ДНК остались раздельными (Gilkerson 2008).Б. Геномы остались раздельными, продукты стали общими (верный вариант)После слияния тРНК, рРНК и белки обоих геномов стали доступны общему матриксу, а нуклеоиды сохранили свою мтДНК — это комплементация без обмена геномами.В. Нуклеоиды обменялись молекулами мтДНК поровну (неверный вариант)Нуклеоиды не обменивались геномами: в эксперименте каждая мтДНК оставалась в своих нуклеоидах, а восстановление синтеза обеспечили общие продукты.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаGilkerson R. W. et al. 2008. Mitochondrial nucleoids maintain genetic autonomy but allow for functional complementation. J Cell BiolChen H., Chomyn A., Chan D. C. 2005. Disruption of fusion results in mitochondrial heterogeneity and dysfunction. J Biol ChemTwig G. et al. 2008. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO JIshihara N. et al. 2009. Mitochondrial fission factor Drp1 is essential for embryonic development and synapse formation in mice. Nat Cell BiolStewart J. B., Chinnery P. F. 2015. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nat Rev GenetWakabayashi J. et al. 2009. The dynamin-related GTPase Drp1 is required for embryonic and brain development in mice. J Cell BiolYamashita S. et al. 2016. Mitochondrial division occurs concurrently with autophagosome formation but independently of Drp1 during mitophagy. J Cell BiolКомплементация без обмена мтДНК — гибриды клеток человека с двумя мтДНК с непересекающимися делециями (Gilkerson 2008). Потеря потенциала и снижение дыхания в клетках без слияния — эмбриональные фибробласты мыши Mfn1⁻/⁻ Mfn2⁻/⁻ (Chen 2005). Неравные дочерние органеллы и удаление аутофагией — β-клетки (линия INS1 и первичные β-клетки мыши; Twig 2008). Распределение митохондрий в отростках — нейроны мыши без DRP1 в культуре (Ishihara 2009). Деление клеток Drp1⁻/⁻ — эмбриональные фибробласты мыши (Wakabayashi 2009); митофагия без DRP1 — клетки HeLa и дрожжи (Yamashita 2016). Схема без чисел.
Слияние и деление · шаг 12 из 30Можно ли переносить схему митохондрий на другие органеллыУ каждой органеллы своя пара процессов и свои машины; общая ГТФаза деления не означает общей логики. Пероксисомы делятся той же DRP1, но слияния зрелых пероксисом не показано; ЭПР — единая сеть; эндосомы и лизосомы сливаются при участии SNARE и Rab.Пероксисомы делятся с DRP1, MFF и FIS1 после удлинения белками PEX11; слияния зрелых пероксисом между собой у млекопитающих не показано.Трубочки ЭПР сливают атластины, и ЭПР остаётся единой сетью; разделения на отдельные органеллы у него нет.Эндосомы и лизосомы сливаются при участии SNARE, Rab и комплексов-привязок; их «деление» — отделение трубчатых переносчиков груза и восстановление лизосом.Слияние и деление встречаются у многих органелл, но схема митохондрий переносится на них только частично. Пероксисомы делятся с помощью той же DRP1 и части тех же рецепторов — MFF и FIS1; MiD49 и MiD51 остаются митохондриальными. Перед делением белки PEX11 вытягивают пероксисому (Koch 2003, 2010). Слияния зрелых пероксисом между собой у млекопитающих не показано: описаны лишь кратковременные контакты без обмена матриксом (Bonekamp 2012); слияние пре-пероксисомных пузырьков при образовании новых пероксисом — отдельный процесс (Sugiura 2017). Поэтому число пероксисом определяется делением и образованием новых органелл, а не балансом двух процессов.Эндоплазматический ретикулум — противоположный случай: это одна непрерывная сеть, и регулируется не число органелл, а соотношение трубочек и цистерн и число соединений. Трубочки сливают ГТФазы атластины; при их недостатке трубочки перестают соединяться в сеть (Hu 2009). Эндосомы и лизосомы сливаются и друг с другом, и с автофагосомами при участии белков SNARE; скорость и выбор партнёра задают малые ГТФазы Rab, комплексы-привязки и белки SM (Jahn 2024). «Деление» эндосомы — отделение трубчатых переносчиков груза, то есть сортировка, а лизосомы после слияния с автофагосомами восстанавливаются из автолизосом при активном mTORC1 (Yu 2010).Аппарат Гольджи и ядерная оболочка разбираются и собираются заново по фазам клеточного цикла: здесь слияние и деление — этапы программы деления клетки, а не стационарный баланс. Вывод для интерпретации: эффект на митохондрии нельзя без проверки переносить на другие органеллы, а вмешательство в общую машину (например, в DRP1) меняет сразу несколько органелл.Переключите таблицы: в первой — машины и наличие обоих процессов, во второй — что из схемы митохондрий переносится, а что нет.Типичная ошибка Раз DRP1 делит и митохондрии, и пероксисомы, у пероксисом тоже есть баланс слияния и деления.Общая ГТФаза деления не означает общей логики: слияния зрелых пероксисом у млекопитающих не показано, и их число задают деление и образование новых пероксисом.Слияния зрелых пероксисом между собой у млекопитающих не показано. Чем тогда определяется число пероксисом в клетке?А. Балансом слияния и деления, как у митохондрий (неверный вариант)Для баланса нужны оба процесса, а слияния зрелых пероксисом не показано. Схему митохондрий здесь переносить нельзя.Б. Только числом молекул DRP1 в цитозоле (неверный вариант)DRP1 участвует в делении пероксисом, но число органелл задаёт не один белок: важны и PEX11, и рецепторы, и образование новых пероксисом.В. Делением и образованием новых пероксисом (верный вариант)Без слияния число пероксисом определяется делением (PEX11, DRP1, MFF, FIS1) и образованием новых органелл; слияния зрелых пероксисом, парного их делению, не показано.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаBonekamp N. A. et al. 2012. Transient complex interactions of mammalian peroxisomes without exchange of matrix or membrane marker proteins. TrafficSugiura A. et al. 2017. Newly born peroxisomes are a hybrid of mitochondrial and ER-derived pre-peroxisomes. NatureKoch A. et al. 2003. Dynamin-like protein 1 is involved in peroxisomal fission. J Biol ChemKoch J. et al. 2010. PEX11 family members are membrane elongation factors that coordinate peroxisome proliferation and maintenance. J Cell SciWakabayashi J. et al. 2009. The dynamin-related GTPase Drp1 is required for embryonic and brain development in mice. J Cell BiolHu J. et al. 2009. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular ER network. CellJahn R., Cafiso D. C., Tamm L. K. 2024. Mechanisms of SNARE proteins in membrane fusion. Nat Rev Mol Cell BiolYu L. et al. 2010. Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR. NatureСводка данных обзоров и первичных работ: пероксисомы — Koch 2003 (клетки HepG2, доминантно-негативная DRP1 и РНК-интерференция), Koch 2010 (PEX11), Wakabayashi 2009 (удлинённые пероксисомы в фибробластах Drp1⁻/⁻); ЭПР — Hu 2009; слияние в эндосомном пути — обзор Jahn 2024; слияние пероксисом — Bonekamp 2012 (клетки COS-7 и CHO, гибриды клеток), пре-пероксисомы — Sugiura 2017 (фибробласты больных без пероксисом); восстановление лизосом — Yu 2010 (клетки почки крысы). Таблица качественная, без чисел.
Слияние и деление · шаг 13 из 30Почему мутации машин слияния и деления поражают прежде всего длинные аксоныМутации в генах машин слияния и деления вызывают наследственные болезни; это прямой довод, что машины нужны тканям человека. Белки есть почти во всех клетках, а поражаются прежде всего нейроны с длинными отростками.Мутации OPA1 вызывают доминантную оптическую атрофию, мутации MFN2 — нейропатию Шарко — Мари — Тута типа 2A.Доминантно-негативная мутация DNM1L нарушает деление и митохондрий, и пероксисом; мутации ATL1 (слияние трубочек ЭПР) вызывают спастическую параплегию.Генетическая связь показывает, что ген необходим ткани, но не указывает, какое звено механизма — слияние, транспорт или строение крист — нарушено.Наследственные болезни показывают, что машины слияния и деления нужны тканям человека. Мутации OPA1 вызывают доминантную оптическую атрофию — избирательную гибель ганглиозных клеток сетчатки, аксоны которых образуют зрительный нерв (Delettre 2000). Мутации MFN2 вызывают наследственную нейропатию Шарко — Мари — Тута типа 2A с преимущественным поражением самых длинных периферических аксонов (Züchner 2004). У новорождённой девочки с доминантно-негативной мутацией в гене DNM1L, кодирующем DRP1, было нарушено деление сразу и митохондрий, и пероксисом; заболевание было тяжёлым и смертельным (Waterham 2007). Мутации ATL1, кодирующего атластин-1, вызывают наследственную спастическую параплегию с поражением длинных двигательных аксонов (Zhao 2001).Обратите внимание на закономерность: эти белки синтезируются почти во всех клетках, а поражение избирательно. Страдают прежде всего нейроны с самыми длинными отростками и клетки, сильнее других зависящие от окислительного фосфорилирования. Возможное объяснение: именно в этих клетках выше требования к транспорту органелл и к поддержанию сети — митохондрии нужно доставить и сохранить работоспособными на расстоянии до метра от тела клетки.Генетическая связь — сильный, но ограниченный довод. Она показывает, что ген необходим данной ткани в живом организме, но не указывает, какое звено механизма нарушено: слияние, транспорт органелл или строение крист. Каждое промежуточное звено требует отдельного измерения в клетках больных или в модели.Переключайте таблицы: в первой — гены и болезни с источниками, во второй — что генетическая связь доказывает и чего не доказывает.Типичная ошибка Раз белки синтезируются почти во всех клетках, их мутации должны одинаково поражать все ткани.Поражение избирательно: сильнее страдают клетки, где нагрузка на механизм выше, — нейроны с самыми длинными отростками и клетки, зависящие от окислительного фосфорилирования.У ребёнка с мутацией DNM1L удлинены и митохондрии, и пероксисомы. Что этот случай говорит о машинах деления двух органелл?А. У органелл общая ГТФаза деления — DRP1 (верный вариант)DNM1L кодирует DRP1, и мутация этого гена нарушила деление обеих органелл сразу: деление митохондрий и пероксисом выполняет одна ГТФаза (Waterham 2007).Б. Пероксисомы и митохондрии сливаются одинаково (неверный вариант)Случай касается деления, а не слияния. Слияния пероксисом в клетках млекопитающих не описано.В. Пероксисомы образуются делением митохондрий (неверный вариант)Пероксисомы — отдельные органеллы со своими белками деления (PEX11); с митохондриями у них общая ГТФаза деления DRP1.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаDelettre C. et al. 2000. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat GenetZüchner S. et al. 2004. Mutations in the mitochondrial GTPase mitofusin 2 cause Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A. Nat GenetWaterham H. R. et al. 2007. A lethal defect of mitochondrial and peroxisomal fission. N Engl J MedZhao X. et al. 2001. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat GenetChan D. C. 2020. Mitochondrial dynamics and its involvement in disease. Annu Rev PatholГенетические работы: Delettre 2000 (семьи с доминантной оптической атрофией), Züchner 2004 (семьи с CMT2A), Waterham 2007 (один ребёнок, фибробласты кожи), Zhao 2001 (семьи с SPG3A). Связь избирательности с длиной аксонов — гипотеза, а не установленный для каждой болезни механизм. Таблица без чисел.
Слияние и деление · шаг 14 из 30Как узнать, какая машина изменена: слияние или делениеМорфологию, процесс, состояние белков и функцию измеряют отдельно: это разные величины. Восстановление формы вмешательством в противоположную машину — компенсация, а не доказательство причины.Процесс измеряют прямо: число событий слияния и деления при прижизненной съёмке и обмен матриксным маркером между органеллами.Состояние машин показывают соотношение длинной и короткой форм OPA1 на блоте и количество DRP1 на наружной мембране.Функцию измеряют отдельно: TMRM — потенциал (состояние мембраны), потребление кислорода — поток.Морфология сети чувствительна ко многим воздействиям, в том числе к условиям съёмки и фиксации, а одна и та же фрагментация совместима с разными механизмами. Поэтому вывод начинают с прямого измерения процессов. При прижизненной съёмке считают события слияния и деления на органеллу или на клетку в минуту: в эмбриональных фибробластах без DRP1 частота делений оказалась в 17 раз ниже, чем в норме (Wakabayashi 2009). Обмен содержимым измеряют матриксным фотоактивируемым GFP: его активируют светом в части сети и следят, как флуоресценция распространяется на другие органеллы; без слияния она остаётся в исходных органеллах (Anand 2014).Состояние машин оценивают по белкам. На вестерн-блоте видно соотношение длинной и короткой форм OPA1: при потере потенциала почти вся длинная форма исчезает. Для DRP1 важно не общее количество в лизате, а доля на наружной мембране — её оценивают по скоплениям DRP1 на митохондриях при иммунофлуоресценции или по митохондриальной фракции. Функцию измеряют отдельно: TMRM показывает мембранный потенциал, то есть состояние мембраны, а потребление кислорода — поток. После CCCP потенциал падает, а потребление кислорода при оптимальной концентрации протонофора, достаточном количестве субстратов и наличии дыхательного резерва растёт: эти величины нельзя подменять друг другом. Избыток протонофора дыхание подавляет (условия разобраны в семинаре 1).Наконец, нужно различать два вида восстановления фенотипа. Возвращение удалённого белка дикого типа поддерживает вывод о механизме, если возвращается само измеряемое событие, а количество и локализация белка сопоставимы с нормой. Вмешательство в противоположную машину — например, подавление DRP1 при ослабленном слиянии — восстанавливает форму сети, но не слияние: это компенсация фенотипа. Поэтому восстановление формы обходным путём не указывает исходную причину; различать нужно, вернулось ли измеряемое событие.Переключайте схемы методов: для каждого показано, что именно он измеряет и чего не измеряет.Типичная ошибка Если подавление DRP1 устранило фрагментацию, значит, причиной фрагментации было усиленное деление.Подавление деления устраняет фрагментацию при любой причине, в том числе при ослабленном слиянии. Это компенсация; о причине судят по измерению самих событий слияния и деления.В двух линиях клеток сеть митохондрий фрагментирована одинаково. Какое измерение покажет, в какой из них подавлено слияние, а в какой усилено деление?А. Средняя длина митохондрий на фотографиях (неверный вариант)По условию форма сети одинакова, а она совместима с обоими механизмами. Нужно измерять сами события, а не их результат.Б. Общее количество DRP1 в лизате клеток (неверный вариант)Общее количество DRP1 не показывает, сколько её на мембране и как часто идут деления; о слиянии оно не говорит ничего.В. Обмен матриксным маркером и частота событий (верный вариант)При подавленном слиянии матриксный маркер распространяется медленнее и событий слияния меньше; при усиленном делении слияние идёт и событий в целом больше.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаWakabayashi J. et al. 2009. The dynamin-related GTPase Drp1 is required for embryonic and brain development in mice. J Cell BiolAnand R. et al. 2014. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. J Cell BiolSong Z. et al. 2007. OPA1 processing controls mitochondrial fusion and is regulated by mRNA splicing, membrane potential, and Yme1L. J Cell BiolHead B. et al. 2009. Inducible proteolytic inactivation of OPA1 mediated by the OMA1 protease in mammalian cells. J Cell BiolMonzel A. S., Enríquez J. A., Picard M. 2023. Multifaceted mitochondria: moving mitochondrial science beyond function and dysfunction. Nat MetabСхемы методов. Частота делений в клетках Drp1⁻/⁻ — эмбриональные фибробласты мыши, съёмка матриксного GFP (Wakabayashi 2009); обмен матриксным PA-GFP — фибробласты мыши, активировано около 23 % сети, наблюдение 60 мин (Anand 2014); формы OPA1 при потере потенциала — Song 2007 (клетки без OPA1 с отдельными формами OPA1 человека, 20 мкМ CCCP, 4 ч) и Head 2009 (клетки HeLa, 10 мкМ CCCP, 30 мин); ложные выводы из морфологии — учебный разбор. Числа на схемах — учебные.
Конденсаты · шаг 15 из 30Чем компартмент без мембраны отличается от мембранногоВ цитоплазме и ядре есть структуры с устойчивым составом, но без мембраны: ядрышко, ядерные спеклы, стресс-гранулы. Их называют биомолекулярными конденсатами: белки и нуклеиновые кислоты в них локально обогащены, хотя ограничивающей липидной мембраны нет; если сборка возникает путём фазового разделения, её граница — это граница между плотной и разбавленной фазами.Белки и РНК конденсата удерживаются вместе множеством слабых контактов, а не липидной мембраной.В жидкоподобном конденсате молекулы непрерывно переходят между плотной фазой и окружением; мембраны с насосами и переносчиками нет, а состав избирательно задают взаимодействия молекул между собой.Быстрый обмен молекул не означает короткой жизни структуры: ядрышко существует всю интерфазу.Долгое время ядрышко, ядерные спеклы, тельца Кахаля и цитоплазматические гранулы оставались морфологическими объектами. Их называли по-разному — РНК-гранулами, рибонуклеопротеиновыми тельцами, безмембранными (немембранными) органеллами (Горшенева 2024), — видели в микроскопе, но не понимали, что удерживает эти структуры вместе. Перелом наступил, когда P-гранулы зародыша нематоды повели себя как капли жидкости: они были округлыми, сливались при соприкосновении, деформировались потоком и снова собирались (Brangwynne 2009). Сегодня к конденсатам относят десятки структур, среди них параспеклы и PML-тельца в ядре, P-тельца и транспортные РНК-гранулы нейронов в цитоплазме, кластеры нефрина и других мембранных рецепторов у плазматической мембраны (Горшенева 2024, таблица).Биомолекулярный конденсат — компартмент без липидной мембраны, в котором белки и нуклеиновые кислоты локально обогащены по сравнению с окружением. Термин предложили Banani и соавторы (2017); в русской литературе употребляют и краткую форму «биоконденсат» (Горшенева 2024). Такое определение описывает наблюдаемое обогащение, а не механизм: фазовое разделение жидкость — жидкость — лишь один из возможных механизмов сборки, и его нужно доказывать отдельно. Материальное состояние конденсата — жидкость, гель или твёрдоподобная сборка — третья, независимая характеристика (Banani 2017; Mittag 2022). В части литературы слово «конденсат» употребляют уже — только для обратимых сборок, возникших путём фазового разделения, и противопоставляют им агрегаты по строению (Горшенева 2024, рис. 4); в этом семинаре принято широкое описательное определение.Сравним конденсат с мембранным компартментом. Собственный состав есть у обоих, а плотность, ионный состав и другие физико-химические свойства конденсата могут отличаться от окружающей среды. При фазовом разделении возникает граница сосуществующих фаз. Ограничивающей мембраны с насосами и переносчиками у конденсата нет, но состав его избирателен: одни молекулы преимущественно включаются в конденсат, другие исключаются из него; так, полностью собранные рибонуклеопротеиновые частицы вытесняются из ядрышка (Riback 2020). Избирательность задают взаимодействия молекул между собой.Свойства конденсата удобно описывать тремя разными временами. Отдельные молекулы обмениваются с окружением за секунды, структура собирается или разбирается при изменении условий за секунды или минуты, а сама структура может существовать долго: ядрышко — всю интерфазу, стресс-гранула — десятки минут. Переключите варианты на схеме и сравните эти три времени у разных компартментов.Типичная ошибка Если молекулы конденсата обмениваются с окружением за секунды, сам конденсат существует лишь секунды.Обмен отдельных молекул и срок существования структуры — разные величины. Ядрышко обменивается белками за секунды и минуты, но существует всю интерфазу.Белки ядрышка обмениваются с нуклеоплазмой за десятки секунд. Как долго существует само ядрышко в интерфазной клетке?А. Десятки секунд, как и обмен его белков (неверный вариант)Время обмена отдельных молекул не равно сроку существования структуры. Молекулы непрерывно обмениваются с окружением, а ядрышко как целое сохраняется.Б. Всю интерфазу, хотя его белки обновляются (верный вариант)Ядрышко существует, пока идёт транскрипция рибосомной РНК, то есть всю интерфазу; его отдельные молекулы при этом непрерывно обмениваются с окружением.В. Десятки минут, как стресс-гранула (неверный вариант)Ядрышко не временная реакция на воздействие, а постоянная структура интерфазного ядра. Короткоживущие конденсаты, например стресс-гранулы, исчезают после снятия стресса.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаBrangwynne C. P. et al. 2009. Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. ScienceBanani S. F. et al. 2017. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell BiolMittag T., Pappu R. V. 2022. A conceptual framework for understanding phase separation and addressing open questions and challenges. Mol CellLafontaine D. L. J. et al. 2021. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev Mol Cell BiolRiback J. A. et al. 2020. Composition-dependent thermodynamics of intracellular phase separation. NatureГоршенева Н. А., Сопова Ю. В., Азаров В. В., Гризель А. В., Рубель А. А. 2024. Биомолекулярные конденсаты: структура, функции, методы изучения. Успехи биологической химии, т. 64, с. 397–430 (англ. версия: Biochemistry (Moscow), т. 89, прил. 1, с. S205–S223)Сравнение по обзорам Banani 2017, Mittag 2022, Lafontaine 2021, Горшенева 2024 (с. 398–408); избирательное исключение собранных частиц из ядрышка — Riback 2020 (клетки человека); P-гранулы — Brangwynne 2009, зародыш C. elegans. Времена в таблице — порядок величин из этих работ, а не измерение одного эксперимента.
Конденсаты · шаг 16 из 30Почему множество слабых контактов собирает молекулы в сетьКонденсат удерживают многие слабые контакты; устойчивость сборки зависит и от их числа, и от силы отдельных взаимодействий. Для этого молекулы должны быть мультивалентными — иметь несколько участков связывания.Молекула с одним участком связывания образует с партнёром только пару; с двумя — цепочки; с тремя и более — разветвлённую сеть.Чем больше участков связывания, тем при меньшей концентрации возникает сеть, захватывающая много молекул.Мультивалентность белка создают повторы доменов или несколько взаимодействующих участков внутренне неупорядоченной области; РНК тоже может связывать несколько партнёров и входить в сеть.Решающий модельный эксперимент поставили Li и соавторы (2012). Они собрали два искусственных белка: один из нескольких повторов SH3-домена, другой из стольких же пролиновых мотивов, с которыми SH3 связывается. Каждый отдельный контакт слаб: константа диссоциации около 350 мкМ. При смешивании выше определённой концентрации раствор мутнел, и в микроскопе появлялись капли диаметром от микрометра до десятков микрометров, сливавшиеся друг с другом. В каплях белки были концентрированы примерно в сто раз.Порог зависел от валентности: чем больше модулей в молекулах, тем ниже концентрация, при которой появлялись капли. Моновалентный лиганд PRM(H)₁, связывающий SH3 значительно прочнее обычного мотива (константа диссоциации около 10 мкМ), в концентрации 1 мМ препятствовал образованию капель, а обычный одиночный мотив PRM₁ в той же концентрации — нет: важна и сила связывания конкурента. Мультивалентное связывание позволяет молекулам образовывать крупные разветвлённые ассоциаты. Но возникновение связной сети и разделение раствора на фазы — разные переходы: сеть может образоваться и без выделения плотной фазы. В экспериментах Li 2012 образование сети сопровождалось разделением фаз; насколько эти переходы связаны, зависит и от свойств спейсеров — участков, соединяющих модули (Harmon 2017; Горшенева 2024).В природных конденсатах мультивалентность создают повторы доменов межбелкового взаимодействия (например, SH3-доменов белка Nck), протяжённые неупорядоченные области белков (IDR), в том числе домены низкой сложности, а также РНК-связывающие домены вместе с самой РНК (Горшенева 2024). В доменах низкой сложности преобладают немногие аминокислоты, например глицин, пролин, глутамин. Взаимодействия таких молекул описывает модель «липких участков и спейсеров». Липкие участки соединяют молекулы между собой: это могут быть целые модули, как SH3-домены и пролиновые мотивы в эксперименте Li 2012, или отдельные остатки — например, тирозин и фенилаланин, вступающие в катион-π-взаимодействия с аргинином. Спейсеры расположены между липкими участками, и от их взаимодействия с растворителем зависит, сопровождается ли образование сети разделением фаз (Harmon 2017).IDR при этом не обязательна и не достаточна: сеть образуют и глобулярные домены, как в эксперименте с SH3, а многие белки с обширными IDR конденсатов не образуют. Последовательность IDR важна: от распределения заряженных и ароматических остатков зависят и склонность к конденсации, и свойства фазы (Holehouse 2024). По типу партнёров различают гомотипические взаимодействия — между молекулами одного вида, например FUS с FUS, — и гетеротипические — между молекулами разных видов: белка с другим белком или с РНК (Горшенева 2024). Контакты SH3-доменов с пролиновыми мотивами в эксперименте Li 2012 гетеротипические. В ядрышке, тельцах Кахаля, стресс-гранулах и P-тельцах клеток человека, которые состоят из многих белков и РНК, преобладают гетеротипические взаимодействия (Riback 2020).Переключите число модулей на схеме и посмотрите, какие ассоциаты образуются и как меняется порог.Типичная ошибка Если у белка есть протяжённая неупорядоченная область, он обязательно образует конденсат.IDR облегчает образование множественных слабых контактов, но не гарантирует его: многие белки с IDR конденсатов не образуют, а сеть могут создавать и глобулярные мультивалентные домены.Мысленный эксперимент: к раствору белков SH3₅ и PRM₅, образующих капли, добавили большой избыток одиночного пролинового мотива PRM(H)₁, который связывает SH3 прочнее обычного (константа диссоциации около 10 мкМ). Что произойдёт с каплями?А. Капли растворятся: участки связывания будут заняты (верный вариант)Одиночный мотив занимает SH3-домены, но не соединяет молекулы между собой. Число связей в сети падает, и в этом мысленном эксперименте капли растворяются. В работе Li 2012 PRM(H)₁ в концентрации 1 мМ не давал каплям образоваться (по фазовым диаграммам другой пары белков, SH3₅ и PRM(N-WASP)₈); растворение готовых капель там не показано.Б. Капли укрупнятся: в сеть войдут новые молекулы (неверный вариант)Одиночный мотив имеет один участок связывания и не может соединить две молекулы. Он не достраивает сеть, а разрывает её.В. Капли не изменятся: каждый контакт слишком слабый (неверный вариант)Слабость исходных контактов не защищает сеть от прочного конкурента. PRM(H)₁ связывает SH3 прочнее обычного мотива и при большом избытке занимает участки, через которые соединяются молекулы каркаса; система оказывается ниже порога. А слабый одиночный мотив PRM₁ в той же концентрации образованию капель не мешал (Li 2012): важна сила связывания конкурента.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLi P. et al. 2012. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. NatureHarmon T. S., Holehouse A. S., Rosen M. K., Pappu R. V. 2017. Intrinsically disordered linkers determine the interplay between phase separation and gelation in multivalent proteins. eLifeHolehouse A. S., Kragelund B. B. 2024. The molecular basis for cellular function of intrinsically disordered protein regions. Nat Rev Mol Cell BiolBanani S. F. et al. 2017. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell BiolRiback J. A. et al. 2020. Composition-dependent thermodynamics of intracellular phase separation. NatureГоршенева Н. А., Сопова Ю. В., Азаров В. В., Гризель А. В., Рубель А. А. 2024. Биомолекулярные конденсаты: структура, функции, методы изучения. Успехи биологической химии, т. 64, с. 397–430 (англ. версия: Biochemistry (Moscow), т. 89, прил. 1, с. S205–S223)Li 2012 — очищенные белки SH3ₙ и PRMₙ (n = 1–5) in vitro, а также их коэкспрессия в клетках HeLa; конкуренты — приложение, рис. S8: фазовые диаграммы SH3₅ и PRM(N-WASP)₈ без конкурента и с 1 мМ PRM(H)₁ или PRM₁; сеть и фаза как разные переходы, роль спейсеров — Harmon 2017 (компьютерное моделирование и теория ассоциативных полимеров); источники мультивалентности, модель липких участков и спейсеров, гомо- и гетеротипические взаимодействия — обзор Горшенева 2024 (с. 409–411); преобладание гетеротипических взаимодействий — Riback 2020 (ядрышко, тельца Кахаля, стресс-гранулы и P-тельца клеток человека); IDR — обзор Holehouse 2024. Пороги на схеме — учебная модель практикума (вопрос 3, базовый уровень), а не числа из работы Li 2012.
Конденсаты · шаг 17 из 30Что такое концентрация насыщения и почему сборка конденсата носит пороговый характерНиже концентрации насыщения каркасный белок существует только в растворе; выше избыток уходит в плотную фазу. Существование порога превращает сборку конденсата в переключатель: малое изменение концентрации вблизи порога меняет состояние системы.При любой концентрации каркасного белка ниже порога капель нет.Выше порога концентрация в разбавленной фазе в идеальном случае остаётся равной порогу, а весь избыток уходит в плотную фазу.Белки-клиенты распределяются в готовую плотную фазу, но для её образования не нужны.Состав конденсата задаётся асимметрично. Различают каркасные белки и белки-клиенты (Горшенева 2024). Каркасные белки — мультивалентные молекулы, контакты между которыми образуют сеть; без них конденсата нет. Белки-клиенты связываются с каркасом и накапливаются в конденсате, но их удаление меняет лишь состав, а не существование структуры. Каркасом может служить и РНК: длинная некодирующая РНК NEAT1 служит структурной основой параспеклов (Горшенева 2024).В простейшем случае — один каркасный компонент в растворителе или два партнёра в неизменном соотношении, которые приближённо рассматривают как один компонент, — поведение системы описывает правило рычага. Пока общая концентрация ниже концентрации насыщения, раствор однороден. Как только она превышает порог, однородный раствор разделяется на две фазы: разбавленную, концентрация в которой равна порогу, и плотную, где белок концентрирован во много раз сильнее. Фазы сосуществуют и обмениваются молекулами, но не смешиваются. Каждая новая молекула сверх порога уходит в плотную фазу, поэтому растёт объём капель, а не концентрация вокруг них.Отсюда следует неочевидное: капли могут занимать около процента объёма и при этом содержать половину молекул белка, если в них белок концентрирован в сто раз. Долю объёма и долю молекул нельзя путать.Реальная клетка сложнее идеального случая. Когда компонентов много, концентрация в разбавленной фазе не остаётся строго постоянной, а состав плотной фазы зависит от концентраций всех участников (Riback 2020). Поэтому порог — свойство конкретного набора компонентов, а не одного белка. Двигайте ползунок концентрации на схеме и сравните кривую с прямой, которая была бы без фазового разделения.Типичная ошибка Если концентрация белка вне капель растёт вместе с его общим количеством, фазового разделения нет.Постоянная концентрация вне капель — свойство идеальной системы из одного каркасного компонента и растворителя. В многокомпонентных конденсатах клетки концентрация насыщения может не быть постоянной: у ядрышка и других исследованных конденсатов клеток человека концентрация вне капель росла вместе с общим количеством белка (Riback 2020). Поэтому отсутствие плато само по себе фазового разделения не исключает.Порог для каркасного белка — 60 мкМ. Его общую концентрацию подняли со 100 до 200 мкМ. Как изменится концентрация белка в разбавленной фазе в идеальной модели?А. Удвоится вместе с общей концентрацией (неверный вариант)Так было бы без фазового разделения. Выше порога избыток уходит в капли, и раствор вокруг них остаётся насыщенным.Б. Останется равной порогу, 60 мкМ (верный вариант)В идеальной модели с одним эффективным каркасным компонентом разбавленная фаза насыщена, её концентрация равна порогу; прибавка белка увеличивает объём плотной фазы.В. Упадёт до нуля: весь белок уйдёт в капли (неверный вариант)Капли находятся в равновесии с насыщенным раствором: вне капель остаётся белок в концентрации порога.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLi P. et al. 2012. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. NatureRiback J. A. et al. 2020. Composition-dependent thermodynamics of intracellular phase separation. NatureMittag T., Pappu R. V. 2022. A conceptual framework for understanding phase separation and addressing open questions and challenges. Mol CellГоршенева Н. А., Сопова Ю. В., Азаров В. В., Гризель А. В., Рубель А. А. 2024. Биомолекулярные конденсаты: структура, функции, методы изучения. Успехи биологической химии, т. 64, с. 397–430 (англ. версия: Biochemistry (Moscow), т. 89, прил. 1, с. S205–S223)Идеальная модель с одним эффективным каркасным компонентом: смесь двух партнёров 1 : 1 рассматривается как один компонент (правило рычага); числа — учебная модель практикума (вопрос 3, базовый уровень): пороги 120, 60 и 30 мкМ для 3, 4 и 5 модулей, обогащение плотной фазы в 100 раз (порядок данных Li 2012). Отклонение от идеального поведения в клетке — Riback 2020 (ядрышко и другие конденсаты клеток человека); каркасные белки и белки-клиенты, структурная роль РНК NEAT1, сосуществующие фазы — обзор Горшенева 2024 (с. 398, 409, 412).
Конденсаты · шаг 18 из 30Что сдвигает порог сборки конденсатаПорог зависит от концентрации компонентов, силы контактов между ними и свойств растворителя. В клетке все три величины меняются: модифицируются белки, меняются количество РНК и плотность цитоплазмы.Фосфорилирование меняет заряд неупорядоченной области и набор её контактов; оно может и растворять конденсат, и создавать его.Действие РНК зависит от её отношения к белку: при низком отношении РНК соединяет молекулы белка и способствует сборке, при высоком — препятствует ей.Плотность цитоплазмы, ионная сила и pH меняют силу слабых контактов и сдвигают порог.Знак действия фосфорилирования заранее не задан. Фосфорилирование карбоксиконцевого домена РНК-полимеразы II киназой CDK7 растворяет его капли in vitro (Boehning 2018), а в клетке переводит полимеразу из конденсатов с медиатором в конденсаты с факторами сплайсинга (Guo 2019). Фосфорилирование тирозинов нефрина, напротив, создаёт участки связывания для адаптера Nck; через N-WASP возникает мультивалентная сеть, и на мембране появляются домены, которых без фосфорилирования нет (Li 2012; Kim 2019). Модификация меняет весь ансамбль слабых контактов сразу, поэтому изменение нескольких остатков переключает состояние целой структуры.РНК несёт много участков связывания, но знак её действия зависит от соотношения с белком. При низком отношении РНК к белку она соединяет молекулы белка и способствует образованию капель; при высоком белок связывается в отдельные растворимые комплексы с РНК, и капли не образуются или растворяются (Banerjee 2017; Maharana 2018). Так, высокая концентрация РНК в ядре поддерживает растворимость РНК-связывающих белков FUS и TDP-43, а в цитоплазме, где РНК меньше, они легче образуют конденсаты (Maharana 2018). Поэтому количество РНК в компартменте — регулятор фазового состояния, а не только субстрат.Порог зависит и от растворителя. Delarue и соавторы (2018) показали, что подавление пути mTORC1 снижает концентрацию рибосом в цитоплазме дрожжей и клеток человека; от этого более чем вдвое возрастает эффективная подвижность частиц диаметром 20 нм и более и меняется склонность белков к фазовому разделению. При снижении pH остатки гистидина протонируются, а повышение ионной силы ослабляет электростатические контакты.Переключите воздействия на схеме: видно, в какую сторону сдвигается порог и что происходит с каплями при той же концентрации каркаса.Типичная ошибка Фосфорилирование всегда растворяет конденсаты, потому что добавляет отрицательный заряд.Знак действия зависит от того, какие контакты меняются: фосфорилирование CTD РНК-полимеразы II растворяет его капли, а фосфорилирование нефрина создаёт участки связывания и вызывает сборку.В клетках подавили путь mTORC1, и концентрация рибосом в цитоплазме снизилась. Как это может изменить склонность белков к фазовому разделению?А. Никак: рибосомы не входят в состав конденсатов (неверный вариант)Рибосомы влияют не как компоненты, а как часть плотно заполненного объёма цитоплазмы: от их концентрации зависят подвижность крупных частиц и порог фазового разделения.Б. Изменит: меняется плотность заполнения цитоплазмы (верный вариант)Рибосомы занимают значительную часть объёма цитоплазмы. Снижение их концентрации меняет плотность заполнения и вместе с ней склонность белков к фазовому разделению (Delarue 2018).В. Изменит: mTORC1 фосфорилирует каркасные белки (неверный вариант)В экспериментах Delarue 2018 эффект шёл через концентрацию рибосом, а не через прямое фосфорилирование каркасных белков киназой mTORC1.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаBoehning M. et al. 2018. RNA polymerase II clustering through carboxy-terminal domain phase separation. Nat Struct Mol BiolGuo Y. E. et al. 2019. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. NatureKim S. et al. 2019. Phosphorylation of nephrin induces phase separated domains that move through actomyosin contraction. Mol Biol CellLi P. et al. 2012. Phase transitions in the assembly of multivalent signalling proteins. NatureBanerjee P. R. et al. 2017. Reentrant phase transition drives dynamic substructure formation in ribonucleoprotein droplets. Angew Chem Int Ed EnglMaharana S. et al. 2018. RNA buffers the phase separation behavior of prion-like RNA binding proteins. ScienceDelarue M. et al. 2018. mTORC1 controls phase separation and the biophysical properties of the cytoplasm by tuning crowding. CellCTD — Boehning 2018 (очищенный белок, CDK7) и Guo 2019 (клетки млекопитающих); нефрин — Li 2012 (in vitro) и Kim 2019 (мембраны и клетки); РНК — Banerjee 2017 (капли синтетических аргининбогатых пептидов и белка FUS с РНК in vitro; растворение при избытке РНК авторы связывают с инверсией заряда комплексов) и Maharana 2018 (FUS и TDP-43 in vitro и в клетках HeLa); плотность цитоплазмы — Delarue 2018 (дрожжи и клетки HEK293). Направления сдвига на схеме — по этим работам; положение порога условное, без чисел.
Конденсаты · шаг 19 из 30Какие функции выполняют конденсаты: концентрирование, секвестрация, организация ядраКонденсат может ускорять реакцию, изымать молекулы из работы и делить пространство ядра без мембран. Но каждую функцию нужно отделять от сопутствующих событий: стресс-гранула — следствие остановки трансляции, а не её причина.Концентрирование фермента и субстрата ускоряет реакцию, но лишь в определённых пределах.При стрессе инициация трансляции подавляется, рибосомы диссоциируют от мРНК, и свободные мРНК с G3BP1/G3BP2 собираются в гранулы.Клетки без G3BP1 и G3BP2 гранул не образуют, но синтез белка при стрессе подавляют так же.Обзоры перечисляют много функций конденсатов: участие в реализации генетической информации, быстрый и обратимый ответ на стресс, регуляцию концентрации белков и нуклеиновых кислот, ускорение химических реакций, временную инактивацию молекул, сортировку и транспорт макромолекул, образование центров нуклеации, передачу сигнала (Горшенева 2024). Ниже разобраны три: повышение локальной концентрации участников реакции, секвестрация и организация ядра.Первая функция — повышение локальной концентрации участников реакции. В реконструированной системе ферменты SUMO-илирования, собранные в капли, работали до 36 раз быстрее, чем в окружающем растворе; ускорение складывалось из повышения концентрации и изменения сродства фермента к субстрату и зависело от субстрата (Peeples 2021). Повышение концентрации само по себе ускорения не гарантирует.Вторая функция — секвестрация, временное изъятие молекул из работы. Здесь полезно разделить события. Стресс подавляет инициацию трансляции (например, через фосфорилирование eIF2α), рибосомы диссоциируют от мРНК, и появляется пул свободных рибонуклеопротеинов. Затем белки G3BP1 и G3BP2 при связывании свободной РНК меняют конформацию и собирают гранулу (Guillén-Boixet 2020; Yang 2020). Клетки U2OS без G3BP1 и G3BP2 гранул в ответ на арсенит не образовывали, но синтез белка подавляли так же, как обычные клетки (Kedersha 2016). Значит, гранула — следствие остановки трансляции.Третья функция — организация ядра. Ядро не имеет внутренних мембран, и ядрышко, спеклы, тельца Кахаля являются конденсатами. Ядрышко ведёт себя как многофазная жидкость: его слои соответствуют последовательным этапам сборки рибосом (Lafontaine 2021). Роль фазового разделения в транскрипционных конденсатах на энхансерах пока остаётся открытым вопросом (Pei 2025).Переключите состояния на схеме и проследите, какие события стресса зависят от G3BP, а какие нет.Типичная ошибка Стресс-гранула останавливает трансляцию, поглощая мРНК и рибосомы.Последовательность обратная: сначала подавляется инициация трансляции, затем из освободившихся мРНК собирается гранула. Клетки без G3BP1 и G3BP2 гранул не образуют, но синтез белка при стрессе подавляют так же.Клетки без G3BP1 и G3BP2 обработали арсенитом натрия. Как изменится синтез белка по сравнению с обработанными обычными клетками?А. Будет подавлен так же, хотя гранул нет (верный вариант)Подавление трансляции при стрессе идёт через фосфорилирование eIF2α и не требует гранул: в экспериментах Kedersha 2016 клетки без G3BP1/2 подавляли синтез белка так же, как обычные.Б. Не будет подавлен: нечем изъять мРНК (неверный вариант)Гранула не причина, а следствие остановки инициации трансляции. Без G3BP1/2 гранул нет, а синтез белка всё равно подавляется.В. Будет подавлен сильнее, чем в обычных клетках (неверный вариант)В экспериментах Kedersha 2016 синтез белка при стрессе подавлялся в клетках без G3BP1/2 так же, как в обычных, — не сильнее и не слабее.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаPeeples W., Rosen M. K. 2021. Mechanistic dissection of increased enzymatic rate in a phase-separated compartment. Nat Chem BiolKedersha N. et al. 2016. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell BiolGuillén-Boixet J. et al. 2020. RNA-induced conformational switching and clustering of G3BP drive stress granule assembly by condensation. CellYang P. et al. 2020. G3BP1 is a tunable switch that triggers phase separation to assemble stress granules. CellLafontaine D. L. J. et al. 2021. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev Mol Cell BiolPei G. et al. 2025. Transcription regulation by biomolecular condensates. Nat Rev Mol Cell BiolГоршенева Н. А., Сопова Ю. В., Азаров В. В., Гризель А. В., Рубель А. А. 2024. Биомолекулярные конденсаты: структура, функции, методы изучения. Успехи биологической химии, т. 64, с. 397–430 (англ. версия: Biochemistry (Moscow), т. 89, прил. 1, с. S205–S223)Перечень функций — обзор Горшенева 2024 (с. 400). Ускорение реакции — Peeples 2021 (реконструированная система SUMO-илирования). Стресс-гранулы — Kedersha 2016 (клетки U2OS без G3BP1/2, арсенит натрия; синтез белка оценён по включению пуромицина), Guillén-Boixet 2020 и Yang 2020 (G3BP как переключатель сборки). Ядрышко — Lafontaine 2021; транскрипционные конденсаты — обзор Pei 2025. Схема — последовательность событий, без чисел.
Конденсаты · шаг 20 из 30Почему жидкоподобная капля может превратиться в агрегатКапли некоторых белков со временем меняют физические свойства, и обмен молекул в них замедляется; так ведут себя, например, капли очищенного FUS in vitro. Замены в неупорядоченных областях FUS и hnRNPA1, найденные у больных, в экспериментах in vitro ускоряют этот переход жидкость — твёрдое.В каплях очищенных FUS и hnRNPA1 при длительной инкубации in vitro могут возникать упорядоченные межмолекулярные структуры, и обмен молекул замедляется.В экспериментах in vitro патогенная замена G156E ускоряет переход капель очищенного FUS в твёрдоподобное, волокнистое состояние.Агрегаты бывают аморфными и упорядоченными; конденсат может ускорять агрегацию, но может и препятствовать ей.Белки с протяжёнными неупорядоченными областями низкой сложности — FUS, hnRNPA1, TDP-43 — образуют жидкоподобные конденсаты. Patel и соавторы (2015) показали, что FUS собирается в жидкоподобные компартменты в местах повреждения ДНК и в цитоплазме при стрессе. Капли очищенного FUS in vitro со временем теряли подвижность и переходили в агрегированное состояние с амилоидоподобными фибриллами, а замены, найденные у больных боковым амиотрофическим склерозом, ускоряли этот переход. Для hnRNPA1 показано, что в каплях плотной фазы образование фибрилл ускоряется (Molliex 2015).Многие патогенные замены в FUS, hnRNPA1 и TDP-43 расположены в неупорядоченных областях, и эксперименты in vitro показывают один из возможных путей их действия. Однако прямых доказательств перехода конденсатов в амилоидные агрегаты в живой клетке практически нет (Горшенева 2024), поэтому эксперимент с каплями очищенного белка не устанавливает механизма болезни.Важно различать механизм сборки и её материальное состояние. Термин «конденсат» в семинаре описывает обогащение без мембраны и включает жидкоподобные, гелеподобные и твёрдоподобные сборки (шаг «Что такое биомолекулярный конденсат»). Агрегаты могут быть аморфными или упорядоченными; амилоидные фибриллы — один из вариантов. В этом сравнении речь идёт об устойчивой сборке с медленным обменом. Внутри конденсата агрегация может ускоряться за счёт высокой концентрации, но в других условиях конденсация препятствует ей, изымая белок из раствора (Visser 2024). Поэтому ни яркий фокус, ни даже медленный обмен сами по себе не устанавливают механизм сборки.На схеме — учебная модель созревания: подвижная фракция FRAP у капель FUS дикого типа и с заменой G156E в зависимости от времени.Типичная ошибка Конденсат и агрегат — одно и то же: оба выглядят как яркие скопления белка.По виду фокуса нельзя установить ни механизм сборки, ни её материальное состояние. В учебной модели свежие капли быстро обмениваются компонентами и растворяются ниже порога, а агрегат обменивается медленно; созревание капли в агрегат — отдельный, обычно медленный процесс. Эти модельные признаки не являются общим определением всех конденсатов и агрегатов.Капли FUS дикого типа сразу после образования обмениваются молекулами за секунды. Как изменится их подвижная фракция FRAP через много часов in vitro?А. Останется прежней: жидкое состояние устойчиво (неверный вариант)Жидкоподобное состояние капель очищенного FUS метастабильно: in vitro они со временем теряют подвижность и переходят в твёрдоподобное состояние.Б. Постепенно снизится: капли созревают (верный вариант)При длительной инкубации капель очищенного FUS обмен молекул в них замедляется, и подвижная фракция падает; замена G156E ускоряет этот процесс (Patel 2015).В. Вырастет: капли сольются в одну большую (неверный вариант)Слияние меняет размер капель, но не делает обмен молекул быстрее. Со временем обмен в каплях FUS замедляется.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаPatel A. et al. 2015. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. CellMolliex A. et al. 2015. Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. CellVisser B. S. et al. 2024. The role of biomolecular condensates in protein aggregation. Nat Rev ChemAlberti S. et al. 2019. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. CellГоршенева Н. А., Сопова Ю. В., Азаров В. В., Гризель А. В., Рубель А. А. 2024. Биомолекулярные конденсаты: структура, функции, методы изучения. Успехи биологической химии, т. 64, с. 397–430 (англ. версия: Biochemistry (Moscow), т. 89, прил. 1, с. S205–S223)Patel 2015 — очищенный FUS in vitro и клетки HeLa; Molliex 2015 — hnRNPA1 in vitro; Visser 2024 — обзор; различие экспериментов in vitro и данных о живых клетках, типы агрегатов — обзор Горшенева 2024 (с. 404–408). Кривые на схеме — учебная модель практикума (вопрос 3, продвинутый уровень): подвижная фракция 0,05 + 0,85·exp(−t/τ), τ = 10 ч у белка дикого типа и 2,5 ч у G156E; направление различия — по Patel 2015, числа условные.
Конденсаты · шаг 21 из 30Что доказывает и чего не доказывает яркий фокус в микроскопеЯркий фокус одинаково выглядит у конденсата, у комплексов с обратимо связанным белком, у белка на невидимой органелле и у агрегата. Ни один признак не достаточен сам по себе: нужен набор независимых проверок.FRAP характеризует обмен компонентов, слияние — жидкоподобное поведение, а зависимость от концентрации помогает проверить фазовую модель сборки, но сама её не доказывает.Замены, нарушающие только слабые контакты и сохраняющие специфическое связывание, проверяют, нужна ли для функции именно конденсация.1,6-гександиол растворяет многие сборки, но действует неизбирательно и не годится как доказательство.Наблюдение, что белок сосредоточен в ярких фокусах, не доказывает фазового разделения. Тот же вид имеют устойчивый комплекс, скопление белка на мембранной структуре, невидимой в этом канале, и агрегат (McSwiggen 2019). Различие не косметическое: от него зависит, обратима ли структура, зависит ли она от концентрации и как на неё можно воздействовать.Методические рекомендации требуют набора признаков (Gao 2022). Обратимость и зависимость от концентрации: структура исчезает при снижении концентрации каркаса и появляется при её повышении; самый прямой вариант — оптогенетическая сборка, когда светом управляют олигомеризацией белка и картируют порог прямо в живой клетке (Shin 2017; Bracha 2018). Зависимость от концентрации ещё не отличает фазовое разделение от других кооперативных сборок; её дополняют измерением концентраций внутри и вне структуры (McSwiggen 2019). В простейшей равновесной системе из одного каркасного компонента и растворителя концентрации сосуществующих фаз при неизменных условиях постоянны и не растут вместе с общим количеством белка. В многокомпонентном конденсате они могут меняться вместе с составом системы, поэтому отсутствие такого плато само по себе фазового разделения не исключает (Riback 2020). Обмен компонентов: FRAP. Материальные свойства: округлость, слияние при соприкосновении, деформация.Каждый признак ограничен. Быстрое восстановление FRAP показывает обмен, но не доказывает жидкого состояния: числа зависят от размера обесцвеченного участка и модели расчёта (Taylor 2019). 1,6-гександиол в концентрациях 5–10 %, которыми растворяют капли, почти полностью подавляет киназы и фосфатазы in vitro (Düster 2021) и меняет проницаемость мембран (Горшенева 2024). Наблюдение может менять и сам объект: повышенная экспрессия меченого белка повышает его концентрацию в клетке и способна вызвать конденсацию, которой при обычном уровне белка нет (Горшенева 2024).Самое трудное — показать, что конденсация нужна для функции. Для этого вводят замены, которые нарушают множественные слабые контакты неупорядоченной области, но сохраняют известное специфическое связывание, и проверяют, нарушается ли функция. Этот контроль в работах области часто отсутствует (McSwiggen 2019). Схемы методов — ниже.Типичная ошибка Если белок образует в клетке яркие округлые фокусы, это доказывает фазовое разделение.Округлые яркие фокусы дают и комплексы, и органеллы, и агрегаты. О механизме сборки судят по совокупности независимых измерений — зависимости от концентрации и составу сосуществующих фаз; обмен компонентов и слияние характеризуют динамику и материальное состояние. Постоянство концентраций ожидается лишь в простейшей фазовой модели, а исчезновение фокусов при разведении требует контроля чувствительности регистрации. Роль конденсации в функции проверяют заменами, нарушающими только конденсацию.Какой эксперимент прямо проверяет, что для функции белка нужна именно его конденсация, а не только связывание с партнёром?А. Замены в IDR, сохраняющие связывание с партнёром (верный вариант)Замены ароматических остатков в неупорядоченной области разделяют две способности белка: если исчезают и фокусы, и функция, а связывание сохранено, это довод в пользу роли конденсации.Б. Растворение фокусов гександиолом и проверка функции (неверный вариант)Гександиол действует неизбирательно: он подавляет киназы и фосфатазы и меняет мембраны, поэтому нарушение функции нельзя приписать растворению конденсата.В. Быстрое восстановление флуоресценции фокусов (FRAP) (неверный вариант)FRAP показывает обмен компонентов, но ничего не говорит о том, нужна ли конденсация для функции; быстро восстанавливается и белок, обратимо связанный с комплексами.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMcSwiggen D. T. et al. 2019. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes DevGao Y. et al. 2022. A brief guideline for studies of phase-separated biomolecular condensates. Nat Chem BiolRiback J. A. et al. 2020. Composition-dependent thermodynamics of intracellular phase separation. NatureTaylor N. O. et al. 2019. Quantifying dynamics in phase-separated condensates using fluorescence recovery after photobleaching. Biophys JShin Y. et al. 2017. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. CellBracha D. et al. 2018. Mapping local and global liquid phase behavior in living cells using photo-oligomerizable seeds. CellDüster R. et al. 2021. 1,6-Hexanediol, commonly used to dissolve liquid-liquid phase separated condensates, directly impairs kinase and phosphatase activities. J Biol ChemГоршенева Н. А., Сопова Ю. В., Азаров В. В., Гризель А. В., Рубель А. А. 2024. Биомолекулярные конденсаты: структура, функции, методы изучения. Успехи биологической химии, т. 64, с. 397–430 (англ. версия: Biochemistry (Moscow), т. 89, прил. 1, с. S205–S223)Критерии — McSwiggen 2019, Gao 2022; FRAP — Taylor 2019 (капли in vitro и конденсаты клеток HEK293); оптогенетика — Shin 2017 (optoDroplets: IDR FUS, DDX4, HNRNPA1 в клетках NIH 3T3) и Bracha 2018 (Corelets); гександиол — Düster 2021 (ферменты in vitro) и Горшенева 2024 (обзор, с. 413–418: сочетание методов и их ограничения); непостоянство концентрации насыщения в многокомпонентных конденсатах — Riback 2020 (ядрышко и другие конденсаты клеток человека). Схемы — схемы методов, числа условные.
Полярность · шаг 22 из 30Почему полярный домен не может удерживаться сам по себеСтороны полярной клетки различаются: участки её мембраны несут разный набор белков и липидов. Белки мембраны перемешиваются диффузией за минуты, а домены существуют часами, поэтому полярность требует непрерывного поддержания.Мембранный белок с D ≈ 0,1 мкм²/с проходит 10 мкм латеральной диффузией примерно за 250 с.Полярный домен существует часами, значит, его поддерживают потоки доставки и удаления и удержание белков на каркасах, а не отсутствие диффузии.Положение будущего домена задаёт слабый ориентир: внешний градиент, контакт с соседней клеткой или матриксом, внутренняя метка.Клеточная полярность — устойчивая асимметрия клетки: участки плазматической мембраны различаются по составу белков и липидов, цитоскелет ориентирован относительно оси клетки, органеллы распределены неравномерно. У эпителиальной клетки это апикальный и базолатеральный домены, у нейрона — аксон и дендриты, у мигрирующей клетки — передний и задний края.Определение содержит количественное условие. Время, за которое молекула смещается диффузией на расстояние x, оценивают как t ≈ x²/4D. Для мембранного белка с D ≈ 0,1 мкм²/с путь в 10 мкм занимает около 250 с, для липида с D ≈ 0,5 мкм²/с — меньше минуты. Домен, который сохраняется часами, не может удерживаться пассивно: без непрерывной работы диффузия выровняла бы состав мембраны.Исходная асимметрия задаётся ориентиром. У эпителия это контакт с соседними клетками и с внеклеточным матриксом, у дрожжей — рубец от предыдущего деления, у мигрирующей клетки — градиент хемоаттрактанта. Ориентир обычно слаб: концентрация хемоаттрактанта на двух сторонах клетки может различаться на несколько процентов, а различие доменов качественное. Значит, между ориентиром и доменом действует механизм усиления (следующие шаги).Схема рассчитывает оценку t ≈ x²/4D; это порядок величины, а не время конкретного эксперимента.Типичная ошибка Полярность — застывшая структура: белки однажды доставлены к своей мембране и остаются там.Мембранные белки и липиды перемешиваются диффузией за минуты. Домен, существующий часами, поддерживается непрерывными потоками доставки, удержания и удаления.Мембранный белок проходит 10 мкм диффузией примерно за 4 мин, а апикальный домен эпителиальной клетки сохраняется часами. Какой вывод следует из этого сравнения?А. Белки домена не диффундируют в мембране (неверный вариант)Белки мембраны диффундируют; именно поэтому домен и требует поддержания. Неподвижные белки не нуждались бы в доставке и удалении.Б. Домен поддерживается непрерывными потоками (верный вариант)Если бы домен удерживался пассивно, диффузия выровняла бы состав мембраны за минуты. Он существует часами, значит, его поддерживают доставка, удержание и удаление.В. Домен однажды создан и далее не меняется (неверный вариант)Неизменный домен расплылся бы за минуты: состав мембраны выравнивается диффузией. Сохранение домена — результат постоянного оборота белков.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаGünzel D., Lehmann M., Honigmann A. 2026. Tight junction structure, assembly and (dys)function. Nat Rev Mol Cell BiolDevreotes P. N. et al. 2017. Excitable signal transduction networks in directed cell migration. Annu Rev Cell Dev BiolRodriguez-Boulan E., Macara I. G. 2014. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat Rev Mol Cell BiolОценка t ≈ x²/4D — расчёт по заданным параметрам. D ≈ 0,1 мкм²/с — порядок величины для мембранного белка животной клетки; D ≈ 0,5 мкм²/с для липидов эпителиальной клетки — обзор Günzel 2026. Градиент хемоаттрактанта в несколько процентов — обзор Devreotes 2017 (мигрирующие клетки, в том числе Dictyostelium и нейтрофилы).
Полярность · шаг 23 из 30Как слабый ориентир превращается в резкий доменРазличие, заданное ориентиром, усиливает локальная положительная обратная связь. При ограниченном общем запасе компонента домен образуется только в одном участке мембраны.Активная CDC42, связанная с GTP, удерживает на мембране каркасный белок Bem1 вместе с Cdc24.Cdc24 — фактор обмена нуклеотидов: он переводит соседние молекулы CDC42 в активную форму, и кластер растёт.Общий запас CDC42 ограничен, поэтому рост в одном участке идёт за счёт остальной мембраны, и образуется один домен.Наиболее полно разобранный пример — малая ГТФаза CDC42 почкующихся дрожжей. В активной форме, связанной с GTP, она задаёт место сборки актиновых кабелей и роста почки. Активная CDC42 через свой эффектор, PAK-киназу Cla4, связывает каркасный белок Bem1, а с ним — фактор обмена нуклеотидов Cdc24; Cdc24 переводит соседние молекулы CDC42 из GDP-формы в GTP-форму, и в участке мембраны возникает самоусиливающийся кластер.Ориентиром у дрожжей служит рубец от предыдущего деления, сигнал от которого передаёт ГТФаза Rsr1. Эксперименты с клетками без ориентиров показали главное: они всё равно образуют один домен активной CDC42, но в случайном месте. В работе Irazoqui 2003 кластер возникал и без ориентиров, и без микротрубочек и актина, но требовал Bem1; в работе Wedlich-Söldner 2003 поляризация активированной CDC42 зависела от доставки по актиновым кабелям. Ориентир задаёт положение домена, а обратная связь — само его существование.Почему домен один? Общий запас CDC42 в клетке ограничен. Участок, где положительная обратная связь установилась раньше, связывает молекулы CDC42 из цитоплазмы, и в соседних участках их становится недостаточно для собственного кластера; в моделях это называют конкуренцией «победитель получает всё» (Goryachev и Pokhilko 2008). По тем же моделям при слишком малом запасе устойчивого кластера не образуется.Схема показывает качественные исходы для сочетаний трёх условий; это не расчёт.Типичная ошибка Положение и само существование домена задаёт ориентир; без ориентира клетка не поляризуется.Ориентир лишь смещает положение домена. Клетки без ориентиров образуют один домен в случайном месте: его существование обеспечивает положительная обратная связь при ограниченном запасе.У дрожжей удалили ГТФазу Rsr1, передающую сигнал от ориентира, но Bem1 и Cdc24 сохранены. Где будет домен активной CDC42?А. Домена не будет: без ориентира нет поляризации (неверный вариант)Ориентир определяет только место. Клетки без ориентиров образуют домен активной CDC42 за счёт положительной обратной связи через Bem1 и Cdc24.Б. Будет один домен в случайном месте мембраны (верный вариант)Обратная связь через Bem1 и Cdc24 усиливает случайное различие, а ограниченный запас CDC42 оставляет один домен. Без ориентира его положение случайно.В. Появятся домены по всей мембране одновременно (неверный вариант)Общий запас CDC42 ограничен: участок, где кластер вырос раньше, связывает молекулы, которых тогда не хватает остальным участкам, поэтому в норме остаётся один домен.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаIrazoqui J. E., Gladfelter A. S., Lew D. J. 2003. Scaffold-mediated symmetry breaking by Cdc42p. Nat Cell BiolWedlich-Söldner R. et al. 2003. Spontaneous cell polarization through actomyosin-based delivery of the Cdc42 GTPase. ScienceGoryachev A. B., Pokhilko A. V. 2008. Dynamics of Cdc42 network embodies a Turing-type mechanism of yeast cell polarity. FEBS LettChiou J.-G., Balasubramanian M. K., Lew D. J. 2017. Cell polarity in yeast. Annu Rev Cell Dev BiolПочкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Irazoqui 2003: клетки без ориентиров (rsr1), с разрушенными микротрубочками и актином; поляризация требовала Bem1 и гидролиза GTP белком CDC42. Wedlich-Söldner 2003: экспрессия активированной CDC42; поляризация требовала направленной секреции по актиновым кабелям. Конкуренция участков и порог по запасу — расчёт моделей (Goryachev и Pokhilko 2008; обзор Chiou 2017). Исходы на схеме качественные.
Полярность · шаг 24 из 30Как два модуля белков PAR разделяют мембрану на два доменаУсиленное различие превращается в два взаимоисключающих домена, когда модули фосфорилируют друг друга. Так работает система белков PAR: передний модуль вытесняет задний, задний — передний.aPKC переднего модуля фосфорилирует PAR-1 и снижает его способность удерживаться на мембране.PAR-1 заднего модуля фосфорилирует PAR-3; с фосфорилированным PAR-3 связывается белок 14-3-3, и комплекс PAR-3 — PAR-6 — aPKC не собирается.При достаточной нелинейности каждый участок мембраны занят одним модулем, и граница доменов резкая.Систему PAR впервые описали в зиготе нематоды, затем нашли у дрозофилы, в эпителии и нейронах млекопитающих. Передний (в эпителии — апикальный) модуль включает PAR-3, PAR-6 и атипичную протеинкиназу C (aPKC), задний (базолатеральный) — киназу PAR-1. Ключ механизма — во взаимном вытеснении: киназа каждого модуля фосфорилирует компоненты другого и тем удаляет их с мембраны.Оба звена показаны прямо. aPKC фосфорилирует PAR-1b человека по Thr595, и это фосфорилирование снижает и киназную активность PAR-1b, и его связь с плазматической мембраной (Hurov 2004, клетки HeLa). PAR-1 у дрозофилы фосфорилирует Bazooka (PAR-3) по двум консервативным остаткам серина; с ними связывается белок 14-3-3, и Bazooka не образует комплекс с PAR-6 и aPKC. Bazooka без этих участков образует эктопические комплексы на латеральной мембране (Benton и St Johnston 2003).Взаимное ингибирование само по себе не гарантирует двух устойчивых доменов. Нужна достаточная нелинейность — кооперативное связывание или олигомеризация на мембране — и подходящее соотношение концентраций; при других параметрах та же схема даёт одно смешанное состояние (Lang и Munro 2017). В зиготе нематоды домены PAR закладываются потоком коры, который сдвигает передние белки к одному полюсу (Goehring 2011). Перенос выводов между зиготой, эпителием и нейроном требует оговорок.Типичная ошибка Каждый белок PAR сам по себе находит «свою» сторону клетки.Положение модулей задаёт их взаимодействие: каждый модуль фосфорилирует белки другого и вытесняет их с мембраны. Если убрать участок фосфорилирования, белок оказывается и на «чужой» мембране.В эпителии дрозофилы экспрессировали Bazooka (PAR-3) с заменами двух остатков серина, которые фосфорилирует PAR-1. Где окажется этот белок?А. Только на апикальной мембране, как в норме (неверный вариант)В норме Bazooka остаётся только на апикальной мембране потому, что PAR-1 вытесняет её с латеральной. Без участков фосфорилирования это вытеснение не действует.Б. Во всей цитоплазме, без связи с мембраной (неверный вариант)Фосфорилирование киназой PAR-1 удаляет Bazooka с мембраны; без участков фосфорилирования белок не теряет связь с мембраной, а, наоборот, удерживается и там, где в норме отсутствует.В. На апикальной и на латеральной мембране (верный вариант)PAR-1 не может фосфорилировать этот белок, 14-3-3 с ним не связывается, и комплексы Bazooka с PAR-6 и aPKC образуются и на латеральной мембране (Benton и St Johnston 2003).Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаHurov J. B., Watkins J. L., Piwnica-Worms H. 2004. Atypical PKC phosphorylates PAR-1 kinases to regulate localization and activity. Curr BiolBenton R., St Johnston D. 2003. Drosophila PAR-1 and 14-3-3 inhibit Bazooka/PAR-3 to establish complementary cortical domains in polarized cells. CellLang C. F., Munro E. 2017. The PAR proteins: from molecular circuits to dynamic self-stabilizing cell polarity. DevelopmentGoehring N. W. et al. 2011. Polarization of PAR proteins by advective triggering of a pattern-forming system. ScienceHurov 2004: PAR-1b человека, клетки HeLa, остаток Thr595 фосфорилируется киназой aPKC. Benton и St Johnston 2003: эпителий и ооцит дрозофилы, Bazooka (PAR-3) фосфорилируется киназой PAR-1 по двум остаткам серина. Условия бистабильности — обзор Lang и Munro 2017; поток коры в зиготе нематоды — Goehring 2011. Схема качественная.
Полярность · шаг 25 из 30Как доставка, диффузия и эндоцитоз поддерживают доменДомен — стационарное состояние трёх потоков: доставки в домен, удержания в нём и удаления ушедших молекул. Резкость границы определяется скоростью удаления: при быстром эндоцитозе белок не успевает отойти далеко от места доставки.Направленная доставка приносит белок в определённую область мембраны по ориентированным трекам.Латеральная диффузия размывает домен, а эндоцитоз удаляет молекулы раньше, чем они уйдут далеко.Ширину домена задаёт длина спада λ = √(D/kэнд); в клетке удалённый белок может возвращаться в домен через рециклирующие эндосомы, в учебной модели этот возврат отдельно не моделируется.Поддержание домена складывается из трёх процессов, и все они уже знакомы. Направленная доставка: секреторные пузырьки перемещаются по микротрубочкам и актиновым филаментам к определённой области мембраны и сливаются с ней при участии комплекса экзоциста. Удержание: каркасные белки коры связывают белки домена с цитоскелетом. Удаление: эндоцитоз изымает молекулы, ушедшие из домена, и они возвращаются через рециклирующие эндосомы или направляются на деградацию.У почкующихся дрожжей так поддерживается полярность белка Snc1: он сосредоточен в почке и на кончике выроста, и для этого необходим его эндоцитоз. В мембране дрожжей Snc1 диффундирует примерно в 40 раз медленнее, чем мембранный белок животной клетки (около 0,0025 мкм²/с), и малой клетке хватает местной доставки и эндоцитозного возврата (Valdez-Taubas и Pelham 2003). Модель, построенная для активированной CDC42, показала, что баланса диффузии, направленного транспорта и эндоцитоза достаточно, чтобы описать форму домена (Marco 2007).В стационарном состоянии профиль концентрации спадает от места доставки с характерной длиной λ = √(D/kэнд). Чем быстрее эндоцитоз, тем уже и резче домен, но тем меньше белка на мембране при том же потоке доставки. Поэтому, если удалённый белок возвращается к полюсу, у скорости эндоцитоза есть оптимум: при слишком быстром удалении на мембране остаётся так мало белка, что домен ослабевает. Marco и соавторы (2007) показали, что измеренные у дрожжей скорости эндоцитоза близки к такому оптимуму. Схема рассчитана по учебной модели практикума: поток доставки в ней постоянен и не зависит от скорости эндоцитоза, возврат удалённого белка к полюсу отдельно не моделируется, поэтому оптимума, описанного Marco 2007, в ней нет.Типичная ошибка Чем больше белка доставлено к полюсу, тем резче домен; эндоцитоз только мешает полярности.Без удаления белок расходится диффузией по всей мембране. Эндоцитоз сужает домен: он убирает молекулы раньше, чем они уйдут от места доставки.Белок доставляется к полюсу клетки; эндоцитоз ускорили в 4 раза, доставка и диффузия прежние. Как изменится ширина домена?А. Уменьшится: белок удаляется ближе к полюсу (верный вариант)Длина спада λ = √(D/kэнд) при четырёхкратном ускорении эндоцитоза уменьшается вдвое: молекулы удаляются раньше, чем отойдут от места доставки.Б. Увеличится: белок быстрее возвращается к полюсу (неверный вариант)В модели поток доставки постоянен, поэтому быстрое удаление домен не расширяет. Ширину определяет путь, который молекула проходит диффузией до удаления, — он сокращается.В. Не изменится: ширину задаёт только доставка (неверный вариант)Доставка задаёт место и высоту домена над фоном, а ширину — отношение диффузии к скорости удаления. Ускорение эндоцитоза сужает домен.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаValdez-Taubas J., Pelham H. R. B. 2003. Slow diffusion of proteins in the yeast plasma membrane allows polarity to be maintained by endocytic cycling. Curr BiolMarco E. et al. 2007. Endocytosis optimizes the dynamic localization of membrane proteins that regulate cortical polarity. CellSnc1 у почкующихся дрожжей — Valdez-Taubas и Pelham 2003; модель для активированной CDC42 у дрожжей — Marco 2007. Схема — расчёт учебной модели практикума (вопрос 4, базовый уровень): окружность 30 мкм, D = 0,1 мкм²/с, постоянный поток доставки; числа условны.
Полярность · шаг 26 из 30Что удерживает апикальный домен эпителиальной клеткиАпикальный и базолатеральный домены эпителия получают белки разными путями доставки. Плотный контакт закрывает промежуток между клетками, но распределение белков по доменам удерживается прежде всего транспортом.NHE3 проходит через рециклирующие эндосомы с Rab11a; Rab11a и Rab8a связывают с пузырьком миозин Vb, и этот мотор переносит пузырёк по актину к апикальной мембране.У апикальной мембраны синтаксин 3 вместе с Munc18-2, Slp4a и Vamp7 обеспечивает слияние пузырька с мембраной, после которого NHE3 оказывается на поверхности.Ошибочно доставленный белок удаляется эндоцитозом и возвращается через рециклирующие эндосомы; без тяжей клаудинов плотного контакта барьер для ионов слабеет, а распределение белков по доменам сохраняется.Энтероцит всасывает вещества потому, что переносчики апикальной и базолатеральной мембран различны: вход и выход вещества разделены, и поток направлен. Белки апикальной мембраны приходят к ней разными путями. В клетках Caco-2 доставка переносчиков NHE3, CFTR и GLUT5 требует Rab11, Rab8, миозина Vb и синтаксина 3; без миозина Vb эти белки распределяются в пузырьках по цитоплазме, а DPPIV, сахараза-изомальтаза и аминопептидаза N остаются на апикальной мембране (Vogel 2015). Доставка избирательна: миозин Vb нужен части грузов, а не домену как таковому.Путь NHE3 удобно разобрать по передачам: на каждой из них груз принимает другой белок или комплекс. NHE3 выбран потому, что для него прямо показана зависимость от миозина Vb и синтаксина 3 и независимость от Vamp3 (Vogel 2015). Сначала, по модели авторов, NHE3 из аппарата Гольджи попадает в рециклирующие эндосомы, на мембране которых находится Rab11a в форме, связанной с GTP; по какому сигналу NHE3 выбирает этот путь, неизвестно. Rab11a и Rab8a служат метками и местами связывания: они удерживают миозин Vb на пузырьке, а по актину движется сам миозин Vb за счёт гидролиза ATP. Миозин Vb с мутациями, нарушающими связь с Rab11 или Rab8, не располагается строго у апикальной мембраны и не восстанавливает полярность клеток без этого миозина (Vogel 2015).Дальше пузырёк оказывается рядом с синтаксином 3. Этот t-SNARE находится в апикальной мембране и без миозина Vb, но взаимодействие синтаксина 3 с Slp4a (белком пузырька, который связывает Rab8a) и с Munc18-2 в клетках без миозина Vb утрачивается; ослабевает и связь синтаксина 3 с Vamp7, а связь с Vamp3 сохраняется. Пузырёк, по предположению авторов, удерживается комплексом экзоциста (субъединица Sec15). Затем, как при любом SNARE-зависимом слиянии, сборка комплекса сближает мембраны пузырька и плазматической мембраны и приводит к их слиянию, и NHE3 оказывается в апикальной мембране. Белки-активаторы ГТФазы Rab (Rab-GAP) TBC1D30 и Evi5 связываются с синтаксином 3 и, как предполагают, переводят Rab8a и Rab11a в неактивную форму, завершая цикл.Границы применимости. Результаты получены на клетках Caco-2 без миозина Vb (мутация 1125G>A, нонсенс-кодон), а взаимодействия белков показаны совместной очисткой из клеточных лизатов: это ассоциация, а не обязательно прямой контакт, и порядок передач — вывод авторов из таких данных. Для NHE3 непосредственно проверены миозин Vb, синтаксин 3 и Vamp3; участие Rab11a, Rab8a, Slp4a, Munc18-2 и Vamp7 следует из их взаимодействий и из нарушений полярности клеток, а не из отдельной проверки положения NHE3. Роль экзоциста и завершающая роль Rab-GAP остаются предположениями. Сигналы, по которым белки распределяются между путями, не найдены; для DPPIV, сахаразы-изомальтазы и аминопептидазы N предполагают путь в обход рециклирующих эндосом, но это не доказано. У части больных и у мышей без Rab8 или Rab11 эти ферменты задерживаются внутри клетки, а в других биоптатах доставка DPPIV и сахаразы-изомальтазы сохранена (обсуждение в Vogel 2015), поэтому разделение путей — результат на клетках Caco-2, а не правило для всех апикальных грузов и тканей.Долго считалось, что тяжи плотного контакта — «изгородь», не пропускающая белки и липиды между доменами. Проверка вмешательством оказалась поучительной. В клетках MDCK II без пяти основных клаудинов тяжей нет, сопротивление монослоя снижено примерно втрое, но апикальные и базолатеральные маркеры распределены как в норме (Otani 2019). Значит, граница доменов поддерживается в основном доставкой, удержанием на каркасах и удалением. Мембранные белки контакта при этом не безразличны: при одновременном удалении клаудинов и JAM-A у части клеток полярность нарушалась (Otani 2019). Для липидов, которые диффундируют быстрее, барьер у контакта, вероятно, важнее (Günzel 2026).Каркас плотного контакта ZO-1 и ZO-2 — отдельный вопрос: в клетках MDCK II без обоих белков полярность нарушалась (Otani 2019), а в клетках EpH4 с подавлением обоих белков сохранялась (Umeda 2006). Результат зависит от типа клеток. Схема рассчитана по учебной модели практикума.Типичная ошибка Полярность эпителия поддерживается плотным контактом: без него белки апикальной и базолатеральной мембран сразу перемешиваются.Без тяжей клаудинов слабеет барьер, но распределение многих белков по доменам сохраняется: его поддерживают направленная доставка и удаление ошибочно доставленного белка.В клетках Caco-2 нет миозина Vb. Где окажутся переносчик NHE3 и фермент DPPIV?А. NHE3 и DPPIV — на апикальной мембране, как в норме (неверный вариант)DPPIV действительно остаётся на апикальной мембране, но NHE3 без миозина Vb туда не доставляется и распределяется в пузырьках по цитоплазме.Б. NHE3 — в пузырьках, DPPIV — на апикальной мембране (верный вариант)Миозин Vb переносит пузырьки с NHE3 к апикальной мембране, а DPPIV доставляется другим путём; так показана избирательность апикальной доставки (Vogel 2015).В. NHE3 и DPPIV — в пузырьках под апикальной мембраной (неверный вариант)Миозин Vb нужен не всем апикальным белкам: DPPIV доставляется другим путём и остаётся на апикальной мембране, в пузырьках задерживается только NHE3.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаVogel G. F. et al. 2015. Cargo-selective apical exocytosis in epithelial cells is conducted by Myo5B, Slp4a, Vamp7, and Syntaxin 3. J Cell BiolOtani T. et al. 2019. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. J Cell BiolUmeda K. et al. 2006. ZO-1 and ZO-2 independently determine where claudins are polymerized in tight-junction strand formation. CellGünzel D., Lehmann M., Honigmann A. 2026. Tight junction structure, assembly and (dys)function. Nat Rev Mol Cell BiolRodriguez-Boulan E., Macara I. G. 2014. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat Rev Mol Cell BiolVogel 2015: клетки Caco-2 с мутацией MYO5B больного (1125G>A), фильтры и трёхмерные цисты. Otani 2019: клетки MDCK II без пяти основных клаудинов, сопротивление 52,5 → 14,5–19,8 Ом·см². Umeda 2006: клетки EpH4 с нокаутом ZO-1 и подавлением ZO-2. Схема — расчёт учебной модели практикума (вопрос 4, продвинутый уровень), числа условны, кроме сопротивления без клаудинов. Цепочка передач: Vogel 2015 — клетки Caco-2 (нокин MYO5B 1125G>A, нокауты Stx3, Rab8a, Vamp3 методом CRISPR/Cas9, подавление Rab11a малой шпилечной РНК); взаимодействия — совместная очистка активных мутантов Rab8a Q67L и Rab11a Q70L из лизатов; положение NHE3, CFTR, GLUT5 и DPPIV — конфокальная микроскопия, ≥ 100 клеток. Тетеринг экзоцистом и прекращение цикла Rab-белков через Rab-GAP — предположения авторов, прямо не проверенные.
Полярность · шаг 27 из 30Как полярность устроена у нейрона и у мигрирующей клеткиУ нейрона полярность разделяет аксон и дендриты, у мигрирующей клетки — передний и задний края. Механизмы те же — избирательный транспорт и взаимное влияние модулей, — но устроены они по-разному.Начальный сегмент аксона отделяет аксон от тела клетки и дендритов и ограничивает свободное перемещение белков.Кинезин KIF5 связывается преимущественно с микротрубочками начального сегмента и потому избирательно переносит грузы в аксон.У мигрирующей клетки RAC1 активен на переднем крае, RHOA — на заднем; на близком расстоянии они подавляют активность друг друга, а на дальнем — повышают.Нейрон — предельный пример полярности. Аксон и соматодендритный отдел различаются составом мембраны, а граница проходит по начальному сегменту аксона — участку у его основания с особой организацией цитоскелета; он генерирует потенциал действия и служит фильтром для белков и грузов (Leterrier 2018). Направленный транспорт тоже избирателен: кинезин KIF5 связывается предпочтительно с микротрубочками начального сегмента, и пузырьки с аксонными белками направляются из аппарата Гольджи прямо в аксон; низкие дозы паклитаксела нарушали эту избирательность, и аксонные белки попадали в кончики дендритов (Nakata и Hirokawa 2003, культивируемые нейроны мыши).У мигрирующей клетки ось — передний и задний края. RAC1 запускает сборку разветвлённого актина и выпячивание переднего края, RHOA — сокращение актомиозина на заднем. Система этих ГТФаз ведёт себя как возбудимая среда: области активации возникают и гаснут, а градиент хемоаттрактанта лишь смещает вероятность их появления (Devreotes 2017).Взаимное подавление RAC1 и RHOA рядом — не вся картина. В нейтрофилоподобных клетках HL-60 показано и дальнее взаимное возбуждение: выпячивания, созданные RAC1, повышают натяжение мембраны и через mTORC2 активируют RHOA на противоположной стороне, а сокращение, вызванное RHOA, через поток коры активирует RAC1 вдали; эта связь нужна для поляризации и миграции первичных Т-лимфоцитов человека (De Belly 2026). Устойчивая ось поддерживается сочетанием локального торможения и дальнего возбуждения.Типичная ошибка Аксон и дендриты различаются только тем, какие белки синтезирует нейрон.Многие белки синтезируются в теле нейрона, а затем избирательно доставляются и удерживаются в своём отделе: кинезин KIF5 связывается преимущественно с микротрубочками начального сегмента, а начальный сегмент аксона служит фильтром. Дополнительный вклад в состав отростков вносят транспорт мРНК и локальная трансляция. Поэтому различие аксона и дендритов определяется совместной работой этих механизмов и барьеров полярности.В мигрирующей клетке оптогенетически вызвали выпячивание переднего края. Как, по данным De Belly 2026, изменится активность RHOA на противоположной стороне клетки?А. Снизится: RAC1 подавляет RHOA во всей клетке (неверный вариант)Взаимное подавление RAC1 и RHOA действует только на близком расстоянии. На противоположной стороне выпячивание через натяжение мембраны и mTORC2 активирует RHOA.Б. Не изменится: сигнал не выходит за край (неверный вариант)Натяжение мембраны передаётся по всей клетке быстро, поэтому выпячивание на переднем крае влияет и на противоположную сторону.В. Повысится: натяжение мембраны активирует RHOA (верный вариант)Выпячивание, вызванное RAC1, повышает натяжение мембраны, и через mTORC2 RHOA активируется на противоположной стороне: передний и задний края активируют друг друга на расстоянии.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаNakata T., Hirokawa N. 2003. Microtubules provide directional cues for polarized axonal transport through interaction with kinesin motor head. J Cell BiolLeterrier C. 2018. The axon initial segment: an updated viewpoint. J NeurosciDevreotes P. N. et al. 2017. Excitable signal transduction networks in directed cell migration. Annu Rev Cell Dev BiolDe Belly H. et al. 2026. Long-range mutual activation establishes Rho and Rac polarity during cell migration. Nat Cell BiolNakata и Hirokawa 2003: культивируемые нейроны мыши, KIF5 и микротрубочки начального сегмента, низкие дозы паклитаксела. Начальный сегмент аксона — обзор Leterrier 2018. Возбудимая среда малых ГТФаз — обзор Devreotes 2017. Дальнее взаимное возбуждение RAC1 и RHOA — De Belly 2026 (оптогенетика в нейтрофилоподобных клетках HL-60 и первичных Т-лимфоцитах человека, сохраняется в эпителиальных клетках). Схема качественная.
Полярность · шаг 28 из 30Как измерить полярность и отличить её от барьераПолярность — это распределение белков и липидов по доменам, барьер — проницаемость промежутков между клетками. Это разные величины, и измеряют их разными методами.Распределение маркеров доменов показывают на вертикальном конфокальном срезе монослоя.Подвижность белка в мембране и обмен между доменами измеряют FRAP.Барьер измеряют трансэпителиальным сопротивлением и потоком меток между клетками.Полярность определяют по положению маркеров: апикальных (у клеток MDCK — gp135, эзрин) и базолатеральных (Na⁺/K⁺-АТФаза, Scribble). Монослой на фильтре метят антителами и рассматривают на вертикальном (XZ) конфокальном срезе; результат — доля маркера на каждой мембране. FRAP мембранного белка или липидного зонда показывает, обменивается ли он с соседними участками и пересекает ли границу доменов.Барьер — отдельная величина. Трансэпителиальное сопротивление измеряют электродами, опущенными по обе стороны фильтра: оно отражает проницаемость межклеточных промежутков для ионов. Поток флуоресцентных меток разного размера с одной стороны монослоя на другую показывает проницаемость для молекул. Эти величины могут меняться независимо от распределения белков: без клаудинов сопротивление падает, а маркеры распределены как в норме (Otani 2019).Медицинский пример — болезнь включений микроворсинок (врождённая атрофия микроворсинок), наследственная болезнь новорождённых с тяжёлой диареей. Её основная причина — мутации MYO5B (Müller 2008; Ruemmele 2010): в энтероцитах меньше микроворсинок, под апикальной мембраной накапливаются пузырьки, а часть апикальных переносчиков, в том числе NHE3, не доставляется к мембране. Нарушена прежде всего доставка, то есть поддержание апикального домена; это видно по распределению белков и ультраструктуре энтероцитов.Типичная ошибка Если сопротивление монослоя снижено, значит, клетки утратили полярность.Сопротивление измеряет барьер для ионов в межклеточных промежутках. Полярность определяют по распределению маркеров доменов; эти величины меняются независимо.После воздействия сопротивление монослоя снизилось втрое, а апикальные и базолатеральные маркеры распределены как в контроле. Какой вывод правомерен?А. Нарушен барьер, полярность сохранена (верный вариант)Сопротивление отражает проницаемость межклеточных промежутков, а распределение маркеров — полярность. Изменилась только первая величина.Б. Нарушены и барьер, и полярность (неверный вариант)Полярность оценивают по распределению маркеров, а оно не изменилось. Снижение сопротивления само по себе о полярности не говорит.В. Нарушена полярность, барьер сохранён (неверный вариант)Снижение сопротивления как раз и означает ослабление барьера для ионов, а маркеры доменов распределены нормально.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаOtani T. et al. 2019. Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity. J Cell BiolMüller T. et al. 2008. MYO5B mutations cause microvillus inclusion disease and disrupt epithelial cell polarity. Nat GenetRuemmele F. M. et al. 2010. Loss-of-function of MYO5B is the main cause of microvillus inclusion disease: 15 novel mutations and a CaCo-2 RNAi cell model. Hum MutatVogel G. F. et al. 2015. Cargo-selective apical exocytosis in epithelial cells is conducted by Myo5B, Slp4a, Vamp7, and Syntaxin 3. J Cell BiolМаркеры, сопротивление и поток меток в клетках MDCK II — Otani 2019. Схема FRAP — в шаге «Чего не доказывает яркий фокус». Болезнь включений микроворсинок: Müller 2008 (мутации MYO5B у больных), Ruemmele 2010 (15 мутаций, подавление MYO5B в клетках Caco-2), Vogel 2015 (NHE3 в клетках Caco-2 с мутацией больного). Схемы методов не масштабны.
Исследование · шаг 29 из 30Как выбрать величину, метод и контрольДля каждого механизма семинара сначала решают, какую величину измерять, затем — каким методом и с каким контролем. Во всех четырёх разделах вид клетки совместим с несколькими механизмами, и отделяет их только правильно выбранный контроль.Величина: направление пробегов груза, частота событий слияния и деления, зависимость структуры от концентрации каркаса и распределение белка между структурой и окружением, контраст домена — это разные измерения, и одно не заменяет другое.Метод: прижизненная съёмка с кимограммой, обмен матриксным маркером, FRAP и разведение, распределение маркеров доменов и трансэпителиальное сопротивление.Контроль: вмешательство, которое меняет одно звено, — удаление белка показывает его необходимость, а искусственное присоединение или индуцированная сборка — достаточность.Каждый из четырёх механизмов описывается своей величиной. Для транспорта это направление и скорость пробегов отдельных грузов и доля подвижных грузов; их измеряют по кимограмме, построенной из прижизненной съёмки, а ориентацию треков в той же клетке определяют по меткам растущих плюс-концов. Для слияния и деления митохондрий морфология сети — лишь картина; процесс измеряют частотой событий и обменом матриксным маркером, а функцию — отдельно, по мембранному потенциалу и потреблению кислорода.Для конденсата измеряют зависимость от концентрации каркасного компонента: исчезает ли структура при её снижении и появляется ли при повышении, как распределяется белок между структурой и окружением. Пороговая картина согласуется с фазовым разделением, но бывает и у других кооперативных сборок. FRAP добавляет сведения об обмене компонентов, слияние фокусов — о материальных свойствах, но ни один признак отдельно не доказывает фазового разделения. Для полярности измеряют распределение маркеров между доменами, а барьер плотного контакта — отдельно, по трансэпителиальному сопротивлению и потоку парацеллюлярного маркера: это разные функции.Контроли во всех разделах устроены одинаково. Разрушение трека нокодазолом показывает, что процесс зависит от микротрубочек, но не указывает мотор. Удаление мотора, адаптера или машины слияния показывает необходимость белка, но не его достаточность и не прямой механизм. Достаточность проверяют противоположным экспериментом: мотор химически индуцируемой связью присоединяют к выбранному грузу, сборку конденсата индуцируют светом в оптогенетической системе. Возвращение белка дикого типа, восстанавливающее само измеряемое событие, поддерживает специфичность вывода, а вмешательство в противоположную машину лишь компенсирует фенотип.Переключайте таблицы: для каждого механизма указаны величина, метод, контроль и ограничение вывода.Типичная ошибка Если белок необходим для процесса, его достаточно, чтобы этот процесс шёл.Удаление белка показывает только необходимость. Достаточность проверяют отдельным экспериментом: белок присоединяют к грузу или активируют в новом месте и смотрят, возникает ли процесс.После удаления белка процесс в клетке прекратился. Какой эксперимент проверит, достаточно ли этого белка для процесса?А. Повторить удаление белка в клетках другой линии (неверный вариант)Повтор в других клетках покажет, насколько общая необходимость белка, но не его достаточность: процесс по-прежнему изучают только в его отсутствие.Б. Присоединить белок в новом месте и проверить процесс (верный вариант)Если белок, присоединённый к новому грузу или активированный в новом месте, вызывает процесс там, где его раньше не было, — белок достаточен. Так проверяют мотор, присоединяя его к пероксисомам химически индуцируемой связью, и сборку конденсата, индуцируя её светом.В. Снизить количество белка наполовину и сравнить (неверный вариант)Частичное снижение покажет, зависит ли процесс от количества белка, но это по-прежнему эксперимент на необходимость: белок убирают, а не добавляют в новое место.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаKapitein L. C. et al. 2010. Probing intracellular motor protein activity using an inducible cargo trafficking assay. Biophys JShin Y. et al. 2017. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. CellGao Y. et al. 2022. A brief guideline for studies of phase-separated biomolecular condensates. Nat Chem BiolGünzel D., Lehmann M., Honigmann A. 2026. Tight junction structure, assembly and (dys)function. Nat Rev Mol Cell BiolAnand R. et al. 2014. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. J Cell BiolСводная таблица по шагам разделов 1–4; схемы каждого метода показаны в шагах «Как измеряют направление транспорта», «Как узнать, какая машина изменена», «Чего не доказывает яркий фокус» и в последнем шаге раздела о полярности. Индуцируемое присоединение мотора к пероксисомам — Kapitein 2010 (клетки COS-7); оптогенетическая сборка конденсатов — Shin 2017 (клетки NIH 3T3, U2OS); критерии конденсата — Gao 2022; барьер и полярность — Günzel 2026; восстановление механизма и компенсация — Anand 2014 (эмбриональные фибробласты мыши).
Исследование · шаг 30 из 30Исследование одного нейрона: от тела клетки до синапсаВ нейроне с длинным аксоном все четыре механизма семинара работают одновременно. Нарушение каждого из них проявляется в одном и том же месте — в далёком от тела клетки синапсе, — но по разным причинам.Полярность: начальный сегмент аксона, собранный на каркасе анкирина G, отделяет аксон от соматодендритного отдела; кинезин KIF5 избирательно переносит грузы в аксон.Транспорт и деление: митохондрия, разделённая DRP1, переносится кинезином-1 через TRAK и Miro и останавливается у активного синапса при участии Miro и синтафилина.Конденсат на органелле: РНП-гранула через белок ANXA11 связывается с лизосомой и переносится вместе с ней к удалённым участкам аксона.Нейрон удобен как итоговый пример, потому что требования к пространственной организации в нём предельны: аксон длиннее тела клетки в тысячи раз, а синапс, где нужны ATP и буферирование Ca²⁺, находится на его конце. Сначала нужна сама полярность. Начальный сегмент аксона собирается на каркасе анкирина G; в культуре нейронов гиппокампа крысы подавление синтеза анкирина G разбирало начальный сегмент, и бывший аксон приобретал признаки дендрита: в него проникали белки соматодендритного отдела, а на нём собирались шипики и постсинаптические уплотнения (Hedstrom 2008).Затем нужна доставка органелл. Митохондрия попадает в аксон и движется по нему, связываясь с кинезином-1 через адаптер TRAK и белок наружной мембраны Miro; в участке активного синапса повышение Ca²⁺ останавливает её, а синтафилин закрепляет на микротрубочке (Wang и Schwarz 2009; Kang 2008; Chen и Sheng 2013). Деление необходимо для нормального распределения митохондрий по отросткам: у дрозофилы с мутацией drp1 митохондрии почти отсутствовали в синапсах нервно-мышечного соединения, и при интенсивной стимуляции синаптическая передача не поддерживалась (Verstreken 2005); у мыши без Drp1 митохондрии в нейронах скапливались и плохо распределялись по отросткам, а образование синапсов нарушалось (Ishihara 2009). Что именно мешает переносу неразделённой сети — её размер или другие свойства, — эти эксперименты прямо не показывают.Третий груз — рибонуклеопротеиновые гранулы, безмембранные сборки с мРНК, которые обеспечивают местный синтез белка вдали от ядра. В нейронах и клетках линий человека гранулы переносились, связываясь с движущимися лизосомами: белок ANXA11 своей неупорядоченной областью входит в гранулу, а другим доменом связывается с мембраной лизосомы; замены в ANXA11, найденные при боковом амиотрофическом склерозе, нарушали эту связь и перенос гранул (Liao 2019). Здесь соединяются конденсат (вопрос 3) и транспорт по треку (вопрос 1).Переключайте нарушения на схеме: отсутствие DRP1, Miro без связывания Ca²⁺ или нейрон без синтафилина, замена в ANXA11, разборка начального сегмента. В каждом случае ответ на вопрос «что нарушено» требует своей величины — распределения органелл по аксону, доли остановленных у синапса митохондрий, переноса гранул, распределения маркеров доменов.Типичная ошибка Если в синапсе мало митохондрий, значит, нарушен мотор, который их переносит.Тот же результат дают нарушение деления, утрата закрепления синтафилином и Ca²⁺-зависимой остановки у синапса или нарушение полярности нейрона. Чтобы назвать причину, измеряют разные величины: распределение и подвижность митохондрий, долю остановленных у синапса, состав доменов.В нейронах без DRP1 митохондрии скапливаются у тела клетки и почти не попадают в синапсы. Какое объяснение согласуется с механизмами семинара?А. Без деления сеть митохондрий хуже переносится в аксон (верный вариант)Без деления митохондрии хуже распределяются по отросткам: в нейронах дрозофилы drp1 и мыши без Drp1 они скапливались в теле клетки. DRP1 при этом не мотор и не адаптер; какое свойство неразделённой сети мешает переносу, эти эксперименты прямо не показывают.Б. DRP1 сама переносит митохондрии к плюс-концу (неверный вариант)DRP1 — ГТФаза деления, которая собирается в кольцо на наружной мембране; переносит митохондрии по аксону кинезин-1, связанный с ними через TRAK и Miro.В. Без DRP1 у синапса не повышается концентрация Ca²⁺ (неверный вариант)Ca²⁺ в участке синапса повышается от активности самого синапса; повышение Ca²⁺ останавливает уже пришедшие митохондрии, но не объясняет, почему они не доходят до аксона.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаHedstrom K. L., Ogawa Y., Rasband M. N. 2008. AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity. J Cell BiolOgawa Y. et al. 2006. Spectrins and ankyrinB constitute a specialized paranodal cytoskeleton. J NeurosciNakata T., Hirokawa N. 2003. Microtubules provide directional cues for polarized axonal transport through interaction with kinesin motor head. J Cell BiolWang X., Schwarz T. L. 2009. The mechanism of Ca2+-dependent regulation of kinesin-mediated mitochondrial motility. CellKang J.-S. et al. 2008. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. CellChen Y., Sheng Z.-H. 2013. Kinesin-1-syntaphilin coupling mediates activity-dependent regulation of axonal mitochondrial transport. J Cell BiolVerstreken P. et al. 2005. Synaptic mitochondria are critical for mobilization of reserve pool vesicles at Drosophila neuromuscular junctions. NeuronIshihara N. et al. 2009. Mitochondrial fission factor Drp1 is essential for embryonic development and synapse formation in mice. Nat Cell BiolLiao Y.-C. et al. 2019. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. CellНачальный сегмент и анкирин G — нейроны гиппокампа крысы в культуре (культура — по методике Ogawa 2006: эмбрионы крысы 18-го дня), РНК-интерференция (Hedstrom 2008); избирательный перенос KIF5 в аксон — Nakata и Hirokawa 2003. Остановка митохондрий у синапса — нейроны гиппокампа крысы, Miro с заменами в EF-мотивах (Wang и Schwarz 2009); доля подвижных митохондрий 36 и 76 % в нейронах гиппокампа мыши дикого типа и без синтафилина (Kang 2008); синтафилин и остановка при активности (Chen и Sheng 2013). Деление и распределение митохондрий — мотонейроны личинок дрозофилы drp1 (Verstreken 2005) и мыши без Drp1 (Ishihara 2009). Перенос РНП-гранул на лизосомах — нейроны крысы, нейроны из индуцированных плюрипотентных клеток человека и клетки линий человека (Liao 2019). Схема — качественная, распределения органелл условны.
