β2-адренорецептор · шаг 1 из 28Как агонист смещает равновесие конформаций рецептораОпорная остановка 1 из 8 · связывание и активация: занятость рецептора лигандом и его активное состояние — разные величины; это начало маршрута. β2-адренорецептор и без лиганда переходит между неактивным и активным состояниями. Агонист не создаёт новую конформацию, а смещает равновесие в сторону активной.Рецептор существует в равновесии неактивной и активной конформаций; без лиганда он чаще неактивен.Агонист связывается в кармане между спиралями и повышает долю времени, которую рецептор проводит в активной конформации.Обратный агонист смещает равновесие к неактивной конформации, антагонист сам равновесие не сдвигает.Связывание лиганда с рецептором — обратимая нековалентная реакция, которая не требует гидролиза ATP и не меняет ковалентной структуры белка. Важно, как описывать её следствие. Рецептор и без лиганда самопроизвольно переходит между неактивной и активной конформациями, поэтому у популяции рецепторов есть небольшая базальная активность даже без агониста. Агонист связывается в кармане, образованном спиралями III, V, VI и VII, и смещает равновесие в пользу активной конформации, увеличивая долю времени в ней.Из такого описания следуют три наблюдаемых факта, которые формула «лиганд включает рецептор» не объясняет. Во-первых, базальная активность без лиганда. Во-вторых, частичные агонисты: даже при насыщающей концентрации они смещают равновесие не полностью и дают меньший максимальный ответ, потому что у них ниже эффективность, а не сродство. В-третьих, обратные агонисты, которые смещают равновесие к неактивному состоянию сильнее, чем в отсутствие лиганда, и снижают активность ниже базальной.Антагонист занимает тот же карман, но равновесие конформаций сам не сдвигает: он лишь препятствует связыванию агониста или обратного агониста. В экспериментах на клетках с выраженной базальной активностью β-рецепторов пропранолол проявляет свойства обратного агониста; клинически его действие в основном объясняется конкурентной блокадой β-рецепторов. Структурные работы показывают, что активная конформация — это не одно состояние, а набор близких по энергии конформаций, различающихся тем, с каким внутриклеточным партнёром они преимущественно связываются; этот факт понадобится при разборе десенситизации и смещённого агонизма.Занятость рецепторов и ответ клетки — разные величины. Занятость — доля рецепторов, связанных с лигандом; она растёт с концентрацией по гиперболе c/(c + KD), а KD (концентрация, при которой занята половина рецепторов) характеризует сродство. Ответ измеряют на выходе цепи — по cAMP, активности PKA или тонусу, — а между рецептором и выходом лежат усиливающие ступени: один активный рецептор успевает перевести в GTP-форму много молекул Gαs. Поэтому половина максимального ответа достигается при занятости, намного меньшей половины. В модели практикума половина максимального расслабления гладкой мышцы достигается при концентрации около 0,03 KD, то есть при занятости около 3 %. Для половины максимального прироста cAMP и доли Gαs-GTP нужна занятость около 20 %, а для PKA — около 9 %: резерв зависит от выбранного выхода. Такое свойство клетки называют резервом рецепторов: часть рецепторов можно выключить, а максимальный ответ почти не изменится.Если число рецепторов уменьшить (необратимым антагонистом, интернализацией, снижением экспрессии), кривая «концентрация — ответ» сдвигается вправо: для того же ответа нужно больше агониста, то есть чувствительность снижена (EC50 растёт). Сродство при этом не изменилось: KD остался прежним, а EC50 и KD — разные величины, и совпадать они не обязаны. Максимальный ответ почти сохраняется, пока оставшихся рецепторов хватает на полный ответ; когда резерв исчерпан, снижается и максимум. Так резерв выявляют классическим способом — необратимо выключают долю рецепторов и следят за кривой; понятие эффективности агониста ввёл Stephenson 1956, а связь занятости с ответом при этом описывает операциональная модель Black и Leff 1983. Усиление между ступенями видно и в клетках: у α2C-адренорецептора в клетках CHO-K1 для половины максимума в тесте на связывание GTPγS (на мембранах тех же клеток) нужна занятость примерно в 20 раз больше, чем для половины максимального подавления cAMP в целых клетках (Umland 2001). Откройте вид «Занятость и ответ»: сначала выберите прогноз, затем сравните кривые.На схеме доля рецепторов в активной конформации показана условным столбиком: это учебные величины, иллюстрирующие смещение равновесия, а не измеренные доли.Типичная ошибка Агонист «включает» рецептор, переводя его из выключенного состояния во включённое.Рецептор переходит между конформациями и без лиганда; агонист лишь смещает равновесие в пользу активной конформации. Поэтому существуют базальная активность, частичные и обратные агонисты.Частичный агонист добавили в насыщающей концентрации, так что он занял все рецепторы. Почему максимальный ответ ниже, чем у полного агониста?А. У частичного агониста ниже сродство к рецептору (неверный вариант)Сродство определяет, при какой концентрации агонист занимает рецепторы, но не высоту максимального ответа. При насыщении все рецепторы заняты независимо от сродства.Б. Он слабее смещает равновесие в сторону активной конформации (верный вариант)Частичный агонист имеет меньшую эффективность: даже заняв все рецепторы, он переводит в активную конформацию меньшую их долю, поэтому максимальный ответ ниже.В. Он смещает равновесие к неактивной конформации (неверный вариант)К неактивной конформации равновесие смещает обратный агонист, снижая активность ниже базальной. Частичный агонист повышает активность, но не до максимума.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWeis W. I., Kobilka B. K. 2018. The Molecular Basis of G Protein-Coupled Receptor Activation. Annu Rev BiochemRasmussen S. G. F. et al. 2011. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. NatureStephenson R. P. 1956. A modification of receptor theory. Br J Pharmacol ChemotherBlack J. W., Leff P. 1983. Operational models of pharmacological agonism. Proc R Soc Lond B Biol SciUmland S. P. et al. 2001. Receptor reserve analysis of the human alpha2C-adrenoceptor using [35S]GTPgammaS and cAMP functional assays. Eur J PharmacolСхема механизма и пороговые величины — по обзору Weis и Kobilka (2018) и структуре комплекса β2AR–Gs (Rasmussen 2011). Доли активной конформации на столбике — учебные, условные. Частичный, обратный агонист и антагонист — пример из фармакологии β-рецепторов. Вид «Занятость и ответ» — расчёт по модели практикума 1б (M1.basic): занятость c/(c + KD), ответ — доля максимального эффекта при занятости, умноженной на долю оставшихся рецепторов; это учебная модель, не измерение. Резерв рецепторов зависит от клетки и измеряемого ответа (Umland 2001, клетки CHO с α2C-адренорецептором).
β2-адренорецептор · шаг 2 из 28Как рецептор активирует Gαs и чем ограничено время её активностиАктивный рецептор служит фактором обмена гуаниновых нуклеотидов для Gαs. Время активного состояния Gαs ограничено её собственной ГТФазной активностью.Активный рецептор раскрывает нуклеотид-связывающий карман Gαs и ускоряет обмен GDP на GTP.Gαs-GTP отделяется от βγ, связывается с аденилатциклазой и активирует синтез cAMP.Субъединица αs за счёт собственной ГТФазной активности гидролизует GTP и возвращается в GDP-форму — передача сигнала прекращается.Гетеротримерный G-белок в покое несёт на α-субъединице GDP, связанный настолько прочно, что самопроизвольный обмен занимает минуты. Активный рецептор, связавшись с гетеротримером, раскрывает нуклеотид-связывающий карман и на несколько порядков ускоряет высвобождение GDP; его место занимает GTP, концентрация которого в цитозоле выше. Иначе говоря, рецептор служит фактором обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) для Gαs: он не переносит фосфат и не расходует ATP, а снижает кинетический барьер диссоциации GDP.Связывание GTP приводит к диссоциации гетеротримера: Gαs-GTP отделяется от димера βγ, связывается с аденилатциклазой и активирует её. Это первый пример механизма, который ещё не раз встретится в семинаре: состояние переключателя задаётся не самим переключателем, а белками, ускоряющими переходы между его состояниями. Тот же принцип «рецептор — это GEF» лежит в основе цикла малой ГТФазы RAS (вопрос 3), где фактором обмена служит SOS1.Инактивация происходит на уровне самого G-белка: α-субъединица — это ГТФаза, она гидролизует связанный GTP и воссоединяется с βγ. Для Gs ускорение этого гидролиза классическими RGS-белками, как правило, не показано, поэтому время существования активного Gs задаётся прежде всего собственной ГТФазной активностью αs. Холерный токсин ADP-рибозилирует в субъединице αs остаток Arg201 (Arg187 в короткой изоформе) и подавляет этот гидролиз: Gαs остаётся в GTP-форме и активирует аденилатциклазу без всякого агониста.Переключите состояния на схеме: видно, как рецептор ускоряет обмен, Gαs-GTP активирует аденилатциклазу, а гидролиз GTP возвращает систему в покой.Типичная ошибка Рецептор передаёт сигнал, фосфорилируя Gαs или перенося на неё фосфат.Рецептор не переносит фосфат: он ускоряет обмен GDP на GTP как фактор обмена гуаниновых нуклеотидов. Фосфат на Gαs не переносится: GTP поступает из цитозоля как целый нуклеотид.Клетки обработали холерным токсином без добавления агониста. Как изменится концентрация cAMP?А. Останется исходной: без агониста рецептор не активирует Gαs (неверный вариант)Токсин делает Gαs активной в обход рецептора: агонист для этого не нужен. Концентрация cAMP повышается.Б. Повысится и останется повышенной: Gαs остаётся в GTP-форме (верный вариант)Токсин подавляет гидролиз GTP на αs, поэтому Gαs-GTP накапливается и постоянно активирует аденилатциклазу без агониста.В. Кратковременно повысится, затем вернётся к исходному значению из-за гидролиза GTP (неверный вариант)Токсин подавляет именно гидролиз GTP. Поэтому повышенная концентрация cAMP сохраняется и к исходному значению не возвращается.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWeis W. I., Kobilka B. K. 2018. The Molecular Basis of G Protein-Coupled Receptor Activation. Annu Rev BiochemRasmussen S. G. F. et al. 2011. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. NatureCassel D., Selinger Z. 1977. Mechanism of adenylate cyclase activation by cholera toxin: inhibition of GTP hydrolysis at the regulatory site. Proc Natl Acad Sci U S AFreissmuth M., Gilman A. G. 1989. Mutations of Gs alpha designed to alter the reactivity of the protein with bacterial toxins. J Biol ChemСхема механизма — по Weis и Kobilka (2018) и структуре β2AR–Gs (Rasmussen 2011). Эффект холерного токсина — Cassel и Selinger (1977), мембраны эритроцитов индейки; остаток Arg187 короткой изоформы Gαs (Arg201 в длинной) — Freissmuth и Gilman (1989).
β2-адренорецептор · шаг 3 из 28Как баланс синтеза и гидролиза задаёт концентрацию cAMP и как cAMP активирует PKAКонцентрация cAMP определяется балансом синтеза аденилатциклазой и гидролиза фосфодиэстеразами. cAMP освобождает каталитические субъединицы PKA, снимая торможение регуляторными субъединицами.Аденилатциклаза синтезирует cAMP из ATP, фосфодиэстеразы гидролизуют его до 5'-AMP.Стационарная концентрация cAMP устанавливается, когда скорость синтеза равна скорости гидролиза.cAMP связывается с регуляторными субъединицами PKA (по два участка на каждую) и освобождает каталитические.Концентрация cAMP в данном объёме меняется по уравнению баланса: скорость синтеза аденилатциклазой минус скорость гидролиза фосфодиэстеразами. Стационарная концентрация достигается, когда эти скорости равны. Отсюда два следствия, которые часто смешивают. Если после прекращения стимула синтез падает, концентрация снижается со скоростью гидролиза; если подавить фосфодиэстеразу при продолжающемся синтезе, концентрация растёт до нового стационарного значения. Поэтому форсколин (прямой активатор аденилатциклазы) повышает концентрацию cAMP в обход рецептора, а ролипрам (ингибитор PDE4) повышает её, замедляя гидролиз.Меняйте на схеме положение ползунков синтеза и гидролиза: стационарная концентрация cAMP определяется их соотношением. Это объясняет, почему ингибитор фосфодиэстеразы продлевает ответ, не затрагивая рецептор, а β-блокатор действует на рецептор, не меняя скорость гидролиза cAMP. Два препарата меняют разные члены одного баланса.Главный эффектор cAMP в этом пути — протеинкиназа A. В покое это тетрамер из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц (R₂C₂); регуляторная субъединица закрывает у каталитической участок связывания субстрата. На каждой регуляторной субъединице есть два участка связывания cAMP. Связывание cAMP снимает торможение и освобождает каталитические субъединицы. Поскольку нужно занять несколько участков, зависимость активности PKA от концентрации cAMP круче простого гиперболического насыщения; так плавное изменение сигнала преобразуется в более резкий ответ.У cAMP есть и мишени помимо PKA: например, каналы HCN проводящей системы сердца связывают cAMP напрямую. Но в разбираемом пути ответ опосредован PKA.Типичная ошибка Концентрацию cAMP определяют только фосфодиэстеразы, а не скорость синтеза.Концентрацию cAMP определяют обе скорости: и синтез аденилатциклазой, и гидролиз фосфодиэстеразами. После остановки синтеза именно скорость гидролиза определяет, как быстро концентрация вернётся к исходной.В клетках с постоянным синтезом cAMP добавили ролипрам (ингибитор PDE4). Как изменится стационарная концентрация cAMP?А. Повысится: при том же синтезе гидролиз замедлен (верный вариант)Ролипрам подавляет часть гидролиза, поэтому при том же синтезе стационарная концентрация cAMP устанавливается выше.Б. Снизится: ролипрам тормозит аденилатциклазу (неверный вариант)Ролипрам действует на фосфодиэстеразу, а не на циклазу: он замедляет удаление cAMP, а не синтез.В. Не изменится: концентрацию cAMP задаёт только синтез (неверный вариант)Концентрация cAMP определяется балансом синтеза и гидролиза. Подавляя гидролиз, ролипрам повышает её даже при неизменном синтезе.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаZaccolo M., Zerio A., Lobo M. J. 2021. Subcellular Organization of the cAMP Signaling Pathway. Pharmacol RevSeamon K. B. et al. 1981. Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells. Proc Natl Acad Sci U S AWeis W. I., Kobilka B. K. 2018. The Molecular Basis of G Protein-Coupled Receptor Activation. Annu Rev BiochemУравнение баланса cAMP (синтез минус гидролиз) — учебная модель по обзору Zaccolo (2021). Концентрация cAMP на схеме — расчёт по модели практикума (кратность относительно исходной концентрации). Форсколин — прямой активатор циклазы (Seamon 1981); ролипрам — избирательный ингибитор PDE4. Числовые доли фосфорилирования — учебные.
β2-адренорецептор · шаг 4 из 28Почему один и тот же путь даёт разные ответы в разных клеткахОпорная остановка 2 из 8 · контекст клетки: один и тот же сигнал рецептора даёт разный ответ в разных клетках из-за набора мишеней; продолжает остановку 1. Один путь Gs–cAMP–PKA даёт расслабление бронха, усиление работы сердца и липолиз. Направление ответа задаёт набор белков-эффекторов, которые PKA фосфорилирует в данной клетке.Путь от рецептора до PKA в этих клетках одинаков; различаются мишени PKA.В кардиомиоците PKA фосфорилирует CaV1.2, фосфоламбан и тропонин I — сила сокращения и скорость расслабления растут.В гладкой мышце бронха PKA несколькими путями снижает тонус: уменьшает активность MLCK (вклад этого механизма in vivo обсуждается) и повышает выход K⁺. В результате наступает расслабление. В адипоците PKA фосфорилирует липазу и перилипин — липолиз усиливается.Ответ клетки определяется не фактом активации рецептора, а тем, какие подтипы рецепторов в ней есть, с какими G-белками они сопряжены и какие эффекторы присутствуют. Расхождение ответов на адреналин возникает на двух уровнях. Первый — выбор G-белка: α1-рецепторы через Gq повышают концентрацию Ca²⁺, α2 через Gi снижают концентрацию cAMP, а β1 и β2 через Gs повышают её. Второй уровень — эффекторы клетки: β1 и β2 сопряжены с одним и тем же Gs (β2-рецептор кардиомиоцита может также сопрягаться с Gi; здесь рассматривается путь через Gs), и противоположный физиологический результат в сердце и бронхе задаётся тем, какие белки PKA фосфорилирует.В кардиомиоците мишени PKA — белок Rad, тормозящий канал CaV1.2 (после фосфорилирования Rad вход Ca²⁺ через канал усиливается), фосфоламбан (снятие торможения SERCA2a ускоряет закачку Ca²⁺ в ретикулум) и тропонин I (расслабление ускоряется). В результате возрастают сила и скорость сокращения и ускоряется расслабление.В гладкой мышце бронха PKA снижает сродство MLCK к Ca²⁺–кальмодулину, повышает активность K⁺-каналов (гиперполяризация уменьшает вход Ca²⁺) и тормозит образование IP₃. Суммарный результат — расслабление. Насколько велик вклад именно фосфорилирования MLCK in vivo, обсуждается: PKA действует на тонус несколькими путями. В адипоците PKA фосфорилирует гормон-чувствительную липазу и перилипин-1, открывая липазам доступ к липидной капле; в результате липолиз ускоряется. В гепатоците путь Gs–cAMP–PKA запускает глюкагон (адреналин действует здесь и через β2-рецепторы, и через α1-рецепторы с повышением концентрации Ca²⁺): PKA фосфорилирует и активирует киназу фосфорилазы, киназа фосфорилазы фосфорилирует и активирует гликогенфосфорилазу, и гликогенолиз ускоряется; одновременно фосфорилирование гликогенсинтазы тормозит синтез гликогена (Jiang и Zhang 2003; Roach 2012).Заметим о подтипах рецепторов: в сердце человека преобладают β1-рецепторы (в предсердии примерно 70 % β1 и 30 % β2), а β2 составляет меньшую часть, но путь ниже рецептора тот же. В модели практикума всё выше PKA одинаково во всех трёх клетках — так выделена роль именно набора мишеней. На схеме значок P стоит только на белках, которые фосфорилирует PKA; образование IP₃ показано пунктирной рамкой как непрямое звено без значка P, а параллельные эффекты PKA сведены в общий итог.Типичная ошибка Расслабление бронха и усиление работы сердца противоположны, потому что в этих клетках работают разные G-белки.В обеих клетках β-рецепторы сопряжены с Gs, и в обеих растёт концентрация cAMP и активируется PKA. Противоположный ответ задан разными мишенями PKA, а не выбором G-белка (он различает пару α1/β2, но не β1/β2).В кардиомиоците и в гладкой мышце бронха β-стимуляция одинаково повышает концентрацию cAMP. Почему сокращение усиливается в одной клетке и ослабевает в другой?А. В бронхе рецептор сопряжён с Gi, а в сердце — с Gs (неверный вариант)В обеих клетках β-рецепторы сопряжены с Gs и повышают концентрацию cAMP. Разница не в G-белке.Б. PKA фосфорилирует в этих клетках разные белки (верный вариант)Путь до PKA одинаков, но набор белков-эффекторов разный, поэтому один посредник даёт противоположные физиологические ответы.В. В бронхе cAMP не активирует PKA (неверный вариант)cAMP активирует PKA и в бронхе; PKA снижает тонус бронха несколькими путями: уменьшает активность MLCK (вклад этого пути in vivo обсуждается) и повышает активность K⁺-каналов.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаBillington C. K. et al. 2013. cAMP regulation of airway smooth muscle function. Pulm Pharmacol TherBers D. M. 2002. Cardiac excitation-contraction coupling. NatureLiu G. et al. 2020. Mechanism of adrenergic CaV1.2 stimulation revealed by proximity proteomics. NatureConti M. A., Adelstein R. S. 1981. The relationship between calmodulin binding and phosphorylation of smooth muscle myosin kinase by the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. J Biol ChemKume H. et al. 1994. β-adrenergic agonists regulate KCa channels in airway smooth muscle by cAMP-dependent and -independent mechanisms. J Clin InvestAnthonsen M. W. et al. 1998. Identification of novel phosphorylation sites in hormone-sensitive lipase that are phosphorylated in response to isoproterenol. J Biol ChemGranneman J. G. et al. 2009. Perilipin controls lipolysis by regulating the interactions of ABHD5 and adipose triglyceride lipase. J Biol ChemMichel M. C. et al. (Brodde O. E.) 1988. Selective regulation of β1- and β2-adrenoceptors in the human heart by chronic β-adrenoceptor antagonist treatment. Br J PharmacolJiang G., Zhang B. B. 2003. Glucagon and regulation of glucose metabolism. Am J Physiol Endocrinol MetabRoach P. J. et al. 2012. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem JМишени PKA — по обзору Billington (2013) для гладкой мышцы (Conti и Adelstein 1981; Kume 1994) и Bers (2002) для кардиомиоцита (регуляция CaV1.2 через Rad — Liu 2020); липолиз — Anthonsen (1998), Granneman (2009). Доли β1/β2 в предсердии человека — Michel и Brodde (1988). Числа на схеме — из модели практикума (занятость 80 %). Гликогенолиз в гепатоците — обзоры Jiang и Zhang (2003), Roach и соавт. (2012).
β2-адренорецептор · шаг 5 из 28Почему место повышения концентрации cAMP важно так же, как её величинаПовышение концентрации cAMP в клетке неоднородно: разные участки отвечают на один агонист по-разному. Размер области повышенной концентрации cAMP определяется балансом источника и стока; AKAP удерживает PKA у определённых мишеней.Источник cAMP — аденилатциклаза у рецептора; сток — фосфодиэстеразы, распределённые неравномерно.Характерный размер области повышенной концентрации cAMP оценивается длиной диффузии λ = √(D/k).Якорные белки AKAP удерживают PKA (а часто и PDE, и циклазу) у конкретного участка, поэтому при одной и той же средней концентрации cAMP фосфорилируются разные субстраты.Классическая схема «рецептор на поверхности → посредник в объёме цитозоля → мишени по всей клетке» описывает эксперименты на суспензиях, но не наблюдения на отдельной живой клетке. Локализованные биосенсоры показали, что повышение концентрации cAMP неоднородно: разные участки одной клетки отвечают на один агонист по-разному, а разные агонисты с одинаковым суммарным повышением концентрации cAMP дают разные функциональные ответы.Локальную концентрацию посредника задаёт тройка «источник — диффузия — сток», а характерный размер области повышенной концентрации оценивается длиной диффузии λ = √(D/k): здесь D — коэффициент диффузии cAMP, k — константа скорости его гидролиза. Меняйте на схеме активность фосфодиэстераз: чем выше их активность, тем меньше размер микродомена. Это расчёт по формуле, а не экспериментальные данные; реальная клетка сложнее (буферирование cAMP, вязкость, физические барьеры).Протеинкиназа A, главная мишень cAMP, не распределена в клетке свободно, а закреплена в определённом месте якорными белками семейства AKAP. Поэтому PKA, закреплённая на участке ретикулума с SERCA, и PKA, закреплённая на плазматической мембране, фосфорилируют разные субстраты при одной и той же средней концентрации cAMP. AKAP нередко удерживают рядом и аденилатциклазу, и фосфодиэстеразы, собирая локальный узел регуляции.Активность рецептора к тому же не заканчивается на поверхности: β2-рецепторы остаются активными в ранней эндосоме и дают там отсроченный эндосомный компонент ответа cAMP (Irannejad 2013). Отдельный второй пик суммарной концентрации при этом не обязателен: вклад эндосомного синтеза зависит от клетки и условий. Интернализация переносит источник cAMP из одного компартмента в другой, а не просто прекращает сигнал. В модели десенситизации (шаг «Десенситизация») этот компонент не учтён.Типичная ошибка Концентрация cAMP одинакова во всех участках клетки, поэтому важен только суммарный уровень cAMP.Повышение концентрации cAMP неоднородно: его локальную концентрацию задают источник, диффузия и сток, а PKA закреплена в определённых местах якорными белками AKAP. Поэтому одинаковое суммарное повышение концентрации cAMP может иметь разные следствия в зависимости от того, где оно произошло.Что показывает оценка λ = √(D/k) для области повышенной концентрации cAMP?А. Чем активнее фосфодиэстеразы, тем меньше область повышенной концентрации cAMP (верный вариант)λ убывает с ростом k: при быстром гидролизе высокая концентрация cAMP сохраняется лишь вблизи источника, и микродомен сужается.Б. Чем активнее фосфодиэстеразы, тем больше область повышенной концентрации cAMP (неверный вариант)Наоборот: больший k означает более быстрый гидролиз, и область повышенной концентрации cAMP сужается.В. Размер области не зависит от активности фосфодиэстераз (неверный вариант)Зависит: λ = √(D/k) прямо связывает размер домена с константой скорости гидролиза k.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаZaccolo M., Zerio A., Lobo M. J. 2021. Subcellular Organization of the cAMP Signaling Pathway. Pharmacol RevIrannejad R. et al. 2013. Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes. NatureНеоднородность cAMP и роль AKAP — обзор Zaccolo (2021); сигнал из эндосомы — Irannejad (2013), клетки HEK293 с конформационными биосенсорами. Кривая λ = √(D/k) — иллюстрация уравнения (расчёт по формуле), D ≈ 40 мкм²/с по Zaccolo (2021); не экспериментальные данные.
β2-адренорецептор · шаг 6 из 28Как ответ ослабевает при длительной стимуляцииОпорная остановка 3 из 8 · сигнал и его прекращение: ответ ослабевает не только из-за удаления агониста, но и из-за изменений самого рецептора; продолжает остановку 2. При длительном действии агониста ответ рецептора ослабевает — это десенситизация. Её запускают GRK, фосфорилирующие активный рецептор, и β-аррестин, связывающийся с фосфорилированным рецептором.GRK распознают активную конформацию рецептора и переносят фосфатные группы на его внутриклеточный хвост.β-аррестин связывается с фосфорилированным рецептором и стерически препятствует связыванию G-белка: передача сигнала от этого рецептора через Gs блокируется.β-аррестин направляет рецептор в эндосому (интернализация); дальше рецептор возвращается на поверхность или разрушается.Активную конформацию рецептора распознаёт не только G-белок, но и киназы GRK: они переносят фосфатные группы на остатки серина и треонина внутриклеточного хвоста рецептора. Субстратом этих киназ служит преимущественно рецептор в активной конформации, поэтому его фосфорилирование следует за активацией, а степень фосфорилирования пропорциональна интенсивности стимуляции. Так механизм выключения запускается тем же событием, что и сам сигнал.Дальше нужно различать четыре события, которые в старых учебниках объединены в одно. Привлечение (рекрутирование) — β-аррестин связывается с фосфорилированным активным рецептором. Десенситизация — связанный β-аррестин стерически перекрывает поверхность, с которой взаимодействует G-белок, и передача через Gs от этого рецептора прекращается. Интернализация — β-аррестин связывается с компонентами клатринового аппарата и направляет рецептор в эндосому; его дальнейшая судьба (возврат на поверхность за минуты или деградация за часы) определяет, как быстро восстановится чувствительность. Каркасная функция — β-аррестин служит каркасным белком (скаффолдом), на котором собираются белки других сигнальных путей.В клетках HEK293 с эндогенным β2-рецептором (Violin 2008, 37 °C, 1 мкМ изопротеренола) максимум cAMP достигается в первые десятки секунд, затем сигнал спадает за несколько минут; по модели авторов, половина активных рецепторов инактивируется примерно за 70 с (полувремя инактивации). Из GRK2, GRK3, GRK5 и GRK6 на этот процесс влиял только нокдаун GRK6. Числа на схеме — из модели практикума, откалиброванной по этим данным. В модели практикума к 10-й минуте cAMP составляет около ×1,8 от исходного (на пике — около ×9), а активность PKA — около 17 % (исходно около 6 %): ответ сильно ослаблен, но не исчез. Синтез cAMP в эндосомах в модели не учтён.Из каркасной функции долго делали вывод, что β-аррестин запускает «вторую ветвь» сигнала, независимую от G-белков. Как общее правило это не подтвердилось: в клетках без функциональных Gα-белков β-аррестин обеспечивал интернализацию, но не активацию ERK (Grundmann 2018). Поэтому смещённый агонизм — обоснованная стратегия поиска лекарств, а не установленный клинический принцип.Типичная ошибка β-аррестин связывается с рецептором — значит, он запускает собственный сигнал без G-белка.Связывание β-аррестина — это прежде всего десенситизация и интернализация. Самостоятельный сигнал без G-белков как общее правило не подтверждён (Grundmann 2018): зависимость ответа от G-белков нужно проверять для каждого рецептора отдельно.В клетках с подавленным синтезом β-аррестина добавили изопротеренол в насыщающей концентрации. Как изменится спад сигнала cAMP по сравнению с обычными клетками?А. Спад станет быстрее: β-аррестин замедляет десенситизацию (неверный вариант)β-аррестин не замедляет, а обеспечивает десенситизацию. Без него она ослаблена, и спад идёт медленнее.Б. Спад исчезнет полностью: cAMP останется на пике (неверный вариант)Спад сохранится: PKA по-прежнему активирует PDE4 и ускоряет гидролиз cAMP. Без β-аррестина он лишь замедляется.В. Спад замедлится: рецептор дольше активирует Gs (верный вариант)Без β-аррестина фосфорилированный рецептор дольше активирует Gs, поэтому сигнал спадает медленнее, хотя активация PDE4 его всё же снижает.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWeis W. I., Kobilka B. K. 2018. The Molecular Basis of G Protein-Coupled Receptor Activation. Annu Rev BiochemGrundmann M. et al. 2018. Lack of beta-arrestin signaling in the absence of active G proteins. Nat CommunViolin J. D. et al. 2008. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real time cAMP dynamics. J Biol ChemIrannejad R. et al. 2013. Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes. NatureЧетыре события β-аррестина — обзоры по GPCR (Weis 2018); проверка независимости от G-белков — Grundmann (2018), клетки HEK293 без функциональных Gα. Динамика cAMP — Violin (2008): HEK293 с эндогенным β2-рецептором (~100 фмоль/мг), сенсор ICUE2, 1 мкМ изопротеренол, 37 °C; нокдаун siRNA GRK2/3/5/6 (>90 %) на фоне H-89 и β-аррестинов 1 и 2 (~75 %). Числа на схеме — модель практикума, откалиброванная по этим данным; доля рецепторов в эндосоме — учебная оценка (интернализацию Violin не измеряли). Эндосомный синтез cAMP в модели не учтён; в живых клетках интернализованный β2-рецептор может продолжать передачу сигнала (Irannejad 2013).
β2-адренорецептор · шаг 7 из 28Как измеряют cAMP в живой клеткеКонцентрацию cAMP в живой клетке измеряют FRET-сенсором в реальном времени. Сенсор даёт отношение сигналов двух цветов, а не абсолютную концентрацию cAMP.Домен связывания cAMP (из Epac) помещён между двумя флуоресцентными белками — CFP и YFP.Без cAMP флуоресцентные белки сближены и эффективность переноса энергии (FRET) высока; связывание cAMP меняет конформацию, и FRET ослабевает.Измеряют отношение сигналов CFP и YFP; максимум калибруют форсколином с IBMX, минимум — по отклику сенсора без связанного cAMP в проверенном протоколе калибровки; обычный исходный сигнал клетки нельзя автоматически считать этим минимумом.Чтобы следить за cAMP в живой клетке, в неё вводят белковый сенсор: домен связывания cAMP (чаще из белка Epac) помещают между двумя флуоресцентными белками — голубым CFP и жёлтым YFP. Когда флуоресцентные белки сближены, энергия возбуждения переносится с CFP на YFP (резонансный перенос, FRET), и в свечении преобладает жёлтый. Связывание cAMP меняет конформацию домена, флуоресцентные белки расходятся, эффективность переноса энергии снижается, и отношение сигналов двух цветов отражает концентрацию cAMP в реальном времени.Важно, какую величину регистрирует метод. Сенсор измеряет отношение сигналов двух цветов. В одноцепочечном сенсоре оба флуоресцентных белка находятся в одной молекуле, поэтому отношение в идеале уменьшает влияние количества сенсора в клетке: общий множитель сокращается. От количества сенсора зависят яркость и шум измерения, а при высокой экспрессии сенсор буферирует cAMP и сам меняет ответ. Чтобы перевести отношение в концентрацию cAMP, нужны калибровка и кривая отклика: максимум задают форсколином вместе с ингибитором фосфодиэстераз IBMX (сенсор насыщен cAMP), минимум — по отклику сенсора без связанного cAMP в проверенном протоколе калибровки; обычный исходный сигнал клетки нельзя автоматически считать этим минимумом, а связь отношения с концентрацией определяют по кривой связывания cAMP сенсором in vitro. Так Violin и соавт. (2008) с сенсором ICUE2 оценили максимум cAMP при изопротереноле в клетках HEK293 примерно в 10 мкМ. Без калибровки результат приводят в относительных величинах.У метода есть ограничения, о которых нужно помнить. Сенсор сам связывает cAMP и при высокой экспрессии буферирует его, тем самым несколько изменяя измеряемую величину. Сигнал из целой клетки усредняет микродомены, поэтому локальные различия (шаг о компартментализации) без адресной версии сенсора не видны. Наконец, сенсор на основе одного домена Epac не обладает кооперативностью PKA, поэтому его кривая отклика отличается от зависимости активности PKA от cAMP.Этим методом и получены данные о коротком всплеске cAMP и о роли PDE4 и десенситизации, на которые опирается продвинутый уровень практикума.Типичная ошибка FRET-сенсор прямо показывает концентрацию cAMP в молях на литр.Сенсор даёт отношение сигналов двух цветов. В концентрацию cAMP его переводят только после калибровки: нужны проверенные минимальный и максимальный отклики и кривая связывания in vitro. Максимум получают при насыщении сенсора cAMP; минимум соответствует сенсору без связанного cAMP и требует отдельной проверки.Что нужно, чтобы перевести изменение сигнала FRET-сенсора в концентрацию cAMP?А. Калибровка: максимум и минимум сигнала и кривая связывания cAMP (верный вариант)Сенсор даёт отношение сигналов двух цветов: оно уменьшает влияние количества сенсора, но не выражено в единицах концентрации. Связывает его с концентрацией cAMP только калибровка (проверенные минимальный и максимальный отклики и кривая отклика сенсора in vitro).Б. Ничего: отношение сигналов уже выражено в микромолях (неверный вариант)Отношение сигналов уменьшает влияние количества сенсора, но само по себе не выражено в единицах концентрации: нужны калибровка и кривая отклика сенсора.В. Достаточно измерить яркость одного жёлтого белка (неверный вариант)Яркость одного белка зависит от его количества в клетке; метод опирается на отношение двух сигналов и на калибровку.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаNikolaev V. O. et al. 2004. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J Biol ChemBörner S. et al. 2011. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat ProtocViolin J. D. et al. 2008. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real time cAMP dynamics. J Biol ChemСхема метода — одноцепочечные сенсоры на домене Epac (Nikolaev 2004); калибровка FRET-сенсоров cAMP — Börner (2011). Данные о динамике cAMP в HEK293 получены сенсором ICUE2 (фрагмент Epac1 между CFP и цитрином, 37 °C; максимум — 50 мкМ форсколина с 200 мкМ IBMX; изопротеренол 1 мкМ давал около половины максимального изменения отношения, 30 ± 2 % против 60 ± 2 %) — Violin (2008). Схема — устройство метода, а не конкретный эксперимент.
Фосфорилирование · шаг 8 из 28Что фосфатная группа меняет в белкеОпорная остановка 4 из 8 · фосфат и его следствия: присоединение фосфата — химическое событие, а изменение активности, партнёров, места или срока жизни белка — его следствия; продолжает остановку 3. Протеинкиназа переносит фосфатную группу ATP на остаток серина, треонина или тирозина в белке, протеинфосфатаза её отщепляет. Фосфат может изменить активность белка, его партнёров, место в клетке или время жизни — эти следствия нужно различать.Киназа переносит γ-фосфат ATP на гидроксильную группу остатка; фосфатаза гидролизует фосфоэфирную связь.Фосфат вносит отрицательный заряд и меняет конформацию белка или создаёт участок узнавания для другого белка.Фосфорилирование одного и того же участка может активировать белок, тормозить его или менять только его связи — направление эффекта задаёт сам белок.Протеинкиназа переносит γ-фосфатную группу ATP на гидроксильную группу остатка серина, треонина или тирозина белка-субстрата, а протеинфосфатаза гидролизует образовавшуюся фосфоэфирную связь. Это две разные реакции с разными ферментами, а не прямая и обратная стадии одной реакции. Поэтому уровень фосфорилирования определяется парой ферментов, работающих одновременно. В геноме человека 518 генов протеинкиназ (Manning 2002), а в одной клеточной линии HeLa масс-спектрометрия выявила более 50 000 разных фосфопептидов (Sharma 2014).Фосфатная группа при физиологическом pH несёт отрицательный заряд (около −1,5…−2), объёмна и образует несколько водородных связей. Рядом с каталитическим центром или в петле активации она меняет конформацию фермента и скорость катализа — в сторону активации или торможения. Например, у киназ семейства Src фосфорилирование петли активации повышает активность, а фосфорилирование тирозина на C-конце удерживает фермент в закрытой малоактивной форме.Второй тип следствий — новые связи. Домены SH2 и PTB распознают фосфотирозин, а белки 14-3-3 — определённые фосфосериновые мотивы (Yaffe 1997). Белок при этом может не менять активности, но меняет партнёров, а значит — место в клетке. Третий и четвёртый типы — изменение локализации и времени жизни: фосфорилированный мотив может стать участком узнавания для убиквитин-лигазы, после чего белок расщепляется в протеасоме.Переключите режимы схемы: на ней показаны четыре разных следствия одного и того же события — переноса фосфата.Типичная ошибка Фосфорилирование всегда активирует белок.Направление эффекта зависит от участка и белка: фосфат может активировать фермент, тормозить его или менять только партнёров, локализацию или время жизни белка. Фосфоламбан (следующие шаги) после фосфорилирования перестаёт тормозить насос.Белок фосфорилировали по серину в пробирке; сохранность фосфата подтверждена, а проба для проверки активности не содержала фосфатазы. Каталитическая активность белка не изменилась. Какой вывод обоснован?А. Этот участок не регулирует белок (неверный вариант)Активность — лишь одно из возможных следствий. Фосфосерин может создавать участок узнавания для другого белка (например, белка 14-3-3 при подходящей последовательности), менять локализацию или время жизни белка; это нужно проверять отдельно.Б. Фосфорилирование этого участка может менять партнёров, место или время жизни белка (верный вариант)Фосфат часто влияет не на катализ, а на связывание белка с партнёрами: фосфосериновые мотивы узнают белки 14-3-3, фосфорилированный мотив может стать участком узнавания убиквитин-лигазы. Домены SH2 и PTB, напротив, узнают фосфотирозин, а не фосфосерин. Если измеряют только каталитическую активность, такие эффекты не выявляются.В. Фосфат на этом участке сразу снимается фосфатазой (неверный вариант)Условие исключает это объяснение: сохранность фосфата подтверждена, а проба фосфатазы не содержит. Отсутствие изменения активности означает лишь, что в этом тесте активность не изменилась; это не значит, что фосфат потерян.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаManning G. et al. 2002. The protein kinase complement of the human genome. ScienceSharma K. et al. 2014. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell RepUbersax J. A., Ferrell J. E. 2007. Mechanisms of specificity in protein phosphorylation. Nat Rev Mol Cell BiolYaffe M. B. et al. 1997. The structural basis for 14-3-3:phosphopeptide binding specificity. CellСхема механизма. Число генов протеинкиназ — Manning 2002 (анализ генома человека); число фосфопептидов — Sharma 2014 (одна линия клеток HeLa, масс-спектрометрия); мотивы узнавания 14-3-3 — Yaffe 1997 (пептидные библиотеки, кристаллическая структура). Заряд фосфата зависит от pH и окружения.
Фосфорилирование · шаг 9 из 28Как пара киназа — фосфатаза задаёт уровень и скорость переключенияОпорная остановка 5 из 8 · доля, поток и время: доля фосфорилированного белка зависит от отношения констант скорости (kк/kф), а время выхода на неё — от суммы этих констант; продолжает остановку 4. Доля фосфорилированного белка задаётся двумя одновременно работающими ферментами. Уровень зависит от отношения их активностей, а время выхода на него — от суммы.Скорость фосфорилирования пропорциональна доле нефосфорилированного белка, скорость дефосфорилирования — доле фосфорилированного.Стационарная доля p* = kк/(kк + kф) зависит только от отношения констант; на плато потоки kк(1 − p*) и kф·p* равны, а реакции продолжаются.Время релаксации τ = 1/(kк + kф): за время τ доля проходит около 63 % пути к новому уровню; чем выше обе активности, тем короче τ.Представим 100 одинаковых молекул фосфоламбана. Киназа присоединяет фосфат к тем из них, которые его не несут, а фосфатаза отщепляет фосфат от тех, которые его несут; обе реакции идут одновременно и непрерывно. Пока фосфорилируется больше молекул, чем дефосфорилируется, доля фосфорилированных растёт. Когда число молекул, получающих фосфат за секунду, сравнивается с числом молекул, теряющих его, доля перестаёт меняться. Реакции при этом не прекращаются: одни молекулы фосфорилируются, другие дефосфорилируются, а доля в среднем остаётся постоянной. Постоянная доля означает равенство потоков, а не отсутствие реакций.Рассмотрим один участок фосфорилирования. Киназа и фосфатаза работают одновременно и непрерывно. Если оба фермента далеки от насыщения субстратом, скорость фосфорилирования равна kк(1 − p), а скорость дефосфорилирования — kф·p, где p — доля фосфорилированных молекул, а kк и kф — эффективные константы скорости первого порядка, в которые уже входят количество и активность фермента. Изменение доли описывается уравнением dp/dt = kк(1 − p) − kф·p. Эти два произведения — потоки vк и vф в долях пула в секунду.Из уравнения следуют два вывода. Первый: стационарная доля p* = kк/(kк + kф) зависит от отношения констант, а в стационаре равны не константы, а потоки: kк(1 − p*) = kф·p*. Например, при kк = 0,03 с⁻¹ и kф = 0,01 с⁻¹ получаем p* = 0,75, и оба потока равны 0,0075 доли пула в секунду; константа фосфорилирования втрое больше, потому что она должна уравновесить втрое меньшую долю нефосфорилированных молекул. Одну и ту же долю можно получить, повысив активность киназы или понизив активность фосфатазы, поэтому рост фосфорилирования сам по себе не указывает на активацию киназы. Второй: доля выходит на новый уровень экспоненциально с характерным временем τ = 1/(kк + kф). За время τ она проходит около 63 % пути к новому уровню, за 3τ — около 95 %; τ — не время полного завершения. Если kк утроить с 0,01 до 0,03 с⁻¹ при kф = 0,04 с⁻¹, p* вырастет с 0,2 лишь до 0,43, а τ сократится с 20 до 14 с.Высокая скорость оборота цикла фосфорилирования и дефосфорилирования позволяет получить быстрый ответ при том же стационарном уровне, но требует непрерывного расхода ATP, пропорционального потоку. Сравните две пары: kк = 0,01 и kф = 0,04 с⁻¹ либо kк = 0,05 и kф = 0,20 с⁻¹. Отношение у них одинаково (p* = 0,2), а сумма различается в пять раз (τ = 20 и 4 с). Одно и то же пробное воздействие — подавление киназы — делает различие видимым: во второй паре доля фосфорилированного белка снижается в пять раз быстрее. Если киназу подавить полностью, доля снижается с характерным временем 1/kф: так в клетке оценивают активность фосфатазы.Начните с вида «Молекулы»: выберите число молекул и пару констант, меняйте время и сравнивайте число актов фосфорилирования и дефосфорилирования за последние 20 с. Затем перейдите к виду «Расчёт по формуле», меняйте kк и kф и следите за потоками. Расчёт выполнен по тем же формулам, что в практикуме.Типичная ошибка Время переключения задаёт фермент, который изменился.Время релаксации τ = 1/(kк + kф) зависит от обеих констант. Если снизить активность фосфатазы, доля вырастет, но новый уровень установится медленнее.В двух клетках доля фосфорилированного белка одинакова — 0,5. В первой kк = kф = 0,1 с⁻¹, во второй kк = kф = 0,01 с⁻¹. Чем различаются эти клетки?А. Первая быстрее выходит на новый уровень при смене сигнала (верный вариант)τ = 1/(kк + kф): в первой клетке 5 с, во второй 50 с. Уровень одинаков, а скорость ответа различается в десять раз.Б. Ничем: одинаковый уровень означает одинаковое поведение (неверный вариант)Стационарная доля зависит от отношения констант, а скорость переключения — от их суммы. При одинаковом отношении суммы здесь различаются в десять раз.В. Вторая быстрее отвечает, потому что тратит меньше ATP (неверный вариант)Меньший расход ATP во второй клетке связан как раз с низкими активностями ферментов, а они дают медленный ответ: τ = 50 с против 5 с.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаGoldbeter A., Koshland D. E. 1981. An amplified sensitivity arising from covalent modification in biological systems. Proc Natl Acad Sci U S AFerrell J. E., Ha S. H. 2014. Ultrasensitivity part I: Michaelian responses and zero-order ultrasensitivity. Trends Biochem SciРасчёт по формулам Goldbeter и Koshland (1981): закрытый пул субстрата, ферменты далеки от насыщения, концентрации ферментов и ATP постоянны. Константы kк и kф — учебные значения в с⁻¹; закачка Ca²⁺ рассчитана для учебной модели фосфоламбана (см. следующий шаг). Вид «Молекулы» — стохастическая учебная модель: на каждом шаге 0,05 с у каждой молекулы своя вероятность реакции (kк·0,05 или kф·0,05); траектории случайны, но воспроизводятся при каждом открытии.
Фосфорилирование · шаг 10 из 28Как фосфорилирование фосфоламбана ускоряет закачку Ca²⁺Фосфоламбан тормозит кальциевый насос SERCA2a кардиомиоцита, пока не фосфорилирован. PKA снимает торможение, фосфорилируя фосфоламбан по Ser16, а PP1, дефосфорилируя его, торможение восстанавливает.Нефосфорилированный PLN снижает кажущееся сродство SERCA2a к Ca²⁺, и при субмикромолярной концентрации Ca²⁺ насос работает медленнее.При β-адренергической стимуляции PKA фосфорилирует PLN по Ser16; торможение снимается, Ca²⁺ быстрее возвращается в СР.PP1 дефосфорилирует PLN, и после прекращения сигнала торможение восстанавливается.Фосфоламбан — небольшой белок мембраны саркоплазматического ретикулума (СР) кардиомиоцита. В нефосфорилированном состоянии он связывается с Ca²⁺-АТФазой SERCA2a и снижает её кажущееся сродство к Ca²⁺: в экспериментах с ферментом, экспрессированным в клетках насекомых, фосфоламбан повышал на 200 нМ концентрацию Ca²⁺, необходимую для половины максимальной активности, не меняя максимальной скорости (Mahaney 2000). Поэтому при той концентрации Ca²⁺, которая бывает в цитозоле во время спада Ca²⁺-транзиента, насос работает медленнее.При стимуляции β-рецепторов PKA фосфорилирует фосфоламбан по Ser16, торможение снимается, Ca²⁺ быстрее закачивается в СР, и спад транзиента свободного Ca²⁺ ускоряется. PKA при этом фосфорилирует и другие белки, поэтому PLN — основной, но не единственный путь ускорения спада Ca²⁺. Механическое расслабление определяется не только скоростью спада свободного Ca²⁺: оно зависит и от отсоединения Ca²⁺ от тропонина C, и от кинетики поперечных мостиков. Фосфорилирование тропонина I меняет связывание Ca²⁺ с миофиламентами, а не откачивает Ca²⁺ из цитозоля (Briston 2014); в экспериментах на мышах главный вклад в ускорение нарастания давления и расслабления в целом организме давало фосфорилирование белка C, связывающего миозин (Gresham и Stelzer 2016). У кардиомиоцитов мышей без фосфоламбана спад Ca²⁺ быстрый уже в покое, а ответ на изопротеренол сохраняется, хотя и слабее, чем в норме (Wolska 1996).Доля фосфорилированного фосфоламбана задаётся парой PKA — PP1 по правилу предыдущего шага. PP1 — главная фосфатаза фосфоламбана; при β-стимуляции PKA фосфорилирует белок ингибитор-1, и фосфорилированный ингибитор-1 подавляет PP1 (Kranias и Hajjar 2012). Сигнал, следовательно, одновременно ускоряет фосфорилирование и замедляет дефосфорилирование.Переключите условия на схеме: учебная модель показывает долю фосфоламбана, фосфорилированного по Ser16, и время полуспада Ca²⁺-транзиента в норме, после пропранолола, у клеток с заменой S16A, без фосфоламбана и под действием ингибитора фосфатаз.Типичная ошибка Фосфорилированный фосфоламбан сам переносит Ca²⁺ в ретикулум.Насос SERCA2a переносит Ca²⁺ за счёт гидролиза ATP. Фосфоламбан — регуляторный белок: нефосфорилированный он тормозит насос, а фосфорилирование это торможение снимает.Каким образом фосфорилирование фосфоламбана по Ser16 ускоряет спад Ca²⁺-транзиента в кардиомиоците?А. Снимает торможение Ca²⁺-насоса SERCA2a (верный вариант)Нефосфорилированный фосфоламбан снижает кажущееся сродство SERCA2a к Ca²⁺. После фосфорилирования Ser16 торможение снимается, насос быстрее закачивает Ca²⁺ в СР, и концентрация свободного Ca²⁺ в цитозоле снижается быстрее. Механическое расслабление зависит ещё и от свойств миофиламентов.Б. Делает фосфоламбан переносчиком Ca²⁺ в СР (неверный вариант)Фосфоламбан не переносит ионы: это регуляторный белок насоса. SERCA2a переносит Ca²⁺ за счёт гидролиза ATP.В. Ускоряет выход Ca²⁺ из СР в цитозоль (неверный вариант)Выход Ca²⁺ из СР обеспечивают рианодиновые рецепторы. Фосфоламбан регулирует обратный поток — закачку Ca²⁺ в СР, которая и определяет скорость спада транзиента.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаMacLennan D. H., Kranias E. G. 2003. Phospholamban: a crucial regulator of cardiac contractility. Nat Rev Mol Cell BiolMahaney J. E. et al. 2000. Kinetics studies of the cardiac Ca-ATPase expressed in Sf21 cells: new insights on Ca-ATPase regulation by phospholamban. Biophys JWolska B. M. et al. 1996. Effect of ablation of phospholamban on dynamics of cardiac myocyte contraction and intracellular Ca2+. Am J PhysiolChu G. et al. 2000. A single site (Ser16) phosphorylation in phospholamban is sufficient in mediating its maximal cardiac responses to beta-agonists. J Biol ChemLuo W. et al. 1998. Transgenic approaches to define the functional role of dual site phospholamban phosphorylation. J Biol ChemKranias E. G., Hajjar R. J. 2012. Modulation of cardiac contractility by the phospholamban/SERCA2a regulatome. Circ ResBriston S. J. et al. 2014. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc ResGresham K. S., Stelzer J. E. 2016. The contributions of cardiac myosin binding protein C and troponin I phosphorylation to β-adrenergic enhancement of in vivo cardiac function. J PhysiolУчебная модель кардиомиоцита мыши (та же, что в практикуме 2п): изопротеренол с 1-й мин, относительные величины, время полуспада Ca²⁺-транзиента — учебная оценка. Сдвиг сродства SERCA2a — Mahaney 2000 (фермент собаки в клетках Sf21); ответ клеток PLN⁻/⁻ — Wolska 1996 (кардиомиоциты мыши, изопротеренол 0,05 мкМ); клетки с PLN S16A — Chu 2000 (трансгенные мыши на фоне PLN⁻/⁻); роль ингибитора-1 — обзор Kranias и Hajjar 2012. Время полуспада свободного Ca²⁺ — учебная оценка; сила и длина клетки в модели не рассчитываются, вклад других эффектов β-стимуляции задан одной феноменологической поправкой, а не откачкой Ca²⁺ тропонином.
Фосфорилирование · шаг 11 из 28Откуда берётся резкое переключениеПростая пара киназа — фосфатаза отвечает плавно. Резкий переход появляется при насыщении ферментов субстратом и при фосфорилировании нескольких участков.Если ферменты далеки от насыщения, доля фосфорилированной формы плавно возрастает с увеличением отношения активностей киназы и фосфатазы.Если оба фермента насыщены субстратом, доля резко возрастает от значения, близкого к нулю, до значения, близкого к единице, в узком интервале около равенства их максимальных скоростей.Резкость (сверхчувствительность) не равна бистабильности: кривая крутая, но каждому значению входного сигнала соответствует одно состояние. Бистабильность требует эффективной положительной обратной связи и проверяется экспериментом с разной предысторией.Формула предыдущего шага даёт гиперболическую зависимость: чтобы доля фосфорилированного белка выросла с 0,1 до 0,9, отношение активностей киназы и фосфатазы нужно изменить примерно в 80 раз. Между «выключено» и «включено» нет качественной границы.Goldbeter и Koshland (1981) показали, что та же пара ферментов отвечает резко, если концентрация субстрата намного выше констант Михаэлиса обоих ферментов. Тогда каждый фермент работает почти с максимальной скоростью, независимо от концентрации субстрата (режим нулевого порядка). Пока максимальная скорость киназы меньше максимальной скорости фосфатазы, почти весь субстрат дефосфорилирован; когда максимальная скорость киназы становится больше, почти весь субстрат фосфорилирован. Переход от 0,1 до 0,9 укладывается в интервал отношения скоростей примерно от 0,9 до 1,1.Второй механизм резкости — многосайтовое фосфорилирование: если для изменения свойств белка нужны фосфаты на нескольких участках, а киназа за одно связывание модифицирует в среднем один участок, зависимость доли полностью модифицированной формы от активности киназы более крутая, чем зависимость доли модифицированных участков. Бистабильность — два устойчивых состояния при одном и том же значении входного сигнала — требует эффективной положительной обратной связи. Её создаёт отдельная петля обратной связи при достаточной нелинейности; положительная обратная связь может возникать и внутри многосайтового цикла без добавленной петли (Markevich 2004). Крутая зависимость сама по себе бистабильность не доказывает: её устанавливают экспериментом с разной предысторией сигнала (гистерезис). Обратные связи и бистабильность разбираются в семинаре 4.Меняйте положение ползунка: при насыщении (оранжевая кривая) небольшое изменение отношения скоростей около 1 переключает почти весь пул.Типичная ошибка Белок с двумя состояниями — «фосфорилирован» и «нефосфорилирован» — всегда даёт резкий ответ «всё или ничего».Пара киназа — фосфатаза без дополнительных условий отвечает плавно. Резкость возникает при насыщении ферментов, многосайтовости или обратной связи; крутая кривая в эксперименте не указывает, какой из механизмов работает.При каком условии пара киназа — фосфатаза переводит почти весь субстрат из одной формы в другую при небольшом изменении отношения их активностей?А. Когда активности обоих ферментов очень высоки (неверный вариант)Высокие активности обоих ферментов ускоряют выход на новый стационарный уровень, но не делают зависимость крутой: в линейном режиме доля по-прежнему задаётся гиперболой kк/(kк + kф).Б. Когда киназа в десять раз активнее фосфатазы (неверный вариант)Соотношение 10 : 1 задаёт высокий уровень фосфорилирования, но ничего не говорит о крутизне перехода. Резкость определяется режимом работы ферментов, а не самим отношением.В. Когда оба фермента насыщены субстратом (верный вариант)В режиме нулевого порядка каждый фермент работает почти с максимальной скоростью, и исход определяется тем, какая из максимальных скоростей больше. Переход от 0,1 до 0,9 укладывается в интервал отношения примерно 0,9–1,1.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаGoldbeter A., Koshland D. E. 1981. An amplified sensitivity arising from covalent modification in biological systems. Proc Natl Acad Sci U S AFerrell J. E., Ha S. H. 2014. Ultrasensitivity part I: Michaelian responses and zero-order ultrasensitivity. Trends Biochem SciUbersax J. A., Ferrell J. E. 2007. Mechanisms of specificity in protein phosphorylation. Nat Rev Mol Cell BiolMarkevich N. I., Hoek J. B., Kholodenko B. N. 2004. Signaling switches and bistability arising from multisite phosphorylation in protein kinase cascades. J Cell BiolРасчёт по уравнению стационарного баланса при кинетике Михаэлиса — Ментен (Goldbeter и Koshland 1981); K — отношение константы Михаэлиса к общей концентрации субстрата, одинаковое для киназы и фосфатазы. Это расчёт, а не измерение.
Фосфорилирование · шаг 12 из 28Чем определяется субстратная специфичность киназыКаталитический центр киназы различает субстраты слабо. Специфичность в клетке складывается из мотива, участков стыковки и совместной локализации на скаффолдах.Консенсусный мотив вокруг остатка нужен, но встречается в тысячах белков.Участки стыковки вне каталитического центра удерживают киназу на субстрате и повышают эффективную концентрацию субстрата.Скаффолды (например, белки AKAP для PKA) размещают киназу, её субстрат, фосфатазу и фосфодиэстеразу в одном месте клетки.У типичной протеинкиназы от одного до нескольких сотен истинных субстратов, и они находятся среди сотен тысяч остатков серина, треонина и тирозина клетки (Ubersax и Ferrell 2007). Эффективность фосфорилирования разных коротких пептидов каталитическим центром различается лишь в несколько раз или в несколько десятков раз. Для PKA это мотив с основными остатками перед серином (например, RRxS), но таких мотивов в протеоме очень много.Второй вклад дают участки стыковки — области поверхности киназы и субстрата вне каталитического центра. Их взаимодействие удерживает пару вместе и повышает вероятность модификации нужного белка. Третий вклад — совместная локализация. Белки AKAP связывают регуляторные субъединицы PKA и закрепляют киназу на определённой мембране или в определённом комплексе, нередко вместе с фосфодиэстеразой и фосфатазой (Langeberg и Scott 2015).В кардиомиоците AKAP18δ входит в комплекс с SERCA2a, фосфоламбаном и PKA. Когда связывание PKA с AKAP нарушали разобщающими пептидами, фосфорилирование фосфоламбана при β-стимуляции снижалось, и закачка Ca²⁺ в СР ускорялась слабее (Lygren 2007, кардиомиоциты крысы). Ферменты те же, мотив тот же — различается только их взаимное расположение.Переключите режимы схемы: в пробирке PKA фосфорилирует любой белок с подходящим мотивом, в клетке — прежде всего те, рядом с которыми её удерживает AKAP.Типичная ошибка Специфичность киназы определяется только последовательностью вокруг фосфорилируемого остатка.Мотив необходим, но недостаточен: подходящих мотивов в протеоме намного больше, чем настоящих субстратов. В клетке решающими оказываются участки стыковки и закрепление киназы в определённом месте скаффолдами.Кардиомиоциты обработали пептидом, разобщающим PKA и AKAP18δ, и стимулировали изопротеренолом. Общая активность PKA в лизате (по фосфорилированию растворимого пептидного субстрата) и количество PLN остались прежними, а фосфорилирование PLN по Ser16 снизилось. Какое объяснение наиболее обосновано?А. Каталитический центр PKA перестал узнавать мотив (неверный вариант)Растворимый пептидный субстрат в лизате фосфорилируется как прежде, значит, каталитический центр работает и мотив узнаёт. Изменилось не свойство центра, а то, какие белки оказываются рядом с киназой.Б. PKA, отделённая от AKAP, больше не находится рядом с PLN (верный вариант)Ферменты, мотив и количество PLN те же, различается только взаимное расположение: AKAP18δ удерживает PKA в комплексе с фосфоламбаном и SERCA2a, а после разобщения киназа рядом с PLN не оказывается (Lygren 2007). Общий дефицит PKA в этом эксперименте исключён контролем с растворимым субстратом.В. В клетке снизилась общая активность PKA (неверный вариант)Контроль с растворимым субстратом показывает, что каталитическая способность PKA в лизате сохранена, поэтому общее снижение активности PKA в этих клетках по такому контролю маловероятно. Но снижение общей активности PKA могло бы изменить набор фосфорилируемых белков: у разных субстратов разные кинетические параметры и пороги обнаружения, и степень их фосфорилирования могла бы снижаться неодинаково. Такое объяснение исключают контролем, а не рассуждением.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаUbersax J. A., Ferrell J. E. 2007. Mechanisms of specificity in protein phosphorylation. Nat Rev Mol Cell BiolLangeberg L. K., Scott J. D. 2015. Signalling scaffolds and local organization of cellular behaviour. Nat Rev Mol Cell BiolLygren B. et al. 2007. AKAP complex regulates Ca2+ re-uptake into heart sarcoplasmic reticulum. EMBO RepСхема механизма. Оценки специфичности — обзор Ubersax и Ferrell 2007; роль AKAP — обзор Langeberg и Scott 2015; комплекс AKAP18δ–PKA–PLN–SERCA2a и эксперимент с разобщающими пептидами — Lygren 2007 (кардиомиоциты крысы, β-адренергическая стимуляция). Эксперимент в задании построен по схеме Lygren 2007 (разобщающие пептиды, кардиомиоциты крысы); контроль общей активности PKA по растворимому субстрату добавлен в задание для однозначности вывода и в статье в таком виде не описан.
Фосфорилирование · шаг 13 из 28Как доказать, что участок фосфорилирования регулирует белокНайти фосфорилированный участок — ещё не значит доказать его роль. Нужны несколько независимых экспериментов: измерение, контроль специфичности и замена остатка.Фосфоспецифичное антитело на блоте показывает, что участок фосфорилируется; обработка лизата λ-фосфатазой проверяет, что сигнал принадлежит фосфорилированной форме.Замена серина на аланин проверяет, нужен ли участок для ответа; фосфомиметическая замена на Asp или Glu воспроизводит фосфорилирование лишь частично.Масс-спектрометрия находит участки, но интенсивность фосфопептида не равна занятости участка.Первый вопрос — фосфорилируется ли участок в ответ на сигнал. Его решают вестерн-блотом с антителом, которое распознаёт белок, только если определённый остаток фосфорилирован, и с антителом, распознающим белок независимо от его фосфорилирования, для нормировки. Контроль специфичности — обработка части лизата λ-фосфатазой: полоса фосфорилированной формы должна исчезнуть, а полоса, выявляемая вторым антителом, — остаться. Сигнал антитела к фосфорилированной форме отражает не долю фосфорилированных молекул, а лишь относительное изменение (Dephoure 2013).Второй вопрос — нужен ли участок для функции. Его решают заменой остатка. Серин заменяют на аланин, который нельзя фосфорилировать: у мышей с фосфоламбаном S16A фосфорилирование PLN после изопротеренола не выявлялось, а сократительный ответ и изменение Ca²⁺-транзиента при действии изопротеренола были ослаблены (Chu 2000). Такой эксперимент показывает необходимость участка, но не его достаточность. Он не исключает и других последствий замены: в экспериментах на сердцах мышей после изопротеренола у PLN S16A не выявляли и фосфорилирования соседнего Thr17 (Luo 1998). В то же время у T17A фосфорилировался Ser16 и сохранялся полный ответ на изопротеренол: это поддерживает достаточность Ser16 в данных условиях (Chu 2000). Поэтому результат сопоставляют с другими мутантами и с восстановлением нормального белка при сопоставимой экспрессии. Замена на аспартат или глутамат вносит отрицательный заряд, но не воспроизводит фосфат: фосфоламбан S16E сохранял около трети тормозящего действия (Lockamy 2011), а белки 14-3-3 и домены SH2 обычно не распознают фосфомиметические замены (Dephoure 2013).Масс-спектрометрия выявляет тысячи участков сразу, но интенсивность фосфопептида зависит и от количества белка, и от свойств пептида. Чтобы назвать участок регуляторным, нужны нормировка на количество белка, надёжная локализация фосфата, изменение во времени в ответ на сигнал и независимая функциональная проверка.Переключайте схемы метода и следите, какие полосы исчезают после обработки λ-фосфатазой и что показывает каждая замена остатка.Типичная ошибка Если участок найден масс-спектрометрией, он регулирует белок.Обнаружение фосфата показывает только, что модификация происходит. О регуляторной роли говорят изменение в ответ на сигнал, нормированное на количество белка, и функциональный эффект замены остатка.У клеток с PLN S16A ответ на изопротеренол (ускорение спада Ca²⁺-транзиента) ослаблен. Количество, локализация и базовая функция PLN без стимуляции сохранены. Какой вывод поддерживают эти данные, если другие последствия замены проверяют отдельно?А. Участок Ser16 необходим для полного ответа на изопротеренол (верный вариант)S16A исключает фосфорилирование Ser16. Если количество, локализация и базовая функция белка не изменены (в работе Chu 2000 основные показатели у линий S16A, T17A и нормального PLN в клетках PLN⁻/⁻ без стимуляции были сходны), ослабление ответа поддерживает необходимость этого участка для полного ответа. Другие последствия замены проверяют отдельно — сравнением с мутантом T17A и восстановлением нормального белка при сопоставимой экспрессии. Достаточность участка этим экспериментом не проверяется.Б. Во всей клетке Ser16 фосфоламбана — единственный участок, фосфорилируемый PKA (неверный вариант)Ответ лишь ослаблен, а не исчез: PKA фосфорилирует и другие белки, например тропонин I. Эксперимент с одним участком ничего не говорит об остальных мишенях киназы.В. Замена S16E восстановит ответ полностью (неверный вариант)Аспартат или глутамат не воспроизводят заряд, объём и связи фосфата; фосфоламбан S16E сохраняет около трети тормозящего действия. Результат с миметиком нужно проверять отдельно.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаDephoure N. et al. 2013. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol CellChu G. et al. 2000. A single site (Ser16) phosphorylation in phospholamban is sufficient in mediating its maximal cardiac responses to beta-agonists. J Biol ChemLuo W. et al. 1998. Transgenic approaches to define the functional role of dual site phospholamban phosphorylation. J Biol ChemLockamy E. L. et al. 2011. Functional and physical competition between phospholamban and its mutants provides insight into the molecular mechanism of gene therapy for heart failure. Biochem Biophys Res CommunSharma K. et al. 2014. Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling. Cell RepСхема метода. Пример фосфоламбана: кардиомиоциты трансгенных мышей с PLN S16A на фоне PLN⁻/⁻, изопротеренол (Chu 2000); остаточное торможение S16E — реконструированные мембраны с очищенной SERCA (Lockamy 2011). Рекомендации по анализу участков — Dephoure 2013. Полосы на схеме — иллюстрация, а не данные конкретного блота.
Цикл RAS · шаг 14 из 28Почему нуклеотид служит переключателемМалая ГТФаза существует в двух формах — с GTP и с GDP, и с эффекторами связывается только форма с GTP. Переключение задаёт одна фосфатная группа — γ-фосфат связанного нуклеотида.Нуклеотид удерживается в G-домене; при связанном GTP присутствует γ-фосфат.Две подвижные области, switch I и switch II, контактируют с γ-фосфатом и при GTP упорядочены.Упорядоченные switch I и switch II образуют поверхность, с которой связываются эффекторы; после гидролиза она исчезает.Малая ГТФаза — компактный белок, ядром которого служит G-домен, связывающий гуаниновый нуклеотид. В отличие от переключателя из вопроса 2, сам белок ковалентно не изменяется: меняется связанный нуклеотид. Информацию несёт присутствие или отсутствие одной группы — γ-фосфата GTP.Нуклеотид удерживается петлёй G-домена, а две подвижные области — switch I и switch II — контактируют с γ-фосфатом, когда он есть. При связанном GTP эти области упорядочены и вместе образуют поверхность, комплементарную эффекторным белкам. После гидролиза GTP контакты с γ-фосфатом исчезают, switch I и switch II разупорядочиваются, и поверхность связывания эффекторов пропадает.Поэтому GTP-форму называют активной: не потому, что она «энергетически заряжена», а потому, что только с ней связываются эффекторы. Белок медленно гидролизует GTP за счёт собственной ГТФазной активности и тем самым сам ограничивает время активного состояния — в этом смысле переключатель называют молекулярным таймером.Оба самопроизвольных перехода — обмен GDP на GTP и гидролиз GTP — идут медленно: каждый из них занимает минуты. Поэтому в клетке состояние переключателя задают совместно регуляторные белки GEF и GAP, собственные скорости белка и доступность нуклеотидов.Типичная ошибка GTP-форма активна, потому что в ней запасена энергия макроэргической связи.Активность определяется не запасённой энергией, а формой белка: γ-фосфат упорядочивает switch I и switch II и создаёт поверхность для эффекторов.Почему RAS-GTP связывает эффекторы, а RAS-GDP — нет?А. γ-фосфат GTP упорядочивает области switch I и switch II (верный вариант)Именно присутствие γ-фосфата удерживает switch I и switch II в упорядоченном состоянии, и только тогда есть поверхность связывания эффекторов.Б. GTP крупнее GDP и физически вытесняет эффекторы к поверхности (неверный вариант)Разница между GTP и GDP — одна фосфатная группа; дело не в размере нуклеотида, а в том, что γ-фосфат упорядочивает подвижные области белка.В. Энергия, освобождаемая при гидролизе GTP, активирует эффекторы (неверный вариант)Эффекторы связывает именно GTP-форма, до гидролиза. Активность определяется формой белка, а не энергией гидролиза.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаVetter I. R., Wittinghofer A. 2001. The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. ScienceCherfils J., Zeghouf M. 2013. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiol RevСхема механизма по обзорам Vetter и Wittinghofer (2001) и Cherfils и Zeghouf (2013); switch I и switch II, их упорядочение при GTP — структурные данные для белков семейства Ras. Состояния на схеме качественные.
Цикл RAS · шаг 15 из 28Как GEF и GAP задают долю активной формыОпорная остановка 6 из 8 · обмен и гидролиз: RAS переключается при смене связанного нуклеотида, а не при фосфорилировании белка; уравнения те же, химия иная; продолжает остановку 5. Самопроизвольные обмен и гидролиз медленны, поэтому долю RAS-GTP задают два регуляторных белка. GEF ускоряет обмен GDP на GTP, GAP ускоряет гидролиз GTP — те же уравнения, что для пары киназа — фосфатаза в вопросе 2.GEF раскрывает нуклеотид-связывающий карман и снижает сродство ГТФазы к GDP; GDP диссоциирует, и его место занимает GTP (его концентрация в цитозоле выше).GAP вносит в активный центр каталитический аргининовый палец и ускоряет гидролиз GTP на несколько порядков.В стационарном состоянии доля активной формы p* = kGEF/(kGEF + kGAP), время выхода τ = 1/(kGEF + kGAP).GEF действует так же, как активный β2-рецептор по отношению к Gs в вопросе 1: раскрывает карман и снижает сродство к GDP. GDP диссоциирует, и его место занимает GTP — потому что концентрация GTP в цитозоле существенно выше концентрации GDP (примерно 0,5 мМ против десятков мкМ, Traut 1994). Сам GEF ATP не расходует.GAP действует на другом этапе цикла: вносит в активный центр RAS собственный аргининовый остаток и правильно ориентирует остаток глутамина самой ГТФазы и атакующую молекулу воды, ускоряя гидролиз GTP на несколько порядков (Scheffzek 1997).Если ни GEF, ни GAP не насыщены субстратом, а обмен направлен избытком GTP, система описывается теми же уравнениями, что и пара киназа — фосфатаза из вопроса 2. Доля активной формы в стационарном состоянии равна отношению kGEF/(kGEF + kGAP), а время выхода на новый уровень — обратной сумме этих констант. Передвиньте ползунки на схеме: при равных активностях половина RAS активна; усиление любой из сторон смещает долю, а рост обеих ускоряет переключение.Сходство уравнений не должно скрывать различие реакций. Обмен GDP на GTP и гидролиз GTP происходят с нуклеотидом, связанным с белком: белок не получает и не теряет ковалентного фосфата. При фосфорилировании киназа, напротив, переносит γ-фосфат ATP на остаток серина, треонина или тирозина, и фосфат остаётся на белке. Режим «Сравнение трёх превращений» на схеме прослеживает метку в каждом из трёх случаев: при обмене она оказывается в свободных нуклеотидах, при гидролизе — в свободном фосфате, при фосфорилировании — на белке.Отсюда следствие: повысить долю RAS-GTP можно и усилением обмена (сигнал на GEF), и ослаблением гидролиза (потеря GAP). Сам по себе рост доли активной формы не говорит, какое из двух событий произошло.Типичная ошибка Чем выше активность GEF, тем быстрее RAS выключается после сигнала.После снятия сигнала активность GEF падает до базальной, и возврат к покою задают GAP и базальный обмен. Пока активность GEF высока, она повышает стационарную долю RAS-GTP, а не выключает RAS.В клетках доля RAS-GTP повысилась. Какой вывод о причине обоснован?А. Усилился обмен (GEF) или ослаб гидролиз (GAP) (верный вариант)Долю активной формы задаёт отношение kGEF/(kGEF + kGAP); её рост одинаково объясним усилением обмена и ослаблением гидролиза.Б. Обязательно усилился обмен GDP на GTP (неверный вариант)Не обязательно: к той же доле приводит ослабление GAP при прежнем обмене. Пример — потеря нейрофибромина.В. Обязательно ускорился собственный гидролиз GTP (неверный вариант)Ускорение гидролиза снизило бы долю активной формы, а не повысило: гидролиз выключает RAS.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаCherfils J., Zeghouf M. 2013. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiol RevScheffzek K. et al. 1997. The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. ScienceTraut T. W. 1994. Physiological concentrations of purines and pyrimidines. Mol Cell BiochemФормулы стационарного состояния и времени релаксации — учебная идеализация при ненасыщенных GEF и GAP и направленном обмене (Cherfils и Zeghouf, 2013); те же уравнения, что в вопросе 2. Концентрации GTP и GDP — Traut (1994). Величины на ползунках условные.
Цикл RAS · шаг 16 из 28Как рецептор доставляет SOS1 к RASФактор роста активирует рецепторную тирозинкиназу, которая фосфорилирует остатки тирозина в собственных цитоплазматических участках. GRB2 связывается с фосфотирозином рецептора и привлекает SOS1 к мембране, где находится RAS.Рецептор (например, EGFR) связывает лиганд, димеризуется и фосфорилирует остатки тирозина своих цитоплазматических участков.GRB2 связывается доменом SH2 с фосфотирозином, а доменом SH3 удерживает SOS1.Оказавшись у мембраны рядом с RAS, SOS1 ускоряет обмен GDP на GTP, и доля RAS-GTP растёт.RAS закреплён на внутренней стороне мембраны липидным якорем (мотив CAAX); без якоря он остаётся в цитозоле и не встречается с SOS1.Активация RAS начинается с рецепторной тирозинкиназы. Связав лиганд, рецептор образует активный димер и фосфорилирует тирозины своих цитоплазматических участков. Каждый фосфотирозин становится участком узнавания для белков с доменами SH2 и PTB.Адаптер GRB2 связывается доменом SH2 с фосфотирозином рецептора, а доменом SH3 удерживает SOS1. Собственной ферментативной активности у GRB2 нет; функция этого комплекса пространственная. SOS1 — цитозольный фермент, а RAS закреплён на плазматической мембране, поэтому GRB2 доставляет фактор обмена к его субстрату.Оказавшись у мембраны рядом с RAS, SOS1 ускоряет обмен GDP на GTP, и доля RAS-GTP на мембране растёт. Если лиганда нет, комплекс не образуется и обмен не ускоряется; если рецептор лишён фосфотирозина, GRB2 с ним не связывается; если SOS1 не перемещается к мембране, он не контактирует с RAS. Нарушение любого из этих звеньев прерывает передачу сигнала на цикл RAS — проверьте это на схеме.Почему RAS находится у мембраны? RAS — не трансмембранный белок: на внутренней стороне плазматической мембраны его удерживает липидный якорь на C-конце. Концевой мотив CAAX (цистеин, две алифатические аминокислоты и любая концевая) последовательно модифицируется: к цистеину присоединяется остаток фарнезила, три концевые аминокислоты отщепляются, а карбоксильная группа метилируется. Для прочного закрепления нужен ещё один сигнал: у HRAS и NRAS пальмитоилируются соседние цистеины, а у основной изоформы KRAS (KRAS4B) закрепление усиливает участок положительно заряженных остатков лизина, притягиваемый к отрицательно заряженным липидам внутреннего слоя мембраны (Hancock 1989, 1990; Prior и Hancock 2012).Роль якоря показывает эксперимент, в котором цистеин-186 HRAS, расположенный на самом конце цепи, заменили на серин: белок перестал модифицироваться, остался в цитозоле, не связывал липиды и не вызывал трансформации клеток (Willumsen 1984). Обратное показано для SOS1 и RAF: SOS1 с мембранным сигналом активирует путь RAS, поскольку для активации достаточно, чтобы SOS1 оказался у мембраны рядом с RAS (Aronheim 1994), а RAF с мембранным сигналом KRAS активен независимо от RAS (Leevers 1994; Stokoe 1994). Поэтому состояние нуклеотида и пространственная доступность — разные свойства: нуклеотид определяет форму RAS, а якорь — встретится ли RAS со своим фактором обмена и эффекторами. Переключите режимы на схеме и сравните.Так внешний сигнал превращается в повышение доли активного RAS. Завершают сигнал GAP, потеря рецепторов и отрицательные обратные связи (подробно — в семинаре 4).Типичная ошибка GRB2 сам активирует RAS, заменяя в нём GDP на GTP.GRB2 — адаптер без ферментативной активности. SOS1 ускоряет обмен нуклеотида; GRB2 лишь привлекает его к мембране.В клетках рецептор активен и фосфорилирован, но SOS1 не перемещается к мембране. Как изменится доля RAS-GTP при добавлении фактора роста?А. Почти не вырастет: без SOS1 у мембраны обмен не ускоряется (верный вариант)SOS1 — фермент, ускоряющий обмен нуклеотида в RAS. Если он не достигает мембраны, сигнал от рецептора не доходит до RAS.Б. Вырастет как обычно: фосфотирозины рецептора сами активируют RAS (неверный вариант)Фосфотирозины — лишь участки сборки; сами они нуклеотид не меняют. Без SOS1 у мембраны обмен не ускоряется.В. Вырастет за счёт GRB2, который заменит SOS1 как фактор обмена (неверный вариант)GRB2 — адаптер без ферментативной активности; заменить SOS1 он не может.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLemmon M. A., Schlessinger J. 2010. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. CellCherfils J., Zeghouf M. 2013. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiol RevHancock J. F. et al. 1989. All ras proteins are polyisoprenylated but only some are palmitoylated. CellHancock J. F., Paterson H., Marshall C. J. 1990. A polybasic domain or palmitoylation is required in addition to the CAAX motif to localize p21ras to the plasma membrane. CellWillumsen B. M. et al. 1984. Harvey murine sarcoma virus p21 ras protein: biological and biochemical significance of the cysteine nearest the carboxy terminus. EMBO JAronheim A. et al. 1994. Membrane targeting of the nucleotide exchange factor Sos is sufficient for activating the Ras signaling pathway. CellLeevers S. J., Paterson H. F., Marshall C. J. 1994. Requirement for Ras in Raf activation is overcome by targeting Raf to the plasma membrane. NatureStokoe D. et al. 1994. Activation of Raf as a result of recruitment to the plasma membrane. SciencePrior I. A., Hancock J. F. 2012. Ras trafficking, localization and compartmentalized signalling. Semin Cell Dev BiolСхема механизма по Lemmon и Schlessinger (2010) и Cherfils и Zeghouf (2013). Переключаемые состояния качественные; показана ветвь EGFR → GRB2 → SOS1 → RAS. Липидный якорь и локализация RAS — Willumsen (1984), Hancock (1989, 1990), Aronheim (1994), Leevers (1994), Stokoe (1994), Prior и Hancock (2012); схема качественная, RAS не является трансмембранным белком.
Цикл RAS · шаг 17 из 28Как эффекторы распознают активный RAS и конкурируют за негоС активным RAS связываются эффекторы трёх групп: RAF, PI3K и RALGDS. Все три связываются с одной и той же поверхностью switch I / switch II, поэтому конкурируют за активный RAS.RAF запускает каскад RAF → MEK → ERK (подробно в семинаре 4).PI3K класса I катализирует образование PIP₃ из PIP₂ и запускает путь AKT.RALGDS — сам фактор обмена для ГТФаз семейства Ral; все три связываются с поверхностью switch I / switch II.Активная GTP-форма RAS образует поверхность из упорядоченных switch I и switch II. С ней связываются эффекторы — белки, которые RAS привлекает к мембране и активирует. Обычно выделяют три группы: протеинкиназы семейства RAF, каталитические субъединицы PI3K класса I и белки RALGDS.Поскольку все три группы связываются с одной и той же поверхностью, они конкурируют за активный RAS: одна молекула RAS-GTP в один момент связывает один эффектор. На схеме с ростом доли RAS-GTP растёт связывание всех трёх групп, а их относительные доли задаются сродством и количеством каждого эффектора в данной клетке.Относительный вклад ветвей зависит от типа клетки — это та же контекстная зависимость, что для β2-рецептора в вопросе 1: один и тот же активный RAS в разных клетках запускает разные программы, потому что набор и количество эффекторов различны. Наиболее полно изучена ветвь RAF — MEK — ERK, она разбирается в семинаре 4.Конкуренция за одну поверхность объясняет, почему усиление одной ветви может идти за счёт других и почему для онкогенного RAS важно, какие эффекторы доступны в ткани.Типичная ошибка У RAS отдельная площадка для каждого эффектора, поэтому RAF, PI3K и RALGDS работают независимо.Все три группы связываются с одной поверхностью switch I / switch II, поэтому конкурируют за активный RAS; их доли зависят от сродства и количества в данной клетке.Почему в разных клетках активный RAS запускает разные программы?А. В разных клетках различаются набор и количество эффекторов (верный вариант)Активный RAS один и тот же, но с ним связываются разные эффекторы в разном количестве, и они делят один пул RAS-GTP.Б. В разных клетках у RAS разные поверхности связывания (неверный вариант)Поверхность switch I / switch II одна и та же; различается набор эффекторов в клетке, а не сам RAS.В. RAS связывает GTP в одних клетках и другой нуклеотид в других (неверный вариант)Активная форма всегда связывает GTP. Исход определяется не нуклеотидом, а набором эффекторов.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаSimanshu D. K., Nissley D. V., McCormick F. 2017. RAS proteins and their regulators in human disease. CellVetter I. R., Wittinghofer A. 2001. The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. ScienceСхема по обзору Simanshu, Nissley и McCormick (2017) и Vetter и Wittinghofer (2001). Относительные доли на схеме — учебные (условные сродства); в эксперименте вклад ветвей зависит от типа клетки.
Цикл RAS · шаг 18 из 28Чем различаются онкогенные варианты RASОнкогенные замены RAS сосредоточены в кодонах 12, 13 и 61 и смещают цикл по-разному. Точнее сказать не «выключатель навсегда включён», а «смещённый цикл с ослабленным выключением».Замены в кодонах 12 и 13 препятствуют внесению аргининового пальца GAP в активный центр: GAP-стимулированный гидролиз резко снижается.Глутамин 61 — каталитический остаток; его замена снижает и собственный, и GAP-стимулированный гидролиз.Потеря нейрофибромина ослабляет инактивацию RAS, не меняя сам белок.Соматические варианты RAS — одни из самых частых онкогенных событий (около 19 % больных раком имеют опухоли с мутацией RAS, и три четверти этих мутаций приходятся на KRAS; Prior 2020). Почти все замены приходятся на три кодона — 12, 13 и 61, все в активном центре. Но нарушения у разных вариантов разные, и описывать их одной фразой нельзя.Замены глицина 12 и 13 вносят в тесный активный центр боковую цепь, которая препятствует введению каталитического аргинина GAP; GAP-стимулированный гидролиз снижается на 97–99 %. При этом собственный гидролиз у разных замен нарушен в разной степени: у KRAS G12C он почти такой же, как у нормального белка (49·10⁻⁵ с⁻¹ против 68·10⁻⁵ с⁻¹), и именно потеря ответа на GAP, а не медленный собственный гидролиз, обусловливает высокую долю активной формы в отсутствие сигнала (Hunter 2015). У G12V собственный гидролиз снижен сильно (4,2·10⁻⁵ с⁻¹).Глутамин 61 ориентирует молекулу воды в реакции гидролиза; его замена (Q61L) резко снижает и собственный (0,80·10⁻⁵ с⁻¹), и GAP-стимулированный гидролиз, поэтому доля активной формы почти не зависит от сигнала. В таблице видно, что варианты различаются скоростью собственного гидролиза и ответом на GAP, а не одним признаком.Отдельный механизм — потеря GAP. При нейрофиброматозе 1 типа функция нейрофибромина утрачена; RAS при этом не изменён, но инактивируется медленнее. Это показывает, что клинически значимое повышение активности пути достигается и усилением прямой реакции, и ослаблением обратной. Высокая доля RAS-GTP сама по себе не указывает, какое именно нарушение её вызвало: к ней приводят усиленный обмен, потеря GAP и замены в кодонах 12, 13 и 61. Различают их по скоростям реакций, по генотипу и по ответу на вышележащий сигнал.Типичная ошибка Онкогенные замены G12C, G12V, G13D и Q61L одинаково «блокируют гидролиз» и держат RAS постоянно включённым.У всех этих вариантов сильно ослаблен ответ на GAP, но собственный гидролиз нарушен в разной степени: у G12C он почти как у нормального белка, у Q61L почти отсутствует. Высокая доля активной формы у G12C — следствие ослабления ответа на GAP, а не остановки собственного гидролиза; точнее говорить о смещённом цикле, а не о «вечном включении».Почему формулировка «онкогенный RAS навсегда включён» неточна для KRAS G12C?А. G12C сохраняет собственный гидролиз, поэтому доля его GTP-формы зависит от сигнала (верный вариант)G12C почти нечувствителен к GAP, но собственный гидролиз сохранён; белок переходит между формами, и подавление вышележащего сигнала снижает долю RAS-GTP.Б. У G12C нет мутации в активном центре, поэтому он работает как нормальный RAS (неверный вариант)Мутация в активном центре есть и снижает чувствительность к GAP. Неточность не в этом, а в словах «навсегда включён»: гидролиз сохранён.В. G12C вообще не связывает GTP, поэтому не может быть постоянно активным (неверный вариант)G12C связывает GTP и активен; он не зафиксирован, а продолжает переходить между GTP- и GDP-формами.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаHunter J. C. et al. 2015. Biochemical and structural analysis of common cancer-associated KRAS mutations. Mol Cancer ResPatricelli M. P. et al. 2016. Selective inhibition of oncogenic KRAS output with small molecules targeting the inactive state. Cancer DiscovSimanshu D. K., Nissley D. V., McCormick F. 2017. RAS proteins and their regulators in human disease. CellPrior I. A., Hood F. E., Hartley J. L. 2020. The frequency of Ras mutations in cancer. Cancer ResСкорости гидролиза — из Hunter и соавт. (2015, Mol Cancer Res 13:1325, табл. 1, KRAS in vitro, ×10⁻⁵ с⁻¹): собственный WT 68, G12C 49, G12V 4,2, Q61L 0,80; GAP-стимулированный при 50 мкМ p120GAP (ненасыщающая концентрация): WT 4300, G12C 20, G12V 24, Q61L 12; обмен ~0,002 с⁻¹ у всех, кроме G13D. Доли RAS-GTP без сигнала — из учебной модели вопроса 3 (относительные величины). Сохранение переходов G12C между GDP- и GTP-формами — Patricelli (2016); частоты мутаций — Prior (2020); механизм NF1 — Simanshu (2017).
Цикл RAS · шаг 19 из 28Как ковалентный ингибитор GDP-формы захватывает KRAS G12CСоторасиб и исследовательское соединение ARS-853 связываются с KRAS G12C только в GDP-форме. Поэтому захват идёт по мере перехода белка из GTP- в GDP-форму, а вариант без гидролиза устойчив к ингибитору.Соторасиб и ARS-853 ковалентно связываются с цистеином-12 в кармане возле switch II, открытом только в GDP-форме.KRAS G12C сохраняет гидролиз, поэтому проходит через GDP-форму и захватывается.У двойного мутанта G12C + Q61L гидролиз почти утрачен, и захвата почти нет; такая же устойчивость наблюдается у клетки с RAS без цистеина-12, поэтому по устойчивости генотип не определить.Долгие годы RAS считали непригодной мишенью: сродство к GTP и GDP пикомолярное, нуклеотид диссоциирует очень медленно, а GTP в цитозоле много, поэтому ингибитор, конкурирующий с нуклеотидом, неэффективен (John 1990; Simanshu 2017). Решение нашли другим путём: ковалентные ингибиторы GDP-формы KRAS G12C (ARS-853, соторасиб) связываются с цистеином, возникшим в результате замены, в кармане возле switch II. Позднее описаны ковалентные ингибиторы другого класса, которые связывают активную GTP-форму KRAS G12C в тройном комплексе с циклофилином A (RMC-4998; Schulze 2023); в этом шаге разобраны ингибиторы GDP-формы.Этот карман открыт только в GDP-форме. Поэтому ингибитор GDP-формы связывается с неактивным KRAS G12C и необратимо удерживает белок в этом состоянии. Захват развивается во времени: молекулы связываются по мере того, как они гидролизуют GTP и проходят через GDP-форму. На графике все условия начинаются с одного и того же исходного состояния — клеток без добавок, в которых около 36 % KRAS G12C находится в GTP-форме, — а ингибитор вносят в момент 0. Без дополнительного EGF через 1 ч в учебной модели связано около 70 % белка, через 2 ч — около 90 %, а доля RAS-GTP снижается постепенно (ARS-853: Patricelli 2016, Lito 2016; соторасиб: Canon 2019).Если гидролиз почти утрачен (двойной мутант G12C + Q61L), GDP-форма образуется редко, и захват почти не идёт: за 2 ч связано около 5 % белка, а доля RAS-GTP остаётся около 94 %. Это согласуется с тем, что KRAS G12C продолжает переходить между GTP- и GDP-формами и ингибитор действует именно потому, что гидролиз сохранён. Само по себе это наблюдение не доказывает такого объяснения: устойчивость к ингибитору дают и другие причины.По устойчивости к ингибитору нельзя определить, какая замена есть в клетке. Если в положении 12 RAS нет цистеина (например, в клетке с KRAS G12D или с другим вариантом RAS), ингибитору G12C не с чем связываться: захвата нет, а доля RAS-GTP остаётся высокой по причине, не связанной с G12C. Если цистеин есть, но гидролиз утрачен (G12C + Q61L), захват тоже почти не идёт. Количество RAS-GTP в RBD pull-down эти случаи не различает; их различают независимые данные: генотип клеток и содержание ингибитора в клетках (методы — в уроке «Чем измеряют количество активного RAS»).Скорость захвата зависит и от вышележащего сигнала. Если ингибитор G12C и EGF добавить одновременно, EGF ускоряет обмен GDP на GTP и удерживает белок в GTP-форме: за 2 ч связано около 45 % белка вместо 90 % без EGF, а доля RAS-GTP в первые минуты даже вырастает. Если одновременно с ингибитором G12C подавить сигнал выше RAS (ингибитор EGFR или SOS1), цикл смещается к GDP-форме и захват ускоряется: через 1 ч связано около 79 % белка вместо 71 %, а доля RAS-GTP снижается до 7 % всего белка (учебная модель, откалиброванная по Lito 2016).Обе кривые на графике выражены в процентах от всего KRAS в клетке (один знаменатель), поэтому условия можно сравнивать между собой по одной шкале.Типичная ошибка Раз KRAS G12C постоянно активен, соторасиб должен связывать его активную GTP-форму.Соторасиб связывает GDP-форму: карман возле switch II открыт только в ней. Поэтому захват зависит от гидролиза, а вариант без гидролиза устойчив. Активную форму KRAS G12C связывают ингибиторы другого класса, действующие в тройном комплексе с циклофилином A (Schulze 2023).Почему двойной мутант KRAS G12C + Q61L устойчив к соторасибу?А. Ингибитору редко доступна GDP-форма: гидролиз GTP у двойного мутанта почти утрачен (верный вариант)Замена Q61L почти устраняет гидролиз, поэтому белок почти не переходит в GDP-форму — ту единственную, которую связывает этот ингибитор.Б. Вторая замена убирает цистеин-12, и ингибитору не с чем связываться (неверный вариант)Цистеин-12 на месте (замена G12C сохранена). Устойчивость даёт утрата гидролиза, а не потеря цистеина.В. Двойной мутант быстрее гидролизует GTP, поэтому выходит из-под действия ингибитора (неверный вариант)Наоборот: Q61L почти лишает белок способности гидролизовать GTP. Именно отсутствие гидролиза, а не его ускорение, делает вариант устойчивым.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаPatricelli M. P. et al. 2016. Selective inhibition of oncogenic KRAS output with small molecules targeting the inactive state. Cancer DiscovLito P. et al. 2016. Allele-specific inhibitors inactivate mutant KRAS G12C by a trapping mechanism. ScienceCanon J. et al. 2019. The clinical KRAS(G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity. NatureJohn J. et al. 1990. Kinetics of interaction of nucleotides with nucleotide-free H-ras p21. BiochemistrySimanshu D. K., Nissley D. V., McCormick F. 2017. RAS proteins and their regulators in human disease. CellSchulze C. J. et al. 2023. Chemical remodeling of a cellular chaperone to target the active state of mutant KRAS. ScienceДанные эксперимента: клеточные линии рака лёгкого с KRAS G12C (H358 и др.); ARS-853 — Patricelli (2016) и Lito (2016); соторасиб (AMG 510) — Canon (2019). Кривые — учебная модель, откалиброванная по этим работам: время в минутах, обе величины в процентах от всего KRAS. Исходная доля RAS-GTP в этой модели (около 36 %) задана по кинетике захвата в клетках и отличается от стационарной модели предыдущих уроков (около 45 % для G12C без сигнала): это два отдельных учебных описания разных экспериментов.
Цикл RAS · шаг 20 из 28Чем измеряют количество активного RASКоличество активного RAS измеряют осаждением на эффекторном домене — RBD pull-down. Собственный гидролиз измеряют отдельно — в пробирке, по освобождению фосфата.RBD-домен RAF на гранулах связывает только RAS-GTP; несвязанный RAS-GDP смывается.В блоте антитела к RAS показывают, сколько было активной формы; общий RAS — контроль загрузки.ГТФазную активность измеряют в пробирке по освобождению меченого фосфата из GTP.Чтобы узнать, сколько RAS активно, используют то же свойство, что и эффекторы: RBD-домен RAF связывает только GTP-форму. Лизат клеток инкубируют с гранулами, на которых закреплён RBD-домен; RAS-GTP осаждается, RAS-GDP смывается. В блоте антитела к RAS показывают количество осаждённой активной формы, а блот того же лизата на общий RAS служит контролем загрузки (de Rooij 1997). Метод измеряет количество RAS-GTP в момент лизиса, усреднённое по миллионам клеток.Что метод показывает и чего нетRBD pull-down показывает количество активной формы, но не различает, усилен ли обмен или ослаблен гидролиз, и не даёт скоростей переходов. Один и тот же результат — большое количество RAS-GTP — дают разные причины: усиленный обмен, потеря GAP, замены в кодонах 12, 13 и 61; поэтому по одному pull-down генотип определить нельзя. Метод не показывает и того, какая часть RAS-GTP находится на мембране и связана с эффекторами. Контроль — предварительное связывание RAS с известным нуклеотидом: лизат, в котором RAS заранее связан с GTPγS, даёт сильную полосу, а лизат с RAS, связанным с GDP, — слабую.Собственную ГТФазную активность измеряют отдельно, в пробирке, на очищенном белке: по освобождению неорганического фосфата или по переходу метки из [γ-³²P]GTP. Так получены относительные скорости вариантов RAS (Hunter 2015). Важно помнить, что скорости в пробирке не равны клеточным: в клетке на цикл влияют GEF, GAP, концентрации нуклеотидов и расположение белков.Чтобы понять, почему количество RAS-GTP не меняется при добавлении ингибитора, одного pull-down недостаточно. Нужны независимые данные: генотип клеток (секвенирование гена) и содержание ингибитора в клетках (масс-спектрометрия). Только вместе с ними результат pull-down можно истолковать.Типичная ошибка Сильная полоса RAS в блоте означает, что в клетке много активной формы RAS.Полоса общего RAS показывает всё количество белка; активную форму показывает только дорожка после RBD pull-down. Их нужно сравнивать.Что показывает дорожка RAS после осаждения на RBD-домене RAF?А. Количество RAS в GTP-форме в момент лизиса (верный вариант)RBD-домен связывает только GTP-форму, поэтому осаждённый RAS — это активная форма; общий RAS служит контролем загрузки.Б. Всё количество белка RAS в клетке (неверный вариант)Всё количество показывает дорожка общего RAS. После RBD pull-down осаждается только активная, GTP-форма.В. Скорость собственного гидролиза GTP у RAS (неверный вариант)Скорость гидролиза измеряют отдельно, в пробирке по освобождению фосфата. Pull-down даёт количество, а не скорость.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаde Rooij J., Bos J. L. 1997. Minimal Ras-binding domain of Raf1 can be used as an activation-specific probe for Ras. OncogeneHunter J. C. et al. 2015. Biochemical and structural analysis of common cancer-associated KRAS mutations. Mol Cancer ResСхемы методов: RBD pull-down — de Rooij и Bos (1997); измерение ГТФазной активности очищенных вариантов — Hunter (2015). Это схемы методов, а не данные конкретного эксперимента; что измеряется и каков контроль, указано на схеме.
STIM–Orai · шаг 21 из 28Как опустошается депо Ca²⁺Депо-зависимый вход запускается после опустошения запаса Ca²⁺ в ЭПР. В физиологических условиях это происходит при активации ветви Gq; посредником служит растворимый IP₃.Рецептор, сопряжённый с Gq, через Gq активирует фосфолипазу Cβ, которая расщепляет PIP₂ с образованием IP₃ и DAG.Растворимый IP₃ диффундирует в цитозоле и открывает IP₃-рецептор в мембране ЭПР.Через IP₃-рецептор Ca²⁺ выходит из депо в цитозоль. Скорость выхода превышает скорость обратной закачки насосом SERCA, поэтому депо опустошается.Депо-зависимый вход начинается не с внешнего Ca²⁺, а с опустошения внутреннего запаса. Рецептор, сопряжённый с белком Gq, активирует фосфолипазу Cβ. Этот фермент гидролизует мембранный липид PIP₂ и образует сразу два посредника с разной локализацией: растворимый IP₃ и мембранный диацилглицерол (DAG).IP₃ диффундирует в цитозоле и связывается с IP₃-рецептором — каналом мембраны ЭПР. Канал открывается при совместном связывании IP₃ и Ca²⁺ на цитозольной стороне и выпускает Ca²⁺ из просвета ЭПР. Пока выход превышает закачку насосом SERCA, концентрация свободного Ca²⁺ в просвете депо снижается.Запас Ca²⁺ в ЭПР ограничен: объём ЭПР — малая часть объёма клетки. Поэтому при высвобождении Ca²⁺ его концентрация в цитозоле быстро повышается, но по мере истощения запаса этот источник Ca²⁺ исчерпывается. Длительный ответ (например, активация транскрипции в лимфоците) требует входа Ca²⁺ из внешней среды — и именно снижение концентрации Ca²⁺ в ЭПР служит сигналом к открытию пути входа Ca²⁺ из среды.В практикуме отдельную ветвь Gq не моделируют: опустошение депо задают напрямую — ползунком концентрации Ca²⁺ в ЭПР (базовый уровень), тапсигаргином или кратким импульсом IP₃ (продвинутый уровень, два протокола). Так состояние депо отделено от рецепторного сигнала; исход импульса зависит от работы SERCA (шаг о протоколе с тапсигаргином).Типичная ошибка IP₃ сам открывает канал на плазматической мембране и впускает Ca²⁺ снаружи.IP₃ открывает канал IP₃-рецептора в мембране ЭПР и выпускает Ca²⁺ из депо; вход снаружи идёт позже и через другой канал — Orai1.Фосфолипаза Cβ активирована. Где окажется образовавшийся IP₃ и на что он подействует?А. Останется в мембране и активирует протеинкиназу C (неверный вариант)В мембране остаётся DAG; он участвует в активации протеинкиназы C. IP₃ растворим и диффундирует в цитозоль.Б. Перейдёт в цитозоль и откроет IP₃-рецептор ЭПР (верный вариант)Растворимый IP₃ диффундирует к IP₃-рецептору мембраны ЭПР и открывает его; Ca²⁺ выходит из депо, и депо опустошается.В. Откроет Orai1 на плазматической мембране (неверный вариант)Orai1 открывают кластеры STIM1 после опустошения депо, а не IP₃ напрямую.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаBerridge M. J. 2016. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiol RevPrakriya M., Lewis R. S. 2015. Store-operated calcium channels. Physiol RevПо обзорам Berridge (2016) и Prakriya и Lewis (2015). Схема — механизм, не данные эксперимента.
STIM–Orai · шаг 22 из 28Как опустошение депо активирует STIM1Опорная остановка 7 из 8 · сенсор, канал и эффектор: звенья цепи STIM1 → Orai1 → кальциневрин — разные белки, и отдельный эксперимент указывает на отдельное звено; продолжает остановку 6. STIM1 — сенсор Ca²⁺ в депо: его домен EF-hand связывает Ca²⁺ в просвете ЭПР. Диссоциация Ca²⁺ от этого домена переводит STIM1 в активную форму. Изменяйте ползунком концентрацию Ca²⁺ в ЭПР и проследите за долей STIM1 в кластерах.Домен EF-hand STIM1 в просвете ЭПР связывает Ca²⁺ с умеренным сродством (Kd около 200–600 мкМ).При опустошении депо Ca²⁺ диссоциирует от домена EF-hand, люминальные домены двух субъединиц сближаются, цитозольная часть распрямляется, и участок SOAR/CAD освобождается из внутримолекулярного зажима с областью CC1.Молекулы STIM1 в распрямлённой форме собираются в кластеры; доля STIM1 в кластерах резко меняется при изменении концентрации Ca²⁺ в ЭПР.STIM1 — белок мембраны ЭПР. Его обращённый в просвет участок (домен EF-hand вместе с доменом SAM) связывает Ca²⁺ с умеренным сродством — таким, что Ca²⁺ диссоциирует именно при физиологическом опустошении депо. Важно правильно описать исходное состояние: в покое полноразмерный STIM1 — уже димер в компактной, «сложенной» конформации, а не одиночная молекула. Каждая субъединица пересекает мембрану ЭПР одной трансмембранной спиралью: домены EF-hand и SAM лежат в просвете ЭПР, а цитозольная часть — в цитозоле. Поэтому Ca²⁺ на домене EF-hand находится внутри ЭПР, и STIM1 служит сенсором концентрации Ca²⁺ в просвете, а не в цитозоле (на схеме точка Ca²⁺ нарисована только в просвете; её плотность показывает долю занятых мест).При снижении концентрации Ca²⁺ в просвете ЭПР ион диссоциирует от домена EF-hand, люминальные домены перестраиваются, цитозольная часть распрямляется и открывает участок связывания канала (как это устроено, объясняется ниже). Распрямлённые димеры собираются в кластеры. В схеме доля STIM1 в кластерах рассчитана по учебной модели практикума как функция Хилла от концентрации Ca²⁺ в ЭПР (K½ около 187 мкМ, коэффициент около 4 по Luik 2008).Высокий коэффициент Хилла означает, что зависимость крутая: около порога небольшое снижение Ca²⁺ в ЭПР резко увеличивает долю STIM1 в кластерах. Поэтому вход Ca²⁺ активируется почти пороговым образом, а не плавно нарастает с каждым потерянным ионом.Выражение «открывает участок связывания» имеет простой структурный смысл. В покое суперспиральная область CC1 цитозольной части удерживает участок SOAR, то есть фрагмент примерно из ста остатков, который способен связывать Orai1 и открывать его (в разных работах границы фрагмента определены чуть по-разному, поэтому его называют также CAD). Такое внутримолекулярное автоторможение закрывает SOAR/CAD для канала. Когда Ca²⁺ уходит из просвета, люминальные домены двух субъединиц димеризуются и сближают их области CC1; по данным переноса энергии от Tb³⁺ на мышином STIM1, это сближение высвобождает SOAR/CAD из контакта с CC1 и позволяет цитозольной части вытянуться через зазор между мембранами (Zhou 2013). Высвобождение управляется взаимодействием CC1 с CC3 и ориентацией двух областей CC1 в димере, причём освобождение SOAR/CAD и последующая сборка кластеров — разные стадии (Fahrner 2014; Korzeniowski 2017). Таким образом, Ca²⁺ в просвете ЭПР влияет на связывание канала не прямо, а через смену внутримолекулярных контактов в цитозольной части. Подробности этой перестройки в полноразмерном белке в клетке остаются предметом исследований (обзор состояний STIM — Sallinger 2024). Как освобождённый SOAR/CAD связывается с каналом, разбирает следующий шаг.Не следует переносить на целый белок поведение изолированного люминального фрагмента: в растворе такой фрагмент действительно олигомеризуется только после потери Ca²⁺, но полноразмерный STIM1 в покое уже димер (Zhou 2013).Типичная ошибка STIM1 в покое — одиночная молекула, которая объединяется в димеры только после опустошения депо.Полноразмерный STIM1 в покое уже димер в сложенной форме; опустошение депо распрямляет его и собирает димеры в кластеры.Концентрацию Ca²⁺ в просвете ЭПР снизили с 500 до 150 мкМ. Какой станет доля STIM1 в кластерах?А. Почти не изменится: в ЭПР ещё много Ca²⁺ (неверный вариант)150 мкМ уже ниже порога кластеризации (K½ ≈ 187 мкМ). В этой области зависимость крутая, и доля STIM1 в кластерах растёт с 2 % до 70 %.Б. Большая часть STIM1 соберётся в кластеры (верный вариант)При 150 мкМ домены EF-hand в значительной мере теряют Ca²⁺, и в модели около 70 % STIM1 находится в кластерах (при 500 мкМ — около 2 %).В. Кластеры распадутся: STIM1 свяжет больше Ca²⁺ (неверный вариант)При снижении концентрации Ca²⁺ в ЭПР домен EF-hand теряет Ca²⁺, а не связывает его. Потеря Ca²⁺ и вызывает распрямление и кластеризацию STIM1.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаLuik R. M. et al. 2008. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. NatureStathopulos P. B. et al. 2006. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of STIM1 via the EF-SAM region. J Biol ChemZhou Y. et al. 2013. Initial activation of STIM1, the regulator of store-operated calcium entry. Nat Struct Mol BiolFahrner M. et al. 2014. A coiled-coil clamp controls both conformation and clustering of stromal interaction molecule 1 (STIM1). J Biol ChemKorzeniowski M. K. et al. 2017. Molecular anatomy of the early events in STIM1 activation - oligomerization or conformational change? J Cell SciSallinger M. et al. 2024. Activation mechanisms and structural dynamics of STIM proteins. J PhysiolМодель схемы — учебная (вопрос 4 практикума), доля STIM1 в кластерах по Luik 2008 (Jurkat, клетки с ЭПР-индикатором): перераспределение STIM1 — функция Хилла с K½ около 190 мкМ и коэффициентом около 4 (в модели схемы принято 187 мкМ и 3,8). Сродство EF-hand — Stathopulos 2006 (рекомбинантный домен, Kd 200–600 мкМ). Строение в покое — Zhou 2013. Автоторможение CC1–SOAR/CAD и его снятие: Zhou 2013 (мышиный STIM1, перенос энергии от Tb³⁺), Fahrner 2014 (клетки HEK293, FRET) и Korzeniowski 2017 (клетки COS, визуализация); это модель конформационного перехода по биохимическим и FRET-данным, а не наблюдение за одной молекулой в живой клетке. Обзор Sallinger 2024 использован как общая рамка (переход от компактного состояния к вытянутому); его детали здесь не пересказываются.
STIM–Orai · шаг 23 из 28Почему вход Ca²⁺ происходит именно в участке контакта двух мембранДепо Ca²⁺ находится в просвете ЭПР, а канал, через который Ca²⁺ входит из среды, — в плазматической мембране. Передачу сигнала обеспечивает участок, где расстояние между мембранами составляет 10–25 нм. Здесь происходят три разных события: сближение, физическое связывание SOAR/CAD с Orai1 и открывание поры.Кластеры распрямлённых молекул STIM1 накапливаются в контактах ЭПР–ПМ, где расстояние между мембранами составляет 10–25 нм.Зазор позволяет освобождённому участку SOAR/CAD достичь цитозольных частей Orai1 в плазматической мембране: это пространственное сближение.SOAR/CAD физически связывается с Orai1 — прежде всего с его цитозольным C-концом и с околомембранным участком N-конца; это связывание, а не открывание.Связывание аллостерически меняет конформацию Orai1 и открывает пору (gating); Ca²⁺ входит из внеклеточной среды пассивно, по электрохимическому градиенту.У открытого Orai1 образуется локальный микродомен с особенно высокой концентрацией Ca²⁺; одновременно может повышаться и средняя концентрация Ca²⁺ в цитозоле. Мишени по-разному отвечают на локальный и общий сигналы.Между двумя событиями — снижением Ca²⁺ внутри ЭПР и открыванием канала в плазматической мембране — нет ни общего компартмента, ни диффундирующего посредника. Их связывает структура — контакт ЭПР и плазматической мембраны, где расстояние между мембранами составляет порядка 10–25 нм.Этот зазор достаточно мал, чтобы освобождённая цитозольная часть STIM1 достигала Orai1 и при этом мембраны не сливались. STIM1 диффундирует в мембране ЭПР и задерживается именно в контактах. Участок контакта здесь — необходимое условие: белок одной мембраны служит лигандом канала другой мембраны, а радиус его действия задан геометрией контакта.Путь от пустого депо до тока Ca²⁺ удобно разделить на три разных события. Первое — пространственное сближение: STIM1 накапливается в контакте, и в отсутствие Orai1 в этом участвует его С-концевой полибазный участок, так что кластеры STIM1 образуются и без канала (Park 2009). Второе — физическое связывание: освобождённый SOAR/CAD связывается с Orai1. В очищенных белках это прямое взаимодействие без посредников; в картировании CAD связывался с цитозольным C-концом Orai1 заметно сильнее, чем с N-концом, но связывался и с околомембранным участком N-конца (примерно остатки 70–90), а без любого из двух концов канал этим фрагментом не активировался (Park 2009). Третье — открывание поры (gating): связанный SOAR/CAD меняет конформацию цитозольных частей Orai1, и это аллостерически открывает пору. Что связывание и открывание — разные события, показывают укороченный STIM1 (остатки 1–440) и вариант C437G: они собирали Orai1 в кластеры у контакта, но почти не активировали вход Ca²⁺ (Park 2009). Открытая пора пропускает Ca²⁺ из среды по электрохимическому градиенту.Границы этих выводов. Картирование связывания получено на очищенных белках, в дрожжевой системе расщеплённого убиквитина и в клетках HEK293 при повышенной экспрессии белков, поэтому оно не устанавливает, какие контакты и в каком порядке образуются в нативной клетке. Сколько молекул STIM1 приходится на один канал и в какой последовательности меняется конформация Orai1 при открывании, здесь не утверждается: это остаётся предметом исследований. Предположение, что энергию для открывания даёт сам мостик SOAR/CAD между двумя участками канала, высказано авторами как гипотеза, а не доказанный механизм (Park 2009).Из открывания поры следует и локальность сигнала: у устья открытого Orai1 образуется микродомен с особенно высокой концентрацией Ca²⁺. Локальный и общий сигналы не исключают друг друга: при длительном входе ионы рассеиваются, и повышается также средняя концентрация Ca²⁺ в цитозоле — именно её показывает индикатор в практикуме. Мишени различают эти сигналы: в неэлектровозбудимых клетках NFAT1 переходил в ядро особенно эффективно при входе через CRAC-каналы, но не через канал TRPC3, хотя оба пути входа повышали концентрацию Ca²⁺ в цитозоле (Kar 2011). Поэтому подавление микродомена (например, быстрым хелатором Ca²⁺) не обязательно меняет среднюю концентрацию Ca²⁺ в цитозоле, а повышение средней концентрации не означает, что у канала есть микродомен.Если увеличить зазор (в схеме — условный режим «60 нм»), SOAR/CAD не достигает Orai1, связывание не происходит, и канал не открывается, несмотря на опустошённое депо. Это показывает, что важна именно геометрия контакта.Типичная ошибка STIM1 перемещается в плазматическую мембрану и сам становится каналом для Ca²⁺.STIM1 остаётся в мембране ЭПР; в участке контакта его SOAR/CAD связывается с Orai1, каналом плазматической мембраны, и аллостерически открывает его пору.Депо опустошено, STIM1 распрямлён, но зазор между мембранами в контакте искусственно увеличен. Откроется ли Orai1?А. Откроется: опустошения депо достаточно (неверный вариант)Опустошение депо распрямляет STIM1, но открыть Orai1 он может, только достигнув его; при большом зазоре этого не происходит.Б. Не откроется: STIM1 не достигнет Orai1 (верный вариант)При увеличенном зазоре цитозольная часть STIM1 не достигает Orai1, и канал не открывается, хотя депо пусто.В. Откроется: STIM1 перейдёт в плазматическую мембрану к Orai1 (неверный вариант)STIM1 остаётся в мембране ЭПР и не переходит в плазматическую мембрану; он действует через контакт на расстоянии.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаPark C. Y. et al. 2009. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. CellPrakriya M., Lewis R. S. 2015. Store-operated calcium channels. Physiol RevWu M. M. et al. 2006. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell BiolKar P., Nelson C., Parekh A. B. 2011. Selective activation of the transcription factor NFAT1 by calcium microdomains near Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) channels. J Biol ChemПо обзору Prakriya и Lewis (2015) и работе Wu и соавт. (2006): при опустошении депо STIM1 накапливается в участках ЭПР на расстоянии 10–25 нм от плазматической мембраны. Связывание и открывание: Park 2009 (HEK293, дрожжи, очищенные Orai1 и фрагмент CAD STIM1, остатки 342–448, 107 аминокислот): прямое связывание с C-концом и околомембранным участком N-конца Orai1, кластеризация без активации у STIM1 1–440 и C437G; число субъединиц в комплексе не определяется. Режимы схемы «STIM1 не связан» и «STIM1 связан» показывают последовательность событий и не изображают отдельные наблюдаемые состояния. Режим «зазор 60 нм» — условная иллюстрация роли геометрии, не данные эксперимента. Различие локального и общего сигналов — Kar 2011 (неэлектровозбудимые клетки): NFAT1 особенно чувствителен к микродомену у открытых каналов CRAC. Показания «у устья канала» и «в объёме цитозоля» на схеме — качественные, не измеренные величины.
STIM–Orai · шаг 24 из 28Что показывают ток CRAC и генетика Orai1Ток через Orai1 обладает характерными свойствами, по которым его отличают от других токов. А молекулярную идентичность канала установила генетика: замена R91W в ORAI1 у больных с иммунодефицитом.Ток CRAC (ICRAC) регистрируют патч-клампом в конфигурации whole-cell после опустошения депо.Его характерные свойства: высокая избирательность к Ca²⁺, очень малая проводимость, входящее выпрямление.У больных с заменой R91W в ORAI1 ток CRAC отсутствует, а введение нормального Orai1 его восстанавливает.Электрофизиологические измерения выявляют характерные свойства тока CRAC. При опустошении депо в конфигурации whole-cell регистрируют входящий ток, очень избирательный к Ca²⁺ (потенциал реверсии выше +90 мВ), с очень малой одноканальной проводимостью и входящим выпрямлением: при отрицательном потенциале ток велик, при деполяризации почти исчезает. Этот набор свойств позволяет отличить ICRAC от других токов, но не указывает, какой белок образует канал.Белок канала идентифицировали двумя независимыми подходами (Feske 2006). Картирование сцепления в семье больных тяжёлым комбинированным иммунодефицитом указало участок хромосомы 12q24, а RNAi-скрининг в клетках дрозофилы, где после тапсигаргина следили за переходом NFAT–GFP в ядро, выявил ген dOrai (оба подхода показаны на схеме). Его человеческий гомолог ORAI1 расположен в том же участке; больные гомозиготны по замене R91W.В T-клетках больных депо-зависимый вход и ток CRAC отсутствуют. Введение нормального Orai1 восстанавливает и вход, и ток, а Orai1 R91W — нет, хотя оба белка синтезируются в равном количестве и находятся у плазматической мембраны. В экспериментах с экспрессией в клетках HEK293 Orai1 R91W сохраняет взаимодействие со STIM1 (Muik 2008): нарушено само проведение Ca²⁺.Вывод относится к этому классу замен с потерей функции; не любая замена в ORAI1 даёт иммунодефицит. Убедительным считают совпадение независимых данных — фармакологических, электрофизиологических и генетических — вместе с восстановлением функции нормальным белком.Типичная ошибка Замена R91W мешает STIM1 собираться в кластеры, поэтому вход Ca²⁺ пропадает.Orai1 R91W находится у мембраны и сохраняет взаимодействие со STIM1 (эксперименты на клетках HEK293); нарушено проведение Ca²⁺ самим каналом.В T-клетках больного с ORAI1 R91W депо опустошили хелатором BAPTA в пипетке. Что покажет патч-кламп?А. Нормальный ток CRAC: мутантный белок есть у мембраны (неверный вариант)Orai1 R91W действительно находится у плазматической мембраны, но канал не проводит Ca²⁺, поэтому ток CRAC не развивается.Б. Ток CRAC не развивается, несмотря на опустошение депо (верный вариант)В T-клетках больных с R91W ток CRAC при опустошении депо не развивается; нормальный Orai1 его восстанавливает (Feske 2006).В. Ток CRAC с выходящим выпрямлением (неверный вариант)Для тока CRAC характерно входящее выпрямление; замена R91W не меняет этого свойства, а устраняет проведение Ca²⁺.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаFeske S. et al. 2006. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. NatureMuik M. et al. 2008. Dynamic coupling of the putative coiled-coil domain of ORAI1 with STIM1 mediates ORAI1 channel activation. J Biol ChemPrakriya M., Lewis R. S. 2015. Store-operated calcium channels. Physiol RevFeske и соавт. (2006): T-клеточные линии и фибробласты двух больных и их родственников. Вход Ca²⁺ — пик и начальная скорость роста [Ca²⁺] после тапсигаргина и возврата Ca²⁺ во внешнюю среду. ICRAC — whole-cell, пассивное опустошение депо 8 мМ BAPTA в пипетке, 20 мМ Ca²⁺ снаружи; ток восстановленных клеток полностью блокировался 2 мкМ La³⁺. Взаимодействие R91W со STIM1 — Muik 2008 (клетки HEK293, FRET). Вольт-амперная кривая на схеме — качественная.
STIM–Orai · шаг 25 из 28Как вход Ca²⁺ приводит к активации транскрипцииДлительный вход Ca²⁺ активирует фосфатазу кальциневрин. Она дефосфорилирует NFAT, и тот переходит в ядро — сигнал передаётся активацией фосфатазы, а не киназы.Ca²⁺ связывается с кальмодулином; комплекс Ca²⁺–кальмодулин активирует фосфатазу кальциневрин.Кальциневрин дефосфорилирует NFAT, открывая его сигнал ядерной локализации; NFAT переходит в ядро и там вместе с партнёром AP-1 участвует в активации генов (для IL2 нужны оба).Продолжающаяся активность кальциневрина поддерживает ядерный NFAT: кальциневрин дефосфорилирует NFAT и, связываясь с ним, маскирует сигналы ядерного экспорта, поэтому NFAT остаётся в ядре.После прекращения Ca²⁺-сигнала кальциневрин теряет активность, и NFAT фосфорилируют киназы; в изученных системах это GSK3 (после праймирующего фосфорилирования, например DYRK) и CK1, а набор киназ зависит от NFAT и клетки.Фосфорилирование многих остатков возвращает регуляторный домен в конформацию, где сигнал ядерной локализации замаскирован, а сигналы ядерного экспорта доступны; NFAT выносится из ядра экспортином XPO1 (CRM1). Выход идёт с задержкой, поэтому ядерный NFAT может заметно пережить сам сигнал.Изменение концентрации Ca²⁺ меняет занятость Ca²⁺-связывающих белков. Центральный из них — кальмодулин: связав Ca²⁺, он меняет конформацию и активирует набор мишеней. Одна из них — кальциневрин, серин-треониновая фосфатаза, активная только в комплексе с Ca²⁺–кальмодулином.Субстрат кальциневрина — транскрипционный фактор NFAT. В покое NFAT фосфорилирован по многим участкам и удерживается в цитоплазме. Дефосфорилирование кальциневрином открывает сигнал ядерной локализации, и NFAT переходит в ядро. Одного ядерного NFAT для ответа недостаточно: на промоторе гена интерлейкина-2 он связывается с ДНК совместно с AP-1 (Fos–Jun), и без партнёра комплекс не образуется кооперативно (Peterson 1996; Macián 2001). Поэтому переход NFAT в ядро — необходимое, но не достаточное условие транскрипции IL2.Здесь используется положение из общей части семинара: сигнал передаётся не активацией киназы, а активацией фосфатазы. Стационарный уровень фосфорилирования NFAT сдвигается за счёт активности фосфатазы. Многосайтовое фосфорилирование делает переход резким. Как NFAT возвращается в цитоплазму после прекращения входа Ca²⁺, объясняет следующий абзац.Возвращение NFAT в цитоплазму — активный процесс, а не простое исчезновение сигнала. Когда Ca²⁺-сигнал спадает, комплекс Ca²⁺–кальмодулин распадается, кальциневрин перестаёт быть активным, и фосфорилирование NFAT берут на себя киназы, которые всё время противодействовали ему. В NFAT1 DYRK1A и DYRK2 фосфорилируют консервативный мотив SP-3 регуляторного домена (праймирующее фосфорилирование), после чего GSK3 фосфорилирует мотив SP-2, а CK1 — богатую серином область SRR-1 (Gwack 2006); в более ранней работе на NF-ATc очищенная киназа NFAT состояла из праймирующей киназы и GSK3, и GSK3 фосфорилировала серины, необходимые для ядерного экспорта (Beals 1997).Фосфорилирование многих остатков регуляторного домена повышает вероятность конформации, в которой сигнал ядерной локализации замаскирован, а сигналы ядерного экспорта доступны: в NFAT1 для маскировки сигнала экспорта и полного открытия сигнала локализации требуется дефосфорилирование всех тринадцати серинов, которые теряют фосфат при стимуляции (Okamura 2000). Доступный сигнал экспорта узнаёт экспортин XPO1 (CRM1): NFAT постоянно курсирует между ядром и цитоплазмой, а кальциневрин удерживает его в ядре, в том числе связываясь с NFAT и маскируя сигналы экспорта без участия своей каталитической активности (Zhu, McKeon 1999). Поэтому после спада Ca²⁺ экспорт перестаёт уравновешиваться импортом, и NFAT покидает ядро. Выход идёт с задержкой: в экспериментах Kar 2011 ядерный NFAT1 сохранялся значительно дольше Ca²⁺-сигнала, а полувремя рефосфорилирования и выхода NFAT1 из ядра в этом эксперименте составляло около 24 минут.Границы этих выводов. Набор киназ и вклад каждой различаются между подсемействами NFAT и клетками; результаты на NF-ATc (Beals 1997) нельзя без проверки переносить на NFAT1 (Gwack 2006) и обратно. Поэтому утверждение «выход из ядра обеспечивает GSK3» неверно в общем виде: GSK3 — одна из киназ, а не единственная и не всегда обязательная. Данные о конформационном переключателе и о роли XPO1 (CRM1) получены в отдельных клеточных системах (в том числе Jurkat и HeLa); их не следует считать описанием всех типов клеток.На этот путь действует иммунодепрессант циклоспорин A. Он связывается с внутриклеточным белком циклофилином, и уже образовавшийся комплекс подавляет кальциневрин. Вход Ca²⁺ при этом не меняется, но NFAT не дефосфорилируется и остаётся в цитоплазме — на этом основано предотвращение отторжения трансплантата.Типичная ошибка Циклоспорин A блокирует вход Ca²⁺ через Orai1, поэтому NFAT не идёт в ядро.Циклоспорин A не действует на вход Ca²⁺: он через циклофилин подавляет кальциневрин, и NFAT остаётся фосфорилированным в цитоплазме.В клетке с нормальным входом Ca²⁺ NFAT находится в ядре. Добавили циклоспорин A. Как изменятся концентрация Ca²⁺ в цитозоле и локализация NFAT?А. Концентрация Ca²⁺ снизится, NFAT вернётся в цитоплазму (неверный вариант)Циклоспорин A не действует на каналы, поэтому вход Ca²⁺ и его концентрация в цитозоле не снижаются; меняется только локализация NFAT.Б. Концентрация Ca²⁺ не изменится, NFAT вернётся в цитоплазму (верный вариант)Вход Ca²⁺ не меняется, но кальциневрин подавлен: киназы рефосфорилируют NFAT, и он возвращается в цитоплазму.В. Концентрация Ca²⁺ не изменится, NFAT останется в ядре (неверный вариант)Удержание NFAT в ядре требует непрерывной активности кальциневрина. Без неё киназы рефосфорилируют NFAT, и он покидает ядро, хотя Ca²⁺ входит нормально.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаHogan P. G. et al. 2003. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes DevHogan P. G. et al. 2010. Molecular basis of calcium signaling in lymphocytes: STIM and ORAI. Annu Rev ImmunolTimmerman L. A. et al. 1996. Rapid shuttling of NF-AT in discrimination of Ca2+ signals and immunosuppression. NatureTomida T. et al. 2003. NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation. EMBO JLiu J. et al. 1991. Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complexes. CellPeterson B. R., Sun L. J., Verdine G. L. 1996. A critical arginine residue mediates cooperativity in the contact interface between transcription factors NFAT and AP-1. Proc Natl Acad Sci USAMacián F. et al. 2001. Partners in transcription: NFAT and AP-1. OncogeneKar P., Nelson C., Parekh A. B. 2011. Selective activation of the transcription factor NFAT1 by calcium microdomains near Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) channels. J Biol ChemBeals C. R. et al. 1997. Nuclear export of NF-ATc enhanced by glycogen synthase kinase-3. ScienceGwack Y. et al. 2006. A genome-wide Drosophila RNAi screen identifies DYRK-family kinases as regulators of NFAT. NatureOkamura H. et al. 2000. Concerted dephosphorylation of the transcription factor NFAT1 induces a conformational switch that regulates transcriptional activity. Mol CellZhu J., McKeon F. 1999. NF-AT activation requires suppression of Crm1-dependent export by calcineurin. NatureПо обзору Hogan и соавт. (2003) и Hogan и соавт. (2010). Зависимость удержания NFAT в ядре от длительности сигнала — Timmerman 1996, Tomida 2003. Мишень циклоспорина — Liu 1991 (кальциневрин — общая мишень комплексов циклофилин–циклоспорин A и FKBP–FK506). Кооперативное связывание NFAT и AP-1 с ДНК — Peterson 1996 (эксперименты со связыванием белков с ДНК in vitro), Macián 2001 (обзор). Обратный цикл: DYRK1A/2 → GSK3 и CK1 на NFAT1 — Gwack 2006 (скрининг на Drosophila с проверкой в клетках млекопитающих); GSK3 и ядерный экспорт NF-ATc — Beals 1997 (очищенная киназа NFAT, опыты в клетках млекопитающих); экспорт через Crm1 и его маскировка кальциневрином — Zhu, McKeon 1999; конформационный переключатель NFAT1 — Okamura 2000. Вклад отдельных киназ в сопоставимых условиях здесь не сравнивается. В клетках NFAT1 остаётся в ядре заметно дольше самого сигнала Ca²⁺, а лимитирует его пребывание в ядре скорость выхода из ядра: NFAT1 остаётся в ядре примерно в 10 раз дольше сигнала Ca²⁺ (Kar 2011).
STIM–Orai · шаг 26 из 28Как отделяют вход Ca²⁺ из среды от высвобождения из депоПроверяя зависимость входа Ca²⁺ от состояния депо, используют тапсигаргин и возврат Ca²⁺ в среду. Концентрацию Ca²⁺ в цитозоле при этом измеряют индикатором Fura-2.Тапсигаргин подавляет SERCA; депо опустошается за счёт утечки Ca²⁺ — без участия рецептора и IP₃.В среде без Ca²⁺ виден лишь преходящий подъём его концентрации в цитозоле за счёт высвобождения из депо; после возврата Ca²⁺ сразу развивается длительный вход.Fura-2 возбуждают на 340 и 380 нм; отношение сигналов пересчитывают в концентрацию Ca²⁺.Этот протокол позволяет разделить вклад отдельных звеньев пути. Сначала клетки держат в среде без Ca²⁺ и добавляют тапсигаргин — необратимый ингибитор SERCA. Закачка Ca²⁺ в ЭПР прекращается, депо опустошается за счёт постоянной утечки, и если вход Ca²⁺ из среды возникает без агониста, это показывает его зависимость от состояния депо. Без внешнего Ca²⁺ виден лишь небольшой преходящий подъём (он обусловлен высвобождением из депо); после возврата Ca²⁺ в среду сразу развивается длительный вход.Концентрацию Ca²⁺ в цитозоле измеряют флуоресцентным индикатором Fura-2. Его возбуждают поочерёдно светом 340 и 380 нм; при связывании Ca²⁺ сигнал на 340 нм растёт, а на 380 нм падает. Отношение двух сигналов (340/380) не зависит от количества красителя в клетке и после калибровки пересчитывается в концентрацию Ca²⁺.Каждый контроль позволяет сравнить определённые составляющие сигнала. Удаление внешнего Ca²⁺ отделяет вход снаружи от высвобождения из депо: длительная составляющая исчезает, а возврат Ca²⁺ её восстанавливает. Нокаут STIM1 или Orai1 и блокатор CRAC подавляют депо-зависимый вход; полнота подавления зависит от эффективности нокаута (проверяют белок и ток CRAC) и от компенсации Orai2, Orai3 или STIM2.Тапсигаргин — не единственный способ опустошить депо, и он не показывает, как сигнал выключается в обычной клетке. Рассмотрим краткий импульс IP₃ в среде с Ca²⁺. Ca²⁺ выходит из ЭПР через IP₃-рецептор, STIM1 собирается в кластеры, Orai1 открывается. Когда импульс заканчивается, SERCA закачивает Ca²⁺ в ЭПР, в том числе вошедший через Orai1: депо пополняется, Ca²⁺ снова связывается с доменом EF-hand, кластеры разбираются, вход прекращается. Orai1 переносит Ca²⁺ из среды только в цитозоль; в просвет ЭПР его переносит SERCA. Если SERCA заблокирована тапсигаргином, депо не пополняется даже при наличии Ca²⁺ в среде, STIM1 остаётся в кластерах, и вход продолжается. Третий режим схемы сравнивает эти два случая; тот же эксперимент есть в практикуме (4а, протокол «импульс IP₃»).У метода есть ограничение: сам индикатор связывает Ca²⁺ и служит буфером, а перевод отношения 340/380 в наномолярную концентрацию требует калибровки. Концентрации на графиках практикума рассчитаны в учебной модели, а не измерены.Типичная ошибка Преходящий подъём концентрации Ca²⁺ сразу после тапсигаргина — это уже вход снаружи через Orai1.Пока внешнего Ca²⁺ нет, вход снаружи невозможен; преходящий подъём обусловлен утечкой Ca²⁺ из ЭПР при подавленной SERCA.Клетки находятся в среде без Ca²⁺. После добавления тапсигаргина измерение с Fura-2 показало небольшой преходящий подъём концентрации Ca²⁺ в цитозоле. Откуда поступил этот Ca²⁺?А. Вошёл снаружи через Orai1 (неверный вариант)Внешнего Ca²⁺ в среде нет, поэтому вход через Orai1 невозможен; преходящее повышение концентрации Ca²⁺ не может быть обусловлено входом из среды.Б. Вышел из ЭПР за счёт утечки (верный вариант)Тапсигаргин подавил SERCA, и депо опустошается за счёт утечки; именно этот Ca²⁺ вызывает преходящий подъём концентрации Ca²⁺ в цитозоле.В. Это артефакт: Fura-2 сам светится ярче (неверный вариант)Отношение 340/380 как раз устраняет зависимость от количества и яркости красителя; подъём отражает реальное высвобождение из депо.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаPrakriya M., Lewis R. S. 2015. Store-operated calcium channels. Physiol RevThastrup O. et al. 1990. Thapsigargin discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the ER Ca2+-ATPase. Proc Natl Acad Sci USAGrynkiewicz G. et al. 1985. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol ChemClapham D. E. 2007. Calcium signaling. CellZweifach A., Lewis R. S. 1993. Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca2+ stores. Proc Natl Acad Sci USAT-лимфоциты и другие клетки (Prakriya и Lewis 2015; Zweifach и Lewis 1993). Тапсигаргин — необратимый ингибитор SERCA (Thastrup 1990). Fura-2 — Grynkiewicz 1985 (отношение 340/380, пересчёт в концентрацию после калибровки). Буферирование Ca²⁺ — Clapham 2007. Числа на графиках практикума — учебная модель. Режим «импульс IP₃» — учебная модель практикума (вопрос 4, 4а): время пополнения депо в модели задано условно и не откалибровано по эксперименту; сохранён порядок событий — пополнение депо, разборка кластеров STIM1, закрытие Orai1.
Исследование · шаг 27 из 28Как выбрать величину, метод и контрольОпорная остановка 8 из 8 · проверка механизма: один результат совместим с несколькими механизмами, а выбрать между ними позволяет контроль; продолжает остановки 1–7. Для каждого переключателя сначала решают, какую величину измерять, затем — каким методом и с каким контролем. Один и тот же результат эксперимента часто совместим с несколькими механизмами; контрольный эксперимент позволяет их различить.Измеряемые величины различны: концентрация посредника, доля фосфорилированного белка, доля GTP-формы ГТФазы и поток ионов.Метод: FRET-сенсор cAMP, вестерн-блот с фосфоспецифичным антителом, осаждение RAS-GTP доменом RBD, флуоресцентный индикатор Ca²⁺.Контроль: вмешательство, которое меняет только одно звено (ингибитор, нокаут, замена остатка, удаление внеклеточного Ca²⁺).Каждый из четырёх разобранных переключателей описывается своей величиной. Для β2-рецептора это концентрация cAMP в цитозоле во времени; её измеряют в живой клетке FRET-сенсором, а калибровка по сигналу при прямой активации аденилатциклазы форсколином вместе с ингибитором фосфодиэстераз IBMX позволяет сравнивать эксперименты. Для фосфорилирования — доля фосфорилированного участка; на блоте видна её относительная динамика, а λ-фосфатаза проверяет, что антитело распознаёт фосфорилированную форму.Для RAS измеряемая величина — количество RAS в GTP-форме: лизат инкубируют с доменом RBD киназы RAF, который связывает только RAS-GTP, и выявляют осаждённый RAS на блоте. Контролем служат лизаты, в которых RAS заранее связан с негидролизуемым аналогом GTP или с GDP. Для депо-зависимого входа Ca²⁺ величина — вход Ca²⁺ из среды; его оценивают по росту концентрации Ca²⁺ в цитозоле после возврата Ca²⁺ в среду, когда депо заранее опустошено тапсигаргином.Главная ошибка — заменить одну величину другой: рост концентрации cAMP не означает определённого ответа клетки, рост фосфорилирования — активации киназы, высокая доля RAS-GTP — усиления сигнала рецептора, а повышение концентрации Ca²⁺ — входа через Orai1. В каждом случае есть альтернативное объяснение, и контроль выбирают так, чтобы его исключить: отличить подавление фосфатазы от активации киназы, потерю GAP — от усиления GEF, высвобождение из депо — от входа из среды.Переключайте таблицы: для каждого переключателя указаны величина, метод, контроль и ограничение вывода.Типичная ошибка Если величина изменилась в нужную сторону, механизм доказан.Одно измерение совместимо с несколькими механизмами. Механизм называют только после контроля, который меняет одно звено пути и исключает альтернативное объяснение.Фосфорилирование белка в клетке выросло после воздействия. Какой эксперимент отличит активацию киназы от торможения фосфатазы?А. Повторно измерить фосфорилирование через час (неверный вариант)Повторное измерение той же величины покажет тот же рост, но не его причину: доля фосфорилированного белка зависит от отношения активностей обоих ферментов.Б. Подавить киназу и сравнить скорость спада фосфорилирования (верный вариант)После полного подавления киназы доля снижается с характерным временем 1/kф. Если воздействие подавило фосфатазу, спад будет медленнее, чем в контроле; если оно активировало киназу, скорость спада не изменится.В. Заменить участок на аспартат и измерить функцию (неверный вариант)Фосфомиметическая замена отвечает на другой вопрос — достаточно ли заряда на участке для функции. О том, какой фермент изменил активность, она не говорит.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаViolin J. D. et al. 2008. β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real time cAMP dynamics. J Biol ChemDephoure N. et al. 2013. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cellde Rooij J., Bos J. L. 1997. Minimal Ras-binding domain of Raf1 can be used as an activation-specific probe for Ras. OncogeneFeske S. et al. 2006. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. NaturePrakriya M., Lewis R. S. 2015. Store-operated calcium channels. Physiol RevMou H. et al. 2017. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by alternative splicing or exon deletion. Genome BiolСводная таблица по шагам разделов 1–4; схемы каждого метода показаны в шагах «Как измеряют cAMP в живой клетке», «Как доказать, что участок фосфорилирования регулирует белок», «Чем измеряют количество активного RAS» и шагах о токе CRAC и протоколе с тапсигаргином.
Исследование · шаг 28 из 28Как четыре переключателя работают вместе в T-лимфоцитеВ активированном T-лимфоците один стимул запускает и вход Ca²⁺, и цикл RAS. Для транскрипции гена интерлейкина-2 необходимы обе ветви, а повышение концентрации cAMP её ослабляет.Рецептор антигена активирует фосфолипазу Cγ1, которая образует IP₃ и DAG: IP₃ опустошает депо и запускает вход Ca²⁺ через STIM1–Orai1, DAG связывается с RASGRP1, и RASGRP1 активирует RAS.Ca²⁺ активирует фосфатазу кальциневрин, дефосфорилированный NFAT переходит в ядро; путь RAS → ERK повышает количество и активность белков AP-1.NFAT и AP-1 вместе связываются с составными элементами промотора IL2; повышение концентрации cAMP подавляет индукцию IL-2.T-лимфоцит удобен как итоговый пример, потому что в нём работают все механизмы семинара. Связывание антигена рецептором T-клетки запускает каскад тирозиновых киназ и активирует фосфолипазу Cγ1. Она, как фосфолипаза Cβ ветви Gq, гидролизует PI(4,5)P₂ с образованием IP₃ и DAG. IP₃ опустошает депо Ca²⁺, STIM1 открывает Orai1, и длительный вход Ca²⁺ активирует кальциневрин. Дефосфорилированный NFAT переходит в ядро — сигнал передаётся через фосфатазу.DAG связывается с C1-доменом белка RASGRP1, фактора обмена гуаниновых нуклеотидов для RAS. У мышей без RASGRP1 тимоциты не активировали RAS в ответ на стимуляцию рецептора антигена или аналоги DAG (Dower 2000). RAS-GTP запускает путь ERK, который повышает синтез и фосфорилирование белков семейств Fos и Jun, образующих AP-1. Цикл RAS здесь управляется тем же принципом, что в вопросе 3: доля RAS-GTP задаётся активностью GEF и GAP.Транскрипция гена интерлейкина-2 требует совпадения двух сигналов: NFAT и AP-1 образуют на составных элементах промотора прочный тройной комплекс с ДНК (Macián 2001). Поэтому ни вход Ca²⁺ без AP-1, ни AP-1 без NFAT недостаточны. У больных с заменой ORAI1 R91W T-клетки лишены депо-зависимого входа Ca²⁺ (Feske 2006), а циклоспорин A подавляет кальциневрин — оба нарушения затрагивают разные звенья одной ветви. Повышение концентрации cAMP (в экспериментах — форсколином и аналогами cAMP) в линиях T-клеток подавляло индукцию IL-2, но не IL-4, частично на уровне транскрипции (Novak и Rothenberg 1990): ответ на один и тот же cAMP снова зависит от того, какие гены и белки задействованы в данной клетке.Отключайте звенья на схеме и следите, какие сигналы доходят до гена IL2.Типичная ошибка Для активации T-лимфоцита достаточно повышения концентрации Ca²⁺ в цитозоле.Ca²⁺ через кальциневрин активирует NFAT, но для транскрипции IL2 нужен ещё AP-1, образование которого зависит от ветви DAG → RASGRP1 → RAS → ERK. Транскрипция гена активируется при совпадении двух сигналов.T-лимфоциты без RASGRP1 стимулировали через рецептор антигена. Вход Ca²⁺ и доля NFAT в ядре соответствуют норме. Как изменится индукция гена IL2?А. Не изменится: NFAT в ядре достаточно (неверный вариант)NFAT на промоторе IL2 действует совместно с AP-1. Без активации RAS и ERK AP-1 почти не образуется, и одного NFAT для полной индукции недостаточно.Б. Ослабнет: без активации RAS мало AP-1 (верный вариант)Обе ветви сходятся на промоторе: NFAT от кальциевой ветви и AP-1 от ветви RAS → ERK. Отсутствие RASGRP1 лишает промотор второго партнёра.В. Усилится: Ca²⁺ не тратится на путь RAS (неверный вариант)Ca²⁺ не расходуется путём RAS, а ветви не конкурируют за общий ресурс. Подавление ветви RAS снижает, а не повышает индукцию IL2.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаDower N. A. et al. 2000. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nat ImmunolMacián F. et al. 2001. Partners in transcription: NFAT and AP-1. OncogeneFeske S. et al. 2006. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. NatureHogan P. G. et al. 2003. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes DevNovak T. J., Rothenberg E. V. 1990. cAMP inhibits induction of interleukin 2 but not of interleukin 4 in T cells. Proc Natl Acad Sci U S AСхема механизма, объединяющая данные разных систем: RASGRP1 — мыши без RASGRP1, тимоциты (Dower 2000); NFAT и AP-1 на промоторе IL2 — обзор Macián 2001; ORAI1 R91W — T-клеточные линии больных (Feske 2006); действие cAMP на IL-2 — линии T-клеток мыши, форсколин и аналоги cAMP (Novak и Rothenberg 1990). Состояния схемы качественные, без расчётов.
