Усиление и завершение · шаг 1 из 26Как устроен каскад RAS → RAF → MEK → ERKСигнальный каскад MAP-киназ передаёт сигнал от активированного рецептора через три последовательных киназных уровня. Его устройство объясняет, почему каскад способен и усиливать сигнал, и быстро его завершать — этому посвящён вопрос 1 практикума.Рецептор EGF связывает лиганд, адаптер GRB2 переносит SOS к мембране, и SOS переводит RAS в GTP-форму.RAS-GTP на внутренней стороне мембраны связывает RAS-связывающий домен (RBD) автоингибированного мономера RAF и удерживает его у мембраны; само связывание киназу не включает.У мембраны комплекс RAF с 14-3-3 раскрывается, ингибирующий фосфосерин дефосфорилируется, и два протомера образуют активный димер; он фосфорилирует MEK, а MEK — киназа двойной специфичности — фосфорилирует ERK по мотиву TEY.Активная ERK фосфорилирует сотни субстратов в цитоплазме и ядре, в том числе белки, которые затем тормозят верхние уровни каскада.MAP-киназный каскад RAF → MEK → ERK начинается у плазматической мембраны. После связывания EGF рецептор фосфорилирует тирозины своих цитоплазматических участков; к ним присоединяется адаптер GRB2, связанный с фактором обмена нуклеотидов SOS. SOS катализирует замену GDP на GTP в RAS, и RAS-GTP привлекает к мембране RAF.Привлечение RAF к мембране — только начало её активации. В цитозоле RAF находится в автоингибированном мономерном состоянии; дальнейшая последовательность описана для BRAF человека, а у CRAF набор регуляторных остатков другой. Димер белков 14-3-3 связывает два фосфосерина, фланкирующих киназный домен (pS365 и pS729), и охватывает киназный домен вместе с MEK1. В таком комплексе богатый цистеином домен (CRD) расположен в центре и закрыт от мембраны и RAS, а киназный домен не может образовать димер, необходимый для активности (Park 2019).RAS-связывающий домен (RBD), напротив, доступен для RAS-GTP: он связывает область switch I белка RAS, константа диссоциации для полноразмерного BRAF около 0,1 мкМ, а контакты CRD, поддерживающие автоингибирование, при этом не нарушаются. Поэтому очищенный фрагмент KRAS без липидного остатка образует комплекс с автоингибированным BRAF, но не активирует его. Активацию in vitro наблюдали, когда KRAS нёс фарнезильную группу и находился в мембране из фосфатидилсерина, но и в этом случае она была неполной (Park 2023). Следовательно, связывание с RAS и активация киназы — разные события: рекрутирование к мембране необходимо, но не равнозначно каталитической активации.Как именно комплекс раскрывается у мембраны, окончательно не установлено. Остатки RBD, образующие контакт с 14-3-3, сначала участвуют в автоингибировании, а затем в связывании RAS (Martinez Fiesco 2022); связывание RAS может нарушать этот контакт, но одного стерического эффекта недостаточно, чтобы освободить CRD. CRD способен связывать и RAS, и фосфатидилсерин мембраны, поэтому предложены две модели: либо контакт с мембраной непосредственно раскрывает комплекс, либо вблизи мембраны комплекс чаще раскрывается на время, и CRD успевает связать RAS и липиды. Раскрытое состояние прямо не наблюдали (Park 2023).Затем дефосфорилируется ингибирующий сайт, с которым связан 14-3-3 (pS365 у BRAF, pS259 у CRAF). Фосфатазный комплекс SHOC2–MRAS–PP1C эффективно дефосфорилирует его в димерной форме, где сайт открыт, но плохо — в закрытом комплексе, где сайт скрыт под CRD и 14-3-3. Поэтому предполагают, что дефосфорилирование происходит в раскрытом мономере у мембраны и не позволяет RAF вернуться в автоингибированное состояние; такой мономер пока не наблюдали (Park 2023).Раскрытые мономеры соединяются в димер «спина к спине». При этом димер 14-3-3 перестраивается: вместо удержания одной молекулы BRAF он связывает C-концевые фосфосерины pS729 двух молекул и сближает их киназные домены. Так 14-3-3 сначала поддерживает автоингибирование, а затем стабилизирует активный димер (Park 2019). Регуляторная часть с RBD и CRD в этот модуль не входит и, вероятно, остаётся у RAS в мембране. Активный димер фосфорилирует MEK1/2 по двум серинам активационной петли. Эти данные получены на очищенных комплексах BRAF, MEK1 и 14-3-3 методом крио-ЭМ и в реконструкции in vitro; в клетке участвуют и другие факторы, например SHOC2 и KSR.MEK занимает особое положение: это киназа двойной специфичности, которая фосфорилирует и треонин, и тирозин мотива TEY в ERK. Других физиологических субстратов у MEK практически нет, поэтому на этом уровне сходятся сигналы многих вышестоящих киназ.ERK активна, когда фосфорилированы оба остатка мотива TEY (T202 и Y204 у ERK1 человека). In vitro MEK фосфорилирует их по очереди, отделяясь от ERK между двумя реакциями; в клетке из-за высокой плотности белков (макромолекулярной скученности) этот процесс может становиться почти непрерывным (квазипроцессивным). Активная ERK фосфорилирует транскрипционные факторы в ядре, киназы RSK и белки цитоскелета в цитоплазме.Ингибитор MEK блокирует передачу сигнала от MEK к ERK, но не мешает активации RAS и RAF. Так можно проверить, какие события зависят именно от ERK.Типичная ошибка Каскад — это простая цепочка «включателей»: каждый уровень лишь передаёт сигнал дальше.Каждый уровень — фермент со своей кинетикой. От соотношения киназ, фосфатаз и их субстратов зависят и усиление, и крутизна, и завершение сигнала, а ERK тормозит верхние уровни каскада.В клетки добавили EGF и аллостерический ингибитор MEK. Какие уровни каскада будут активированы?А. RAS и RAF активируются, ERK почти не фосфорилирована (верный вариант)Ингибитор MEK действует ниже RAF: рецептор, SOS, RAS и RAF отвечают на EGF, а передача сигнала от MEK к ERK заблокирована.Б. Ни один уровень не активируется: ингибитор блокирует рецептор (неверный вариант)Ингибитор MEK не связывается с рецептором EGF. Верхние уровни каскада по-прежнему отвечают на лиганд.В. ERK фосфорилируется, но RAS остаётся в GDP-форме (неверный вариант)Порядок обратный: RAS находится выше MEK и активируется, а фосфорилирование ERK, которое выполняет MEK, подавлено.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаMartin-Vega A et al. 2023. Navigating the ERK1/2 MAPK Cascade. BiomoleculesLavoie H et al. 2020. ERK signalling: a master regulator of cell behaviour, life and fate. Nat Rev Mol Cell BiolFerrell JE et al. 1997. Mechanistic studies of the dual phosphorylation of mitogen-activated protein kinase. J Biol ChemAoki K et al. 2011. Processive phosphorylation of ERK MAP kinase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S APark E et al. 2019. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. NatureMartinez Fiesco JA et al. 2022. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat CommunPark E et al. 2023. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat CommunСхема механизма составлена по обзорам Martín-Vega и Cobb (2023) и Lavoie и соавт. (2020). Дистрибутивное фосфорилирование ERK показано in vitro (Ferrell и Bhatt 1997); квазипроцессивное — в клетках HeLa (Aoki 2011). Нумерация сайтов — для ERK1 человека. Последовательность активации RAF дана для BRAF человека по крио-ЭМ-структурам очищенных комплексов и реконструкции in vitro (Park 2019; Martinez Fiesco 2022; Park 2023); механизм раскрытия комплекса у мембраны и роль SHOC2–MRAS–PP1C остаются моделью. Номера остатков относятся к BRAF (pS365, pS729) и к CRAF (pS259, pS621) и не переносятся между изоформами.
Усиление и завершение · шаг 2 из 26Что такое каталитическое усиление и где оно возникаетУсиление показывает, во сколько раз активных молекул на выходе больше, чем на входе. В каскаде ERK оно возникает не одинаково на каждом уровне: главную роль играет ступень RAF → MEK.Одна активная киназа, не расходуясь, фосфорилирует много молекул субстрата следующего уровня.Число активных молекул на выходе ограничено общим количеством субстрата: активной ERK не может быть больше, чем всей ERK в клетке.Каталитическое усиление оценивают при одном фиксированном стимуле, сравнивая количество активных молекул на входе и выходе.Фермент в реакции не расходуется, поэтому одна молекула активной киназы за время сигнала фосфорилирует много молекул субстрата. Если на каждом из трёх уровней одна молекула активирует десять, на выходе окажется в 1000 раз больше активных молекул, чем на входе. Такой расчёт показывает принцип, но не описывает реальную клетку.В реальной клетке усиление ограничено количеством белков каждого уровня. По измерениям Fujioka и соавт. (2006), в клетках HeLa концентрация RAF составляет около 0,013 мкМ, MEK — около 1,4 мкМ, ERK — около 0,96 мкМ, RAS — около 0,4 мкМ. Число активных молекул равно общему количеству белка, умноженному на долю его активной формы. Когда доли активных форм на соседних уровнях сопоставимы — в модели так бывает при максимальном стимуле, около 77–84 %, — соотношение активных молекул задают количества белков: на ступени RAS → RAF-1 их число не растёт, на ступени RAF-1 → MEK может возрасти примерно в сто раз, а на ступени MEK → ERK многократно не растёт, так как ERK и MEK сопоставимы по количеству. При других стимулах доли различаются, и усиление нужно считать по обоим сомножителям.В модели практикума при максимальном стимуле на одну активную RAF приходится около 70 активных молекул ERK. Это число почти одинаково в двух режимах работы ферментов, хотя форма кривой «доза — ответ» в них различается (следующий шаг).Усиление увеличивает число эффекторных событий в расчёте на один занятый рецептор, но не позволяет различить две высокие концентрации лиганда, при которых почти все рецепторы уже заняты. Верхнюю границу различимых концентраций задаёт связывание лиганда с рецептором.Типичная ошибка Каскад усиливает сигнал в десять раз на каждом уровне, поэтому ERK всегда во много раз больше, чем RAS.Усиление ограничено количеством белков на каждом уровне. В клетках HeLa RAF намного меньше, чем RAS, MEK и ERK, поэтому основное усиление по числу молекул приходится на ступень RAF → MEK.В клетке RAF около 0,013 мкМ, MEK — 1,4 мкМ, ERK — 0,96 мкМ. На какой ступени каскада число активных молекул может вырасти больше всего?А. RAF → MEK (верный вариант)MEK примерно в сто раз больше, чем RAF, и каждая активная RAF фосфорилирует много молекул MEK.Б. MEK → ERK (неверный вариант)В клетках HeLa ERK и MEK сопоставимы по количеству (оценки различаются в зависимости от метода), поэтому на этой ступени число активных молекул многократно не растёт.В. На всех ступенях одинаково (неверный вариант)Это условный пример «по десять на уровень». Реальное усиление зависит от количества белка на каждом уровне и различается между ступенями.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаFujioka A et al. 2006. Dynamics of the Ras/ERK MAPK cascade as monitored by fluorescent probes. J Biol ChemHuang CY et al. 1996. Ultrasensitivity in the mitogen-activated protein kinase cascade. Proc Natl Acad Sci U S AКонцентрации — клетки HeLa, флуоресцентные зонды (Fujioka 2006; значения таблицы 1 приведены по аннотации и базе BioNumbers). Расчёт «70 молекул ERK на одну RAF» — учебная модель практикума (вопрос 1б) с этими концентрациями. Пример «10 × 10 × 10» — условный.
Усиление и завершение · шаг 3 из 26Почему ответ каскада бывает пологим или крутымКрутизна показывает, насколько резко доля активной ERK меняется при небольшом изменении стимула. Её создают кинетические свойства ферментов, а не само число уровней каскада.Если киназа и фосфатаза насыщены субстратом, их скорости почти постоянны, и малый сдвиг их соотношения резко меняет долю фосфорилированного субстрата (переключение нулевого порядка).Дистрибутивное фосфорилирование двух сайтов ERK добавляет ещё одну кинетическую ступень и повышает крутизну.При последовательном соединении уровней их крутизна перемножается: коэффициент Хилла каскада больше, чем у любого отдельного уровня.Крутизна, или сверхчувствительность, описывает форму кривой «концентрация стимула — доля активной ERK». Её выражают эффективным коэффициентом Хилла: при значении 1 ответ гиперболический и постепенный, при 4–5 — сигмоидный, близкий к переключателю.Goldbeter и Koshland (1981) показали, что крутой ответ может возникнуть без кооперативного связывания. Если концентрация субстрата намного выше Km киназы и фосфатазы, обе работают почти с максимальной скоростью. Пока скорость фосфорилирования ниже скорости дефосфорилирования, почти весь субстрат находится в нефосфорилированной форме; как только она становится выше, почти весь субстрат фосфорилирован. Вблизи равенства скоростей малое изменение входного сигнала переводит систему из одного состояния в другое.Huang и Ferrell (1996) измерили ответ каскада в неразбавленных экстрактах ооцитов Xenopus, добавляя киназу Mos в разной концентрации. Для ERK2 эффективный коэффициент Хилла составил 4–5, для MEK1 — около 1,7. Крутизна возрастала от уровня к уровню. Это значение относится к экстрактам с естественными концентрациями ферментов и не переносится автоматически на другие клетки.На схеме можно сравнить два режима учебной модели. Усиление при максимальном стимуле в них почти одинаковое, а форма кривой разная: усиление и крутизна — независимые свойства. Коэффициент Хилла зависит от того, по какой величине строят кривую: по концентрации EGF в насыщенном режиме он около 3, а по доле занятых рецепторов — около 5, потому что занятость сама нелинейно зависит от концентрации лиганда. Оба режима — учебные наборы параметров, в которых различаются и насыщение ферментов, и отношения скоростей киназ и фосфатаз; это иллюстрация двух форм ответа, а не эксперимент с изменением одного параметра.Типичная ошибка Сильный каскад, дающий много активной ERK, обязательно отвечает круто, по порогу.Масштаб ответа (усиление) и его крутизна независимы: тот же каскад с тем же максимальным выходом может отвечать полого или круто в зависимости от насыщения ферментов.Ферменты каскада насыщены субстратом. В модели практикума концентрацию EGF повышают в 10 раз: с 0,06 до 0,6 Kd. Как изменится доля активной ERK?А. Резко возрастёт: от почти нуля до половины максимума (верный вариант)В модели практикума доля активной ERK возрастает примерно с 1 до 46 %: в насыщенном режиме ответ ниже порога почти отсутствует, а вблизи порога резко нарастает (эффективный коэффициент Хилла кривой по концентрации EGF около 3, по доле занятых рецепторов — около 5). Конечную долю задают исходная и конечная концентрации: без них можно утверждать лишь, что переход резкий.Б. Увеличится примерно в 10 раз, как стимул (неверный вариант)Около порога при насыщении ответ растёт гораздо сильнее, чем стимул; почти пропорциональный рост возможен лишь при малом входе в ненасыщенном режиме.В. Изменится немного: каскад сглаживает изменения (неверный вариант)Так отвечают ненасыщенные ферменты. При насыщении каскад, напротив, превращает небольшое изменение входа в резкий сдвиг ответа.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoldbeter A et al. 1981. An amplified sensitivity arising from covalent modification in biological systems. Proc Natl Acad Sci U S AHuang CY et al. 1996. Ultrasensitivity in the mitogen-activated protein kinase cascade. Proc Natl Acad Sci U S AMarkevich NI et al. 2004. Signaling switches and bistability arising from multisite phosphorylation in protein kinase cascades. J Cell BiolКоэффициенты Хилла 4–5 (ERK2) и ~1,7 (MEK1) — экстракты ооцитов Xenopus laevis, стимул — Mos 0–300 нМ (Huang и Ferrell 1996; прочитана аннотация, числа проверены по обзору Ferrell 1996). Кривые схемы — учебная модель практикума (функция Голдбетера — Кошланда для трёх уровней), величины условные; коэффициент Хилла на схеме рассчитан по EC10 и EC90 кривой «концентрация EGF — доля активной ERK».
Усиление и завершение · шаг 4 из 26Какими механизмами завершается сигналСигнал ERK затухает, даже когда EGF остаётся в среде: его завершают несколько механизмов на разных уровнях. Они различаются скоростью и мишенью, поэтому их нарушения меняют ответ по-разному.Фосфатазы DUSP дефосфорилируют ERK, а GAP-белки, например нейрофибромин, ускоряют гидролиз GTP в RAS.Активная ERK фосфорилирует RAF-1 и через RSK — SOS1, ослабляя их; кроме того, она индуцирует синтез DUSP и SPRY.Активные рецепторы интернализуются и частично разрушаются в лизосомах, так что на поверхности их становится меньше.Завершение сигнала обеспечивают шесть групп механизмов: фосфатазы, прямо дефосфорилирующие ERK; тормозящее фосфорилирование вышестоящих белков, которое осуществляет активная ERK; дефосфорилирование рецептора и адаптеров; GAP-зависимый гидролиз GTP в RAS; интернализация и сортировка рецептора; протеолитическая деградация компонентов.Механизмы работают на разных временных масштабах. Дефосфорилирование и гидролиз GTP протекают непрерывно; вызванные ими изменения развиваются и обращаются за секунды и минуты. Тормозящее фосфорилирование SOS и RAF-1 развивается за минуты и не требует синтеза белка. Синтез DUSP и SPRY занимает десятки минут и часы. Интернализация меняет положение рецептора, а деградация необратимо уменьшает его количество.Поэтому в клетках PC12 после добавления EGF активность MEK максимальна через 2 мин и возвращается к исходному уровню за 60–90 мин, хотя EGF остаётся в среде (Traverse 1992). Если же EGF отмыть, сигнал затухает за минуты: новые рецепторы не активируются, а дефосфорилирование и гидролиз GTP продолжаются.Механизмы не независимы. Интернализация не всегда выключает сигнал: рецептор в эндосоме может продолжать передачу. Обнаружение одного работающего механизма не позволяет предсказать скорость затухания: для этого нужны вклады и временные профили всех механизмов. Часть механизмов завершения — торможение RAF-1 и SOS1 активной ERK, индуцированный синтез DUSP и SPRY — одновременно являются петлями обратной связи; их устройство разобрано в шаге «Чем обратная связь отличается от завершения сигнала в узле».Типичная ошибка Сигнал ERK затухает только тогда, когда из среды исчезает лиганд.При постоянном EGF сигнал ERK тоже затухает: число рецепторов на поверхности уменьшается, ERK тормозит RAF-1 и через RSK — SOS1, фосфатазы дефосфорилируют ERK.EGF остаётся в среде, а через 60 мин pERK в несколько раз ниже пика. Что объясняет это наблюдение?А. Несколько механизмов завершения на разных уровнях каскада (верный вариант)Рецепторы интернализуются и разрушаются, ERK тормозит RAF-1 и через RSK — SOS1, фосфатазы дефосфорилируют ERK: сигнал затухает при сохраняющемся лиганде.Б. Распад EGF в среде за первые минуты (неверный вариант)Если EGF отмыть, pERK падает за минуты; при EGF в среде спад медленнее. Значит, лиганд сохраняется, а сигнал прекращают внутриклеточные механизмы.В. Исчерпание ERK: все молекулы разрушились (неверный вариант)ERK — стабильный белок: её общее содержание за час почти не меняется. Снижается доля фосфорилированной ERK.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаMartin-Vega A et al. 2023. Navigating the ERK1/2 MAPK Cascade. BiomoleculesLavoie H et al. 2020. ERK signalling: a master regulator of cell behaviour, life and fate. Nat Rev Mol Cell BiolTraverse S et al. 1992. Sustained activation of the mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade may be required for differentiation of PC12 cells. Comparison of the effects of nerve growth factor and epidermal growth factor. Biochem JCaunt CJ et al. 2013. Dual-specificity MAP kinase phosphatases (MKPs): shaping the outcome of MAP kinase signalling. FEBS JКлассификация механизмов — по обзорам Martín-Vega и Cobb (2023) и Lavoie и соавт. (2020); время ответа на EGF — клетки PC12 (Traverse 1992, аннотация). Графики — учебная модель практикума (вопрос 1п), величины относительные.
Усиление и завершение · шаг 5 из 26Что меняют потеря NF1 и мутация KRAS G12CПотеря нейрофибромина увеличивает время жизни RAS-GTP, но не создаёт нового сигнала. KRAS G12C продолжает переходить между GTP- и GDP-формами, и именно на этом основано действие соторасиба.Нейрофибромин вводит в активный центр RAS каталитический аргинин (Arg1276) и ускоряет гидролиз GTP на несколько порядков.KRAS G12C почти не отвечает на GAP и медленно гидролизует GTP, поэтому значительная его часть находится в GTP-форме и без фактора роста.Соторасиб ковалентно связывает цистеин мутантного KRAS в GDP-форме и не даёт белку вернуться в GTP-форму.Собственная ГТФазная активность RAS медленная. GAP-белки, в том числе нейрофибромин, ускоряют гидролиз GTP на несколько порядков: аргининовый остаток GAP входит в активный центр RAS и стабилизирует переходное состояние реакции.При нейрофиброматозе 1 типа одна аллель NF1 мутантна во всех клетках, а в клетках опухоли (например, в шванновских клетках нейрофибромы) утрачена и вторая, и нейрофибромина нет совсем. Новый сигнал при этом не возникает: RAS по-прежнему активируется только через факторы обмена нуклеотидов (SOS и другие). Но RAS-GTP сохраняется дольше, и каскад, запущенный фактором роста, работает дольше и сильнее. Особенно показательна мутация R1276P: она избирательно выключала GAP-активность нейрофибромина, не нарушая его структуру и связывание с RAS (Klose 1998).KRAS G12C смещает равновесие к GTP-форме: мутантный белок почти не отвечает на GAP. Но он не зафиксирован в активном состоянии — медленно гидролизует GTP и проходит через GDP-форму. В ней у белка открыт карман возле участка switch II, и соторасиб необратимо связывает цистеин 12 (Canon 2019). Молекулы захватываются по мере перехода в GDP-форму, поэтому RAS-GTP и pERK снижаются постепенно.Два случая показывают две стороны завершения сигнала. При потере NF1 утрачен физиологический механизм выключения RAS, а при лечении опухолей с мутацией KRAS G12C соторасиб создаёт искусственный механизм выключения.Типичная ошибка Мутантный KRAS G12C постоянно связан с GTP, поэтому соторасиб должен связывать его активную форму.KRAS G12C продолжает гидролизовать GTP, хотя медленно. Соторасиб связывает его именно в GDP-форме и удерживает в неактивном состоянии.Почему соторасиб снижает pERK в клетках с KRAS G12C постепенно, а не мгновенно?А. Он связывает только GDP-форму мутантного KRAS (верный вариант)Молекулы KRAS G12C захватываются по мере того, как они гидролизуют GTP и переходят в GDP-форму; на это нужно время.Б. Он связывает GTP-форму, но медленно проникает в клетку (неверный вариант)Соторасиб связывает не GTP-, а GDP-форму: его карман возле switch II открыт только в неактивном состоянии.В. Он действует через нейрофибромин, активируя GAP (неверный вариант)Соторасиб связывает сам мутантный KRAS; KRAS G12C к тому же почти нечувствителен к GAP.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаAnastasaki C et al. 2022. RAS and beyond: the many faces of the neurofibromatosis type 1 protein. Dis Model MechKlose A et al. 1998. Selective disactivation of neurofibromin GAP activity in neurofibromatosis type 1. Hum Mol GenetCanon J et al. 2019. The clinical KRAS(G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity. NatureМеханизм GAP и мутация R1276P — Anastasaki и соавт. (2022), Klose и соавт. (1998); механизм соторасиба — Canon и соавт. (2019). Состояния на схеме — качественные, не данные эксперимента.
Усиление и завершение · шаг 6 из 26Как измеряют активность каскада и что показывает блотЧтобы увидеть усиление и завершение сигнала, активность каскада измеряют во многих точках времени и при разных дозах. Каждый метод измеряет свою величину, и её нельзя подменять другой.Вестерн-блот с антителами к фосфорилированной форме позволяет сравнивать относительное содержание pERK в лизате многих клеток после нормировки на общую ERK; проценты на экранах — рассчитанные доли учебной модели.Ингибиторы MEK и RAF и генетические воздействия (siRNA, мутации) показывают, какие события зависят от данного звена.Репортёры в живых клетках, например FRET-сенсор, показывают динамику активности ERK в отдельной клетке.Основной метод — вестерн-блот: клетки лизируют через 0, 2, 5, 15, 30 и 60 мин после стимула и окрашивают антителами к pERK (T202/Y204), pMEK и общей ERK. Серия точек показывает нарастание и затухание сигнала, а серия доз — форму кривой «доза — ответ».Фосфорилирование не то же самое, что активность. Антитело выявляет фосфорилированные сайты, а каталитическую активность фермента проверяют по фосфорилированию его субстратов. Например, для AKT при действии ATP-конкурентных ингибиторов сайты активации даже гиперфосфорилированы (Okuzumi 2009), хотя каталитическая активность фермента подавлена.Сигнал на блоте усреднён по миллионам клеток. Гладкая кривая в лизате может складываться из коротких импульсов в отдельных клетках, сдвинутых по фазе. Для одноклеточной динамики используют репортёры: FRET-сенсор EKAR-EV и флуоресцентно меченную ERK, которая при активации переходит в ядро (раздел 2).Эксперименты с ингибиторами и генетическими воздействиями отвечают на вопрос, зависит ли событие от данного звена. Ингибитор MEK, подавляющий событие, показывает его зависимость от MEK, но не доказывает её: при высокой дозе возможны побочные эффекты. Вывод становится надёжнее, если его подтверждает второй, независимый способ — другой ингибитор, siRNA или мутант.Типичная ошибка Если на блоте вырос сигнал pERK, значит, в каждой клетке ERK стала активнее.Блот показывает среднее фосфорилирование по популяции в момент фиксации. Оно не говорит ни о каталитической активности, ни о поведении отдельных клеток.Ингибитор MEK подавил экспрессию гена-мишени ERK. Какой вывод корректен?А. Доказано, что экспрессия гена зависит только от ERK (неверный вариант)Один ингибитор показывает зависимость, но не доказывает её: возможны побочные эффекты; нужны независимые подтверждения.Б. Экспрессия зависит от MEK; вывод требует проверки другим способом (верный вариант)Результат согласуется с ролью MEK–ERK. Независимый способ — другой ингибитор, siRNA или мутант — делает вывод надёжнее.В. ERK в этих клетках неактивна и без ингибитора (неверный вариант)Эксперимент с ингибитором ничего не говорит о состоянии ERK без него; это проверяют отдельным измерением pERK.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаLavoie H et al. 2020. ERK signalling: a master regulator of cell behaviour, life and fate. Nat Rev Mol Cell BiolMadsen RR et al. 2023. PI3K signaling through a biochemical systems lens. J Biol ChemOkuzumi T et al. 2009. Inhibitor hijacking of Akt activation. Nat Chem BiolAlbeck JG et al. 2013. Frequency-modulated pulses of ERK activity transmit quantitative proliferation signals. Mol CellKomatsu N et al. 2011. Development of an optimized backbone of FRET biosensors for kinases and GTPases. Mol Biol CellToettcher JE et al. 2013. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. CellМетоды и их ограничения — по обзорам Lavoie и соавт. (2020) и Madsen и Toker (2023); устройство сенсора EKAR-EV — Komatsu и соавт. (2011), ERK, переходящая в ядро, — Toettcher и соавт. (2013). Полосы на схеме условные, это не результат эксперимента.
Длительность сигнала · шаг 7 из 26Чем описывается временной профиль сигналаАктивность ERK во времени описывают четыре различимых свойства: амплитуда, длительность, число импульсов и площадь под кривой. Они не обязательно независимы: изменение дозы стимула часто меняет сразу несколько из них.Амплитуда — наибольшее значение активности; длительность — время, пока активность выше заданного порога (например, половины пика).Число и частота импульсов описывают повторяющиеся подъёмы; площадь под кривой — интеграл активности по времени (интегральная доза).Нижележащие процессы с разной кинетикой «считывают» разные свойства временного профиля.Сигнал описывается не двумя состояниями «включено — выключено», а кривой изменения активности во времени. Короткий высокий пик и долгое низкое плато могут иметь одинаковую площадь, но действовать на клетку по-разному. Чтобы сравнивать профили, их описывают несколькими числами.Амплитуда показывает, насколько сильно активирована киназа в момент максимума. Длительность — сколько времени активность остаётся выше порога; порог нужно указывать, иначе число теряет смысл. Площадь под кривой — интегральная доза — показывает суммарное количество сигнала. Если активность изменяется импульсами, важны их число, частота и интервалы между ними.Нижележащие белки различаются скоростями. Состояние быстро активируемых и быстро инактивируемых мишеней изменяется вслед за текущей активностью ERK. Мишени, которые накапливаются медленно, например стабильные белки или продукты транскрипции, суммируют сигнал во времени. А механизмы с порогом по непрерывной длительности отвечают только на достаточно долгий сигнал.Свойства профиля не являются независимыми информационными каналами: более высокая доза стимула обычно повышает и амплитуду, и длительность, и площадь. Поэтому вывод о роли одного свойства требует эксперимента, в котором остальные удерживаются постоянными.Типичная ошибка Если суммарная активность ERK одинакова, то и ответ клетки одинаков.Одинаковая площадь под кривой может складываться из разных профилей. Механизмы, требующие непрерывного сигнала, по-разному отвечают на один длинный сигнал и на несколько коротких той же суммарной дозы.Два профиля ERK имеют одинаковую площадь под кривой: короткий высокий пик и долгое низкое плато. Чем они различаются?А. Ничем: интегральная доза полностью описывает сигнал (неверный вариант)Площадь — лишь одно из четырёх свойств профиля. Амплитуда и длительность у этих профилей разные.Б. Амплитудой и длительностью при равной интегральной дозе (верный вариант)Пик выше, но короче; плато ниже, но дольше. Механизмы с порогом по длительности ответят только на плато.В. Только числом импульсов (неверный вариант)В обоих случаях импульс один. Профили различаются высотой и продолжительностью.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаPurvis JE et al. 2013. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. CellОпределения — по обзору Purvis и Lahav (2013). Профили схемы — условные, построены для иллюстрации; площадь выражена в условных единицах.
Длительность сигнала · шаг 8 из 26Что показывает эксперимент с EGF и NGF на клетках PC12В клетках PC12 EGF вызывает кратковременную активацию ERK и деление, а NGF — устойчивую активацию и нейрональную дифференцировку. Этот классический результат показывает связь профиля ERK с исходом, но не позволяет выделить причину.EGF через рецептор EGFR активирует ERK на минуты: активность максимальна через несколько минут и затем возвращается к исходному уровню.NGF через рецептор TrkA активирует ERK на часы, ERK накапливается в ядре.Рецепторы EGFR и TrkA различаются не только профилем ERK, но и другими ветвями сигнала.PC12 — линия клеток феохромоцитомы крысы. Под действием одних факторов они делятся, под действием других образуют отростки, похожие на нейриты. Это удобная модель выбора клеточного ответа.Traverse и соавт. (1992) измерили активность MEK и ERK после EGF и NGF. И EGF, и NGF повышали активность MEK более чем в 20 раз, но после EGF она была максимальна через 2 мин и возвращалась к исходному уровню за 60–90 мин, а после NGF оставалась высокой не менее 90 мин; ERK переходила в ядро, тогда как после EGF к 30 мин этого не происходило. EGF стимулировал деление клеток, NGF — нейрональную дифференцировку.Marshall (1995) обобщил эти данные: длительность активации ERK может определять выбор ответа. Но сравнение EGF и NGF не позволяет выделить роль длительности. EGFR и TrkA — разные рецепторы, и они по-разному активируют PI3K, PLCγ и другие ветви. Разный исход может зависеть и от них.Поэтому эксперимент с двумя факторами показывает корреляцию. Чтобы проверить причинную роль длительности, нужно изменить профиль ERK при прочих равных — это следующий шаг.Типичная ошибка Эксперимент с EGF и NGF доказал, что исход определяет только длительность активности ERK.Эксперимент показал связь профиля ERK с исходом. EGFR и TrkA различаются и другими ветвями сигнала, поэтому причинность требует экспериментов, где меняется только профиль.В клетках PC12 EGF даёт короткий сигнал ERK и деление, NGF — длительный сигнал и дифференцировку. Какой вывод обоснован строже всего?А. Длительность активации ERK — единственная причина разных исходов (неверный вариант)Рецепторы EGFR и TrkA различаются и другими ветвями сигнала; одно сравнение не позволяет выделить роль длительности.Б. ERK не участвует в выборе исхода (неверный вариант)Эксперимент показывает обратное: профиль ERK различается вместе с исходом.В. Профиль ERK связан с исходом, причина не выделена (верный вариант)Наблюдение — корреляция. Для причинного вывода нужно менять только длительность сигнала.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаTraverse S et al. 1992. Sustained activation of the mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade may be required for differentiation of PC12 cells. Comparison of the effects of nerve growth factor and epidermal growth factor. Biochem JMarshall CJ 1995. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. CellДанные — клетки PC12 крысы, EGF и NGF, активность MEK и MAP-киназ (Traverse 1992, аннотация; обзор Marshall 1995). Кривые схемы — учебная модель практикума (вопрос 2б), относительные величины.
Длительность сигнала · шаг 9 из 26Как проверяют, что исход определяет именно длительность сигналаПричинную роль длительности проверяют, меняя профиль ERK при том же рецепторе и лиганде. Избыток EGFR превращает короткий ответ на EGF в длительный — и клетки PC12 дифференцируются.Если рецепторов EGF во много раз больше, уменьшение их числа на поверхности и обратные связи не успевают ослабить сигнал от рецепторов, и ERK остаётся активной долго.С тем же EGF клетки PC12 с избытком EGFR образуют отростки, как при NGF.Профиль ERK определяется сетью обратных связей: при EGF преобладает отрицательная обратная связь, при NGF добавляется положительная (через PKC).Traverse и соавт. (1994) получили клетки PC12, в которых рецептора EGF было намного больше обычного. В таких клетках EGF вызывал длительную активацию MAP-киназ и их переход в ядро, а затем нейрональную дифференцировку, как NGF в обычных клетках. Сходный результат дал избыток рецептора инсулина: инсулин вызывал длительную активацию и рост отростков (Dikic 1994).Этот эксперимент сильнее сравнения двух факторов: лиганд и тип рецептора те же, изменился профиль ERK, и изменился исход. Остаётся оговорка: избыток рецептора усиливает и другие ветви сигнала, поэтому решающие эксперименты — те, где вход задают напрямую (следующие шаги).Чем обусловлено различие профилей? Santos и соавт. (2007) определили знаки обратных связей в модуле RAF–MEK–ERK клеток PC12: при EGF в модуле действовала только отрицательная обратная связь, а при NGF добавлялась положительная, зависящая от PKC. Модель, учитывающая это различие, воспроизводила короткий и длительный профили. Рецептор задаёт вход, а форму профиля создаёт сеть обратных связей.Значит, для причинного вывода нужен эксперимент, где меняется одна переменная, а остальные контролируются.Типичная ошибка Длительный сигнал ERK — особое свойство рецептора NGF.Тот же EGF даёт длительный сигнал при избытке EGFR. Профиль задаёт не рецептор сам по себе, а соотношение входа и обратных связей.В клетках PC12 с избытком EGFR тот же EGF вызвал длительную активацию ERK и дифференцировку. Что добавляет этот эксперимент к сравнению EGF и NGF?А. Исход изменился вместе с профилем ERK при том же лиганде (верный вариант)Лиганд и тип рецептора те же, а изменился профиль ERK — это довод в пользу причинной роли длительности сигнала.Б. Доказывает, что другие ветви сигнала не участвуют (неверный вариант)Избыток рецептора усиливает и другие ветви. Эксперимент сильнее сравнения факторов, но не исключает их вклад.В. Показывает, что NGF действует через EGFR (неверный вариант)NGF действует через TrkA. Эксперимент показывает, что длительный сигнал можно получить и через EGFR.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаTraverse S et al. 1994. EGF triggers neuronal differentiation of PC12 cells that overexpress the EGF receptor. Curr BiolDikic I et al. 1994. PC12 cells overexpressing the insulin receptor undergo insulin-dependent neuronal differentiation. Curr BiolSantos SD et al. 2007. Growth factor-induced MAPK network topology shapes Erk response determining PC-12 cell fate. Nat Cell BiolКлетки PC12 с избытком EGFR (Traverse 1994) и рецептора инсулина (Dikic 1994) — аннотации. Топология обратных связей — Santos и соавт. (2007, аннотация и последующие работы); киназа положительной связи названа PKC без уточнения изоформы. Графики — учебная модель практикума (вопрос 2б).
Длительность сигнала · шаг 10 из 26Как c-Fos «считывает» длительность сигнала ERKc-Fos — белок, который накапливается только тогда, когда ERK ещё активна в момент его синтеза. Длительность сигнала считывается в два этапа: стабилизация белка и его дополнительное фосфорилирование через DEF-мотив.ERK запускает транскрипцию гена немедленного ответа c-fos; белок c-Fos появляется через десятки минут и без модификаций быстро разрушается.Если ERK в это время активна, она и RSK фосфорилируют С-конец c-Fos (S374, S362), и белок стабилизируется.Затем открывается DEF-мотив: ERK связывается с ним и фосфорилирует T325 и T331; без этого этапа сигнальная функция c-Fos нарушена.Murphy и соавт. (2002) изучали, почему в фибробластах Swiss 3T3 короткий и длительный сигналы ERK приводят к разному результату. Оказалось, что решающее значение имеет время: мРНК c-fos синтезируется сразу после стимула, а белок c-Fos появляется позже. При коротком сигнале ERK к этому моменту уже неактивна, и новый c-Fos быстро разрушается.При длительном сигнале ERK ещё активна, когда появляется белок. ERK фосфорилирует S374, а RSK — S362 в С-концевой области (нумерация c-Fos человека). Это фосфорилирование стабилизирует белок и открывает DEF-мотив (FXFP) — участок связывания ERK, после чего ERK фосфорилирует T325 и T331. Стабильный c-Fos накапливается и вместе с c-Jun образует фактор AP-1.Замены в DEF-мотиве нарушают второй этап: начальное фосфорилирование S374 от DEF-мотива не зависит, а T325 и T331 ERK без него почти не фосфорилирует, и c-Fos-зависимая передача сигнала нарушается, хотя сигнал ERK длительный (Murphy 2002). Значит, способность различать длительность сигнала определяется свойствами самого белка-мишени. В учебной модели количество стабильного белка при замене DEF-мотива принято неизменным, а с формой pT325/pT331 связана активность AP-1 — это допущение модели.Механизм показан для c-Fos в фибробластах. Переносить его на другие белки немедленного ответа можно только после проверки, есть ли у них сходный мотив связывания ERK и сходная кинетика.Типичная ошибка Чем дольше активна ERK, тем больше мРНК c-fos, и поэтому c-Fos накапливается.мРНК c-fos образуется и при коротком сигнале. Накопление белка определяется фосфорилированием новосинтезированного c-Fos активной ERK, которое его стабилизирует.В c-Fos заменены остатки DEF-мотива, а сигнал ERK длительный. Как изменится фосфорилирование c-Fos по T325 и T331?А. Не изменится: ERK активна долго (неверный вариант)Активность ERK одинакова, но для фосфорилирования T325 и T331 ERK должна связаться с DEF-мотивом; без него этот этап почти не идёт.Б. Будет намного слабее, хотя стабилизирующее фосфорилирование S374 сохранится (верный вариант)Начальное фосфорилирование С-конца от DEF-мотива не зависит, а T325 и T331 ERK фосфорилирует, связавшись с DEF-мотивом (Murphy 2002).В. Будет сильнее: мутантный мотив прочнее связывает ERK (неверный вариант)Замена остатков FXFP разрушает участок связывания ERK, а не усиливает его.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаMurphy LO et al. 2002. Molecular interpretation of ERK signal duration by immediate early gene products. Nat Cell BiolLavoie H et al. 2020. ERK signalling: a master regulator of cell behaviour, life and fate. Nat Rev Mol Cell BiolФибробласты Swiss 3T3 (Murphy 2002; аннотация, подписи к рисункам и, по данным внешнего аудита, результаты к рис. 3–7: DEF-мотив не нужен для фосфорилирования S374; сайты S374/S362 — по Reactome). Период полужизни c-Fos из этой работы в модель не перенесён. Кривые схемы — учебная модель практикума (вопрос 2п): свет включает RAS, c-Fos — условные величины, % от программы «120 мин подряд».
Длительность сигнала · шаг 11 из 26Как оптогенетика разделяет длительность и интегральную дозуСвет позволяет включать RAS напрямую, минуя рецепторы, и менять только временной профиль входа. Так показали, что некоторые ответы требуют непрерывного сигнала дольше часа и не возникают при прерывистом сигнале с той же интегральной дозой.Красный свет переносит каталитический домен SOS к мембране, где он активирует RAS; дальний красный свет возвращает его в цитоплазму (оптогенетический вход).Каскад передаёт входные сигналы длительностью от 4 мин до 2 ч и сглаживает более короткие.Паракринная программа — фосфорилирование STAT3 в соседних клетках — включается только после непрерывной активации RAS дольше часа.Toettcher и соавт. (2013) соединили каталитический домен SOS с белком PIF, а на мембране закрепили фоторецептор PhyB. Красный свет вызывает их связывание, и SOS активирует RAS; дальний красный свет вызывает диссоциацию этого комплекса, и SOS возвращается в цитоплазму. Так в фибробластах NIH3T3 можно задавать вход любой длительности, не меняя рецептор и лиганд.Каскад вёл себя как фильтр: входные сигналы длительностью от 4 мин до 2 ч и более передавались к ERK в ядре, а более короткие сглаживались. Сигнал от RAS до ядерной ERK проходил примерно за 3 мин.Затем сравнили профили при одинаковой суммарной дозе. Фосфорилирование STAT3 в соседних клетках, вызванное секретируемым фактором, появлялось только после непрерывной активации RAS дольше часа. Два импульса по 1 ч с паузой 1 ч при той же суммарной дозе такого ответа не давали. Механизм с порогом по непрерывной длительности отвечает на эти протоколы по-разному, хотя интеграл одинаков.Контроль интегральной дозы обязателен: если два протокола различаются и длительностью, и дозой, разные исходы допускают три объяснения. В модели практикума видно и другое: c-Fos стабилизируется в каждом импульсе длительностью 1 ч, а паракринная программа — нет. Разные механизмы считывают длительность с разными порогами.Типичная ошибка Если суммарная доза активации RAS одинакова, клетка ответит одинаково.При равной интегральной дозе непрерывный сигнал дольше часа включает паракринную программу, а два импульса по 1 ч с паузой — нет.Свет подают двумя импульсами по 60 мин с паузой 60 мин; интеграл активности ERK такой же, как при 120 мин подряд. Будет ли фосфорилирован STAT3 в соседних клетках?А. Да: важна только суммарная доза (неверный вариант)Паракринная программа требует непрерывной активации дольше часа; за время паузы её активация прерывается.Б. Да, но слабее, пропорционально дозе (неверный вариант)Доза одинакова, а ответа нет: решающей оказывается непрерывная длительность, а не интеграл.В. Нет: нужна непрерывная активация дольше часа (верный вариант)В экспериментах Toettcher (2013) два импульса по 1 ч с паузой не вызывали фосфорилирования STAT3, а 2 ч подряд — вызывали.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаToettcher JE et al. 2013. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. CellPurvis JE et al. 2013. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. CellФибробласты NIH3T3, оптогенетическая система PhyB–PIF–SOScat (Toettcher 2013, полный текст): задержка ≈3 мин, передача входов от 4 мин до ≥2 ч, STAT3 после >1 ч непрерывной активации, сравнение 2 ч подряд и 2 × 1 ч с паузой 1 ч. Кривые — учебная модель практикума (вопрос 2п); порог паракринной программы в модели — 75 мин непрерывной активности.
Длительность сигнала · шаг 12 из 26Чем среднее по популяции отличается от сигнала одной клеткиГладкая кривая pERK в лизате может складываться из коротких импульсов в отдельных клетках, сдвинутых по фазе. Различить эти варианты можно только наблюдая отдельные живые клетки во времени.Репортёр активности ERK (например, FRET-сенсор EKAR) показывает динамику в каждой клетке.В клетках MCF-10A при постоянном EGF ERK активируется дискретными импульсами, не синхронными между клетками.Частота импульсов растёт с концентрацией EGF; доля делящихся клеток связана с интегралом активности ERK.Вестерн-блот и другие популяционные измерения усредняют сигнал миллионов клеток. Если клетки отвечают импульсами в разные моменты, среднее даёт плавную кривую, которой нет ни в одной клетке. Поэтому по популяционной кривой нельзя судить, гладкий ли сигнал в каждой клетке или импульсный.Albeck и соавт. (2013) наблюдали активность ERK в отдельных клетках эпителия молочной железы MCF-10A с помощью сенсора EKAR-EV. При постоянном EGF ERK активировалась импульсами примерно по 20–30 мин, разделёнными паузами; при низкой концентрации EGF паузы длились часами. С ростом концентрации EGF импульсы становились чаще и длиннее.Доля клеток, вступающих в S-фазу, была связана с интегралом активности ERK во времени. Ингибитор рецептора снижал частоту импульсов, а ингибитор MEK — их амплитуду; деление прекращалось, лишь когда выход пути ERK (по уровню белка Fra-1) падал ниже примерно 10 % исходного; подавление выхода на 85 % снижало пролиферацию меньше чем вдвое.Отсюда практическое правило: прежде чем делать вывод о «длительном» или «коротком» сигнале, нужно знать, к какому уровню относится измерение — к популяции или к клетке.Типичная ошибка Плавная кривая pERK на блоте означает плавный сигнал в каждой клетке.Плавное среднее совместимо и с плавной динамикой каждой клетки, и с асинхронными импульсами. Различить их можно только наблюдением отдельных клеток.pERK в лизате клеток плавно растёт и остаётся на постоянном промежуточном уровне. Какое измерение покажет, что происходит в отдельных клетках?А. Вестерн-блот с большим числом точек времени (неверный вариант)Больше точек уточнит среднюю кривую, но она по-прежнему отражает среднее по клеткам и скрывает импульсы в отдельных клетках.Б. Наблюдение репортёра ERK в живых отдельных клетках (верный вариант)Покадровое наблюдение отдельных клеток различает гладкую динамику и асинхронные импульсы.В. Измерение общей ERK в лизате (неверный вариант)Общее количество ERK не отражает её активности и тоже усредняется по клеткам.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаAlbeck JG et al. 2013. Frequency-modulated pulses of ERK activity transmit quantitative proliferation signals. Mol CellPurvis JE et al. 2013. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. CellКлетки MCF-10A, сенсор EKAR-EV, постоянный EGF (Albeck 2013, полный текст). Кривые схемы — учебная модель асинхронных импульсов (40 условных клеток), не данные эксперимента.
Обратные связи · шаг 13 из 26Чем обратная связь отличается от завершения сигнала в узлеПри обратной связи нижележащий компонент регулирует вышестоящие звенья, поэтому прошлое состояние сети влияет на её дальнейшую динамику. Отрицательная связь ограничивает ответ, положительная его усиливает и может сделать необратимым.Локальное завершение не зависит от выхода каскада: постоянно присутствующая фосфатаза дефосфорилирует ERK, GAP переводит RAS в GDP-форму.В отрицательной обратной связи активная ERK тормозит RAF-1 и через RSK — SOS1, а также индуцирует синтез DUSP и SPRY.В положительной обратной связи выход усиливает собственное образование: например, при NGF в клетках PC12 ERK усиливает активацию RAF через PKC.В шаге «Какими механизмами завершается сигнал» перечислены способы ослабления сигнала. Часть из них локальна: постоянно присутствующие фосфатазы и GAP уменьшают активность своего звена независимо от выхода каскада. Другие — торможение RAF-1 и SOS1 активной ERK, индуцированный синтез DUSP и SPRY — одновременно являются петлями обратной связи: выход каскада действует на его вход или промежуточные звенья. «Завершение» описывает результат воздействия, «обратная связь» — устройство связи в сети, и один процесс может отвечать обоим определениям. Посмотрим, как замыкание петли меняет временной профиль: ответ сети в данный момент зависит от её состояния минуту или час назад.В каскаде ERK отрицательная связь действует на двух временных масштабах. Быстрая — посттрансляционная: ERK фосфорилирует несколько сериновых остатков RAF-1 и снижает её связывание с RAS (Dougherty 2005), а ERK и RSK фосфорилируют С-концевой участок SOS1: фосфорилирование по S1134 и S1161 (RSK) создаёт сайты связывания белков 14-3-3 и ослабляет активацию RAS (Douville и Downward 1997; Saha 2012). Медленная — транскрипционная: ERK индуцирует синтез DUSP и белков SPRY/SPRED, которые действуют только после накопления.Положительная связь усиливает ответ. В клетках PC12 при NGF ERK через PKC усиливает активацию RAF, и ответ становится длительным (Santos 2007). В ооцитах Xenopus MAPK стабилизирует Mos и усиливает его синтез — так возникает переключатель; этот пример разобран в шагах о бистабильности.Обратная связь не заменяет механизмы завершения, а надстраивается над ними. Поэтому разрыв одной петли обычно меняет весь профиль — форму пика, высоту плато и время затухания, — а не одну длительность.Типичная ошибка Фосфорилирование SOS и RAF-1 активной ERK — положительная обратная связь, усиливающая каскад.Это отрицательная обратная связь: фосфорилированные SOS и RAF-1 хуже передают сигнал, и каскад тормозит сам себя.Активная ERK фосфорилирует RAF-1, после чего RAF-1 хуже связывается с RAS. К какому типу регуляции это относится?А. Положительная обратная связь (неверный вариант)Фосфорилированная RAF-1 хуже передаёт сигнал: выход каскада ослабляет собственный вход, а это отрицательная связь.Б. Отрицательная обратная связь (верный вариант)Выход каскада (ERK) тормозит вышестоящее звено (RAF-1) — классическая отрицательная обратная связь, действующая за минуты.В. Завершение сигнала в узле, не связанное с выходом (неверный вариант)Торможение запускает сама активная ERK, то есть выход каскада, поэтому это обратная связь, а не локальное завершение.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаDougherty MK et al. 2005. Regulation of Raf-1 by direct feedback phosphorylation. Mol CellDouville E et al. 1997. EGF induced SOS phosphorylation in PC12 cells involves P90 RSK-2. OncogeneSaha M et al. 2012. RSK phosphorylates SOS1 creating 14-3-3-docking sites and negatively regulating MAPK activation. Biochem JSantos SD et al. 2007. Growth factor-induced MAPK network topology shapes Erk response determining PC-12 cell fate. Nat Cell BiolLavoie H et al. 2020. ERK signalling: a master regulator of cell behaviour, life and fate. Nat Rev Mol Cell BiolОтрицательные связи — Dougherty и соавт. (2005; Raf-1, шесть сайтов), Douville и Downward (1997), Saha и соавт. (2012; RSK, SOS1 S1134/S1161), аннотации; положительная связь через PKC — Santos и соавт. (2007). Схема — механизм, не данные эксперимента.
Обратные связи · шаг 14 из 26Что делают быстрая и медленная отрицательные петли ERKБыстрая петля ограничивает пик в первые минуты, медленная снижает поздний уровень сигнала и повышает порог повторной активации. Их разрыв меняет не только длительность, но и форму всего профиля.Быстрая петля: ERK фосфорилирует RAF-1, а активированная ею RSK — SOS1 (S1134, S1161); эффект развивается за минуты и не требует синтеза белка.Медленная петля: ERK индуцирует транскрипцию генов DUSP и SPRY; белки накапливаются через десятки минут и часы.Циклогексимид, подавляющий синтез белка, выключает медленную петлю, но не быструю.Две отрицательные петли действуют на разных временных масштабах и по-разному влияют на профиль сигнала. Быстрая начинает работать, как только ERK становится активной: фосфорилирование SOS и RAF-1 уменьшает поток сигнала от рецептора уже в первые минуты. Поэтому она определяет, насколько широк пик и как быстро начинается спад.Медленная петля требует синтеза мРНК и белка: ядерная ERK индуцирует гены DUSP1, DUSP5, DUSP6 и SPRY. Пока эти белки не накопились, они не действуют; затем они дефосфорилируют ERK и тормозят вход на уровне RAS. Эффект сохраняется дольше однократного фосфорилирования и повышает порог повторной активации тем же стимулом.Вклад петель можно разделить экспериментально. Мутанты RAF-1 без сайтов, которые фосфорилирует ERK, дольше остаются активными (Dougherty 2005). Подавление синтеза белка выключает медленную петлю; но циклогексимид подавляет синтез всех белков, поэтому роль именно DUSP подтверждают с помощью siRNA или нокаута.В модели практикума без быстрой петли pERK через 30 мин после EGF выше нормы почти вдвое, а без медленной — выше на позднем спаде. Если выключить обе, pERK остаётся высоким гораздо дольше: снижается он в основном из-за потери рецепторов.Типичная ошибка Обратные связи определяют только длительность сигнала.Разрыв петли может изменить и амплитуду, и высоту плато, и время затухания. Поэтому у обратной связи различают по меньшей мере три наблюдаемых следствия.Синтез белка подавлен циклогексимидом, EGF в среде. Какая петля перестанет работать?А. Быстрая: фосфорилирование SOS и RAF-1 (неверный вариант)Фосфорилирование уже существующих SOS и RAF-1 не требует синтеза белка и сохраняется.Б. Обе петли сразу (неверный вариант)Циклогексимид не мешает фосфорилированию имеющихся белков; выключается только индуцируемый синтез DUSP и SPRY.В. Медленная: синтез DUSP и SPRY (верный вариант)Медленной петле нужны транскрипция и трансляция DUSP и SPRY; без синтеза белка она не работает.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаDougherty MK et al. 2005. Regulation of Raf-1 by direct feedback phosphorylation. Mol CellMartin-Vega A et al. 2023. Navigating the ERK1/2 MAPK Cascade. BiomoleculesLavoie H et al. 2020. ERK signalling: a master regulator of cell behaviour, life and fate. Nat Rev Mol Cell BiolМеханизмы — Dougherty и соавт. (2005), Martín-Vega и Cobb (2023), Lavoie и соавт. (2020). Кривые — учебная модель практикума (вопрос 3п): фибробласты, EGF остаётся в среде, относительные величины.
Обратные связи · шаг 15 из 26Почему ингибитор RAF в меланоме подавляет ERK ненадолгоВемурафениб в клетках меланомы с BRAF V600E быстро подавляет ERK, но одновременно снимает ERK-зависимую отрицательную обратную связь. Через часы растёт RAS-GTP, образуются устойчивые к препарату RAF-димеры, и pERK частично восстанавливается.Мономер BRAF V600E активен без RAS; высокий pERK постоянно индуцирует DUSP и SPRY, которые поддерживают низкое содержание RAS-GTP.Вемурафениб подавляет мономер, pERK падает; без ERK DUSP и SPRY за часы исчезают, и вход от рецепторов растормаживается.RAS-GTP растёт, образуются RAF-димеры с участием CRAF, на которые препарат действует слабо; отскок зависит от RAS, SOS1 и CRAF, не снимается повторной обработкой вемурафенибом и подавляется ингибитором MEK.Отдельный лекарственный механизм: в RAS-зависимом димере ингибитор, занявший один протомер, подавляет его, но может трансактивировать второй; он описан в клетках с активным RAS и BRAF дикого типа.В клетках меланомы с BRAF V600E мутантная киназа активна в виде мономера и не зависит от RAS. pERK постоянно высокий, поэтому ERK-зависимые ингибиторы каскада — DUSP6, SPRY2 и SPRY4 — синтезируются непрерывно, а RAS-GTP низкий. Опухоль сама поддерживает сильную отрицательную обратную связь на верхнюю часть каскада.Lito и соавт. (2012) добавляли вемурафениб к таким клеткам. pMEK и pERK были максимально подавлены за 1–2 ч. Но без активной ERK DUSP6 и SPRY за 4–8 ч исчезали, ингибирующее фосфорилирование RAF-1 (CRAF) исчезало, а клетки вновь начинали отвечать на лиганды рецепторов — EGF, нейрегулин, HGF. RAS-GTP рос начиная с 4–8 ч и к 24 ч выходил на новый уровень.При росте RAS-GTP образуются RAF-димеры с участием RAF-1 (CRAF). Их прямо выявили совместным осаждением CRAF с BRAF при обработке клеток ингибитором MEK, который так же снимает обратную связь. Для вемурафениба участие димеров следует из других данных: отскок зависел от RAS, SOS1 и CRAF, не уменьшался при повторной обработке вемурафенибом через 24 ч и подавлялся ингибитором MEK. Поэтому pERK частично восстанавливался и держался на новом уровне, выше достигнутого минимума. Сочетание ингибитора RAF с ингибитором MEK углубляло подавление ERK и усиливало противоопухолевый эффект в моделях на мышах.В этом отскоке действуют два разных механизма. Первый — сетевой: он объясняет, откуда берутся RAS-зависимые димеры. Пока ERK активна, DUSP6, SPRY и ингибирующее фосфорилирование CRAF и SOS поддерживают низкое содержание RAS-GTP; SPRY, в частности, связывают GRB2 и не дают комплексу GRB2–SOS присоединяться к рецепторам. После подавления ERK эти тормоза исчезают, рецепторы вновь передают сигнал через GRB2 и SOS1, и RAS-GTP привлекает RAF в димеры.Второй механизм — лекарственный и конформационный: он объясняет, почему в димере ингибитор теряет эффективность. Вемурафениб и родственные препараты связываются в АТФ-центре киназного домена. В мономере BRAF V600E это просто блокирует катализ. В димере CRAF–CRAF или CRAF–BRAF препарат, занявший один протомер, подавляет его, но активирует второй, свободный от препарата, — это называют трансактивацией (Poulikakos 2010). Её показали методом химической генетики: мутация «привратника» делала один из протомеров нечувствительным к ингибитору, и препарат, связанный только с каталитически неактивной молекулой, усиливал фосфорилирование MEK и ERK за счёт второй. Для трансактивации нужны активный RAS и целостный интерфейс димера: замена аргинина в его центре ослабляла и димеризацию, и эффект. При низких и умеренных концентрациях препарата сигнал растёт, при высоких, когда заняты оба протомера, подавляется. Структурная причина, по которой занятый препаратом протомер активирует соседний, в этой работе не определялась.Эти ситуации нельзя отождествлять. Парадоксальную активацию ERK ингибиторами RAF описали в клетках с BRAF дикого типа при активном RAS, например при активации HER2 или при мутации RAS: RAS-GTP способствует образованию димеров, и препарат, связанный с одним протомером, активирует второй. В меланоме с BRAF V600E RAS-GTP исходно низкий, мутантный мономер подавляется, и ERK вначале падает; реактивация идёт позже, после снятия обратной связи, и обычно умеренна. Общее у двух ситуаций — RAS-зависимые димеры. Если в клетках с BRAF V600E присутствует мутантный RAS, вемурафениб уже не подавляет ERK, а ингибитор MEK подавляет (Poulikakos 2010). Выраженность отскока различается между линиями: у Lito и соавт. (2012) из семи линий меланомы он был выраженным в четырёх и слабым в двух, а в колоректальном раке, по их обсуждению, в среднем сильнее. Вклад трансактивации в отскок в меланоме в этих работах напрямую не проверяли.Общий вывод: подавление одного узла не устраняет петлю, а смещает равновесие всей сети. Выбор схемы лечения — решение онколога; пример иллюстрирует системный принцип.Типичная ошибка Если ингибитор хорошо подавляет ERK в первый час, подавление сохранится и дальше.Ранний эффект снимает ERK-зависимую обратную связь. Через часы растёт RAS-GTP, образуются устойчивые к препарату RAF-димеры, и pERK частично восстанавливается.Меланома BRAF V600E, вемурафениб в среде. Почему через 24 ч pERK выше, чем через 1 ч?А. Препарат разрушился в среде (неверный вариант)Восстановление идёт и при сохранённом препарате: меняется не препарат, а сеть — растёт RAS-GTP и образуются RAF-димеры.Б. Снята обратная связь: растёт RAS-GTP, образуются RAF-димеры (верный вариант)Без ERK исчезают DUSP и SPRY, вход от рецепторов растормаживается, а RAF-димеры слабо чувствительны к вемурафенибу.В. Мономер BRAF V600E стал устойчив к препарату (неверный вариант)Мономер по-прежнему подавлен; сигнал восстанавливается обходным путём через RAS и RAF-димеры.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLito P et al. 2012. Relief of profound feedback inhibition of mitogenic signaling by RAF inhibitors attenuates their activity in BRAFV600E melanomas. Cancer CellPoulikakos PI et al. 2010. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. NatureКлетки меланомы с BRAF V600E, вемурафениб и PLX4720 (Lito 2012, полный текст): минимум pMEK/pERK за 1–2 ч, рост RAS-GTP с 4–8 ч, новый уровень к ~24 ч. Кривые — учебная модель практикума (вопрос 3п), среда с сывороткой, относительные величины. Трансактивация RAF-димеров ингибиторами показана в клетках 293H, MEF и опухолевых линиях с BRAF дикого типа и методом химической генетики с каталитическим доменом CRAF (Poulikakos 2010, полный текст); в клетках меланомы Lito 2012 этот механизм напрямую не проверяли.
Обратные связи · шаг 16 из 26Как положительная обратная связь создаёт переключательОдна положительная петля ещё не создаёт переключатель: для этого необходима также достаточная нелинейность. Тогда при одном и том же стимуле возможны два устойчивых состояния — система бистабильна.В ооците Xenopus прогестерон запускает синтез Mos; Mos активирует MEK1, MEK1 — MAPK (ортолог ERK2).Активная MAPK стабилизирует Mos и усиливает его синтез — положительная петля.Петля вместе с крутизной каскада даёт бистабильность: отдельный ооцит отвечает «всё или ничего».Положительная обратная связь ускоряет нарастание ответа: чем больше выход, тем сильнее он усиливает свой вход. Если зависимость пологая, сигнал просто растёт быстрее. Но если петля сочетается с крутой, нелинейной зависимостью, например со сверхчувствительностью каскада, у системы появляются два устойчивых состояния — низкое и высокое — и неустойчивое между ними.Классический пример — созревание ооцитов шпорцевой лягушки. Ferrell и Machleder (1998) измеряли активность MAPK в отдельных ооцитах при разных концентрациях прогестерона. В каждом ооците MAPK была либо почти неактивна, либо полностью активна; эффективный коэффициент Хилла одноклеточного ответа составил не менее 35, тогда как в экстрактах коэффициент Хилла каскада составлял 4–5. В ооцитах с циклогексимидом, где Mos не синтезируется, MAPK активировали введённым белком Mos, и ответ отдельного ооцита становился постепенным (Ferrell 1999).Xiong и Ferrell (2003) показали память переключателя: временный стимул вызывал устойчивый ответ, сохранявшийся после удаления прогестерона, а при блокаде положительной связи ответ становился временным.На схеме — учебная модель: выход A способствует собственному образованию через нелинейный член и распадается с постоянной скоростью. Повышайте и снижайте стимул при разной силе петли и сравните пути. В этой модели после удаления члена положительной связи остаётся один устойчивый ответ. Это свойство выбранной модели: в каскаде MAPK бистабильность может возникать и без нарисованной внешней петли — из многосайтового фосфорилирования при насыщении и конкуренции форм субстрата (Markevich 2004).Типичная ошибка Крутой ответ отдельной клетки сам по себе доказывает бистабильность.Крутой ответ доказывает сверхчувствительность. Для бистабильности нужно показать два устойчивых состояния при одном стимуле: зависимость от предыстории и гистерезис.Что необходимо, чтобы система с положительной обратной связью стала бистабильной?А. Достаточно одной положительной петли (неверный вариант)Петля с пологой зависимостью только ускоряет нарастание ответа; переключателя не возникает.Б. Положительная петля вместе с достаточной нелинейностью (верный вариант)Только сочетание петли и крутой зависимости даёт два устойчивых состояния при одном стимуле.В. Сильная отрицательная обратная связь (неверный вариант)Отрицательная связь стабилизирует единственное состояние или даёт колебания, но не создаёт двух устойчивых состояний.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаFerrell JE et al. 1998. The biochemical basis of an all-or-none cell fate switch in Xenopus oocytes. ScienceFerrell JE 1999. Building a cellular switch: more lessons from a good egg. BioessaysXiong W et al. 2003. A positive-feedback-based bistable 'memory module' that governs a cell fate decision. NatureHuang CY et al. 1996. Ultrasensitivity in the mitogen-activated protein kinase cascade. Proc Natl Acad Sci U S AMarkevich NI et al. 2004. Signaling switches and bistability arising from multisite phosphorylation in protein kinase cascades. J Cell BiolОоциты Xenopus laevis: nH ≥ 35 (Ferrell и Machleder 1998, аннотация; в обзоре Ferrell 1999 — ≥ 42; там же — эксперимент с циклогексимидом и введённым белком Mos), память ответа (Xiong и Ferrell 2003, аннотация и подписи к рисункам). Схема — учебная модель: dA/dt = s + k₁·A⁴/(K⁴ + A⁴) − A, параметры условные.
Обратные связи · шаг 17 из 26Как доказать бистабильность и чем гистерезис отличается от необратимостиБистабильность доказывают тремя наблюдениями: бимодальным распределением ответов, зависимостью от предыстории и гистерезисом. Гистерезис — разные пороги включения и выключения; он не означает, что обратный переход невозможен.Бимодальное распределение: при одном промежуточном стимуле клетки распределяются по двум крайним состояниям, а не на промежуточных уровнях.Зависимость от предыстории: клетка, получившая промежуточный стимул после более высокого, находится в другом состоянии, чем клетка, получившая его после более низкого.Гистерезис: выключение происходит при более низком стимуле, чем включение; необратимость означает, что возврат невозможен при любом стимуле.По плавной кривой «доза — ответ» в популяции нельзя судить о том, как отвечает отдельная клетка. У ооцитов Xenopus среднее по лизату росло плавно, а каждый ооцит был либо в низком, либо в высоком состоянии: промежуточное среднее складывалось из смеси двух групп с разной чувствительностью. Это первое наблюдение — бимодальность.Бимодальность ещё не доказывает бистабильность: её может дать и крутой ответ при разной чувствительности клеток. Нужно второе наблюдение — зависимость от предыстории: при одном и том же стимуле клетка, ранее приведённая в высокое состояние, остаётся в нём, а клетка, получившая стимул «с нуля», остаётся в низком состоянии. Третье — гистерезис: при снижении стимула клетка выключается при более низком значении, чем включилась.Гистерезис не тождествен необратимости. При слабой петле обратный переход возможен — он лишь требует более низкого входа. Необратимость означает, что возврата нет при любом снижении стимула; в модели так ведёт себя сильная петля. В клетке необратимость созревания ооцита обеспечивают и нижележащие события клеточного цикла, которые нужно проверять отдельно.Во многих процессах с двумя исходами — делении, апоптозе, дифференцировке — бистабильность препятствует установлению промежуточных состояний и делает выбранное состояние устойчивым к кратковременным колебаниям стимула.Типичная ошибка Гистерезис означает, что после переключения система уже никогда не вернётся назад.При гистерезисе обратный переход возможен, но при более низком стимуле, чем прямой. Необратимость — особый случай, её нужно проверять отдельно.При промежуточном стимуле в популяции одни клетки полностью активны, другие нет. Что ещё нужно показать, чтобы говорить о бистабильности?А. Ничего: бимодальность уже доказывает бистабильность (неверный вариант)Бимодальность возможна и при крутом ответе клеток с разной чувствительностью; нужны зависимость от предыстории и гистерезис.Б. Что ответ необратим при любом снижении стимула (неверный вариант)Необратимость не обязательна: бистабильная система может вернуться при более низком стимуле.В. Зависимость от предыстории и гистерезис при снижении стимула (верный вариант)Эти два наблюдения вместе с бимодальностью показывают два устойчивых состояния при одном стимуле.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаFerrell JE et al. 1998. The biochemical basis of an all-or-none cell fate switch in Xenopus oocytes. ScienceXiong W et al. 2003. A positive-feedback-based bistable 'memory module' that governs a cell fate decision. NatureПризнаки бистабильности и пример ооцита — Ferrell и Machleder (1998), Xiong и Ferrell (2003). Таблица — схема наблюдений, не данные эксперимента.
Обратные связи · шаг 18 из 26Чем различаются точная адаптация, десенситизация и возбудимостьПри постоянном входе система может вернуться к исходному выходу, снизить чувствительность входа или дать один всплеск. Это разные режимы, и их обеспечивают разные схемы связей в сети.Точная адаптация: выход возвращается к исходному уровню при сохраняющемся входе; в хемотаксисе E. coli её обеспечивает метилирование хеморецепторов.Десенситизация рецептора: GRK фосфорилирует рецептор, β-аррестин блокирует взаимодействие рецептора с G-белком, и чувствительность входа снижается.Возбудимость: надпороговый стимул вызывает один всплеск с возвратом к покою; при автоколебаниях система при постоянных условиях повторяет циклы без периодического внешнего воздействия.Слово «адаптация» в разговорной речи означает любое ослабление ответа. В теории сетей точная адаптация — возврат выхода к прежнему уровню при том, что вход остаётся повышенным. Классический пример — хемотаксис кишечной палочки. Аттрактант подавляет киназу CheA, частота кувырканий падает, и бактерия плывёт дальше; затем метилтрансфераза CheR и метилэстераза CheB, активируемая CheA, меняют метилирование рецепторов и возвращают активность CheA к прежнему уровню.Barkai и Leibler (1997) показали в модели, а Alon и соавт. (1999) в эксперименте, что точность такого возврата определяется устройством сети и сохраняется при изменении концентраций белков сети; меняется скорость адаптации, но не её точность. Yi и соавт. (2000) показали, что это устройство работает как интегральная обратная связь. Точная адаптация возможна и при других схемах: перебрав все трёхузловые ферментные сети, Ma и соавт. (2009) нашли два основных класса — отрицательную обратную связь с буферным узлом, работающую как интегральная, и некогерентную прямую связь с пропорциональным узлом. Это результат для исследованного класса моделей, а не исчерпывающий список схем любой биологической сети.Десенситизация рецептора, сопряжённого с G-белком, — другой механизм: при длительной стимуляции тот же рецептор передаёт сигнал хуже. Снижается чувствительность входа, а возврат выхода целой сети к исходному уровню не гарантирован. Примером служит снижение действия β2-агонистов при частом применении.Возбудимая система имеет одно устойчивое состояние покоя: надпороговый стимул вызывает один всплеск, после которого система сама возвращается к покою. В режиме автоколебаний при постоянных условиях (в том числе при постоянном стимуле) система повторяет циклы без периодического внешнего воздействия, а её стационарное состояние неустойчиво. Один пик после стимула не позволяет различить эти режимы: нужна длительная регистрация отдельных клеток.Типичная ошибка Точная адаптация и десенситизация рецептора — одно и то же: ответ ослабевает при постоянном стимуле.Десенситизация снижает чувствительность одного рецептора. Точная адаптация возвращает выход всей сети к исходному уровню при сохраняющемся входе; в хемотаксисе E. coli её обеспечивает интегральная отрицательная обратная связь, а в других сетях возможны и иные схемы, например некогерентная прямая связь.Аттрактант остаётся в среде, а частота кувырканий E. coli вернулась к исходной. Как называется такое поведение?А. Точная адаптация (верный вариант)Выход сети вернулся к прежнему уровню при сохраняющемся входе: баланс метилирования рецепторов (CheR) и деметилирования (CheB) компенсирует действие аттрактанта.Б. Десенситизация одного рецептора (неверный вариант)Десенситизация снижает чувствительность входа и не гарантирует возврата выхода к исходному уровню.В. Возбудимость: один всплеск ответа (неверный вариант)Возбудимость описывает всплеск после надпорогового стимула, а здесь речь о возврате выхода при постоянном входе.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаBarkai N et al. 1997. Robustness in simple biochemical networks. NatureAlon U et al. 1999. Robustness in bacterial chemotaxis. NatureTyson JJ et al. 2003. Sniffers, buzzers, toggles and blinkers: dynamics of regulatory and signaling pathways in the cell. Curr Opin Cell BiolMa W. et al. 2009. Defining network topologies that can achieve biochemical adaptation. CellYi T. M. et al. 2000. Robust perfect adaptation in bacterial chemotaxis through integral feedback control. Proc Natl Acad Sci USAХемотаксис E. coli — Barkai и Leibler (1997), Alon и соавт. (1999); режимы сетей — Tyson и соавт. (2003). Таблица — схема, не данные эксперимента.
Сеть инсулина · шаг 19 из 26Как инсулин активирует AKTPIP₃ не активирует AKT сам по себе: он собирает на мембране AKT и две киназы, которые её фосфорилируют. Для полной активности AKT нужны два фосфорилирования разными киназами.Рецептор инсулина фосфорилирует IRS1/IRS2; фосфотирозины IRS связывают p85, и PI3K превращает PIP₂ в PIP₃.PIP₃ связывает PH-домены AKT, PDK1 и SIN1 (субъединица mTORC2); связывание с PIP₃ снимает аутоингибирование AKT.PDK1 фосфорилирует T308, mTORC2 — S473 (у AKT1); вместе они полностью активируют AKT.Инсулин связывается с рецептором — тирозинкиназой — и вызывает фосфорилирование его внутриклеточных доменов. Активный рецептор фосфорилирует адаптеры IRS1 и IRS2. Их фосфотирозины связывают регуляторную субъединицу p85 PI3K класса IA, и каталитическая p110 переносится к мембране, где превращает PIP₂ в PIP₃. Через GRB2 и SOS IRS может запускать и путь RAS–ERK, разобранный в вопросах 1–3.PIP₃ служит местом сборки сигнального комплекса. Он связывает PH-домены AKT, PDK1 и SIN1 в составе mTORC2. Связывание AKT с PIP₃ снимает аутоингибирование: PH-домен перестаёт закрывать каталитический центр. Затем PDK1 фосфорилирует активационную петлю (T308 у AKT1, T309 у AKT2), а mTORC2 — гидрофобный мотив (S473 у AKT1, S474 у AKT2).В печени и мышцах преобладает AKT2, поэтому номера сайтов нужно указывать вместе с изоформой. PTEN уменьшает содержание PIP₃, отщепляя 3-фосфат. SHIP1/2 превращают PIP₃ в PI(3,4)P₂ и тем самым меняют липидный состав мембраны, локализацию и динамику сигнала. PI(3,4)P₂ тоже связывает PH-домен AKT и может поддерживать её привлечение к мембране и активацию: в фибробластах NIH 3T3 PI(3,4)P₂, образованный SHIP2, активировал прежде всего AKT2 на плазматической мембране и ранних эндосомах (Liu 2018). Поэтому действие SHIP зависит от условий и не сводится к выключению сигнала.Фосфорилирование AKT — не то же самое, что её активность: степень фосфорилирования отражает баланс активности киназ и фосфатаз. Активность проверяют по фосфорилированию субстратов, например PRAS40 по T246.Типичная ошибка PIP₃ сам активирует AKT, поэтому появление PIP₃ равнозначно полной активации.PIP₃ собирает AKT, PDK1 и mTORC2 на мембране. Полная активность требует двух фосфорилирований — T308 (PDK1) и S473 (mTORC2).В клетке образуется PIP₃, но mTORC2 неактивен. Каким будет состояние AKT после добавления инсулина?А. AKT полностью активна: PIP₃ достаточно (неверный вариант)PIP₃ лишь собирает AKT и её киназы на мембране; без фосфорилирования S473 активация неполная.Б. AKT активирована частично: есть T308, нет S473 (верный вариант)PDK1 фосфорилирует T308 и частично активирует AKT; полную активность даёт фосфорилирование S473 комплексом mTORC2.В. AKT не привлекается к мембране (неверный вариант)Привлечение к мембране зависит от PIP₃ и PH-домена AKT, а не от mTORC2.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаBurchfield JG et al. 2025. The insulin signalling network. Nat MetabManning BD et al. 2017. AKT/PKB Signaling: Navigating the Network. CellMadsen RR et al. 2023. PI3K signaling through a biochemical systems lens. J Biol ChemLiu S. L. et al. 2018. Quantitative lipid imaging reveals a new signaling function of phosphatidylinositol-3,4-bisphophate: isoform- and site-specific activation of Akt. Mol CellПо обзорам Burchfield и соавт. (2025), Manning и Toker (2017; полный текст) и Madsen и Toker (2023). Нумерация сайтов — AKT1 и AKT2 человека. Схема — механизм, не данные эксперимента.
Сеть инсулина · шаг 20 из 26Как AKT распределяет сигнал по ветвямAKT фосфорилирует более ста субстратов; в печени важнее всего ветви mTORC1, FOXO1 и GSK3, а в мышцах и жировой ткани — ещё и TBC1D4 (перенос GLUT4). Через TSC2, GSK3 и TBC1D4 AKT снимает торможение соответствующих процессов, а в ветви FOXO1 подавляет активатор транскрипции, и экспрессия генов глюконеогенеза снижается.AKT фосфорилирует TSC2 и ослабляет его GAP-активность: RHEB-GTP накапливается и активирует mTORC1.AKT фосфорилирует FOXO1; он связывается с 14-3-3 и выходит из ядра — экспрессия генов глюконеогенеза PEPCK и G6PC снижается.AKT фосфорилирует GSK3 и TBC1D4: растормаживаются синтез гликогена и (в мышцах и жировой ткани) перенос GLUT4 к мембране.Сигнал AKT расходится по ветвям с разной кинетикой. Первая ведёт к mTORC1: TSC2 — GAP для RHEB, и, пока он активен, RHEB остаётся в GDP-форме. AKT фосфорилирует TSC2 (S939, T1462 у человека) и PRAS40 (T246), ослабляя торможение со стороны обоих белков; RHEB-GTP активирует mTORC1, при условии, что аминокислоты привлекли комплекс к лизосоме.Вторая ветвь — FOXO1. Нефосфорилированный FOXO1 в ядре вместе с другими факторами активирует гены глюконеогенеза. AKT фосфорилирует его (T24, S256 у человека), FOXO1 связывается с белками 14-3-3 и выводится из ядра. В гепатоцитах крысы инсулин снижал содержание мРНК PEPCK примерно на 95 % (Li 2010).Третья — GSK3: без инсулина она фосфорилирует и ингибирует гликогенсинтазу; AKT фосфорилирует GSK3 (S21 у α, S9 у β) и снимает это торможение. Четвёртая — TBC1D4 (AS160), GAP для малых ГТФаз Rab в мышцах и жировой ткани: после фосфорилирования под действием AKT активность TBC1D4 снижается, и пузырьки с GLUT4 переносятся к плазматической мембране.В ветвях TSC2, GSK3 и TBC1D4 действует снятие торможения: AKT подавляет белок, ограничивающий соответствующий процесс. Ветвь FOXO1 устроена иначе: FOXO1 активирует транскрипцию генов глюконеогенеза, поэтому его подавление снижает их экспрессию. Так один сигнал одновременно стимулирует синтез белка, липидов и гликогена и подавляет глюконеогенез.Типичная ошибка AKT напрямую активирует каждый процесс, которым управляет инсулин.AKT действует через свои субстраты: подавление TSC2, GSK3 и TBC1D4 снимает торможение соответствующих процессов, а подавление активатора FOXO1 снижает экспрессию генов глюконеогенеза.Почему фосфорилирование FOXO1 под действием AKT снижает экспрессию PEPCK?А. Фосфорилированный FOXO1 выводится из ядра (верный вариант)FOXO1 после фосфорилирования связывается с 14-3-3 и покидает ядро, поэтому перестаёт активировать гены глюконеогенеза.Б. Фосфорилированный FOXO1 становится репрессором PEPCK (неверный вариант)Фосфорилирование не превращает FOXO1 в репрессор; оно убирает активатор из ядра.В. AKT фосфорилирует сам ген PEPCK (неверный вариант)Киназы фосфорилируют белки, а не гены; AKT действует через транскрипционный фактор FOXO1.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаManning BD et al. 2017. AKT/PKB Signaling: Navigating the Network. CellBurchfield JG et al. 2025. The insulin signalling network. Nat MetabLi S et al. 2010. Bifurcation of insulin signaling pathway in rat liver: mTORC1 required for stimulation of lipogenesis, but not inhibition of gluconeogenesis. Proc Natl Acad Sci U S AСайты — Manning и Toker (2017, полный текст), нумерация человека; снижение мРНК PEPCK — гепатоциты крысы (Li 2010, аннотация). Столбики — учебная модель практикума (вопрос 4), величины условные.
Сеть инсулина · шаг 21 из 26Как AKT и AMPK вместе регулируют mTORC1mTORC1 — точка сходимости противоположных входов: инсулиновый сигнал через AKT его активирует, дефицит энергии через AMPK подавляет. AMPK тормозит mTORC1 даже при высоком инсулине, а AKT, в свою очередь, ослабляет активацию AMPK.AKT фосфорилирует TSC2 и ослабляет его; AMPK фосфорилирует другие сайты TSC2 (T1227 и S1345 у крысы; у человека T1271 и S1387) и усиливает его.AMPK фосфорилирует Raptor (S722, S792), к нему присоединяется 14-3-3, и mTORC1 подавляется независимо от TSC2.AKT фосфорилирует α1-субъединицу AMPK по S487 (у человека) и ослабляет фосфорилирование T172 киназой LKB1.mTORC1 активен на лизосоме при двух условиях одновременно: аминокислоты через Rag-ГТФазы привлекают комплекс к лизосоме, а RHEB-GTP его активирует. Инсулиновый сигнал обеспечивает второе условие: AKT подавляет TSC2, и RHEB накапливается в GTP-форме. Подробно это разобрано в семинаре 7.AMPK активируется при дефиците энергии. Inoki и соавт. (2003) показали, что при энергетическом стрессе AMPK фосфорилирует TSC2 по T1227 и S1345 (нумерация белка крысы; у человека — T1271 и S1387) и усиливает его действие на RHEB — в противоположность AKT. Gwinn и соавт. (2008) нашли второй путь: AMPK фосфорилирует Raptor по S722 и S792, с ним связывается 14-3-3, и mTORC1 подавляется даже в клетках без TSC2. Поэтому при дефиците энергии синтез белка и липидов тормозится и при высоком инсулине.Регуляция действует и в обратном направлении. AKT фосфорилирует α1-субъединицу AMPK по S487 (S485 у крысы) в участке ST-петли, и LKB1 хуже фосфорилирует T172 (Hawley 2014). α2-субъединица почти не фосфорилируется AKT: соответствующий сайт S491 фосфорилируется самой AMPK.Состояние mTORC1 отражает баланс входов. Одна из ветвей AKT — FOXO1 — от AMPK этим путём не зависит, поэтому дефицит энергии может подавить синтез, не возвращая FOXO1 в ядро.Типичная ошибка AMPK подавляет инсулиновый сигнал на уровне рецептора, поэтому при её активации выключаются все ветви AKT.AMPK тормозит прежде всего mTORC1 — через TSC2 и Raptor. AKT остаётся фосфорилированной, и её другие ветви, например FOXO1, продолжают отвечать.К гепатоцитам добавили инсулин, затем возник дефицит энергии, и AMPK активировалась. Как изменятся p-S6K и локализация FOXO1 в модели?А. p-S6K снизится, FOXO1 перейдёт в ядро (неверный вариант)AMPK подавляет mTORC1, но не AKT; FOXO1 по-прежнему фосфорилирован и остаётся в цитоплазме.Б. p-S6K снизится, FOXO1 останется в цитоплазме (верный вариант)AMPK через TSC2 и Raptor подавляет mTORC1 и S6K; ветвь FOXO1 зависит от AKT, а та фосфорилирована.В. p-S6K не изменится: инсулин перевешивает (неверный вариант)AMPK тормозит mTORC1 и при высоком инсулине: фосфорилирование Raptor действует независимо от TSC2.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаInoki K et al. 2003. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. CellGwinn DM et al. 2008. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol CellHawley SA et al. 2014. Phosphorylation by Akt within the ST loop of AMPK-α1 down-regulates its activation in tumour cells. Biochem JGoul C et al. 2023. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell BiolСайты TSC2 — Inoki и соавт. (2003; конструкция TSC2 крысы), Raptor — Gwinn и соавт. (2008), аннотации и базы OMIM/Reactome; AKT → AMPKα1 S487 — Hawley и соавт. (2014, полный текст). Схема — механизм, не данные эксперимента; ответ клеток без TSC2 — Gwinn и соавт. (2008).
Сеть инсулина · шаг 22 из 26Какие обратные связи ограничивают вход инсулиновой сетиS6K фосфорилирует IRS1 по серинам и ослабляет его связь с PI3K — отрицательная обратная связь от mTORC1 к входу сети. Знак эффекта отдельного сайта зависит от системы: в культуре и в организме он может быть разным.Активная S6K1 фосфорилирует IRS1 по серину; IRS1 хуже связывает PI3K, и сигнал к AKT ослабевает.Рапамицин подавляет mTORC1 и S6K; петля ослабевает, и p-AKT повышается. Так бывает при кратком действии; длительный рапамицин в ряде клеток нарушает сборку mTORC2 и снижает p-AKT (Sarbassov 2006).На уровне организма тоже есть петли: ингибитор PI3Kα вызывает гипергликемию, а компенсаторное повышение концентрации инсулина вновь активирует PI3K в опухоли.Tremblay и Marette (2001) показали на мышечных клетках L6, что избыток аминокислот за час снижал стимулированный инсулином транспорт глюкозы почти вдвое; рапамицин это предотвращал. Аминокислоты через mTOR и S6K усиливали фосфорилирование IRS1 по серину и треонину и уменьшали его связь с p85. Harrington и соавт. (2004) нашли ту же петлю в клетках без TSC: постоянно активная S6K фосфорилировала IRS1 (S302 у мыши), и AKT активировалась слабо. Мыши без S6K1 на высокожировой диете сохраняли чувствительность к инсулину, хотя глюкоза и свободные жирные кислоты у них повышались (Um 2004). В адипоцитах 3T3-L1, впрочем, чувствительная к рапамицину петля, ограничивающая фосфорилирование AKT, по-видимому, идёт не через IRS1 (Tan 2012).Но переносить вывод о роли одного сайта на целый организм нужно с осторожностью. Мыши, у которых Ser307 в IRS1 (Ser312 у человека) заменён на аланин, на высокожировой диете развивали более тяжёлую, а не более лёгкую инсулинорезистентность (Copps 2010). В краткосрочных экспериментах на культуре клеток фосфорилирование этого сайта ослабляет сигнал, а в длительных экспериментах на целом организме его роль иная. IRS1 тормозят несколько частично избыточных петель, и удаление одной перераспределяет вклад остальных.Обратные связи действуют и между органами. Ингибиторы PI3Kα подавляют ответ на инсулин в мышцах, жире и печени и вызывают гипергликемию в первые часы. Поджелудочная железа отвечает выбросом инсулина, который вновь активирует PI3K в опухоли. В моделях на мышах кетогенная диета и ингибиторы SGLT2 снижали этот выброс и усиливали действие препарата (Hopkins 2018).Наличие фосфорилированного «тормозящего» сайта само по себе не доказывает инсулинорезистентность: нужна проверка причинной связи.Типичная ошибка Фосфорилирование IRS1 по Ser307 всегда вызывает инсулинорезистентность.В культуре клеток это фосфорилирование связано с ослаблением сигнала, но у мышей с заменой Ser307 резистентность была тяжелее. Знак эффекта зависит от системы и длительности.В модели гепатоцита (стационарный расчёт, mTORC2 сохранён) при умеренном инсулине добавили рапамицин. Как изменится p-AKT?А. Повысится: ослабнет петля S6K → IRS1 (верный вариант)Рапамицин подавляет S6K, IRS1 меньше фосфорилируется по серину и лучше передаёт сигнал к PI3K и AKT.Б. Снизится: рапамицин подавляет AKT (неверный вариант)Рапамицин действует на mTORC1, ниже AKT; AKT при этом не подавляется.В. Не изменится: петли нет (неверный вариант)Отрицательная петля S6K → IRS1 показана в клетках разных типов; в модели её ослабление повышает p-AKT. При длительном действии рапамицин в ряде клеток нарушает сборку mTORC2 и снижает p-AKT (Sarbassov 2006) — этого модель не учитывает.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаTremblay F et al. 2001. Amino acid and insulin signaling via the mTOR/p70 S6 kinase pathway. A negative feedback mechanism leading to insulin resistance in skeletal muscle cells. J Biol ChemHarrington LS et al. 2004. The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K signaling via regulation of IRS proteins. J Cell BiolUm SH et al. 2004. Absence of S6K1 protects against age- and diet-induced obesity while enhancing insulin sensitivity. NatureCopps KD et al. 2010. Irs1 serine 307 promotes insulin sensitivity in mice. Cell MetabHopkins BD et al. 2018. Suppression of insulin feedback enhances the efficacy of PI3K inhibitors. NatureTan SX et al. 2012. Amplification and demultiplexing in insulin-regulated Akt protein kinase pathway in adipocytes. J Biol ChemSarbassov DD et al. 2006. Prolonged rapamycin treatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB. Mol CellL6 (Tremblay и Marette 2001), клетки без TSC (Harrington 2004, полный текст), мыши без S6K1 (Um 2004), мыши Irs1 S307A (Copps 2010), ингибиторы PI3K в моделях на мышах (Hopkins 2018, полный текст). Столбики — учебная модель практикума (вопрос 4).
Сеть инсулина · шаг 23 из 26Что такое селективная инсулинорезистентность печениПри селективной резистентности инсулин плохо подавляет глюконеогенез, но продолжает стимулировать липогенез. Это рассогласование ветвей одной сети, а не равномерное ослабление сигнала.У мышей ob/ob — модели диабета 2 типа — печень продолжает выделять глюкозу при высоком инсулине, а SREBP-1c и липогенез сохранены или усилены.У мышей LIRKO (нет рецептора инсулина в гепатоцитах) не отвечает ни одна ветвь: SREBP-1c снижен, гипертриглицеридемии нет.Ветви расходятся ниже AKT: в гепатоците подавление генов глюконеогенеза идёт через FOXO1, липогенез — через mTORC1 и SREBP-1c.При диабете 2 типа резистентность печени к инсулину неполная: ветви инсулинового сигнала затронуты по-разному. Инсулин хуже подавляет глюконеогенез, и печень выделяет глюкозу при высокой концентрации гормона. Но липогенез через SREBP-1c сохраняется или усиливается. В итоге гипергликемия сочетается с гипертриглицеридемией — эту картину Brown и Goldstein (2008) назвали селективной (избирательной) инсулинорезистентностью.Shimomura и соавт. (2000) нашли в печени мышей ob/ob и мышей с липодистрофией сниженную экспрессию IRS-2 при сохранённой способности инсулина стимулировать SREBP-1c. Полное выключение рецептора даёт иную картину: у мышей LIRKO печень не отвечает на инсулин, возникает проатерогенный профиль липопротеинов, но SREBP-1c и секреция триглицеридов печенью снижены (Biddinger 2008). Это разные типы нарушения сети, а не точки одного градиента.Почему одна ветвь страдает, а другая нет, до конца не установлено. Ветви расходятся ниже AKT и используют разных посредников (FOXO1 и mTORC1). По данным Titchenell и соавт. (2016), подавление продукции глюкозы печенью в значительной мере зависит от того, как инсулин подавляет липолиз в жировой ткани, тогда как липогенез требует сигнала в самом гепатоците.В модели практикума рассогласование задано так: ветви AKT различаются чувствительностью, и при сниженном IRS-2 и высоком инсулине сигнала хватает для mTORC1, но не для FOXO1. Это учебное допущение, а не установленный механизм: в адипоцитах 3T3-L1 фосфорилирование FOXO1, напротив, чувствительнее к инсулину, чем фосфорилирование TSC2 и AS160 (Tan 2012). Данные Titchenell и соавт. (2016) указывают на другое объяснение: сигнал в гепатоците сохранён и поддерживает липогенез, а продукцию глюкозы печенью не подавляет избыток жирных кислот, поступающих из жировой ткани. И ещё одно ограничение: модель и эксперименты с мРНК сравнивают маркеры ветвей (мРНК PEPCK, мРНК и ядерный белок SREBP-1c), а не скорости глюконеогенеза и липогенеза; продукция глюкозы печенью включает и гликогенолиз.Типичная ошибка При инсулинорезистентности все действия инсулина в печени ослаблены одинаково.При селективной резистентности подавление глюконеогенеза ослаблено, а липогенез сохранён. Полная потеря рецептора (LIRKO) даёт иной фенотип.Чем селективная инсулинорезистентность печени отличается от полной потери рецептора (LIRKO)?А. Липогенез сохранён, а глюконеогенез не подавляется (верный вариант)При селективной резистентности нарушено подавление продукции глюкозы при сохранённом липогенном ответе; при LIRKO не отвечает ни одна ветвь. В модели практикума это различие задано разной чувствительностью ветвей, но в организме сам фенотип не устанавливает, что нарушено именно фосфорилирование FOXO1.Б. Глюконеогенез подавлен, а липогенез нарушен (неверный вариант)Это обратная картина. При селективной резистентности печень продолжает выделять глюкозу и синтезировать липиды.В. Ничем: при обоих состояниях нет ответа ни одной ветви (неверный вариант)При селективной резистентности липогенная ветвь отвечает на инсулин; этим и различаются фенотипы.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаBrown MS et al. 2008. Selective versus total insulin resistance: a pathogenic paradox. Cell MetabShimomura I et al. 2000. Decreased IRS-2 and increased SREBP-1c lead to mixed insulin resistance and sensitivity in livers of lipodystrophic and ob/ob mice. Mol CellBiddinger SB et al. 2008. Hepatic insulin resistance is sufficient to produce dyslipidemia and susceptibility to atherosclerosis. Cell MetabTitchenell PM et al. 2016. Direct hepatocyte insulin signaling is required for lipogenesis but is dispensable for the suppression of glucose production. Cell MetabTan SX et al. 2012. Amplification and demultiplexing in insulin-regulated Akt protein kinase pathway in adipocytes. J Biol ChemМыши ob/ob и с липодистрофией (Shimomura 2000), LIRKO (Biddinger 2008), понятие селективной резистентности (Brown и Goldstein 2008), вклад жировой ткани (Titchenell 2016, полный текст), чувствительность субстратов AKT в адипоцитах (Tan 2012, полный текст). Столбики — учебная модель практикума (вопрос 4п); допущение о разной чувствительности ветвей — учебное.
Сеть инсулина · шаг 24 из 26Как проверяют, где расходятся ветви сетиТочку разветвления находят с помощью воздействий, которые выключают одну ветвь и оставляют другую. Рапамицин блокирует индукцию мРНК SREBP-1c, но не подавление мРНК PEPCK; ингибиторы PI3K и AKT блокируют обе.В гепатоцитах крысы рапамицин блокировал индукцию мРНК SREBP-1c инсулином, но не мешал снижению мРНК PEPCK (Li 2010).Ингибиторы PI3K и AKT блокировали обе ветви — значит, они расходятся ниже AKT.Резерв сети: умеренное ослабление ранних узлов — числа рецепторов или фосфорилирования AKT — не обязательно меняет выход.Li, Brown и Goldstein (2010) добавляли инсулин к свежевыделенным гепатоцитам крысы: мРНК SREBP-1c возрастала примерно в 25 раз, мРНК PEPCK снижалась примерно на 95 %. Ингибиторы PI3K и AKT блокировали оба ответа. Рапамицин в субнаномолярной концентрации блокировал индукцию мРНК SREBP-1c, но не подавление PEPCK; тот же результат получен у крыс и мышей при кормлении после голодания. Ингибитор S6K индукцию мРНК SREBP-1c не блокировал.Отсюда вывод: ветви расходятся ниже AKT, на уровне mTORC1, а индукция мРНК SREBP-1c использует мишень mTORC1, отличную от S6K. Это относится к измеренной величине — мРНК. Owen и соавт. (2012) на гепатоцитах трансгенных крыс, у которых SREBP-1c синтезируется под постоянным промотором, отдельно изучили протеолитическое созревание белка: оно тоже требует mTORC1, но, в отличие от индукции мРНК, блокируется ингибитором S6K. Значит, после mTORC1 липогенная ветвь сама разветвляется. Именно на уровне mTORC1 возможно рассогласование ветвей при селективной резистентности.Интерпретируя измерения, нужно учитывать резерв сети. В адипоцитах крупных тучных крыс число рецепторов инсулина было снижено на 30–40 %, но это лишь сдвигало кривую «доза — ответ» вправо, а максимальный транспорт глюкозы не менялся (Olefsky 1976). В адипоцитах 3T3-L1 подавление фосфорилирования AKT примерно на 85 % лишь немного снижало фосфорилирование её субстратов (Tan 2012). Поэтому умеренное изменение раннего узла не обязательно объясняет изменение физиологического ответа.Наконец, фосфорилирование не тождественно активности: вывод о ветви делают по её выходу — фосфорилированию субстрата, локализации фактора, экспрессии гена-мишени.Типичная ошибка Если в печени снижено фосфорилирование AKT, то обязательно и пропорционально ослаблены все её действия.У сети есть резерв: умеренное снижение p-AKT может почти не менять фосфорилирование субстратов, а ветви ниже AKT регулируются по-разному.Рапамицин блокирует индукцию мРНК SREBP-1c инсулином, но не подавление мРНК PEPCK, а ингибитор AKT блокирует оба ответа. Где расходятся эти ветви?А. Выше PI3K, на уровне рецептора (неверный вариант)Ингибиторы PI3K и AKT блокируют обе ветви, значит, до AKT они общие.Б. Ниже AKT: индукция мРНК SREBP-1c требует mTORC1 (верный вариант)Оба ответа зависят от AKT, а рапамицин выключает только индукцию мРНК SREBP-1c: разветвление ниже AKT, на уровне mTORC1.В. На уровне S6K (неверный вариант)Ингибитор S6K не блокировал индукцию мРНК SREBP-1c (Li 2010). S6K нужна для другого этапа — созревания белка SREBP-1c (Owen 2012).Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаLi S et al. 2010. Bifurcation of insulin signaling pathway in rat liver: mTORC1 required for stimulation of lipogenesis, but not inhibition of gluconeogenesis. Proc Natl Acad Sci U S AOwen JL et al. 2012. Insulin stimulation of SREBP-1c processing in transgenic rat hepatocytes requires p70 S6-kinase. Proc Natl Acad Sci U S AOlefsky JM 1976. The effects of spontaneous obesity on insulin binding, glucose transport, and glucose oxidation of isolated rat adipocytes. J Clin InvestTan SX et al. 2012. Amplification and demultiplexing in insulin-regulated Akt protein kinase pathway in adipocytes. J Biol ChemBurchfield JG et al. 2025. The insulin signalling network. Nat MetabTitchenell PM et al. 2016. Direct hepatocyte insulin signaling is required for lipogenesis but is dispensable for the suppression of glucose production. Cell MetabГепатоциты крысы (Li 2010, аннотация: 25 раз, 95 %, субнаномолярный рапамицин; измерялась мРНК); созревание SREBP-1c — гепатоциты трансгенных крыс (Owen 2012, аннотация); резерв сети — адипоциты (Olefsky 1976, аннотация), адипоциты 3T3-L1 (Tan 2012, полный текст) и обзор Burchfield и соавт. (2025); роль жировой ткани — Titchenell и соавт. (2016). Таблица — схема экспериментов.
Исследование · шаг 25 из 26Как выбрать измеряемую величину, метод и контрольКаждый вопрос семинара требует своей величины: крутизна — кривой доз, длительность — серии точек времени, переключатель — ответа отдельных клеток, ветвление — выходов разных ветвей. Метод выбирают по величине, а контроль — по тому, какое другое объяснение нужно исключить.Оптогенетический вход задаёт профиль сигнала в обход рецептора и позволяет установить, на какой профиль сигнала отвечает нижележащий процесс.Измерение отдельных ооцитов отличает переключатель «всё или ничего» от плавного ответа, который возникает при усреднении.Тканеспецифический нокаут (система Cre–loxP) выключает ген в одном типе клеток и позволяет отличить прямое действие от действия через другие органы.Оптогенетика позволяет экспериментатору задавать входной сигнал. В экспериментах Toettcher и соавт. (2013) на мембране закрепили фоторецептор PhyB, а каталитический домен SOS соединили с белком PIF. Красный свет переводит PhyB в форму, связывающую PIF, и SOS переходит к мембране, где активирует RAS; дальний красный свет возвращает его в цитоплазму. Так можно подать на RAS импульс заданной длительности, не меняя рецепторы и их петли. Контроль — тот же свет в клетках без конструкции.Переключатель проверяют по отдельным клеткам. Ferrell и Machleder (1998) измеряли активацию MAPK в каждом ооците лягушки отдельно. При промежуточной дозе прогестерона часть ооцитов была полностью активна, остальные — неактивны, а среднее по популяции выглядело плавным. Ответ отдельного ооцита соответствовал эффективному коэффициенту Хилла не меньше 35. Петлю проверяли так: в ооцитах с циклогексимидом Mos не синтезируется, и MAPK активировали введённым белком Mos — ответ отдельного ооцита становился постепенным (Ferrell 1999).Действие гормона в одном органе проверяют тканеспецифическим нокаутом. Участок гена окружают сайтами loxP, а рекомбиназу Cre экспрессируют под контролем промотора, активного только в гепатоцитах, например промотором гена альбумина. Cre вырезает участок между сайтами, и белок исчезает только в печени. Так получены мыши LIRKO (Michael 2000) и мыши без AKT1/2 в печени (Titchenell 2016). Контроль — мыши с сайтами loxP, но без Cre.Одно воздействие показывает зависимость, но не доказывает её. Вывод надёжен, если его подтверждают два независимых способа — например, ингибитор и siRNA к тому же белку, — а результат не зависит от побочного действия каждого. В эксперименте Li и соавт. (2010) ингибиторы PI3K, AKT, mTORC1 и S6K вместе указали, где расходятся ветви.Два метода практикума измеряют то, что не видно на обычном блоте. Активный RAS выделяют из лизата доменом RAF, связывающим RAS (RBD), закреплённым на гранулах: он связывает только GTP-форму, и связавшийся RAS выявляют на блоте. Количество мРНК, например PEPCK, определяют методом ОТ-ПЦР: обратная транскриптаза переписывает мРНК в кДНК, которую затем умножают в ПЦР; чем больше исходной мРНК, тем раньше продукт достигает порога.Типичная ошибка Если среднее по популяции растёт плавно, то и каждая клетка отвечает плавно.Плавное среднее может складываться из ответов «всё или ничего» в отдельных клетках с разным порогом. Переключатель видно только при измерении отдельных клеток.Нужно проверить, работает ли ответ клеток как переключатель «всё или ничего». Какой эксперимент для этого подходит?А. Измерить ответ отдельных клеток при разных дозах (верный вариант)Только отдельные клетки показывают, есть ли два состояния; при промежуточной дозе часть клеток включена полностью, часть — нет.Б. Измерить лизат всей популяции при разных дозах (неверный вариант)Измерение в лизате усредняет ответ клеток: из ответов «всё или ничего» с разным порогом складывается плавная кривая.В. Добавить ингибитор MEK при одной дозе (неверный вариант)Ингибитор покажет зависимость ответа от MEK, но не форму ответа отдельной клетки.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаToettcher JE et al. 2013. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. CellFerrell JE et al. 1998. The biochemical basis of an all-or-none cell fate switch in Xenopus oocytes. ScienceFerrell JE 1999. Building a cellular switch: more lessons from a good egg. BioessaysMichael MD et al. 2000. Loss of insulin signaling in hepatocytes leads to severe insulin resistance and progressive hepatic dysfunction. Mol CellTitchenell PM et al. 2016. Direct hepatocyte insulin signaling is required for lipogenesis but is dispensable for the suppression of glucose production. Cell MetabLi S et al. 2010. Bifurcation of insulin signaling pathway in rat liver: mTORC1 required for stimulation of lipogenesis, but not inhibition of gluconeogenesis. Proc Natl Acad Sci U S ACopps KD et al. 2010. Irs1 serine 307 promotes insulin sensitivity in mice. Cell MetabОптогенетика — клетки NIH3T3 (Toettcher 2013, полный текст); ооциты Xenopus (Ferrell и Machleder 1998, аннотация и обзор Ferrell 1999); Cre–loxP в печени — Michael и соавт. (2000, аннотация) и Titchenell и соавт. (2016, полный текст); анализ ветвей — Li и соавт. (2010). Схемы показывают устройство методов, не результаты эксперимента.
Исследование · шаг 26 из 26Один каскад под действием ингибитора: четыре вопроса вместеОпухоль с BRAF V600E под действием препарата объединяет все четыре вопроса семинара: усиление, длительность, обратные связи и перекрёстная регуляция сетей. Успех лечения в модели определяет не минимум pERK в первый час, а то, сколько активности ERK остаётся за сутки.Усиление и резерв: остаточная активность RAF усиливается каскадом, а клеткам для деления хватает небольшой доли активной ERK.Длительность и обратная связь: вемурафениб снимает ERK-зависимое торможение, и через часы pERK частично восстанавливается.Перекрёстная регуляция сетей: при подавлении одного пути отвечают соседние — у ингибиторов PI3K это выброс инсулина, вновь активирующий PI3K в опухоли.Вопрос 1 — усиление. Каскад усиливает сигнал, поэтому даже небольшая остаточная активность RAF поддерживает заметную долю pERK. Albeck и соавт. (2013) показали в эпителиальных клетках MCF-10A, что пролиферация останавливалась, только когда выход пути ERK (по уровню белка Fra-1) падал ниже примерно 10 % исходного; подавление выхода на 85 % снижало пролиферацию меньше чем вдвое. Перенос этого порога на меланому — допущение, но вывод общий: подавление должно быть глубоким.Вопросы 2 и 3 — длительность и обратная связь. Измерение pERK через час завышает эффект препарата. Lito и соавт. (2012) показали, что после добавления вемурафениба DUSP и SPRY исчезают за 4–8 ч, RAS-GTP растёт и образуются RAF-димеры, на которые препарат действует слабо. Поэтому нужно измерять серию точек за сутки и оценивать интегральную активность — площадь под кривой pERK. В учебной модели вемурафениб снижает её примерно до 40 % от уровня без препарата, а сочетание с ингибитором MEK — до 8 %.Вопрос 4 — перекрёстная регуляция сетей. Hopkins и соавт. (2018) показали, что ингибиторы PI3Kα вызывают гипергликемию, выброс инсулина вновь активирует PI3K–mTOR в опухоли, а ограничение этого выброса усиливает действие препарата у мышей. Сигнальная сеть клетки встроена в сеть организма, и её ответ на препарат зависит от гормонов.Вывод: чтобы оценить действие ингибитора, нужны кривая доз (крутизна и порог), серия точек во времени (отскок и площадь), измерение обратных связей (DUSP, SPRY, RAS-GTP) и учёт соседних путей. Выбор схемы лечения — решение онколога; пример иллюстрирует системный подход.Типичная ошибка Препарат эффективен, если через час после добавления pERK снизился на 80 %.Через час обратная связь ещё не перестроилась. Важно, сколько активности ERK остаётся за сутки, и ниже ли она порога, необходимого для деления клеток.Какой показатель лучше всего отражает действие ингибитора RAF на клетки меланомы за сутки?А. pERK через 1 ч после добавления (неверный вариант)Через час pERK минимален: отрицательная обратная связь ещё не снята, а восстановление pERK ещё не началось.Б. Площадь под кривой pERK за 24–48 ч (верный вариант)Площадь учитывает и глубину подавления, и частичное восстановление pERK после снятия обратной связи.В. Количество общей ERK через 24 ч (неверный вариант)Ингибитор RAF меняет фосфорилирование ERK, а не её количество; общая ERK служит контролем загрузки.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаAlbeck JG et al. 2013. Frequency-modulated pulses of ERK activity transmit quantitative proliferation signals. Mol CellLito P et al. 2012. Relief of profound feedback inhibition of mitogenic signaling by RAF inhibitors attenuates their activity in BRAFV600E melanomas. Cancer CellHopkins BD et al. 2018. Suppression of insulin feedback enhances the efficacy of PI3K inhibitors. NatureПорог 10 % — клетки MCF-10A (Albeck 2013, полный текст); отскок — клетки меланомы с BRAF V600E (Lito 2012, полный текст); выброс инсулина — модели на мышах (Hopkins 2018, полный текст). Кривые — учебная модель практикума (вопрос 3п), среда с сывороткой, относительные величины; площадь — за 48 ч относительно эксперимента без препарата.
