Метилирование ДНК · шаг 1 из 28Что изменяется при метилировании ДНКМетилирование ДНК — это химическая модификация основания, при которой порядок нуклеотидов не меняется. В основной модели курса метилируется цитозин в составе CpG.ДНК-метилтрансфераза (DNMT) переносит метильную группу с донора, S-аденозилметионина (SAM), на атом C5 цитозина.Образуются 5-метилцитозин (5mC) и S-аденозилгомоцистеин (SAH).Основание остаётся цитозином: оно по-прежнему образует пару с гуанином, и последовательность не меняется.Метилирование ДНК у млекопитающих — это присоединение метильной группы к цитозину по атому углерода C5. Реакцию катализируют ДНК-метилтрансферазы. Донором метильной группы служит SAM, который превращается в SAH, а продуктом реакции становится 5mC.Основание при этом остаётся цитозином: оно по-прежнему образует пару с гуанином, а порядок нуклеотидов не меняется. Метилирование — это изменение химического состояния основания, а не замена нуклеотида. Замена происходит в другом процессе: при дезаминировании 5mC образуется тимин.Метилируется главным образом цитозин в составе CpG-динуклеотида. В нём за цитозином в той же цепи в направлении 5′→3′ следует гуанин, а буква p обозначает фосфатный остаток между ними. Это не комплементарная пара C–G. Участок 5′-CG-3′ одной цепи комплементарен участку 3′-GC-5′ другой, поэтому в двухцепочечной ДНК CpG-диаду образуют два цитозина — по одному в каждой цепи. Каждый из них может быть метилирован или нет; состояния диады обозначают MM (метилированы оба), MU (метилирован один) и UU (не метилирован ни один).Метилирование вне CpG тоже существует: в геномах животных его описывают, в частности, в нейронах. Закономерности, установленные для CpG, поэтому нельзя без проверки переносить на другие контексты.Сама по себе метка не определяет, будет ли ген экспрессироваться. Её влияние на связывание белков и на транскрипцию зависит от локуса, типа клеток и положения CpG; это влияние измеряют отдельно.Типичная ошибка CpG — это пара оснований C–G, соединённых водородными связями.В записи CpG буква p обозначает фосфатный остаток, связывающий соседние нуклеотиды одной цепи. Комплементарная пара C–G записывается иначе, а два цитозина диады находятся в разных цепях.В участке ДНК цитозин в составе CpG превращён в 5mC. Порядок нуклеотидов сохранён. Какое изменение произошло?А. Основание химически модифицировано, но нуклеотид не заменён. (верный вариант)DNMT присоединяет метильную группу к цитозину. Меняется химическое состояние основания, но нуклеотид не заменяется другим.Б. Цитозин заменён тимином, поэтому возникла точечная мутация. (неверный вариант)Образование 5mC не является заменой C на T. Дезаминирование 5mC — другой процесс.В. Изменилось комплементарное основание: гуанин заменён аденином. (неверный вариант)Метилирование цитозина не затрагивает гуанин противоположной цепи: 5mC по-прежнему образует с ним пару.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаSmith ZD et al. 2025. DNA methylation in mammalian development and diseaseZhang ZM et al. 2018. Structural basis for DNMT3A-mediated de novo DNA methylationBrethouwer T et al. 2025. Non-CG DNA methylation in animal genomesОписание реакции метилирования и CpG-контекста опирается на обзор Smith и соавт. (2025) и на структуру комплекса DNMT3A–DNMT3L с ДНК (Zhang и соавт., 2018); метилирование вне CpG в геномах животных описано в обзоре Brethouwer и соавт. (2025). Схема показывает механизм и не содержит результатов измерений.
Метилирование ДНК · шаг 2 из 28Как устанавливается новый рисунок метилированияМетилирование de novo — это появление 5mC там, где метки раньше не было. Основные ферменты метилирования de novo — DNMT3A и DNMT3B; DNMT1 преимущественно поддерживает метилирование после репликации.DNMT3A или DNMT3B переносит метильную группу с SAM на цитозин неметилированной CpG-диады.Для реакции не нужна метилированная родительская цепь: этим de novo отличается от поддерживающего метилирования.Выбор участка зависит от нескольких признаков хроматина и от партнёров фермента, а не от одного сигнала.Метилирование de novo — установление метки на участке, который был неметилированным в обеих цепях. Его выполняют ферменты DNMT3A и DNMT3B. Как и все ДНК-метилтрансферазы, они переносят метильную группу с SAM на цитозин, а SAM при этом превращается в SAH.Участок для метилирования выбирается не по одному признаку. ADD-домен DNMT3A связывается с N-концевым участком гистона H3, лизин 4 которого не метилирован (H3K4me0). PWWP-домены DNMT3A и DNMT3B узнают метилированный лизин 36 гистона H3 (H3K36me2/3). Эти взаимодействия помогают направить фермент к определённым участкам хроматина, но каждое из них само по себе не определяет, будет ли участок метилирован.DNMT3L родственен DNMT3A и DNMT3B, но каталитически неактивен. Он образует с DNMT3A комплекс (структуру такого комплекса определили Jia и соавт.) и усиливает метилирование. Особенно важна его роль в зародышевой линии, например при установлении импринтов. Это не значит, что DNMT3L нужен для метилирования любого CpG в соматических клетках.Разделение ролей — «de novo выполняют DNMT3A и DNMT3B, поддержание выполняет DNMT1» — описывает основную схему, но не является абсолютным. DNMT3A и DNMT3B участвуют и в поддержании метилирования отдельных участков. У мыши для DNMT1 показано метилирование de novo некоторых ретротранспозонов, в частности IAP. Этот результат нельзя автоматически переносить на все локусы и на человека.Появление 5mC на новом участке показывает, что метилтрансферазная активность там была. Какой именно фермент метилировал участок и какие признаки хроматина его направили, выясняют отдельными экспериментами: например, поочерёдно инактивируют каждую DNMT и измеряют метилирование того же локуса.Типичная ошибка Метилирование de novo возникает, когда DNMT1 копирует метку родительской цепи.Копирование метки с родительской цепи — поддерживающее метилирование. При de novo метилированной родительской цепи нет, поэтому DNMT3A и DNMT3B действуют на неметилированную диаду.В ранее неметилированном участке впервые появился 5mC. Какой процесс непосредственно объясняет появление новой метки?А. Метилирование de novo ферментами DNMT3A/3B. (верный вариант)DNMT3A/3B способны устанавливать метилирование там, где исходной метки не было.Б. Восстановление метки ферментом DNMT1 по уже метилированной родительской цепи. (неверный вариант)В условии нет метилированной родительской цепи, а без неё поддерживающее метилирование невозможно.В. Окисление цитозина ферментами TET. (неверный вариант)TET окисляют 5mC и его производные; перенос метильной группы с SAM они не катализируют.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаJia D et al. 2007. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylationZhang ZM et al. 2018. Structural basis for DNMT3A-mediated de novo DNA methylationSmith ZD et al. 2025. DNA methylation in mammalian development and diseaseOtani J et al. 2009. Structural basis for recognition of H3K4 methylation status by the DNA methyltransferase 3A ATRX-DNMT3-DNMT3L domainWeinberg DN et al. 2019. The histone mark H3K36me2 recruits DNMT3A and shapes the intergenic DNA methylation landscapeРоли DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L описаны по обзору Smith и соавт. (2025); связывание ADD-домена DNMT3A с гистоном H3, не метилированным по лизину 4, — по работе Otani и соавт. (2009), а узнавание H3K36me2/3 PWWP-доменом DNMT3A — по работе Weinberg и соавт. (2019; обе прочитаны на уровне реферата); для PWWP-домена DNMT3B отдельный первичный источник в шаге не указан; структурные работы — Jia и соавт. (2007) о комплексе DNMT3A с DNMT3L и Zhang и соавт. (2018) о метилировании de novo. Схема показывает механизм, а не измеренную скорость реакции.
Метилирование ДНК · шаг 3 из 28Как восстанавливается метилирование после репликацииПосле репликации полностью метилированной CpG-диады обе дочерние молекулы ДНК полуметилированы: старая цепь несёт метку, новая — нет. Поддерживающее метилирование восстанавливает метку на новой цепи по образцу старой.Репликация полуконсервативна: каждая дочерняя диада получает одну старую цепь и одну новую; метка остаётся только на старой цепи.UHRF1 узнаёт метку на старой цепи (SRA-домен связывает полуметилированный CpG) и убиквитинирует гистон H3 (RING-домен); этот убиквитин служит признаком для DNMT1.DNMT1 с ослабленным автоингибированием переносит метильную группу с SAM на цитозин новой цепи; метка старой цепи остаётся на месте.Допустим, что CpG-диада полностью метилирована (MM). При репликации каждая дочерняя молекула получает одну родительскую цепь и одну только что синтезированную. Старая цепь сохраняет 5mC, а в новой цепи в этой позиции стоит неметилированный цитозин. Поэтому обе дочерние диады полуметилированы (MU). ДНК-полимераза метильные группы не копирует.Поддерживающее метилирование — отдельная ферментативная реакция после репликации, и между старой меткой и новой метильной группой лежат несколько стадий. Первая — узнавание метки. SRA-домен UHRF1 избирательно связывает CpG, метилированный только на одной цепи, и выворачивает 5-метилцитозин из двойной спирали в карман белка (структура комплекса SRA с ДНК; в клетках мыши UHRF1 необходим для поддержания метилирования). На этой стадии метка на ДНК только опознаётся: UHRF1 не переносит метильную группу на новую цепь.Вторая стадия превращает узнанную метку на ДНК в метку на гистоне. Связывание SRA-домена с полуметилированной ДНК повышает активность UHRF1 как E3-убиквитинлигазы: в опытах с очищенными белками и рекомбинантным хроматином такая ДНК усиливала убиквитинирование нескольких лизинов N-концевого хвоста гистона H3. Убиквитин присоединяет RING-домен UHRF1; в указанных работах основными мишенями были лизины 18 и 23 гистона H3 (K18 и K23). Для этого нужен и N-концевой убиквитин-подобный домен UHRF1 (UBL): он помогает собрать на хроматине комплекс UHRF1 с убиквитин-конъюгирующим ферментом UBE2D1 (UbcH5a). Так возникают метки разной природы: метильная группа на цитозине ДНК (остаётся на старой цепи) и убиквитин на гистоне H3 (отдельная метка, которую узнаёт DNMT1).Третья стадия — привлечение и включение DNMT1. Без подходящей ДНК фермент автоингибирован: в кристалле DNMT1 мыши без ДНК N-концевой домен RFTS, направляющий фермент к реплицирующемуся хроматину, вставлен в ДНК-связывающий карман, и для метилирования его нужно убрать. RFTS узнаёт убиквитин на гистоне H3. В кристалле комплекса RFTS с фрагментом H3, несущим убиквитин на K18 и K23, две доли RFTS смещаются относительно друг друга, что согласуется с раскрытием активного центра, а in vitro такой H3 повышал активность DNMT1. Кроме того, UBL-домен UHRF1 непосредственно связывается с DNMT1, и в эмбриональных стволовых клетках мыши нужны оба контакта — UBL–DNMT1 и DNMT1–убиквитин на H3: при нарушении любого из них DNMT1 неправильно располагается в ядре, и метилирование не восстанавливается. Привлечение к реплицирующемуся хроматину и ослабление автоингибирования — разные события, и в разных работах показаны разные их стороны.Затем DNMT1 действует как метилтрансфераза. В экспериментах in vitro UHRF1 повышал активность и специфичность DNMT1 по аллостерическому механизму, а сам DNMT1 метилирует полуметилированные CpG эффективнее, чем неметилированные. Донором метильной группы служит S-аденозилметионин (SAM), который превращается в S-аденозилгомоцистеин (SAH). Метильная группа старой цепи остаётся на месте и служит образцом. Новая группа присоединяется к атому C5 цитозина новой цепи, и диада возвращается в состояние MM.Описанная цепь — упрощение. Она собрана из данных разных систем: структуры и биохимия очищенных белков, экстракты яиц Xenopus (убиквитинирование H3K23), клетки мыши. Не для каждого звена показано, что оно работает в клетках человека. Известен и второй путь привлечения: в эмбриональных стволовых клетках мыши в ранней S-фазе UHRF1 преимущественно убиквитинирует PAF15 — белок, связанный с PCNA, и этот убиквитин тоже привлекает DNMT1, а убиквитин на H3 преобладает в поздней S-фазе. Поэтому фразу «UHRF1 привлекает DNMT1» следует читать как краткое описание нескольких событий.Реакция выполняется не со стопроцентной точностью. Для гиперметилированного CpG-островка гена FMR1 на неактивной X-хромосоме в лимфоцитах человека по данным бисульфитной ПЦР со шпилькой оценили эффективность поддерживающего метилирования: около 96 % на сайт за деление. Это оценка, полученная из распределения состояний диад. Неполное восстановление метки может приводить к постепенной потере метилирования, если его не восполняют другие процессы, например метилирование de novo.Типичная ошибка Репликация переносит метильные группы на новую цепь вместе с копированием последовательности.ДНК-полимераза копирует порядок нуклеотидов, но не метку. Метильную группу на новую цепь переносит DNMT1 после репликации; UHRF1 её не переносит, а узнаёт метку на старой цепи и убиквитинирует гистон H3.Полностью метилированная CpG-диада реплицировалась. Поддерживающее метилирование ещё не произошло. Каково состояние двух дочерних молекул?А. В каждой молекуле метилирован цитозин старой цепи, а цитозин новой цепи не метилирован. (верный вариант)Полуконсервативная репликация сохраняет одну старую цепь в каждой дочерней молекуле.Б. В одной молекуле метилированы обе цепи, а в другой не метилирована ни одна. (неверный вариант)Здесь обе старые цепи оказались бы в одной молекуле, но при полуконсервативной репликации каждая дочерняя молекула получает одну старую цепь.В. Обе молекулы полностью метилированы, поскольку репликация переносит метильные группы на новые цепи. (неверный вариант)ДНК-полимераза не копирует метилирование. Для новой метки необходима отдельная реакция DNMT.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаBashtrykov P et al. 2014. The UHRF1 protein stimulates the activity and specificity of the maintenance DNA methyltransferase DNMT1 by an allosteric mechanismSmith ZD et al. 2025. DNA methylation in mammalian development and diseaseLaird CD. et al. Hairpin-bisulfite PCR: assessing epigenetic methylation patterns on complementary strands of individual DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:204–9. doi:10.1073/pnas.2536758100Bostick M et al. 2007. UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cellsArita K et al. 2008. Recognition of hemi-methylated DNA by the SRA protein UHRF1 by a base-flipping mechanismHarrison JS et al. 2016. Hemi-methylated DNA regulates DNA methylation inheritance through allosteric activation of H3 ubiquitylation by UHRF1Foster BM et al. 2018. Critical role of the UBL domain in stimulating the E3 ubiquitin ligase activity of UHRF1 toward chromatinLi T et al. 2018. Structural and mechanistic insights into UHRF1-mediated DNMT1 activation in the maintenance DNA methylationIshiyama S et al. 2017. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenanceTakeshita K et al. 2011. Structural insight into maintenance methylation by mouse DNA methyltransferase 1 (Dnmt1)Nishiyama A et al. 2013. Uhrf1-dependent H3K23 ubiquitylation couples maintenance DNA methylation and replicationNishiyama A et al. 2020. Two distinct modes of DNMT1 recruitment ensure stable maintenance DNA methylationВосстановление метки по образцу старой цепи и роль UHRF1 описаны по работе Bashtrykov и соавт. (2014; эксперименты с очищенными белками) и обзору Smith и соавт. (2025). Узнавание полуметилированного CpG доменом SRA — по Bostick и соавт. (2007) и Arita и соавт. (2008; структура комплекса с очищенным белком). Активацию убиквитинлигазной активности UHRF1 полуметилированной ДНК описали Harrison и соавт. (2016; очищенные белки, рекомбинантный хроматин), роль UBL-домена — Foster и соавт. (2018; очищенные белки, рекомбинантный хроматин). Связывание RFTS-домена DNMT1 с убиквитином на H3 — по Ishiyama и соавт. (2017; структура и опыты in vitro) и Li и соавт. (2018; также эмбриональные стволовые клетки мыши); автоингибирование DNMT1 — по Takeshita и соавт. (2011; структура DNMT1 мыши). Нумерация K18 и K23 относится к гистону H3 в этих работах; убиквитинирование K23 показано в экстрактах яиц Xenopus (Nishiyama и соавт., 2013), а убиквитинирование PAF15 — в эмбриональных стволовых клетках мыши (Nishiyama и соавт., 2020); переносить эти результаты на другие системы без проверки нельзя. Оценка около 96 % за деление относится к CpG-островку гена FMR1 неактивной X-хромосомы в лимфоцитах человека (Laird и соавт., 2004); на другие участки её переносить нельзя. На схеме последовательность стадий (узнавание, убиквитинирование H3, привлечение DNMT1, перенос метильной группы) показывает причинный порядок, а не измеренное время; эффективность задаётся ползунком как учебный параметр.
Метилирование ДНК · шаг 4 из 28Почему метилирование уменьшается при деленияхДоля метилированных цитозинов может уменьшаться при делениях без химического удаления метки. Тогда новые цепи остаются неметилированными, а старые просто распределяются между всё большим числом копий.Старая цепь сохраняет 5mC, но после каждой репликации число цепей удваивается.Если нет ни поддерживающего метилирования, ни метилирования de novo, новые цепи метку не получают.Доля метилированных цитозинов уменьшается как 2⁻ⁿ, где n — число раундов репликации.Пассивное деметилирование — уменьшение доли метилированных оснований при репликации. Метильные группы при этом не отщепляются: просто новые цепи не получают метки, потому что поддерживающее метилирование не срабатывает или срабатывает не полностью.Рассмотрим идеальную задачу. Исходная диада метилирована на обеих цепях (MM). Поддерживающее метилирование и метилирование de novo полностью отсутствуют, 5mC не окисляется, клетки не подвергаются отбору. После первой репликации получаются две диады MU: в них 2 метилированных цитозина из 4, то есть 50 %. После второй репликации четыре диады содержат 8 цитозинов, из которых метилированы только 2 старых, то есть 25 %. После n раундов доля метилированных цитозинов равна 2⁻ⁿ.Эта формула описывает только идеальную задачу. В клетке и в практикуме семинара метилирование de novo может оставаться активным, копирование метки бывает неполным, а окисление 5mC может идти параллельно. Результаты практикума нельзя заменять значением 2⁻ⁿ.Это важно и для выводов из экспериментов. Уменьшение доли 5mC после делений совместимо с пассивной потерей, но не доказывает её: активное деметилирование и отбор клеток могут дать похожий результат. Чтобы различить эти объяснения, нужны контроль числа делений, измерение окисленных форм 5mC и определение состояния диад.Типичная ошибка Доля метилированных цитозинов снизилась — значит, метильные группы были химически удалены.Доля может снизиться и при репликации без удаления: старые 5mC сохраняются, но распределяются среди растущего числа молекул. Химическое удаление нужно подтверждать отдельно.В идеальной задаче исходная CpG-диада метилирована на обеих цепях. Поддерживающего метилирования, метилирования de novo и активного удаления 5mC нет. Какова доля метилированных цитозинов этого локуса среди всех копий после двух раундов репликации?А. 25 %. (верный вариант)Число старых метилированных цитозинов сохраняется, а общее число копий увеличивается вчетверо. Доля составляет 1/4.Б. 50 %. (неверный вариант)50 % получается после одного раунда. Условие задаёт два раунда репликации.В. 0 %. (неверный вариант)В условии нет химического удаления старой метки. Её доля уменьшается, но старые метилированные цепи сохраняются.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаSmith ZD et al. 2025. DNA methylation in mammalian development and diseaseBashtrykov P et al. 2014. The UHRF1 protein stimulates the activity and specificity of the maintenance DNA methyltransferase DNMT1 by an allosteric mechanismИдеальная задача и формула 2⁻ⁿ — расчёт, который следует из полуконсервативной репликации при заданных допущениях, а не результат эксперимента. Поддерживающее метилирование описано по обзору Smith и соавт. (2025) и работе Bashtrykov и соавт. (2014; эксперименты in vitro о стимуляции DNMT1 белком UHRF1). В практикуме рассматриваются другие условия: метилирование de novo может оставаться активным.
Метилирование ДНК · шаг 5 из 28Как окисление связано с активным деметилированиемВ основной модели активное деметилирование идёт через окисление 5mC и удаление окисленного основания. Метильную группу ферменты не отщепляют напрямую.TET последовательно окисляют 5mC до 5hmC, 5fC и 5caC; для реакции нужны Fe²⁺, O₂ и α-кетоглутарат.TDG вырезает 5fC и 5caC; затем эксцизионная репарация оснований восстанавливает обычный цитозин.5hmC — самостоятельная химическая форма: её появление ещё не означает завершения деметилирования.Белки TET1, TET2 и TET3 — диоксигеназы. Для реакции им нужны ионы Fe²⁺, молекулярный кислород и α-кетоглутарат. TET не отщепляют метильную группу, а окисляют её: 5mC превращается в 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), затем в 5-формилцитозин (5fC) и в 5-карбоксилцитозин (5caC).ДНК-гликозилаза TDG распознаёт окисленные формы 5fC и 5caC. Она удаляет само основание, и в ДНК остаётся сайт без основания. Ферменты эксцизионной репарации оснований (BER) обрабатывают этот участок, включают нуклеотид с немодифицированным цитозином и восстанавливают целостность цепи. Так завершается показанный путь активного деметилирования.5hmC нельзя считать «почти цитозином». Это отдельная химическая форма, которая в ряде тканей может сохраняться. Её обнаружение не доказывает, что путь дошёл до конца: об этом можно судить по другим продуктам и по результату репарации. Если после активации TET доля 5hmC в локусе выросла, это означает рост доли продукта окисления 5mC; восстановление обычного цитозина проверяют отдельно.Окисление не исключает пассивной потери. Окисленные формы хуже распознаются системой поддерживающего метилирования, поэтому окисление и последующее разведение метки при репликации могут действовать вместе. Вклад каждого пути оценивают отдельно.Типичная ошибка TET отщепляют метильную группу от 5mC, и цитозин сразу восстанавливается.TET катализируют окисление. В показанном пути немодифицированный цитозин восстанавливается после удаления 5fC или 5caC гликозилазой TDG и последующей репарации; эти этапы проверяют отдельно.После активации TET доля 5hmC в локусе увеличилась. Какой вывод непосредственно поддерживает это наблюдение?А. Выросла доля продукта окисления 5mC; возврат к обычному цитозину не доказан. (верный вариант)5hmC — отдельная химическая форма. Конечный результат пути устанавливают, измеряя другие продукты и результат репарации.Б. Все модифицированные цитозины в этом локусе уже заменены обычными цитозинами. (неверный вариант)Наличие 5hmC показывает, что по крайней мере часть цитозинов ещё модифицирована.В. TET удалили метильную группу напрямую, без образования промежуточных оснований. (неверный вариант)TET не отщепляют метильную группу, а окисляют 5mC до 5hmC, 5fC и 5caC. В этом пути обычный цитозин восстанавливается после удаления 5fC или 5caC гликозилазой TDG и эксцизионной репарации оснований.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаIto S et al. 2011. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosineHe YF et al. 2011. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNAKohli RM et al. 2013. TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylationПоследовательное окисление 5mC ферментами TET описано в работе Ito и соавт. (2011); вырезание 5caC гликозилазой TDG — в работе He и соавт. (2011); общая картина — в обзоре Kohli и соавт. (2013). Схема показывает порядок реакций, а не скорости.
Метилирование ДНК · шаг 6 из 28Что показывают методы анализа метилированияОбычное бисульфитное секвенирование не отличает 5mC от 5hmC. Чтобы их различить, нужны дополнительные методы, например oxBS-seq или TAB-seq, а состояние двух цепей диады читают методом шпильки.При бисульфитной обработке обычный цитозин читается как тимин, а 5mC и 5hmC читаются как цитозин.oxBS-seq выявляет 5mC, а TAB-seq — 5hmC; по разности сигналов обычного бисульфитного секвенирования и oxBS-seq при тех же контролях оценивают долю 5hmC.Метод шпильки соединяет обе цепи одной молекулы, поэтому позволяет определить состояние диады: MM, MU или UU; при обычной бисульфитной обработке «M» означает 5mC или 5hmC.При обычном бисульфитном секвенировании неметилированный цитозин превращается в урацил, который после ПЦР читается как тимин. 5mC устойчив к этому превращению. 5hmC в реакции с бисульфитом образует продукт, который тоже не превращается в урацил. Поэтому сигнал «цитозин сохранился» объединяет 5mC и 5hmC.В oxBS-seq перед бисульфитной обработкой 5hmC окисляют до 5fC. Эта форма при обработке бисульфитом читается как тимин, поэтому остаточный сигнал принадлежит 5mC. В TAB-seq 5hmC сначала защищают присоединением глюкозы, затем окисляют 5mC ферментом TET до 5caC; в результате сохраняется сигнал 5hmC. По разности сигналов обычного бисульфитного секвенирования и oxBS-seq оценивают долю 5hmC.Метод шпильки (hairpin-bisulfite) соединяет две цепи одной молекулы и поэтому позволяет прочитать состояние обоих цитозинов диады. Он различает MM, MU и UU (при обычной бисульфитной обработке «M» означает 5mC или 5hmC), тогда как обычное бисульфитное секвенирование даёт только долю метилирования в каждой позиции цитозина.Бисульфитное секвенирование применяют ко всему геному или к его части. При секвенировании всего генома метилирование цитозина определяют с разрешением одного основания: так построили первые карты метилирования генома человека для эмбриональных стволовых клеток и фибробластов плода. Почти четверть метилированных цитозинов в стволовых клетках находилась вне контекста CG; при индуцированной дифференцировке такое метилирование исчезало. При редуцированном бисульфитном секвенировании (RRBS) исследуют только часть генома: ДНК расщепляют рестриктазой, отбирают фрагменты определённой длины, присоединяют адаптеры, обрабатывают бисульфитом и секвенируют. Поэтому результат относится только к выбранным фрагментам.Для всех этих методов нужны контроли: эффективность превращения неметилированного цитозина, эффективность окисления в oxBS-seq, полнота защиты 5hmC в TAB-seq и одинаковая нормировка образцов. Числа на схеме — искусственные: они показывают логику вычитания, а не результат эксперимента.Типичная ошибка Обычный бисульфитный сигнал 60 % означает, что 60 % цитозинов — это 5mC.Бисульфитный сигнал суммирует 5mC и 5hmC. Чтобы выделить 5mC, нужен oxBS-seq, а 5hmC оценивают по разности сигналов или напрямую методом TAB-seq.В образцах с сопоставимой нормировкой обычное бисульфитное секвенирование даёт сигнал 60 %, а oxBS-seq — 40 %. Контроли химического превращения пройдены. Чем непосредственно объясняется разность сигналов?А. Приблизительно 20 процентных пунктов приходятся на 5hmC. (верный вариант)В заданном сравнении обычный бисульфит учитывает 5mC вместе с 5hmC, а oxBS-seq — 5mC. Разность составляет 20 процентных пунктов, а не относительное изменение на 20 %.Б. 5mC составляет 60 %, а 5hmC отсутствует. (неверный вариант)5mC здесь оценивают по сигналу oxBS-seq, то есть 40 %, а не 60 %. Разность сигналов нельзя приписать 5mC.В. 20 % всех CpG-диад обязательно метилированы на обеих цепях. (неверный вариант)Сигнал отдельных цитозинов не определяет, как метки распределены между двумя цепями одной диады.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаBooth MJ et al. 2013. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosineHuang Y et al. 2010. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencingLaird CD. et al. Hairpin-bisulfite PCR: assessing epigenetic methylation patterns on complementary strands of individual DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:204–9. doi:10.1073/pnas.2536758100Lister R et al. 2009. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differencesMeissner A et al. 2005. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysisПринцип oxBS-seq описан в работе Booth и соавт. (2013); поведение 5hmC в бисульфитном секвенировании — в работе Huang и соавт. (2010); метод шпильки — в работе Laird и соавт. (2004). Бисульфитное секвенирование всего генома описано в работе Lister и соавт. (2009; эмбриональные стволовые клетки и фибробласты человека); редуцированное — в работе Meissner и соавт. (2005; фрагменты, полученные рестриктазой BglII). Числа на схеме искусственные и заданы для иллюстрации вычитания.
Метилирование ДНК · шаг 7 из 28Как белки связывают метилированную ДНКМетилирование может по-разному менять связывание белков с ДНК. Белки с MBD-доменом образуют разнородную группу: у каждого свои партнёры и функции.Метильная группа 5mC выступает в большую бороздку и меняет поверхность ДНК.Одни транскрипционные факторы связываются с метилированным мотивом хуже, чем с неметилированным, у других связывание не меняется; результат зависит от белка и положения CpG.Следствие связывания определяют партнёры белка: MeCP2 взаимодействует с NCoR/SMRT, а MBD2 входит в комплекс NuRD.Метильная группа 5mC находится в большой бороздке ДНК и меняет её поверхность. Для транскрипционного фактора, узнающего мотив, это может ослабить связывание, а может не повлиять на него: результат зависит от белка и от положения CpG в мотиве. Поэтому нельзя утверждать, что метилирование блокирует связывание всех факторов. Пример — CTCF, чувствительность которого к метилированию зависит от конкретного сайта.Часть белков узнаёт метилированную ДНК с помощью MBD-домена — домена связывания метилированного CpG. Эти белки нельзя считать однородной группой. MeCP2, MBD1 и MBD2 связываются с метилированной ДНК. MBD3 в обычном виде метил-CpG не связывает. MBD4 — прежде всего ДНК-гликозилаза репарации.Дальнейшее зависит от партнёров. MeCP2 взаимодействует с корепрессорным комплексом NCoR/SMRT через участок, образованный аминокислотными остатками 269–309. Мутации синдрома Ретта в участке 302–306 эту связь нарушают, а замена T158M в MBD-домене её не нарушает, но ухудшает связывание с метилированной ДНК. MBD2 входит в комплекс NuRD: в экспериментах in vitro этот комплекс предпочтительно связывает метилированные нуклеосомы и деацетилирует их. Эти данные относятся к комплексу MBD2–NuRD; на другие белки MBD их нельзя автоматически переносить.Метилирование промотора, тела гена и повтора обсуждают раздельно. Метилирование промотора часто сопутствует подавлению транскрипции, однако это закономерность, зависящая от локуса, а не правило для каждого гена.Причинную роль метилирования проверяют адресным изменением метки и независимым измерением экспрессии. Для этого используют каталитически неактивную Cas9 (dCas9), соединённую с DNMT3A или с каталитическим доменом TET1, который окисляет 5mC и может способствовать деметилированию. В работе Valcárcel и соавт. направленно изменяли метилирование промотора IL1RN в человеческих B-лейкозных клетках: деметилирование (dCas9-TET1) повышало содержание мРНК IL1RN более чем в 15 раз, а гиперметилирование (dCas9-DNMT3A) при трансдифференцировке в макрофаги снижало экспрессию IL1RN и изменяло свойства полученных клеток. Изменение количества РНК после направления конструкции на промотор само по себе ещё не доказывает действие метки. Нужны измерение метилирования, контрольная направляющая РНК, контроль с каталитически неактивным эффекторным доменом и независимое вмешательство. Это существенно и для гистоновых меток. В работе O'Geen и соавт. присоединённый к dCas9 фрагмент EZH2 с доменом SET подавлял экспрессию HER2 в клетках HCT116, но H3K27me3 на этом промоторе не откладывал (метку откладывал только полноразмерный EZH2). Варианты этого фрагмента с заменами каталитических остатков подавляли экспрессию так же, как исходный. Авторы допускают некаталитический механизм, например стерические помехи; в этом примере репрессия не требовала накопления H3K27me3. Выраженность репрессии зависела от конструкции, гена и клеток — от отсутствия эффекта до десятикратного снижения экспрессии.Типичная ошибка Все белки семейства MBD связывают метилированную ДНК и подавляют транскрипцию.Функции членов семейства различаются: MBD3 в обычном виде не связывает метил-CpG, а MBD4 — гликозилаза. Даже связывание с метилированной ДНК не означает единого репрессорного действия.В локусе появился 5mC. Для фактора X показано снижение связывания с метилированным мотивом. Какое предсказание относится непосредственно к этому наблюдению?А. При прочих равных занятость данного мотива фактором X может уменьшиться. (верный вариант)Вывод относится к изученному мотиву и фактору. Изменение количества РНК нужно измерить отдельно.Б. Все транскрипционные факторы перестанут связываться с любыми участками ДНК. (неверный вариант)Чувствительность к метилированию зависит от белка и положения CpG в мотиве.В. Транскрипция любого гена с метилированным телом немедленно прекратится. (неверный вариант)Метилирование тела гена не имеет единственного универсального эффекта; в условии исследован конкретный фактор.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаChen L et al. 2015. MeCP2 binds to non-CG methylated DNA as neurons mature, influencing transcription and the timing of onset for Rett syndromeMonteagudo-Sánchez A et al. 2024. The impact of DNA methylation on CTCF-mediated 3D genome organizationLyst MJ. et al. Rett syndrome mutations abolish the interaction of MeCP2 with the NCoR/SMRT co-repressor. Nat Neurosci. 2013;16:898–902. doi:10.1038/nn.3434Feng Q., Zhang Y. The MeCP1 complex represses transcription through preferential binding, remodeling, and deacetylating methylated nucleosomes. Genes Dev. 2001;15:827–32. doi:10.1101/gad.876201Kondo E et al. 2005. The thymine DNA glycosylase MBD4 represses transcription and is associated with methylated p16(INK4a) and hMLH1 genesValcárcel G et al. 2025. Modulating immune cell fate and inflammation through CRISPR-mediated DNA methylation editingO'Geen H et al. 2017. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repressionВзаимодействие MeCP2 с NCoR/SMRT и роль мутаций синдрома Ретта описаны в работе Lyst и соавт. (2013; HeLa, фрагменты MeCP2 и мыши с мутацией R306C); комплекс MBD2–NuRD — в работе Feng и Zhang (2001; ядерный экстракт HeLa, in vitro); связывание MeCP2 с метилированной ДНК вне CpG в нейронах — Chen и соавт. (2015); зависимость CTCF от метилирования — обзор Monteagudo-Sánchez и соавт. (2024); для MBD4 в клетках человека описано также HDAC-зависимое подавление транскрипции через Sin3A и HDAC1 (Kondo и соавт., 2005; реферат). Направленное изменение метилирования описано в работах Valcárcel и соавт. (2025; промотор IL1RN, иммунные клетки человека) и O'Geen и соавт. (2017; набор слияний dCas9, разные гены и типы клеток). Выводы относятся к указанным системам.
Метилирование ДНК · шаг 8 из 28Как родительский аллель связан с регуляцией генаПри геномном импринтинге активность аллеля зависит от того, от какого родителя он получен. У изученных импринтированных локусов, например H19/Igf2, различие закладывается метилированием контрольной области в зародышевой линии и сохраняется в соматических клетках.В изученных локусах, например H19/Igf2, DNMT в зародышевой линии устанавливают разное метилирование контрольной области импринтинга (ICR) на родительских аллелях; в соматических клетках различие поддерживается.В мышином локусе H19/Igf2 метилирование ICR влияет на связывание CTCF и на действие общих энхансеров на промоторы Igf2.У каждого импринтированного локуса свой механизм: пример H19/Igf2 нельзя переносить на UBE3A и другие локусы.Мышиный локус H19/Igf2Импринтинг проявляется как аллель-специфичная экспрессия, зависящая от родительского происхождения аллеля. Различие устанавливается в зародышевой линии, где в установлении импринтов участвует и DNMT3L, а в соматических клетках поддерживается: DNMT1 воспроизводит метилирование ICR при репликации. Импринтинг не требует различий в последовательности двух аллелей: различаются родительская метка и её последствия. В мышином локусе H19/Igf2 метка связана с ICR, расположенной между генами.На материнском аллеле ICR не метилирована, и с ней связывается CTCF. Связанный CTCF ограничивает доступ общих энхансеров к гену Igf2: на этом аллеле Igf2 не экспрессируется, а H19 экспрессируется. На отцовском аллеле ICR метилирована, и CTCF с ней не связывается. Поэтому общие энхансеры могут активировать промоторы Igf2, и этот ген экспрессируется. H19 на этом аллеле не экспрессируется: его промотор метилирован, причём, по данным захвата конформации хромосом в печени новорождённых мышей, энхансер от него, по-видимому, физически не отделён (Kurukuti и соавт., 2006). Таким образом, метилирование ICR связано с аллель-специфичной экспрессией Igf2 через связывание CTCF и доступ энхансеров, а молчание отцовского H19 сопровождается метилированием его промотора.Контакты энхансеров с промоторами Igf2 на отцовской хромосоме и их предотвращение связыванием CTCF в ICR на материнской показаны методом захвата конформации хромосом (Kurukuti и соавт., 2006). Мутации четырёх сайтов CTCF в ICR в культуре фибробластов мыши нарушали аллель-специфичный состав хроматина по всему домену, в том числе метки H3K27me3 и ацетилирование H3K9 (Han и соавт., 2008). Эти данные получены на мышах, и на другие виды и ткани их автоматически переносить нельзя. Чтобы проверить последствия нарушения сайта CTCF, измеряют аллель-специфичную РНК Igf2 вместе со связыванием CTCF и контактами локуса: изменение нужно показать именно для материнского аллеля.Другие локусы и разные виды нарушенийИнактивация X-хромосомы устроена иначе: она устанавливается длинной некодирующей РНК XIST (у мыши Xist) в цис на одной из двух X-хромосом и не сводится к метилированию одной контрольной области. Нельзя переносить на неё объяснение локуса H19/Igf2. Нарушения, связанные с метилированием, бывают разными. К нарушениям импринтинга относят, например, синдром Беквита — Видемана и синдромы Прадера — Вилли и Ангельмана: в них нарушена экспрессия импринтированных генов определённого локуса. Вариант синдрома ICF (ICF1) вызван мутациями гена DNMT3B и не сводится к общей потере метилирования. Синдром Ретта связан с мутациями гена MECP2, кодирующего белок, который связывается с метилированной ДНК. Это три разных вида нарушений.Для гена UBE3A фраза «отцовский промотор просто метилирован» не подходит. В нейронах молчание отцовского аллеля связано с транскрипцией нейронального антисмыслового транскрипта UBE3A-ATS, перекрывающегося с геном UBE3A. В экспериментах на мышах антисмысловые олигонуклеотиды снижали содержание транскрипта Ube3a-ATS, и отцовский аллель Ube3a частично активировался. Эти данные не дают оснований для выводов о лечении людей.Типичная ошибка Импринтинг — это просто метилирование промотора гена на одном из аллелей.У H19/Igf2 метилируется контрольная область, и результат зависит от связывания CTCF и доступа энхансеров. У UBE3A в нейронах важен антисмысловой транскрипт UBE3A-ATS.В изучаемой мышиной модели CTCF связывается с неметилированной ICR материнского аллеля локуса H19/Igf2 и ограничивает действие общих энхансеров на Igf2. Какое измерение лучше всего проверит последствия нарушения этого сайта CTCF?А. Аллель-специфичная РНК Igf2, связывание CTCF и контакты локуса. (верный вариант)Нужно установить изменение именно материнского аллеля и сопоставить его с нарушенным механизмом.Б. Только средняя доля 5mC, измеренная во всём геноме клеток образца. (неверный вариант)Средний сигнал по геному не показывает изменение исследуемого контрольного участка.В. Только общее содержание белка CTCF во всех клетках каждого образца. (неверный вариант)Количество CTCF не показывает ни связывания с конкретным сайтом, ни аллель-специфичной транскрипции.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаKurukuti S et al. 2006. CTCF binding at the H19 imprinting control region mediates maternally inherited higher-order chromatin conformation to restrict enhancer access to Igf2Han L et al. 2008. CTCF is the master organizer of domain-wide allele-specific chromatin at the H19/Igf2 imprinted regionKalsner L et al. 2015. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromesBrioude F et al. 2018. Expert consensus document: Clinical and molecular diagnosis, screening and management of Beckwith-Wiedemann syndrome: an international consensus statementChen L et al. 2015. MeCP2 binds to non-CG methylated DNA as neurons mature, influencing transcription and the timing of onset for Rett syndromeBowness JS et al. 2022. Xist-mediated silencing requires additive functions of SPEN and Polycomb together with differentiation-dependent recruitment of SmcHD1Meng L et al. 2015. Towards a therapy for Angelman syndrome by targeting a long non-coding RNASmith ZD et al. 2025. DNA methylation in mammalian development and diseaseHansen RS et al. 1999. The DNMT3B DNA methyltransferase gene is mutated in the ICF immunodeficiency syndromeInoue A et al. 2017. Maternal H3K27me3 controls DNA methylation-independent imprintingЛокус H19/Igf2 описан на мыши (Kurukuti и соавт., 2006; Han и соавт., 2008): работа Kurukuti и соавт. прочитана в полном тексте, работа Han и соавт. — на уровне реферата; у Kurukuti контакты и роль связывания CTCF в ICR показаны захватом конформации хромосом, а равная частота контактов эндодермального энхансера en4 с промотором H19 на обоих аллелях позволила авторам заключить, что метилирование промотора, по-видимому, не приводит к физическому исключению энхансера (результаты получены на печени новорождённых мышей); у Han мутации четырёх сайтов CTCF в ICR исследованы в культуре фибробластов мыши. Участие DNMT3L в установлении импринтов и воспроизведение метилирования ICR ферментом DNMT1 при репликации — сведения программы курса и шагов 2–3, в источниках этого шага не проверялись. Синдромы нарушения импринтинга — Kalsner и соавт. (2015; Прадера — Вилли, Ангельман) и Brioude и соавт. (2018; Беквит — Видеман). Работа Meng и соавт. (2015) выполнена на мышах: однократное введение антисмысловых олигонуклеотидов частично активировало отцовский аллель Ube3a. Эффект наблюдался около 16 недель; клинических выводов из этого не следует. Роль Xist — Bowness и соавт. (2022; эмбриональные стволовые клетки мыши; реферат). Мутации DNMT3B при синдроме ICF — Hansen и соавт. (1999; реферат). У мыши описан также импринтинг, не зависящий от метилирования ДНК (материнский H3K27me3; Inoue и соавт., 2017; реферат): на этой странице он не рассматривается.
Энхансер и промотор · шаг 9 из 28Чем различаются энхансер и промоторПромотор — участок ДНК, на котором собирается комплекс инициации и определяется место начала транскрипции. Энхансер — отдельный регуляторный участок: к нему присоединяются факторы и коактиваторы, и в результате меняется транскрипция мишени.Что показывает схема. Схема показывает на одной шкале ДНК энхансер, промотор, место начала транскрипции (TSS) и ген. Факторы занимают энхансер, коактиваторы, по основной модели, передают влияние на комплекс инициации промотора при сближении участков. При удалении энхансера промотор и TSS сохраняются, а количество РНК может снизиться; при удалении промотора РНК с него синтезироваться не будет.На промоторе собирается комплекс инициации; место начала транскрипции (TSS) — позиция ДНК, с которой начинается синтез РНК.К энхансеру присоединяются транскрипционные факторы и коактиваторы; они повышают вероятность или скорость транскрипции мишени.Связанные с энхансером факторы влияют на работу промотора. Сближение энхансера и промотора в пространстве может способствовать этому влиянию, но контакт и активацию промотора измеряют отдельно.Промотор расположен у начала гена; на нём собирается комплекс инициации транскрипции. Сборка комплекса определяет место начала транскрипции — позицию ДНК, с которой РНК-полимераза начинает синтез. Если удалить промотор вместе с этой позицией, РНК с него синтезироваться не будет, даже когда все остальные регуляторные участки сохранены.Энхансер — другой участок ДНК, и его роль иная. К нему присоединяются транскрипционные факторы, а через них — коактиваторы, например Mediator и CBP/p300. В результате у промотора-мишени повышается вероятность или скорость транскрипции. Если энхансер и промотор находятся на одной молекуле ДНК, говорят о действии в цис. Энхансер не заменяет промотор: при его удалении промотор и место начала транскрипции остаются, но вклад связанных с энхансером факторов исчезает, и количество РНК может снизиться. Насколько именно, зависит от других регуляторов локуса.Энхансер может находиться в разных состояниях. На активных энхансерах обычно есть H3K4me1 и H3K27ac, а на праймированных — H3K4me1 без ацетилирования лизина 27. По этим признакам выделяют кандидатов в праймированные энхансеры; часть таких участков может активироваться при дифференцировке. Для отдельного участка эту возможность нужно проверить. Классы энхансеров не исчерпываются этим делением: в эмбриональных стволовых клетках мыши и их производных праймированные энхансеры различались по наличию H3K27me3 и H3K9me3, а активные — по уровням H3K4me1, H3K27ac и H3K36me3. Метки помогают описать состояние участка, но их наличие само по себе не устанавливает причинного влияния на его активность.В репортёрных экспериментах энхансерную активность проверяют по усилению транскрипции с промотора. Её сохранение при изменении положения и ориентации фрагмента — классический признак энхансера, но он получен в конкретных конструкциях и не описывает геном: там действие энхансера зависит от расстояния, доступности участков, организации хроматина и свойств промотора. Поэтому ближайший ген не обязательно служит мишенью, а функциональную связь проверяют вмешательством в исходном локусе (шаг 14).Последовательность энхансера содержит сайты связывания транскрипционных факторов. Связанные факторы и взаимодействующие с ними коактиваторы влияют на работу промотора. Пространственная организация хроматина может способствовать этому влиянию, однако способы его передачи и необходимость прямого контакта продолжают изучать. Поэтому частота контактов энхансера с промотором и синтез РНК — разные величины; их различают в следующем шаге.Типичная ошибка Энхансер всегда регулирует ближайший к нему ген.Энхансер может действовать на промотор, удалённый по последовательности ДНК. Сохранение активности при смене положения и ориентации — признак, используемый в репортёрных экспериментах; в геноме мишень зависит от доступности, контактов и свойств промотора, поэтому её определяют вмешательством, а не по близости.Из локуса удалили активный энхансер, сохранив промотор и место начала транскрипции. Что удалено непосредственно?А. Регуляторный участок, связывающий факторы, которые усиливают транскрипцию мишени. (верный вариант)Энхансер и промотор — разные элементы. Насколько снизится количество РНК, зависит от других регуляторов.Б. Само место начала транскрипции и все сайты сборки общего транскрипционного аппарата. (неверный вариант)По условию промотор и TSS сохранены.В. Последовательность, которая обязательно назначает ближайший ген единственной мишенью. (неверный вариант)Энхансер может действовать на более удалённый промотор. Функциональную мишень нельзя определить только по расстоянию.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаHafner A et al. 2023. The spatial organization of transcriptional controlYang JH et al. 2024. Enhancer selectivity in space and time: from enhancer-promoter interactions to promoter activationBergman DT et al. 2022. Compatibility rules of human enhancer and promoter sequencesCreyghton MP et al. 2010. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental stateZentner GE et al. 2011. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functionsКлассическое репортёрное определение энхансера по сохранению активности при изменении положения и ориентации фрагмента и обсуждение его избирательности даны по обзору Yang и соавт. (2024); пространственная организация регуляции — по обзору Hafner и соавт. (2023); совместимость последовательностей — по работе Bergman и соавт. (2022). Состояния энхансера описаны в работах Creyghton и соавт. (2010) и Zentner и соавт. (2011; эмбриональные стволовые клетки мыши и их производные). Ослабление действия энхансера с расстоянием в геноме дано как общее положение (см. вкладку «Энхансер и промотор» практикума, Zuin и соавт., 2022): в источниках этого шага оно не проверялось. Схема показывает устройство локуса и не содержит результатов измерений.
Энхансер и промотор · шаг 10 из 28От чего зависит избирательность действия энхансераДействие энхансера на промотор зависит сразу от нескольких условий, а не от одного свойства. Доступность участков, частоту контактов и свойства промотора оценивают отдельно: эти показатели характеризуют разные звенья регуляции.Что показывает схема. Схема показывает энхансер E1 и два промотора. Для каждого промотора независимо заданы условная частота контакта, доступность и совместимость, а условный индекс новосинтезированной РНК рассчитывается по формуле учебной модели. Если промотор недоступен, рост частоты контакта не меняет синтез РНК; при высоких частотах ответ насыщается.Первое условие — доступ факторов к своим мотивам в данном типе клеток.Второе условие — сближение энхансера и промотора: контакт создаёт возможность взаимодействия, но не гарантирует его результат.Третье условие — способность промотора собрать продуктивный комплекс; результат измеряют по новосинтезированной РНК за заданный интервал.Избирательность взаимодействия энхансера и промотора — это преимущественное влияние энхансера на определённые промоторы в заданных условиях. Она количественна и зависит от клеточной системы, поэтому не сводится к жёсткому правилу «один энхансер — один промотор». Её удобно разложить на несколько условий, которые не заменяют друг друга.Первое условие — доступность. Мотив энхансера может быть открыт в клетках одного типа и закрыт нуклеосомой в клетках другого, а в разных клетках его занимают разные комбинации факторов. Второе условие — пространственные контакты: чем чаще энхансер сближается с промотором, тем больше возможностей для их взаимодействия. Третье — свойства самого промотора: его последовательность и набор факторов определяют, насколько продуктивно он отвечает на влияние энхансера.Совместимость последовательностей проверяли в репортёрной системе. В эксперименте ExP STARR-seq на клетках человека линии K562 попарно сопоставили 1000 энхансеров и 1000 промоторов. Большинство энхансеров активировало большинство промоторов примерно одинаково, а активность пары описывалась произведением собственных активностей энхансера и промотора: такая модель объясняла 82 % дисперсии сигнала (R² = 0,82). Различия оказались тоньше: промоторы генов «домашнего хозяйства» слабее отвечали на энхансеры, чем промоторы генов с переменной экспрессией. Такой результат ограничивает универсальные утверждения о жёстких парах, но не отменяет избирательности в эндогенном локусе, где добавляются состояние хроматина и пространственная организация.Отсюда вывод: частота контакта и синтез РНК — разные величины. После вмешательства контакт может участиться, а количество новосинтезированной РНК останется прежним, если, например, промотор недоступен или его ответ ограничен другими условиями. И наоборот, количество РНК может измениться без заметного изменения контакта. Поэтому частоту контакта, доступность и количество РНК измеряют независимо и на сопоставимых сроках.Типичная ошибка Если энхансер чаще контактирует с промотором, синтез РНК этого гена обязательно растёт пропорционально.Контакт создаёт возможность взаимодействия, но не гарантирует результат. Доступность, набор факторов и свойства промотора ограничивают ответ, а связь частоты контакта с синтезом РНК не обязана быть линейной.После вмешательства частота контакта энхансера с промотором выросла, но количество новосинтезированной РНК не изменилось. Какое объяснение допустимо?А. Контакт участился, а продуктивный ответ промотора ограничен другими условиями. (верный вариант)Контакт создаёт возможность взаимодействия. Доступность, факторы и свойства промотора определяют результат.Б. Такой результат невозможен: контакт и транскрипция всегда меняются пропорционально. (неверный вариант)Частота контакта и синтез РНК — отдельные величины; строгая пропорциональность не установлена.В. Наличие контакта позволяет исключить влияние доступности промотора и его факторов. (неверный вариант)Контакт не устраняет других условий продуктивной транскрипции. Состояние промотора остаётся самостоятельным ограничением.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаBergman DT et al. 2022. Compatibility rules of human enhancer and promoter sequencesYang JH et al. 2024. Enhancer selectivity in space and time: from enhancer-promoter interactions to promoter activationHafner A et al. 2023. The spatial organization of transcriptional controlРезультаты ExP STARR-seq получены на репортёрных конструкциях в клетках человека линии K562 (Bergman и соавт., 2022); эндогенный локус дополнительно ограничен хроматином и топологией (Yang и соавт., 2024; Hafner и соавт., 2023). Числа на схеме условные: формула учебной модели показана рядом, и это не результат измерения.
Энхансер и промотор · шаг 11 из 28Как когезин и CTCF меняют контакты хроматинаКогезин — АТФазный мотор: за счёт гидролиза АТФ он увеличивает петлю хроматина, а ориентированные сайты CTCF могут остановить её рост. TAD — участок хроматина с повышенной частотой внутренних контактов. Его выявляют по карте, усреднённой по множеству клеток; такая карта не показывает постоянную петлю в каждой клетке.Что показывает схема. Схема показывает, как когезин, гидролизуя АТФ, увеличивает петлю между двумя точками хроматина и как ориентированные сайты CTCF могут её ограничить. NIPBL участвует в загрузке и активации когезина, а WAPL высвобождает его с ДНК. Рядом показана усреднённая карта контактов: внутри домена контакты чаще, чем через границу, но граница не исключает контактов. При удалении когезина показанная когезин-зависимая петля не образуется; другие механизмы контактов и транскрипционный ответ в схеме не рассчитываются.Когезин — SMC-комплекс с АТФазными головками: гидролиз АТФ позволяет ему процессивно втягивать ДНК в растущую петлю; этот процесс называют экструзией петли.Сайты связывания CTCF могут остановить экструзию, и результат зависит от ориентации мотива; WAPL высвобождает когезин с ДНК и ограничивает размер петли.На усреднённой карте контактов это видно как TAD: внутри домена контакты встречаются чаще, чем через границу, но граница не абсолютна.Когезин — кольцевой комплекс из семейства SMC. Субъединицы SMC1A и SMC3 образуют АТФазные головки, а RAD21 замыкает кольцо. NIPBL (с партнёром MAU2) участвует в загрузке когезина на ДНК и повышает активность его АТФазы. В опытах с очищенными белками человека когезин с NIPBL втягивал ДНК в растущую петлю процессивно, на десятки kb. Мутантный комплекс с нарушенным гидролизом АТФ ДНК не сжимал: значит, необходим гидролиз АТФ, а не одно связывание нуклеотида. Когезин и NIPBL–MAU2 при этом находились у основания петли. Как смена конформации АТФазных головок и кольца превращается в втягивание ДНК, остаётся предметом исследований, и схема этот этап не детализирует.Скорость и направление зависят от условий опыта. Средняя скорость сжатия ДНК составила около 0,5 kb/с при растяжении 0,3 пН (Kim и соавт., 2019), скорость отдельных петель достигала 2,1 kb/с (Davidson и соавт., 2019); при нагрузке 0,8 пН сжатие почти прекращалось. Эти числа получены на закреплённой ДНК in vitro и не равны скорости в ядре. Направление втягивания разные работы оценили по-разному. Kim и соавт. по данным с двойным закреплением ДНК предположили двустороннюю экструзию димером когезина, Davidson и соавт. описали симметричные петли, а в работе с одиночными молекулами (Barth и соавт., 2025) когезин втягивал ДНК с одной стороны, но направление могло переключаться; переключения тесно коррелировали со сменой субъединицы NIPBL, а петли также могли диффундировать и сжиматься. Поэтому одновременное и постоянное втягивание ДНК с обеих сторон нельзя считать установленным механизмом; на схеме рост петли в обе стороны показан как упрощение.Продвижение когезина могут задерживать сайты связывания CTCF, и важна ориентация мотива. Ориентация мотива — свойство сайта на ДНК: она определяет, какой стороной белок обращён к подходящему когезину. Направление экструзии — свойство движения конкретного комплекса, и оно может меняться. N-концевая область CTCF взаимодействует с субъединицами SA2 и RAD21 когезина, и это взаимодействие необходимо для CTCF-якорных петель (Li и соавт., 2020). В опытах с очищенными белками CTCF, обращённый N-концом к втягивающему ДНК когезину, останавливал экструзию примерно в 45 % встреч, а при противоположной ориентации сайта — примерно в 16 %; эффективность зависела от натяжения ДНК (Davidson и соавт., 2023). Следовательно, CTCF служит ориентированным, но неполным барьером. В клетках человека более 90 % сайтов CTCF в основаниях петель ориентированы навстречу друг другу, то есть конвергентно (Rao и соавт., 2014). Эту закономерность нельзя без проверки переносить на каждую реальную границу: положение сайтов, время пребывания когезина на ДНК, скорость его высвобождения и состояние участка меняют распределение контактов.Размер петли ограничивает также WAPL, который высвобождает когезин с ДНК. При его ослаблении петли удлинялись и возникали между неправильно ориентированными сайтами CTCF (Haarhuis и соавт., 2017; Wutz и соавт., 2017). Положение границ петли в клетке поэтому складывается из нескольких процессов: загрузки когезина, АТФ-зависимого роста петли, остановки у CTCF и высвобождения комплекса.Карта Hi-C показывает частоту контактов, усреднённую по множеству клеток. Области с повышенной частотой внутренних контактов видны на ней как TAD. Это статистическая картина, а не конформация одной клетки: петля не обязана существовать в каждой клетке непрерывно. Граница домена снижает вероятность части контактов через неё, но не исключает их. Поэтому положение энхансера внутри домена сужает поиск мишени, но не делает любой контакт за границей домена физически невозможным. Контакт энхансера с промотором также не обязан создаваться экструзией когезина: после быстрой деградации когезина или CTCF в клетках человека большинство контактов промоторов исчезало, но заметная часть сохранялась, а некоторые новые возникали (Thiecke и соавт., 2020).Что происходит при потере когезина? В клетках линии HCT-116 (колоректальная карцинома человека) быстрая деградация субъединицы RAD21 когезина через 6 ч устраняла когезин-зависимые петлевые домены. Компартментная организация сохранялась, а её выраженность усиливалась; исследованные гистоновые метки существенно не менялись. Эктопическая активация была редкой: из генов, не экспрессированных до воздействия, активировалось около 1 %. У 13 % генов, экспрессированных до воздействия, транскрипция изменилась более чем на 30 %, у остальных 87 % — менее чем на 30 %. Организацию контактов и транскрипционный ответ поэтому проверяют отдельно, в заданной клеточной системе и в выбранный срок.Типичная ошибка TAD — замкнутая «коробка»: контакты через её границу полностью исключены.Граница снижает вероятность части контактов, но не исключает их. TAD — статистическая характеристика популяции клеток и условий измерения, а не неподвижная структура с непроницаемой стенкой.После быстрого удаления субъединицы когезина RAD21 исчезла значительная часть когезин-зависимых петель. В ранний срок количество РНК многих генов изменилось мало. Какой вывод обоснован?А. Организация контактов и транскрипция могут меняться в разной степени и с разной скоростью. (верный вариант)Потеря петель не вызывает одинакового немедленного эффекта для каждого гена.Б. Если петля исчезла, экспрессия каждого гена внутри неё уже должна быть полностью подавлена. (неверный вариант)Такой обязательной связи нет: роль петли и время ответа проверяют для каждого локуса отдельно.В. CTCF и когезин вообще не влияют на пространственную организацию генома в клетках. (неверный вариант)Уже первое наблюдение условия — исчезновение петель после удаления RAD21 — показывает, что организация контактов изменилась.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаRao SSP et al. 2017. Cohesin Loss Eliminates All Loop DomainsHoencamp C et al. 2023. Genome control by SMC complexesKim Y et al. 2019. Human cohesin compacts DNA by loop extrusionDavidson IF et al. 2019. DNA loop extrusion by human cohesinBarth R et al. 2025. SMC motor proteins extrude DNA asymmetrically and can switch directionsLi Y et al. 2020. The structural basis for cohesin-CTCF-anchored loopsDavidson IF et al. 2023. CTCF is a DNA-tension-dependent barrier to cohesin-mediated loop extrusionRao SSP et al. 2014. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin loopingHaarhuis JHI et al. 2017. The cohesin release factor WAPL restricts chromatin loop extensionWutz G et al. 2017. Topologically associating domains and chromatin loops depend on cohesin and are regulated by CTCF, WAPL, and PDS5 proteinsThiecke MJ et al. 2020. Cohesin-dependent and -independent mechanisms mediate chromosomal contacts between promoters and enhancersСвойства SMC-комплексов, экструзия петель и роль CTCF описаны в обзоре Hoencamp и соавт. (2023). Экструзию очищенным когезином человека in vitro описали Kim и соавт. (2019; рекомбинантный когезин с C-концевым фрагментом NIPBL, закреплённая и растянутая ДНК, 0,3 пН для скорости 0,5 kb/с) и Davidson и соавт. (2019; когезин с NIPBL–MAU2); асимметрию и смену направления — Barth и соавт. (2025; одиночные молекулы in vitro). Ориентированный барьер CTCF описали Li и соавт. (2020; структура и клетки человека) и Davidson и соавт. (2023; одиночные молекулы in vitro: доли 45 % и 16 % относятся к условиям этого опыта, на клетку их переносить нельзя). Конвергентную ориентацию сайтов в основаниях петель определили Rao и соавт. (2014; клетки человека); действие WAPL — Haarhuis и соавт. (2017) и Wutz и соавт. (2017; культивируемые клетки); сохранение части контактов промоторов после деградации когезина или CTCF — Thiecke и соавт. (2020; клетки человека). Результаты быстрой деградации когезина — в работе Rao и соавт. (2017; клетки линии HCT-116, 6 ч после добавления ауксина; доли генов — по полному тексту: активировалось 216 из 14 853 генов, не экспрессированных в необработанных клетках; у 10 615 из 12 222 генов, экспрессированных в необработанных клетках, транскрипция изменилась менее чем на 30 %). Схема качественная: конкретные частоты контактов в ней не рассчитываются, время экструзии задано в условных единицах, рост петли в обе стороны от точки загрузки показан как упрощение, а ориентации сайтов CTCF показывают логику правила, а не закон для каждого локуса.
Энхансер и промотор · шаг 12 из 28Как факторы и коактиваторы связывают контакт с транскрипциейMediator, CBP/p300 и BRD4 по-разному участвуют в передаче влияния энхансера на транскрипцию. Связывание белка, ацетилирование гистона и изменение синтеза РНК — разные события, и измеряют их отдельно.Что показывает схема. Схема показывает четыре показателя разных этапов регуляции: контакт энхансера с промотором, H3K27ac, присутствие BRD4 и новосинтезированную РНК. Связывание, ацетилирование и функциональное влияние обозначены разными стрелками. Если новосинтезированная РНК не измерена, транскрипционный эффект не оценён: контакт, H3K27ac и присутствие BRD4 не заменяют такого измерения.Mediator способствует взаимодействию активаторов, связанных с энхансером, с аппаратом РНК-полимеразы II.CBP/p300 — ацетилтрансферазы: они присоединяют ацетильные группы к лизинам, в том числе к лизину 27 гистона H3 (H3K27ac).BRD4 связывает ацетилированные участки хроматина и участвует в регуляции транскрипции.Коактиватор — белок или комплекс, который способствует транскрипции, взаимодействуя с регуляторами и с транскрипционным аппаратом. На энхансере действуют сразу несколько таких белков, и их функции не совпадают.Mediator — многосубъединичный комплекс. Его хвостовой модуль связывается с активаторами на энхансере и облегчает сборку преинициаторного комплекса РНК-полимеразы II на промоторе. По данным обзора Yang и соавт., после острого удаления Mediator частота контактов энхансера с промотором, измеренная методом Hi-C, менялась мало (авторы обзора оговаривают технические ограничения таких методов). Это согласуется с тем, что связь между энхансером и промотором не сводится к одному белку, а контакт и функция коактиватора — разные величины.CBP и p300 — родственные ацетилтрансферазы. Они присоединяют ацетильную группу к лизинам гистонов, в частности к лизину 27 гистона H3, и поэтому на активных энхансерах появляется метка H3K27ac. Воздействия на эти белки бывают разными. Каталитический ингибитор A-485 конкурирует с ацетил-КоА и в клетках линии PC-3 снижал H3K27ac, но не H3K9ac. Блокада бромодомена CBP/p300 в моделях гематологических опухолей приводила к потере H3K27ac на энхансерах при сохранении самих белков на хроматине. Это два разных вмешательства, и результаты нельзя объединять в одно утверждение.BRD4 относится к BET-белкам: его бромодомены связывают ацетилированные лизины, поэтому BRD4 локализуется на ацетилированном хроматине. BET-ингибитор препятствует такому связыванию, и присутствие BRD4 в локусе уменьшается. Присутствие BRD4 — показатель связывания; он не равен ни контакту энхансера с промотором, ни синтезу РНК.Скопления коактиваторов в ядре описывают как возможные локальные конденсаты. Одной микрофотографии для вывода о фазовом разделении недостаточно; критерии и ограничения разобраны в следующем шаге.Типичная ошибка Если BET-ингибитор уменьшил присутствие BRD4 на энхансере, то синтез РНК мишени тоже снизился.Присутствие BRD4, контакт энхансера с промотором и синтез РНК — разные величины. Влияние ингибитора на транскрипцию оценивают по новосинтезированной РНК в том же временном интервале, а не по одному из первых двух показателей.BET-ингибитор уменьшил присутствие BRD4 в локусе, а контакт энхансера с промотором в тот же срок сохранился. Что необходимо измерить, чтобы оценить транскрипционный эффект?А. Новосинтезированную РНК мишени в том же временном интервале. (верный вариант)Сохранение контакта не отвечает на вопрос о продуктивности транскрипции. Нужен отдельный показатель синтеза РНК.Б. Исходное расстояние между элементами по последовательности ДНК. (неверный вариант)По исходному расстоянию нельзя судить о действии BRD4 на текущую транскрипцию.В. Наличие CTCF в другом локусе. (неверный вариант)Наличие CTCF в другом локусе не служит прямым показателем ответа исследуемой мишени.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаYang JH et al. 2024. Enhancer selectivity in space and time: from enhancer-promoter interactions to promoter activationHafner A et al. 2023. The spatial organization of transcriptional controlLasko LM. et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 2017;550:128–132. doi:10.1038/nature24028Raisner R. et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Rep. 2018;24:1722–1729. doi:10.1016/j.celrep.2018.07.041Роль Mediator и данные о контактах после его острого удаления даны по обзору Yang и соавт. (2024); A-485 как каталитический ингибитор CBP/p300 (клетки PC-3, снижение H3K27ac, но не H3K9ac) — по работе Lasko и соавт. (2017); зависимость активности энхансера от бромодомена CBP/p300 в моделях гематологических опухолей — по аннотации работы Raisner и соавт. (2018). Сведения о BRD4 и о действии BET-ингибиторов — общие, в источниках шага не проверялись. Состояния на схеме выбираются вручную и показывают логику измерений, а не результаты экспериментов.
Энхансер и промотор · шаг 13 из 28Что называют суперэнхансеромСуперэнхансер — группа соседних регуляторных элементов, выделенная по заданному критерию высокого суммарного сигнала. Порог такого отбора условен, а принадлежность к суперэнхансерам сама по себе не доказывает влияние на конкретный ген.Что показывает схема. Схема показывает ряд соседних регуляторных элементов с условным сигналом H3K27ac. Соседние элементы объединяются по заданному расстоянию, группы ранжируются по суммарному сигналу, а порог определяет, какие из них отнесены к суперэнхансерам. Изменение расстояния и порога меняет список; влияние группы на ген в схеме не проверяется.Соседние элементы с высоким сигналом H3K27ac или связывания коактиваторов объединяют в группу, если расстояние между ними меньше выбранного предела.Группы ранжируют по суммарному сигналу; к суперэнхансерам относят те, что превышают заданный порог.Влияние группы на ген проверяют отдельно: нарушают функцию элементов и измеряют РНК предполагаемой мишени с контролями.Суперэнхансер — не особая последовательность, а группа регуляторных элементов, выделенная по конкретному критерию: например, по высокому суммарному сигналу H3K27ac или связывания коактиваторов, таких как BRD4 и MED1. Один из способов выделения состоит в том, чтобы объединить близко расположенные элементы и проранжировать получившиеся группы по суммарному сигналу.Критерий условен. Если изменить расстояние, на котором соседние элементы объединяют, или порог суммарного сигнала, состав списка изменится: часть групп попадёт в него или выйдет из него. Поэтому «суперэнхансер» — операционное понятие, и в каждой работе нужно выяснить, по какой метке, при каком объединении и при каком пороге группу выделили.Выделенные так группы часто расположены рядом с генами клеточной идентичности. Например, в эмбриональных стволовых клетках мыши суперэнхансеры связаны с геном Nanog, а также с генами Klf4, Mir290 и Trim28 (Sabari и соавт., 2018). Однако высокий сигнал H3K27ac помогает лишь выбрать кандидатов: он не показывает, какой ген регулируется группой и нужна ли она для экспрессии этого гена. Для этого нарушают функцию элементов, например удаляют их или подавляют адресно, и измеряют новосинтезированную РНК предполагаемой мишени с контролями. Ближайший ген мишенью автоматически не считают.На суперэнхансерах эмбриональных стволовых клеток мыши BRD4 и MED1 образуют скопления с жидкоподобными свойствами; эксперименты in vitro и с 1,6-гександиолом поддерживают модель конденсации. Это не доказывает, что каждый суперэнхансер образует конденсат или что конденсат необходим для транскрипции: критерии косвенные, а 1,6-гександиол неспецифичен. Одинаковую чувствительность всех суперэнхансеров к BET-ингибитору тоже нельзя предполагать заранее.Типичная ошибка Суперэнхансер — одна очень длинная последовательность с особой функцией, а высокий сигнал H3K27ac доказывает регуляцию ближайшего гена.Суперэнхансер — группа соседних элементов, выделенная по заданному критерию с условным порогом. Сигнал H3K27ac помогает найти кандидатов, а мишень и необходимость группы устанавливают отдельным функциональным тестом.Группу элементов отнесли к суперэнхансерам по высокому суммарному сигналу H3K27ac. Какой дополнительный тест нужен, чтобы установить её влияние на выбранный ген?А. Нарушить функцию элементов и измерить РНК предполагаемой мишени с контролями. (верный вариант)Критерий классификации и функциональное действие проверяют отдельно.Б. Ограничиться высоким сигналом H3K27ac, потому что он уже доказывает функциональную связь. (неверный вариант)Метка помогает выделить кандидатов, но не доказывает причинную связь с конкретным геном.В. Выбрать ближайший ген, потому что суперэнхансеры действуют только на него. (неверный вариант)По близости расположения нельзя установить мишень регуляторного элемента.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаHafner A et al. 2023. The spatial organization of transcriptional controlYang JH et al. 2024. Enhancer selectivity in space and time: from enhancer-promoter interactions to promoter activationSabari BR. et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 2018;361:eaar3958. doi:10.1126/science.aar3958Определение по критерию сигнала и ограничения интерпретации даны по обзорам Hafner и соавт. (2023) и Yang и соавт. (2024); скопления BRD4 и MED1 в эмбриональных стволовых клетках мыши, эксперименты in vitro и с 1,6-гександиолом, а также связь суперэнхансеров с генами Nanog, Klf4, Mir290 и Trim28 — по работе Sabari и соавт. (2018). Значения на схеме искусственные и показывают логику классификации.
Энхансер и промотор · шаг 14 из 28Как проверить мишень энхансера и последствия перестройкиЧтобы установить мишень энхансера, нужно вмешаться в исходный локус и измерить новосинтезированную РНК. Контакт, доступность, метки хроматина и репортёрный тест — отдельные свидетельства, и каждое отвечает на свой вопрос.Что показывает схема. Схема сопоставляет методы и их ограничения (контакты, доступность, присутствие белка, репортёрный тест, делеция, CRISPRi, замена мотива, новосинтезированная РНК), а также показывает локус с границей, связанной с CTCF. При нарушении границы энхансеры получают доступ к другому гену, и возможна его эктопическая экспрессия; перестройка, сохраняющая границу, этого не вызывает.Hi-C и 4C показывают контакты, ATAC — доступность, ChIP и CUT&Tag — присутствие белка или модификации; вместе они помогают выбрать кандидата, но не доказывают регуляцию.Репортёрный тест показывает, что фрагмент способен усиливать транскрипцию в конкретной системе, а не то, что он регулирует данный ген в исходном локусе.Мишень устанавливают вмешательством в локус — делецией, подавлением (CRISPRi) или заменой мотива — и независимым измерением новосинтезированной РНК.Методы отвечают на разные вопросы. Hi-C и 4C измеряют частоту пространственной близости участков, ATAC — доступность хроматина для транспозазы, ChIP и CUT&Tag — присутствие белка или модификации около участка. Эти показатели помогают выбрать кандидатов в энхансеры и в мишени, однако ни один из них не доказывает, что элемент регулирует данный ген. Высокий сигнал ATAC в смеси клеток может отражать небольшую популяцию, а контакт не равен синтезу РНК.Репортёрный тест проверяет, способен ли фрагмент усиливать транскрипцию в конструкции. После переноса фрагмента меняются соседство, число копий и хроматиновый контекст. Поэтому положительный результат показывает активность фрагмента в этой системе, но система воспроизводит не все ограничения исходного локуса.Ближе к физиологии вмешательство в самом локусе. Делеция проверяет необходимость участка, но одновременно изменяет расстояния между соседними последовательностями. Точечная замена мотива точнее указывает на роль конкретного сайта связывания фактора, хотя может создать новый мотив. Подавление участка с помощью dCas9-KRAB (CRISPRi) даёт другую проверку, но вмешательство может менять местный хроматин. Если разные способы приводят к согласованному изменению новосинтезированной РНК, вывод устойчивее. Отсутствие эффекта одной делеции не доказывает, что элемент нефункционален: соседние элементы могут частично компенсировать его утрату.Перестройки показывают, как состав мишеней может меняться. В локусе WNT6/IHH/EPHA4/PAX3, охватывающем несколько TAD, делеции, инверсии и дупликации вызывают у людей разные пороки формирования конечности. В мышиных моделях с соответствующими перестройками кластер энхансеров конечности, в норме связанный с Epha4 внутри одного TAD, оказывался смещён относительно границ TAD и запускал эктопическую экспрессию другого гена локуса. Такое перераспределение контактов происходило только в тех случаях, когда вариант нарушал границу, связанную с CTCF.Типичная ошибка Если фрагмент усиливает репортёр и расположен рядом с геном A, то он регулирует ген A в исходном локусе.Репортёрный тест показывает активность фрагмента в конструкции, а близость и доступность лишь помогают выбрать кандидата. Мишень в исходном локусе устанавливают вмешательством и независимым измерением новосинтезированной РНК.В репортёрном тесте фрагмент усиливает экспрессию. Какой результат сильнее подтверждает, что в исходном локусе он регулирует именно ген A?А. Вмешательство в локус меняет новосинтезированную РНК A; независимое вмешательство даёт тот же результат. (верный вариант)Функциональное вмешательство в исходной системе связывает элемент с измеряемым ответом; нужны также контроль специфичности и жизнеспособности.Б. Фрагмент расположен ближе к гену A, чем к любому другому гену, находящемуся рядом с этим локусом. (неверный вариант)Расстояние полезно для выбора кандидата, но не устанавливает функциональную связь.В. Фрагмент имеет высокий ATAC-сигнал в смеси клеток, в которых экспрессируется ген A, и связывает активаторы. (неверный вариант)Доступность хроматина и связывание активаторов сами по себе не определяют ген-мишень.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаLupiáñez DG et al. 2015. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactionsBergman DT et al. 2022. Compatibility rules of human enhancer and promoter sequencesPreissl S et al. 2023. Characterizing cis-regulatory elements using single-cell epigenomicsYang JH et al. 2024. Enhancer selectivity in space and time: from enhancer-promoter interactions to promoter activationВозможности и ограничения методов описаны в обзорах Preissl и соавт. (2023) и Yang и соавт. (2024); совместимость последовательностей в репортёрной системе — в работе Bergman и соавт. (2022); перестройки района EPHA4 — в работе Lupiáñez и соавт. (2015; люди, модельные мыши, фибробласты пациентов). Сравнение делеции, замены мотива и CRISPRi дано как общее методическое знание: в названных обзорах оно не разбирается. Схема качественная и не содержит результатов измерений; она не заменяет интерпретацию нового варианта у конкретного пациента.
FOXO и сигнал · шаг 15 из 28Как сигнал инсулина достигает FOXOСигнал инсулина или IGF-1 доходит до FOXO по цепи реакций: рецептор → IRS → PI3K → PIP₃ → AKT → FOXO. PI3K фосфорилирует липид в мембране, а AKT — белок FOXO; количество AKT, её фосфорилирование и каталитическая активность — разные величины.Что показывает схема. Схема показывает цепь: инсулин или IGF-1 → рецептор → IRS → PI3K → PIP₃ в мембране → AKT (при участии PDK1 и mTORC2) → FOXO1. PTEN снижает содержание PIP₃. Без сигнала все показатели цепи низкие, при сигнале они повышаются по всей цепи. Селективный ингибитор PI3K снижает содержание PIP₃ и фосфорилирование FOXO1 при активном рецепторе. АТФ-конкурентный ингибитор AKT снижает фосфорилирование субстратов при высоком pAKT. Рапамицин не подавлял фосфорилирование FOXO1 по участкам AKT в клетках 293.Рецептор инсулина или рецептор IGF-1 фосфорилирует белки IRS, к которым присоединяется липидкиназа PI3K.PI3K превращает мембранный PI(4,5)P₂ в PIP₃; фосфатаза PTEN снижает содержание PIP₃.PIP₃ привлекает AKT к мембране, где её фосфорилируют PDK1 и mTORC2; активная AKT фосфорилирует FOXO по определённым участкам.Эта сеть знакома по семинару 4; здесь у неё новый выход — транскрипционный фактор FOXO. Последовательно разбираются положение фактора в клетке, его связывание с участком ДНК и синтез РНК мишени. После связывания инсулина или IGF-1 рецептор фосфорилирует адаптерные белки IRS, и к ним присоединяется липидкиназа PI3K. Её субстрат — мембранный фосфоинозитид PI(4,5)P₂: PI3K превращает его в PIP₃. На этом этапе FOXO ещё не затронут, а сам PIP₃ остаётся в мембране.PIP₃ служит местом связывания для киназы AKT, поэтому AKT локализуется у мембраны. Там её фосфорилируют PDK1 (по Thr308) и mTORC2 (по Ser473). Фосфатаза PTEN дефосфорилирует PIP₃ и тем самым снижает содержание этого липида; при потере PTEN оно может быть повышенным и без внешнего сигнала.Активная AKT фосфорилирует FOXO. В человеческом FOXO1 это остатки Thr24, Ser256 и Ser319; в клетках 293 их фосфорилирование при стимуляции IGF-1 подавлялось вортманнином, ингибитором PI3K, но не рапамицином. Поэтому порядок событий таков: сначала фосфорилируется липид, затем киназа AKT, затем транскрипционный фактор FOXO1.Для AKT различают три величины: количество белка, его фосфорилирование по Thr308 и Ser473 (pAKT) и каталитическую активность — способность фосфорилировать заданный субстрат. Эти величины не обязательно изменяются одновременно: pAKT показывает модификацию самой киназы, а активность оценивают по фосфорилированию её субстрата (шаг 20).Типичная ошибка PI3K — киназа, поэтому она сама фосфорилирует FOXO.Субстрат PI3K — фосфоинозитид в мембране, а не белок FOXO. FOXO1 фосфорилируется киназой AKT, которая активируется ниже по цепи, поэтому подавление PI3K действует на FOXO опосредованно — через PIP₃ и AKT.В клетках с сохранными рецептором и IRS селективно подавлена PI3K. Какое звено рассматриваемой цепи нарушено непосредственно?А. Образование мембранного PIP₃ из PI(4,5)P₂. (верный вариант)PI3K фосфорилирует фосфоинозитид. Дальнейшие изменения AKT и FOXO следуют из нарушения этого звена.Б. Экспорт FOXO1 из ядра в цитоплазму переносчиком PI3K. (неверный вариант)PI3K — липидкиназа, а не экспортный рецептор. Перенос FOXO меняется на последующих этапах сигнальной цепи.В. Фосфорилирование FOXO1 самой киназой PI3K. (неверный вариант)В рассматриваемой цепи субстрат PI3K — мембранный фосфоинозитид. FOXO1 фосфорилируется киназой AKT.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаRodriguez-Colman MJ et al. 2024. FOXO transcription factors as mediators of stress adaptationZhao X. et al. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. Biochem J. 2004;378:839–49. doi:10.1042/BJ20031450Rena G et al. 1999. Phosphorylation of the transcription factor forkhead family member FKHR by protein kinase BOkuzumi T. et al. Inhibitor hijacking of Akt activation. Nat Chem Biol. 2009;5:484–93. doi:10.1038/nchembio.183Фосфорилирование человеческого FOXO1 киназой PKB/AKT по Thr24, Ser256 и Ser319, его зависимость от PI3K (вортманнин) и независимость от рапамицина показаны в клетках 293 при стимуляции IGF-1 (Rena и соавт., 1999); эти же номера остатков названы в работе Zhao и соавт. (2004). Зависимость гиперфосфорилирования AKT по Thr308 и Ser473 от PI3K, PDK1 и mTORC2 описана в клетках HEK293 (Okuzumi и соавт., 2009). Роль PTEN дана как общее сведение о пути и в источниках шага не измерялась. Схема качественная: уровни условны и не измерены.
FOXO и сигнал · шаг 16 из 28Как фосфорилирование меняет распределение FOXO1Фосфорилирование FOXO1 меняет баланс между переносом белка в ядро и из ядра. Перенос в ядро и из ядра, связывание с ДНК и синтез РНК — разные события, и измеряют их отдельно.Что показывает схема. Модель показывает FOXO1, который постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой. Доля белка в ядре определяется соотношением констант импорта и экспорта. Фосфорилирование ослабляет импорт, усиливает экспорт или делает и то и другое, поэтому доля в ядре уменьшается, но не до нуля. Лептомицин B подавляет CRM1-зависимый экспорт: FOXO1 накапливается в ядре, но остаётся фосфорилированным, и его связывание с ДНК может быть слабым.FOXO1 постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой; в белке есть сигнал ядерной локализации (NLS) и сигнал ядерного экспорта (NES).Фосфорилирование Thr24, Ser256 и Ser319 влияет на перенос несколькими способами: с фосфорилированным FOXO1 связываются белки 14-3-3, а Ser319 и соседние остатки действуют совместно с NES.Экспорт FOXO1 из ядра чувствителен к лептомицину B; экспортным рецептором такого сигнала служит CRM1/XPO1 (для FOXO1 в источнике шага CRM1 прямо не показан).FOXO1 не закреплён ни в ядре, ни в цитоплазме: он постоянно переходит между ними. В белке есть сигнал ядерной локализации в C-концевой области ДНК-связывающего домена, богатой основными аминокислотами, и лейцин-богатый сигнал ядерного экспорта, чувствительный к лептомицину B. Установившаяся доля FOXO1 в ядре зависит от соотношения констант скорости импорта и экспорта. После изменения условий эта доля постепенно приближается к новому установившемуся значению.Фосфорилирование Thr24, Ser256 и Ser319 смещает это соотношение несколькими способами. Белки 14-3-3 связываются с фосфорилированным FOXO1, и для этого существенны одновременно Thr24 и Ser256. Ser319 и три соседних остатка действуют совместно с сигналом экспорта. Участок 1–50, слитый с GFP, достаточен для исключения белка из ядра, и для этого необходимо фосфорилирование Thr24. Эти способы не заменяют друг друга и не сводятся к одному остатку.Белок 14-3-3 — партнёр связывания, а не экспортный рецептор. FOXO1 переносится из ядра рецептором CRM1/XPO1, поэтому при активном сигнале инсулина под действием лептомицина B FOXO1 должен накапливаться в ядре, а его фосфорилирование — сохраняться. Связывание фосфорилированного FOXO1 с ДНК при этом может оставаться слабым. Это предсказание вытекает из устройства пути: в источниках шага такой эксперимент не описан.У других паралогов схема иная. Для FOXO4 (AFX) в клетках 3T3 показано, что AKT фосфорилирует белок в ядре по Ser193 внутри неклассического сигнала ядерной локализации и ослабляет импорт, а экспорт фосфорилированием не регулируется. Поэтому, говоря о переносе, называют белок, участок и клетки.Типичная ошибка Фосфорилированный FOXO1 связан с 14-3-3, значит, 14-3-3 выводит его из ядра.Белки 14-3-3 связывают фосфорилированные мотивы, но экспортным рецептором служит CRM1/XPO1. Авторы источника (Zhao и соавт., 2004) допускают, что белок 14-3-3, связанный в районе Ser256, может препятствовать ядерному импорту FOXO1 и его связыванию с ДНК; вклад каждого механизма зависит от участка и белка.На фоне активного сигнала инсулина в клетках с FOXO1 добавили лептомицин B, подавляющий CRM1-зависимый экспорт. Какое изменение следует проверять непосредственно?А. Уменьшение CRM1-зависимого экспорта и изменение доли FOXO1 в ядре. (верный вариант)Подавление экспорта и последующее изменение доли FOXO1 в ядре — разные события; фосфорилирование и связывание с ДНК измеряют отдельно.Б. Снятие всех фосфатных групп с FOXO1 ингибитором экспорта. (неверный вариант)Ингибитор экспортного рецептора не является фосфатазой.В. Активация всех мишеней FOXO1 независимо от состояния их хроматина. (неверный вариант)Удержание FOXO1 в ядре не гарантирует ни связывания с локусом, ни синтеза РНК.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаZhao X. et al. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. Biochem J. 2004;378:839–49. doi:10.1042/BJ20031450Brownawell AM et al. 2001. Inhibition of nuclear import by protein kinase B (Akt) regulates the subcellular distribution and activity of the forkhead transcription factor AFXRodriguez-Colman MJ et al. 2024. FOXO transcription factors as mediators of stress adaptationОстатки Thr24, Ser256, Ser319, участие 14-3-3 и участок 1–50 описаны для FOXO1 человека (Zhao и соавт., 2004; в реферате не названы киназа, клеточная линия и CRM1: сведение о CRM1 как экспортном рецепторе и о действии лептомицина B общее). Данные по FOXO4 (AFX) получены в клетках 3T3 (Brownawell и соавт., 2001). Схема на экране — учебная модель с условными константами скорости, а не измерения.
FOXO и сигнал · шаг 17 из 28Почему фосфорилирование FOXO даёт разные результатыФосфатная группа сама по себе не определяет результат: он зависит от киназы, участка белка, паралога и клеточных условий. Ацетилирование и деацетилирование добавляют ещё один независимый уровень регуляции.Что показывает схема. AKT фосфорилирует FOXO1 человека по Thr24, Ser256 и Ser319: белок исключается из ядра, активность подавляется. SGK1 фосфорилирует FOXO3, предпочитая Ser315, тогда как AKT предпочитает Ser253; обе киназы фосфорилируют Thr32. JNK (через Ral) фосфорилирует FOXO4 по Thr447 и Thr451; это фосфорилирование участвует в переходе FOXO4 в ядро и усиливает его активность. MST1 фосфорилирует консервативный участок forkhead-домена в первичных нейронах, нарушает связь с 14-3-3 и способствует переходу FOXO в ядро. AMPK фосфорилирует FOXO3 по шести участкам и усиливает его активность без изменения локализации. CBP ацетилирует FOXO4 и подавляет его активность, SIRT1 деацетилирует FOXO3 и действует двояко: усиливает остановку клеточного цикла и устойчивость к стрессу, но ослабляет гибель клеток.AKT и SGK фосфорилируют FOXO и подавляют его транскрипционную активность.Киназы JNK и MST1 фосфорилируют FOXO по другим участкам; в описанных системах это усиливает активность FOXO и способствует его переходу в ядро.AMPK изменяет активность FOXO3 без перемещения между ядром и цитоплазмой; ацетилирование и деацетилирование меняют транскрипционные свойства FOXO.Для вывода о влиянии фосфата нужно знать киназу, участок и белок. Фосфорилирование FOXO киназой AKT подавляет его транскрипционную активность. Для FOXO4 in vitro показано, что фосфорилирование Thr28 и Ser193 создаёт два мотива связывания для 14-3-3, и для полного подавления связывания с ДНК нужны оба.Стрессовые киназы действуют иначе. При окислительном стрессе JNK фосфорилирует FOXO4 по Thr447 и Thr451; это фосфорилирование участвует в переходе белка в ядро и в активации транскрипции. В первичных нейронах киназа MST1 фосфорилирует консервативный участок forkhead-домена FOXO и нарушает связь FOXO с 14-3-3; перенос FOXO в ядро приводит к гибели нейронов. Эти результаты получены на разных паралогах и в разных клетках, поэтому в одну схему их не складывают.AMPK фосфорилирует FOXO3 человека по шести участкам и усиливает его транскрипционную активность без изменения локализации; значит, активность FOXO нельзя вывести только из его положения. Ацетилирование образует отдельный уровень регуляции: при пероксидном стрессе CBP ацетилирует FOXO4 и подавляет его активность, а SIRT1 деацетилирует FOXO и продлевает транскрипцию генов ответа на стресс. На FOXO3 SIRT1 действует двояко: усиливает остановку клеточного цикла и устойчивость к окислительному стрессу, но подавляет индукцию гибели клеток.Убиквитинирование и протеасомная деградация FOXO — ещё один способ регуляции; он зависит от условий и здесь не рассматривается.Типичная ошибка Любое фосфорилирование FOXO выводит его из ядра и подавляет его работу.Для AKT это показано, но JNK, MST1 и AMPK фосфорилируют другие участки, и в описанных системах активность FOXO при этом растёт; у AMPK — без изменения локализации. Знак эффекта определяют участок, киназа, паралог и клетки.AKT и стрессовая киназа фосфорилируют FOXO по разным участкам. Можно ли предсказать одинаковый эффект только по наличию фосфата?А. Нет; нужно знать участок, киназу, паралог и клеточные условия. (верный вариант)Разные модификации меняют разные взаимодействия и функции.Б. Да; фосфорилирование по любому участку полностью активирует FOXO. (неверный вариант)Для AKT в изучаемом механизме фосфорилирование ограничивает доступ FOXO к части ядерных мишеней.В. Да; фосфорилирование по любому участку разрушает белок FOXO. (неверный вариант)Наличие фосфатной группы само по себе не означает, что белок будет расщеплён протеасомой.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаRodriguez-Colman MJ et al. 2024. FOXO transcription factors as mediators of stress adaptationZhao X. et al. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. Biochem J. 2004;378:839–49. doi:10.1042/BJ20031450Rena G et al. 1999. Phosphorylation of the transcription factor forkhead family member FKHR by protein kinase BTang ED et al. 1999. Negative regulation of the forkhead transcription factor FKHR by AktBrunet A et al. 2001. Protein kinase SGK mediates survival signals by phosphorylating the forkhead transcription factor FKHRL1 (FOXO3a)Essers MAG et al. 2004. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNKLehtinen MK et al. 2006. A conserved MST-FOXO signaling pathway mediates oxidative-stress responses and extends life spanGreer EL et al. 2007. The energy sensor AMP-activated protein kinase directly regulates the mammalian FOXO3 transcription factorvan der Horst A et al. 2004. FOXO4 is acetylated upon peroxide stress and deacetylated by the longevity protein hSir2(SIRT1)Brunet A et al. 2004. Stress-dependent regulation of FOXO transcription factors by the SIRT1 deacetylaseObsil T et al. 2003. Two 14-3-3 binding motifs are required for stable association of Forkhead transcription factor FOXO4 with 14-3-3 proteins and inhibition of DNA bindingУчастки и результаты приведены по рефератам первичных работ и относятся к разным системам: FOXO1 в клетках 293 и 293T (Rena и соавт., 1999; Tang и соавт., 1999); FOXO3 с SGK и AMPK (Brunet и соавт., 2001; Greer и соавт., 2007); FOXO4 с JNK и CBP в клетках и с 14-3-3 in vitro (Essers и соавт., 2004; van der Horst и соавт., 2004; Obsil и соавт., 2003); первичные нейроны с MST1 (Lehtinen и соавт., 2006; вид по индексации PubMed — крыса); SIRT1 и FOXO3 (Brunet и соавт., 2004). Обзор Rodriguez-Colman и соавт. (2024) дан как общая рамка.
FOXO и сигнал · шаг 18 из 28От ядерной локализации к связыванию с ДНК и синтезу РНКПрисутствие FOXO в ядре — условие его работы, но не доказательство связывания с участком ДНК и не доказательство синтеза РНК. Доля белка в ядре, занятость участка и новосинтезированная РНК — три разные величины со своими условиями.Что показывает схема. Схема сравнивает два образца по трём величинам: доля FOXO в ядре, занятость участка и новосинтезированная РНК мишени. При одинаковой доле в ядре занятость участка ниже, если участок недоступен, нарушен ДНК-связывающий домен или нет партнёрского фактора; синтез РНК, кроме того, зависит от условий на промоторе.Сначала FOXO перемещается между цитоплазмой и ядром; соотношение импорта и экспорта определяет долю FOXO в ядре.Затем FOXO связывается с доступным участком ДНК с помощью ДНК-связывающего домена; занятость участка зависит также от концентрации белка, сродства и других факторов.Наконец, на промоторе идёт транскрипция; её измеряют по новосинтезированной РНК.Доля FOXO в ядре характеризует распределение белка между ядром и цитоплазмой. Она сама по себе не определяет число молекул или концентрацию FOXO в ядре: для этого учитывают общее количество белка и объём ядра. Занятость конкретного участка зависит от ядерной концентрации FOXO, сродства к последовательности, доступности хроматина и времени связывания. Поэтому при одинаковой доле FOXO в ядре занятость одного и того же участка может различаться.Если участок закрыт нуклеосомой, FOXO может не связаться с ним, хотя в ядре присутствует. Если ДНК-связывающий домен нарушен так, что ядерный импорт сохранён, белок остаётся в ядре, но не связывается с мотивом. Важны и другие факторы: на промоторах IGFBP1 и G6PC в клетках HepG2 связывание FOXO1 и FoxA1/A2 было взаимозависимым, и после снижения связывания одного из них уменьшалось связывание другого и РНК-полимеразы II.В экспериментах in vitro с реконструированными нуклеосомами на фрагменте промотора Igfbp1 мыши замена S253D в рекомбинантном мышином FoxO1 ослабляла связывание с нуклеосомной ДНК; связывание со свободной ДНК сохранялось. Это отдельный эксперимент, а не измерение на двух промоторах в клетках HepG2. Он показывает действие фосфомиметической замены и не устанавливает, что фосфорилирование киназой в клетке даст такой же результат.Синтез РНК тоже проверяют отдельно: даже при занятом участке результат зависит от условий на промоторе. Поэтому локализацию FOXO, связывание с участком и новосинтезированную РНК измеряют разными методами (шаг 20).Типичная ошибка Если FOXO находится в ядре, его мотивы в каждом локусе постоянно заняты.Занятость зависит от концентрации, сродства, доступности участка и времени; постоянное насыщение участков не гарантировано. Закрытый хроматин и нарушенный ДНК-связывающий домен ограничивают связывание при сохранной ядерной локализации.В двух образцах доля FOXO в ядре одинакова. В одном из них доступность участка связывания FOXO снижена. Следует ли ожидать одинакового связывания FOXO с этим участком и синтеза РНК мишени?А. Нет; доступность участка и другие условия могут ограничить связывание и синтез РНК. (верный вариант)Локализация — лишь одно звено механизма. Проверяют связывание с исследуемым участком и синтез РНК мишени.Б. Да; одинаковая доля FOXO в ядре полностью определяет и связывание, и синтез РНК мишени. (неверный вариант)По доле FOXO в ядре нельзя судить о доступности каждого локуса и об условиях на промоторе.В. Да; наличие FOXO в ядре означает, что каждый его мотив в геноме постоянно занят белком. (неверный вариант)Занятость зависит от концентрации, сродства, доступности и времени; постоянное насыщение участков не гарантировано.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаYalley A et al. 2016. Loss of Interdependent Binding by the FoxO1 and FoxA1/A2 Forkhead Transcription Factors Culminates in Perturbation of Active Chromatin Marks and Binding of Transcriptional Regulators at Insulin-sensitive GenesRodriguez-Colman MJ et al. 2024. FOXO transcription factors as mediators of stress adaptationВзаимозависимое связывание FOXO1 и FoxA1/A2, изменение связывания РНК-полимеразы II и ацетилирования H3K27 проверяли на промоторах IGFBP1 и G6PC в клетках HepG2. Замены в мышином FoxO1, включая S253D, исследовали отдельно in vitro на свободной ДНК и реконструированных нуклеосомах (Yalley и соавт., 2016, полный текст, методы и рис. 1). Фосфомиметическая замена не равна фосфорилированию киназой. Уровни на экране качественные; количество белка и объём ядра фиксированы допущением модели.
FOXO и сигнал · шаг 19 из 28Почему эффект FOXO зависит от паралога и тканиFOXO1, FOXO3, FOXO4 и FOXO6 — продукты разных генов, а не разные состояния одного белка. Схему регуляции, установленную для одного паралога, проверяют для другого, а результат зависит от ткани и мишени.Что показывает схема. FOXO1, FOXO3 и FOXO4 имеют три консервативных района с мотивом фосфорилирования PKB; в мышином FoxO6 одного из них нет. При трансфекции GFP-слитый FoxO6 после обработки ростовыми факторами остаётся преимущественно в ядре, но его экспорт зависит от пути PI3K/PKB. FOXO1: Thr24, Ser256, Ser319; FOXO3: Thr32, Ser253, Ser315 (AKT предпочитает Ser253, SGK — Ser315); FOXO4: Thr28 и Ser193 (два мотива связывания 14-3-3 in vitro).Четыре белка FOXO человека кодируются разными генами и регулируются неодинаково.У FOXO1, FOXO3 и FOXO4 три консервативных района с мотивом фосфорилирования PKB; в мышином FoxO6 одного из них нет.Мишени и результат зависят от ткани: в печени это гены глюконеогенеза, в других системах — гены антиоксидантной защиты, регуляции клеточного цикла и клеточной гибели.FOXO1, FOXO3, FOXO4 и FOXO6 близки по ДНК-связывающему домену, но кодируются разными генами и регулируются неодинаково. Их нельзя считать состояниями одного белка: FOXO6 не является «дефосфорилированным FOXO1». Вывод, сделанный для одного паралога, поэтому проверяют для другого.Различие хорошо видно на FoxO6 мыши. В нём нет одного из трёх консервативных районов с мотивом фосфорилирования PKB, которые есть у других членов группы. В экспериментах с трансфекцией GFP-слитый FoxO6 после обработки ростовыми факторами оставался преимущественно в ядре, а FoxO1 и FoxO3 были преимущественно цитоплазматическими. При этом экспорт FoxO6 зависел от пути PI3K/PKB, так что у него иная схема регуляции, а не её отсутствие.Ткань и мишень тоже влияют на результат. В клетках HepG2 FOXO1 связан с промоторами IGFBP1 и G6PC; к генам глюконеогенеза относят также PCK1. В других системах среди мишеней FOXO называют SOD2, каталазу, CDKN1B, гены аутофагии и апоптоза. Набор мишеней зависит от паралога, доступности хроматина и сигнала, поэтому перечень не означает, что все они регулируются в одной клетке.Связь FOXO с продолжительностью жизни показана на модельных организмах, например на C. elegans, у которого ортолог FOXO — белок DAF-16. Это не даёт оснований для утверждений о продлении жизни человека или о лечебном эффекте.Типичная ошибка Если FOXO6 остаётся в ядре после обработки ростовыми факторами, он не зависит от сигнала PI3K и AKT.Экспорт мышиного FoxO6 зависит от пути PI3K/PKB, но схема регуляции переноса у него иная, чем у FOXO1: нет одного из трёх консервативных районов. Неполный ответ на сигнал не означает отсутствия регуляции.При одинаковом стимуле доля FOXO6 в ядре меняется иначе, чем доля FOXO1. Что следует учитывать, объясняя это различие?А. У паралогов различаются элементы регуляции переноса и модификаций. (верный вариант)Механизм, установленный для FOXO1, нельзя автоматически переносить на FOXO6.Б. FOXO6 представляет собой полностью дефосфорилированное состояние молекулы FOXO1. (неверный вариант)FOXO6 и FOXO1 — продукты разных генов. Различие паралогов не сводится к наличию фосфатных групп.В. Достаточно измерить pAKT; перенос каждого паралога отдельно оценивать не требуется. (неверный вариант)По pAKT нельзя судить о распределении FOXO. Особенности паралогов требуют прямого анализа локализации и связывания.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаJacobs FM. et al. FoxO6, a novel member of the FoxO class of transcription factors with distinct shuttling dynamics. J Biol Chem. 2003;278:35959–67. doi:10.1074/jbc.M302804200Rodriguez-Colman MJ et al. 2024. FOXO transcription factors as mediators of stress adaptationYalley A et al. 2016. Loss of Interdependent Binding by the FoxO1 and FoxA1/A2 Forkhead Transcription Factors Culminates in Perturbation of Active Chromatin Marks and Binding of Transcriptional Regulators at Insulin-sensitive GenesRena G et al. 1999. Phosphorylation of the transcription factor forkhead family member FKHR by protein kinase BBrunet A et al. 2001. Protein kinase SGK mediates survival signals by phosphorylating the forkhead transcription factor FKHRL1 (FOXO3a)Obsil T et al. 2003. Two 14-3-3 binding motifs are required for stable association of Forkhead transcription factor FOXO4 with 14-3-3 proteins and inhibition of DNA bindingBrownawell AM et al. 2001. Inhibition of nuclear import by protein kinase B (Akt) regulates the subcellular distribution and activity of the forkhead transcription factor AFXСведения о FoxO6 — по реферату работы Jacobs и соавт. (2003): белок мыши, GFP-слитая конструкция, трансфекция; клеточная линия и остатки в реферате не названы, количественных данных нет. Участки FOXO1, FOXO3 и FOXO4 даны по Rena и соавт. (1999), Brunet и соавт. (2001) и Obsil и соавт. (2003). Мишени в HepG2 — по Yalley и соавт. (2016). Перечень мишеней в других системах, а также PCK1 даны по программе курса и общим сведениям и не проверялись по первичным работам.
FOXO и сигнал · шаг 20 из 28Как проверить прямое звено регуляции FOXOКаждый показатель отвечает на свой вопрос: где находится FOXO, связан ли он с ДНК, фосфорилирован ли он и синтезируется ли РНК. Высокий pAKT не доказывает, что AKT фосфорилирует субстрат; для этого измеряют фосфорилирование самого субстрата.Что показывает схема. Положение FOXO показывают иммунофлуоресценция и анализ фракций; фосфорилирование остатка — фосфоспецифические антитела; активность AKT — фосфорилирование субстрата; связывание с ДНК — ChIP или CUT&RUN; транскрипцию — новосинтезированная РНК. При АТФ-конкурентном ингибиторе AKT pAKT может быть высоким при подавленном фосфорилировании субстрата GSK3β; при аллостерическом ингибиторе Akti-1,2 гиперфосфорилирование подавлялось. FOXO1-AAA не может быть фосфорилирован по Thr24, Ser256 и Ser319; фосфомиметическая замена имитирует фосфат лишь отчасти.Положение FOXO определяют иммунофлуоресценцией или в ядерной и цитоплазматической фракциях; фосфорилирование — фосфоспецифическими антителами.Связывание с участком ДНК измеряют методами ChIP или CUT&RUN, а синтез РНК — по новосинтезированной РНК.Каталитическую активность AKT оценивают по фосфорилированию её субстрата, а не по pAKT.Метод подбирают к вопросу. Положение FOXO показывают иммунофлуоресценция и анализ ядерной и цитоплазматической фракций, но связывание с ДНК они не показывают. Фосфорилирование конкретного остатка выявляют фосфоспецифические антитела. Занятость участка оценивают методами ChIP или CUT&RUN; их сигнал не равен абсолютной доле занятых молекул. О синтезе РНК за заданный интервал судят по новосинтезированной РНК, тогда как количество суммарной РНК зависит ещё и от распада.Особый случай — ингибиторы AKT. В клетках HEK293 АТФ-конкурентный ингибитор A-443654 вызывал гиперфосфорилирование AKT по Thr308 и Ser473, при этом фосфорилирование субстрата GSK3β по Ser9 было подавлено. Гиперфосфорилирование возникало и у каталитически неактивных вариантов AKT, поэтому его связывают с присоединением ингибитора к АТФ-связывающему участку. Для аллостерического ингибитора Akti-1,2 гиперфосфорилирование, напротив, подавлялось. Поэтому класс ингибитора называют явно, а активность AKT оценивают по субстрату. FOXO в этой работе не измеряли.Варианты белка также называют точно. FOXO1-AAA — белок с заменой Thr24, Ser256 и Ser319 на аланин; по этим участкам он не может быть фосфорилирован. Фосфомиметическая замена вносит отрицательный заряд, но не воспроизводит фосфорилирование полностью. Вывод о роли AKT поэтому строят на сравнении вариантов в одной системе и подтверждают независимым подходом.Типичная ошибка Фосфомиметический вариант FOXO1 ведёт себя так же, как фосфорилированный белок.Замена на остаток с отрицательным зарядом имитирует фосфат лишь отчасти. В работе Yalley и соавт. такая замена в ДНК-связывающем мотиве ослабляла связывание FoxO1 с нуклеосомой, но из этого не следует, что фосфорилирование киназой AKT в клетке даёт тот же результат.После АТФ-конкурентного ингибитора pAKT остаётся высоким, но фосфорилирование проверенного субстрата AKT снижено. Какой вывод лучше подтверждён?А. Каталитическая активность AKT по этому субстрату подавлена, хотя pAKT высок. (верный вариант)Субстратный тест непосредственно относится к исследуемой активности. Модификация самой киназы — другой показатель.Б. AKT по-прежнему активна по всем субстратам, потому что pAKT остаётся высоким. (неверный вариант)При таком классе ингибиторов уровень pAKT и фосфорилирование субстрата могут расходиться.В. Общее количество белка AKT в обработанных клетках уменьшилось до нуля. (неверный вариант)Ни фосфорилирование, ни субстратный тест сами по себе не показывают исчезновение всего белка.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаRodriguez-Colman MJ et al. 2024. FOXO transcription factors as mediators of stress adaptationOkuzumi T. et al. Inhibitor hijacking of Akt activation. Nat Chem Biol. 2009;5:484–93. doi:10.1038/nchembio.183Zhao X. et al. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. Biochem J. 2004;378:839–49. doi:10.1042/BJ20031450Tang ED et al. 1999. Negative regulation of the forkhead transcription factor FKHR by AktYalley A et al. 2016. Loss of Interdependent Binding by the FoxO1 and FoxA1/A2 Forkhead Transcription Factors Culminates in Perturbation of Active Chromatin Marks and Binding of Transcriptional Regulators at Insulin-sensitive GenesРезультаты с A-443654 получены в клетках HEK293; часть подтверждений на каталитически неактивных вариантах — в других линиях (Okuzumi и соавт., 2009). Дозы и сроки обработки даны на рисунках работы и здесь не приводятся; фосфорилирование FOXO в ней не измеряли. Тройная замена на аланин — по реферату Tang и соавт. (1999, клетки 293T). Схема на экране показывает качественное соответствие показателей, а не измерения.
Хроматиновая память · шаг 21 из 28Что нужно показать, чтобы говорить о клеточной памятиО клеточной памяти говорят, если изменённое состояние или изменённый ответ сохраняется после того, как исходное воздействие прекратилось. Остаток реагента, смена состава клеток и изменение хроматина могут давать внешне одинаковый результат, поэтому второй ответ сравнивают с контролем, получившим только второй стимул, а причину различия проверяют отдельными измерениями.Что показывает схема. Схема показывает ход эксперимента: первое воздействие, отмывка, период покоя и второй стимул у экспериментальной группы и у контроля того же возраста, который получает только второй стимул. Вывод о следе первого воздействия допустим, если есть одновременный контроль и ответы различаются. Отмывка и покой ограничивают вклад остатка реагента, а сопоставление состава клеток позволяет исключить смену популяции как причину различия. Измерение хроматина показывает различие состояния, но не называет носитель. Носитель устанавливают вмешательством в признак, а передачу потомкам — наблюдением за делящимися клетками.Клетки получают первое воздействие, затем его удаляют отмывкой, после чего наступает период покоя.Экспериментальная группа и контроль того же возраста, не получавший первого воздействия, одновременно получают второй стимул.Различие ответов при выполненных контролях указывает на влияние первого воздействия. Для проверки хроматиновой памяти измеряют предполагаемый признак хроматина и вмешательством проверяют его роль в повторном ответе.О клеточной памяти говорят, когда изменённое состояние или изменённый ответ сохраняется после того, как исходное воздействие прекратилось. В эксперименте это выглядит так: клетки получают первый стимул, его удаляют отмывкой, а после периода покоя клетки стимулируют повторно. Если ответ на второй стимул отличается от ответа клеток, которые первого воздействия не получали, возникает вопрос, какой след оставило первое воздействие.Чтобы ответить на этот вопрос, нужно различать несколько понятий. Состояние хроматина — это модификации гистонов, метилирование ДНК и доступность участков; его измеряют отдельно. Синтез РНК в данный момент и ответ на повторный стимул — функциональные показатели, и они не тождественны состоянию хроматина. Сохранение состояния в клетках, которые не делились, и передача его дочерним клеткам после митоза — разные утверждения: для проверки второго нужны деление клеток и наблюдение за потомками, и только передачу называют эпигенетическим наследованием.Контролем служит группа того же возраста, получившая только второй стимул в тот же срок. Сравнение с первым ответом тех же клеток не подходит: за время покоя могли измениться дифференцировка, плотность и состав культуры. Вклад остатка реагента ограничивают отмывкой и периодом покоя, а содержание вещества в среде проверяют отдельно. Изменение состава популяции выявляют подсчётом клеток разных типов и оценкой их выживаемости. Только после этого различие ответов связывают с первым воздействием, а носитель следа называют лишь после прямого измерения признака и вмешательства в него.Типичная ошибка Если ответ на второй стимул усилился, значит, след первого воздействия хранится в метке хроматина.Усиление показывает только, что ответ изменился. Тот же результат могут дать остаток реагента, смена состава клеток и возраст культуры; носитель следа определяют измерением признака и вмешательством в него. Поэтому нужны отмывка, контроль, получивший только второй стимул, и прямое измерение хроматина.После первого воздействия и покоя ответ на второй стимул вырос. С какой группой прежде всего нужно сравнить этот ответ?А. С клетками того же возраста, получившими только второй стимул в тот же срок. (верный вариант)Такой контроль отделяет влияние предшествующего воздействия от условий регистрации второго ответа.Б. С первым ответом тех же самых клеток, который был зарегистрирован неделю назад. (неверный вариант)За неделю могли измениться возраст, дифференцировка и состав культуры.В. С исходным содержанием одной гистоновой метки, измеренным в тех же самых клетках. (неверный вариант)Метка не заменяет функциональное измерение повторного ответа.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаSaeed S et al. 2014. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunityCheng SC et al. 2014. mTOR- and HIF-1α-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunityNetea MG et al. 2020. Defining trained immunity and its role in health and diseaseОпределение памяти и схема эксперимента — рабочие формулировки курса. Протоколы с β-глюканом на моноцитах человека описаны в работах Saeed и соавт. (2014) и Cheng и соавт. (2014), определение тренированного врождённого иммунитета — в обзоре Netea и соавт. (2020); все три источника прочитаны на уровне реферата. Схема на экране — учебный пример, а не воспроизведение одного эксперимента; сроки условные.
Хроматиновая память · шаг 22 из 28Как PRC2 восстанавливает H3K27me3H3K27me3 — триметилирование лизина 27 гистона H3: метку ставит каталитическая субъединица комплекса PRC2, а субъединица EED её распознаёт. Связывание EED с меткой повышает активность комплекса, и эта положительная обратная связь помогает восстанавливать метку после репликации.Что показывает схема. Схема показывает три нуклеосомы: старую с меткой H3K27me3, соседнюю и новую после репликации. EED узнаёт метку, EZH2 переносит метильные группы на H3, а связывание EED с меткой повышает активность EZH2. Если EED не узнаёт метку или исходной метки нет, аллостерического усиления не происходит. В показанной модели компенсация через EZH1 исключена, поэтому потеря каталитической активности EZH2 прекращает образование новых меток. Метка находится на гистоне H3, а не на ДНК.В PRC2 входят EZH2 (в некоторых клетках её заменяет EZH1), EED и SUZ12; метильные группы переносит домен SET в EZH2.EED связывается с триметилированным лизином на гистоновых хвостах, и это аллостерически активирует метилтрансферазу.Новая метка появляется на гистоне H3 соседней или новой нуклеосомы, а не на ДНК.Комплекс PRC2 содержит каталитическую субъединицу EZH2 (в некоторых клетках её заменяет EZH1), а также EED и SUZ12. Метильные группы на лизин 27 гистона H3 переносит домен SET в составе EZH2, поэтому H3K27me3 — модификация белка гистона, а не ДНК. Метилирование цитозина выполняют другие ферменты — DNMT.Субъединица EED связывается с триметилированными лизинами на гистоновых хвостах. В экспериментах in vitro это связывание аллостерически активировало метилтрансферазу PRC2, а мутации EED, нарушающие распознавание метки, устраняли эту активацию (Margueron и соавт., 2009). Получается положительная обратная связь: рядом с уже существующей меткой комплекс метилирует H3K27 быстрее. Авторы рассматривают её как основу восстановления метки на гистонах после репликации, то есть поддержания домена.Появление PRC2 на новом участке и образование первых меток рассматривают отдельно: в этом могут участвовать другие факторы. Присутствие комплекса на хроматине и его активность — разные величины: мутантные варианты EZH2 и EED почти не проявляли активности в клетках, хотя связывались с хроматином сходно с нормой (Lee и соавт., 2018). При потере EZH2 в эпителии кишечника мыши каталитическую функцию может частично брать на себя EZH1 (Jadhav и соавт., 2020).Сохранение репрессивного хроматина связано и с другой системой метилирования гистонов. Метилтрансферазы SUV39H1 и SUV39H2 образуют H3K9me3 — триметилированный лизин 9 гистона H3. Белки HP1 распознают эту метку и взаимодействуют с SUV39H1. Сами белки HP1 метильные группы не переносят. В перицентромерном гетерохроматине фибробластов мыши при снижении содержания HP1 уменьшалось накопление SUV39H1, а ниже примерно 80 % от нормы убывал и уровень H3K9me3; по количественным данным предложена модель, в которой стабильно связанные комплексы SUV39H способствуют сохранению метки и её ограниченному распространению на соседние нуклеосомы (Müller-Ott и соавт., 2014). Эти выводы относятся к перицентромерному гетерохроматину клеток мыши; без проверки их нельзя переносить на любой локус или на все формы памяти клетки.Следующий шаг отдельно рассматривает идеальный случай, когда образование новых меток H3K27me3 полностью прекращено.Типичная ошибка EED — это метилтрансфераза, которая сама ставит H3K27me3.Метильные группы переносит EZH2 (или EZH1) в составе PRC2. EED распознаёт метку и повышает активность комплекса; без активной каталитической субъединицы метка не образуется. H3K27me3 означает триметилирование лизина 27 гистона H3, а не метилирование цитозина ДНК.EED связывается с H3K27me3. Как это взаимодействие участвует в поддержании домена?А. EED аллостерически активирует PRC2 и способствует восстановлению H3K27me3. (верный вариант)Это положительная обратная связь: когда EED распознаёт продукт реакции (H3K27me3), комплекс PRC2 образует этот продукт быстрее.Б. EED переносит метильную группу на цитозин в новой цепи ДНК после репликации. (неверный вариант)Поддерживающее метилирование ДНК выполняют другие ферменты — DNMT; EED к ним не относится.В. EED удаляет метку H3K27me3 с гистона и затем превращает эту метку в H3K27ac. (неверный вариант)Субъединица EED узнаёт метку, но не удаляет её и не превращает в H3K27ac.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаMargueron R et al. 2009. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marksLee CH et al. 2018. Allosteric Activation Dictates PRC2 Activity Independent of Its Recruitment to ChromatinJadhav U et al. 2020. Replicational Dilution of H3K27me3 in Mammalian Cells and the Role of Poised PromotersMüller-Ott K et al. 2014. Specificity, propagation, and memory of pericentric heterochromatinАллостерическая активация PRC2 меткой показана в экспериментах in vitro. У дрозофилы мутации ESC, гомолога EED, нарушающие распознавание метки, снижали уровни H3K27me2/3 и нарушали развитие (Margueron и соавт., 2009, раздел результатов и рис. 4–5 полного текста). Расхождение между активностью и присутствием на хроматине описано для мутантных вариантов EZH2 и EED в клетках (Lee и соавт., 2018); эта работа в исходной проверке прочитана на уровне реферата. Компенсация потери EZH2 ферментом EZH1 сверена с разделом результатов и рис. 1 полного текста Jadhav и соавт. (2020). В показанной модели компенсация через EZH1 исключена допущением. Появление PRC2 на новых участках и образование первых меток схема подробно не рассматривает. Схема качественная, числа не показаны. Система H3K9me3–SUV39H–HP1 описана по Müller-Ott и соавт. (2014; фибробласты мыши, линия NIH-3T3; прочитаны реферат и фрагменты результатов полного текста): это модель перицентромерного гетерохроматина, а не общее правило для всех локусов.
Хроматиновая память · шаг 23 из 28Как деление и удаление меток меняют устойчивость состоянияПри репликации старые гистоны с меткой распределяются между двумя дочерними молекулами ДНК, а недостающие места занимают новые гистоны без метки, поэтому доля метки убывает и без химического удаления. Средняя доля метки и доля клеток, сохранивших домен, — разные показатели; порог сохранения домена в учебной модели задан условно.Что показывает схема. Модель показывает домен из десяти нуклеосом. При репликации каждая метка с вероятностью одна вторая остаётся в данной дочерней клетке, а недостающие места занимают новые гистоны без метки; затем метка может восстанавливаться и удаляться. Если метка не восстанавливается и не удаляется, средняя доля метки после каждого раунда репликации уменьшается примерно вдвое. Доля клеток, у которых домен сохранён, зависит от порога и падает иначе, чем среднее значение. В неделящихся клетках разведения нет.До репликации метки находятся на старых гистонах домена.После репликации старые гистоны распределяются между дочерними молекулами ДНК, а новые добавляются без метки: в среднем метка разводится вдвое.Восстановление метки ферментами, её удаление и замена гистонов меняют скорость убыли.Репликация удваивает суммарное число нуклеосом в двух дочерних молекулах ДНК домена. Старые гистоны с метками распределяются между двумя дочерними молекулами ДНК, а недостающие места занимают новые гистоны без метки. Если новые метки не образуются и метка химически не удаляется, то после одного раунда репликации доля H3K27me3 в домене в среднем уменьшается примерно вдвое, после двух раундов — примерно вчетверо. Для такой убыли не нужен фермент, удаляющий метку: её разводит рост числа нуклеосом.В эпителии кишечника мыши при удалении Ezh2 часть H3K27me3 сохранялась (авторы объясняют это частичной компенсацией ферментом EZH1), а исследованные гены-мишени оставались подавленными (Jadhav и соавт., 2020). Этот эксперимент нельзя описывать как полное прекращение образования меток. Идеальная модель разведения относится к иному условию: новые метки не образуются совсем. В той же работе в клетках B-клеточной лимфомы человека с мутантным EZH2 для снятия репрессии после подавления PRC2 требовалось несколько делений, а промоторы с высоким содержанием H3K4me2/3 активировались при остаточной H3K27me3. Поэтому условный порог модели нельзя приписывать конкретному гену.Среднее значение скрывает различия между клетками. В модели старые гистоны распределяются между дочерними молекулами независимо и случайно: одни клетки получают больше меток, другие меньше. Доля клеток, в которых домен ещё удерживает ген в неактивном состоянии, поэтому может падать раньше, чем среднее число меток опустится ниже порога. Положительная обратная связь через EED ускоряет восстановление метки комплексом PRC2 и тем самым замедляет её убыль, а деметилирование и замена гистонов убыль ускоряют.В клетках, которые не делятся, разведения нет. В них содержание метки меняется из-за обмена гистонов, деметилирования и процессов, связанных с транскрипцией. Поэтому в делящихся и неделящихся клетках домен утрачивается разными путями, и сравнивать такие клетки нужно в одном протоколе.Типичная ошибка Если доля метки снизилась, значит, метку химически удалили.При репликации доля метки убывает и без удаления: старые гистоны распределяются между дочерними молекулами ДНК, а новые добавляются без метки. Деметилирование и замена гистонов — отдельные процессы; чтобы отличить их вклад от разведения, сравнивают делящиеся и неделящиеся клетки.В учебной модели образование новых меток H3K27me3 полностью прекращено, химическое удаление метки исключено, старые гистоны распределяются между дочерними молекулами в среднем поровну. Как изменится доля H3K27me3 после одного раунда репликации?А. В среднем уменьшится примерно вдвое из-за добавления новых гистонов. (верный вариант)При прекращении образования H3K27me3 репликация уменьшает долю модифицированных гистонов за счёт добавления новых гистонов без метки. Это среднее значение для идеальной задачи.Б. Станет равной нулю сразу после прекращения образования новых меток. (неверный вариант)Прекращение образования новых меток не означает, что уже существующие метки немедленно исчезают.В. Не изменится, потому что модифицированные гистоны не распределяются при репликации. (неверный вариант)Распределение старых гистонов и добавление новых заданы условием.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаJadhav U et al. 2020. Replicational Dilution of H3K27me3 in Mammalian Cells and the Role of Poised PromotersMargueron R et al. 2009. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marksВ эпителии кишечника мыши при потере Ezh2 возможна частичная компенсация ферментом EZH1 (Jadhav и соавт., 2020, результаты и рис. 1 полного текста). Данные о задержке снятия репрессии в лимфомах человека с мутантным EZH2 приведены качественно. Формула, число нуклеосом (10), вероятности и порог на экране — допущения модели, а не измерения. Старые гистоны в модели распределяются между дочерними молекулами ДНК независимо, а приблизительно симметричное наследование родительских гистонов сестринскими хроматидами в расчёте не учтено. Положительная обратная связь через EED в модель не включена.
Хроматиновая память · шаг 24 из 28Как различить локальный носитель и устойчивую сеть факторовСостояние может сохраняться благодаря локальному носителю на самом аллеле или сети общих факторов, действующих в транс; эти объяснения проверяют разными экспериментами. Различие двух аллелей в одном ядре поддерживает возможность локального носителя, но не называет его химическую природу.Что показывает схема. Режим «Два аллеля в одном ядре»: оба аллеля находятся в одном ядре и получают одни и те же диффундирующие факторы. Если после удаления инициатора один аллель активен, а другой молчит, это поддерживает возможность локального носителя, но не называет его природу; изменение последовательности исключают секвенированием. Режим «Инактивация X (XIST)»: подъём Xist при участии SPEN, параллельное подавление генов с участием SPEN и Polycomb, привлечение SmcHD1 при дифференцировке, поддержание подавления, при котором часть генов избегает инактивации.Фактор действует в цис, если влияет на ту же молекулу ДНК или тот же аллель, и в транс, если диффундирует и действует на все доступные мишени.Оба аллеля находятся в одном ядре и получают одни и те же диффундирующие факторы.Если после удаления инициатора аллели остаются в разных состояниях, объяснение одними общими факторами теряет силу, а возможность локального носителя поддерживается.Регуляторное состояние может сохраняться двумя способами. Локальный носитель связан с самим аллелем: это метилирование цитозина, модификация гистонов или другой признак хроматина, воспроизводимый на этом участке; метилирование ДНК взаимодействует с другими слоями регуляции (Smith и соавт., 2025). Сеть транскрипционных факторов поддерживает состояние иначе: факторы взаимно усиливают синтез друг друга и действуют на все доступные мишени.Различить объяснения помогает наблюдение за двумя аллелями одной клетки при сопоставимых регуляторных последовательностях и исходном состоянии. Оба аллеля находятся в одном ядре и получают общие диффундирующие факторы. Если после удаления инициатора (исходного воздействия) один аллель остаётся активным, а другой нет, объяснение одними общими факторами становится менее вероятным, а возможность локального носителя поддерживается. Природу носителя такое наблюдение не устанавливает: для этого предполагаемую метку изменяют адресно, а изменение последовательности исключают секвенированием.Один из способов сохранения регуляторных признаков связан с митозом. Во время митоза транскрипция временно подавлена, а специфическое связывание многих транскрипционных факторов с хроматином ослабевает. В эритроидных клетках мыши (линия G1E-ER4) часть GATA1 оставалась на митотическом хроматине: около 5 % участков, занятых GATA1 в интерфазе, оставались занятыми и в митозе. Гены с митотическим GATA1 после выхода из митоза обычно возобновляли транскрипцию быстрее, чем гены без него, но само по себе это только корреляция. Роль GATA1 проверили его разрушением исключительно в митозе: оно задерживало возобновление транскрипции именно этих генов, тогда как гены без митотического GATA1 возобновляли транскрипцию в обычные сроки; авторы не исключают вклада повторного синтеза разрушенного белка в эту задержку (Kadauke и соавт., 2012). Это пример митотического сохранения регуляторных признаков, а не продолжения транскрипции в ходе митоза.Инактивация X-хромосомы показывает, что состояние устанавливают и поддерживают разные механизмы. Некодирующая РНК XIST (у мыши Xist) действует преимущественно в цис. В мышиных эмбриональных стволовых клетках для подъёма экспрессии Xist нужен SPEN, который привлекается рано и подавляет промотор Tsix (Robert Finestra и соавт., 2021). SPEN и Polycomb подавляют гены параллельно, а для подавления многих генов X-хромосомы нужно привлечение SmcHD1, зависящее от дифференцировки (Bowness и соавт., 2022). Часть генов избегает инактивации.Вычислительные модели показывают, что устойчивую память могут давать обратные связи, например между модификациями гистонов и метилированием ДНК (Bruno и соавт., 2022). Это теоретический вывод, экспериментальной проверки он не заменяет.Типичная ошибка Если два аллеля в одном ядре ведут себя по-разному, значит, носителем состояния служит H3K27me3.Различие аллелей показывает, что у состояния есть локальная составляющая. Химическую природу носителя оно не называет: это может быть метилирование ДНК, другая модификация гистонов или их сочетание. Носитель определяют адресным вмешательством в предполагаемую метку.Два аллеля в одном ядре имеют разную историю воздействия и сохраняют разную транскрипцию после удаления инициатора. Что это наблюдение поддерживает?А. Возможность локального носителя состояния, природу которого нужно установить. (верный вариант)Оба аллеля получают одни и те же растворимые факторы, поэтому объяснение только транс-факторами становится менее вероятным; конкретную метку это наблюдение не устанавливает.Б. Доказательство того, что носителем состояния служит именно метка H3K27me3. (неверный вариант)Различие аллелей не называет химический носитель без адресного вмешательства.В. Доказательство изменения нуклеотидной последовательности обоих аллелей в ядре. (неверный вариант)Разная активность может сохраняться без мутации; последовательность проверяют отдельно.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаBruno S et al. 2022. Epigenetic cell memory: The gene's inner chromatin modification circuitSmith ZD et al. 2025. DNA methylation in mammalian development and diseaseBowness JS et al. 2022. Xist-mediated silencing requires additive functions of SPEN and Polycomb together with differentiation-dependent recruitment of SmcHD1Robert-Finestra T et al. 2021. SPEN is required for Xist upregulation during initiation of X chromosome inactivationKadauke S et al. 2012. Tissue-specific mitotic bookmarking by hematopoietic transcription factor GATA1Данные по инактивации X приведены по рефератам: Robert Finestra и соавт. (2021) — мышиные эмбриональные стволовые клетки; в реферате Bowness и соавт. (2022) клеточная система не названа. Работа Bruno и соавт. (2022) — вычислительная модель, а не эксперимент. Обзор Smith и соавт. (2025; онлайн-публикация 2024) использован только для общего положения о взаимодействии метилирования ДНК с другими слоями регуляции. Существование генов, избегающих инактивации, — общие сведения, в источниках шага не проверялось. Схема на экране учебная, числовых значений нет. Митотическое сохранение GATA1 — по Kadauke и соавт. (2012; эритроидные клетки мыши, прочитан полный текст): авторы называют часть данных корреляционными и не исключают вклада повторного синтеза разрушенного белка в задержку реактивации.
Хроматиновая память · шаг 25 из 28Почему повторный ответ усиливается или ослабеваетУсиление повторного ответа после β-глюкана и ослабление после LPS — разные результаты, и каждый относится к своему протоколу, клеткам и измеренным цитокинам. В культуре моноцитов клетки между стимулами не делятся, поэтому такой эксперимент не показывает наследование через митоз.Что показывает схема. Моноциты человека: после β-глюкана, отмывки и покоя ответ на LPS выше, чем у контроля, получившего только LPS; после первого LPS ответ на второй LPS ниже (толерантность); β-глюкан частично восстанавливает ответ у толерантных клеток. IBET151 предотвращал толерантность, если добавлялся вместе с первым LPS, и не отменял её после него. Ингибиторы Akt, mTOR и HIF-1α вместе с β-глюканом препятствовали формированию усиленного ответа. Макрофаги мыши: потеря Eed снижала TNF и IL-6 и после однократного LPS, поэтому эксперимент не показывает, что PRC2 специфически вызывает толерантность. Деление клеток в этих экспериментах не рассматривали; носитель следа не установлен.В протоколе тренированного иммунитета моноциты получают β-глюкан, а после отмывки и периода покоя — LPS; ответ сравнивают с клетками, получившими только LPS.О толерантности говорят, когда после первого LPS ответ на второй LPS ниже, чем у клеток, получивших LPS впервые.Вмешательство во время первого стимула и вмешательство после него — разные эксперименты; они отвечают на разные вопросы.Моноциты человека в культуре получают β-глюкан, затем среду меняют, и клетки выдерживают в покое. После второго стимула — LPS — их цитокиновый ответ выше, чем у контроля, получившего только LPS (Cheng и соавт., 2014; Novakovic и соавт., 2016). Если первым воздействием был LPS, результат обратный: продукция TNF и IL-6 при втором LPS ниже, то есть развивается толерантность. Знак изменения зависит от первого стимула, а толерантность затрагивает не все гены (Foster и соавт., 2007, макрофаги мыши).Цитокиновый ответ, состояние хроматина и обмен веществ измеряют по отдельности. После β-глюкана меняются эпигенетические признаки на энхансерах и промоторах (Saeed и соавт., 2014), а аэробный гликолиз усиливается при участии сигнального пути дектин-1 — Akt — mTOR — HIF-1α; ингибиторы Akt, mTOR или HIF-1α, добавленные вместе с β-глюканом, препятствовали формированию усиленного ответа (Cheng и соавт., 2014). Ингибитор BET-белков IBET151 предотвращал толерантность, если его добавляли вместе с первым LPS, и не отменял её, если добавляли после него (Novakovic и соавт., 2016).Одно и то же вмешательство может менять и повторный ответ, и обычный ответ на однократный стимул. В макрофагах костного мозга мыши потеря Eed снижала TNF и IL-6 и после однократного LPS, поэтому эксперимент не показывает, что PRC2 специфически вызывает толерантность (Boonmee и соавт., 2024). Различие ответов говорит о следе первого воздействия, но не называет H3K27me3 носителем и не показывает передачу потомкам: в культуре моноцитов деления нет.Типичная ошибка Усиление ответа после β-глюкана доказывает, что метка передалась дочерним клеткам.В этом протоколе клетки не делились, поэтому передачу через митоз он проверить не мог. Он показывает, что функциональный ответ изменился и что изменились признаки хроматина и обмена веществ; носитель и режим наследования устанавливают отдельными тестами.Моноциты человека получили β-глюкан; затем клетки отмыли и выдержали в покое. При стимуляции LPS их цитокиновый ответ выше, чем у контроля, получившего только LPS. Деления в этом эксперименте не было. Какой вывод допустим?А. В этом протоколе первое воздействие связано с усилением ответа; наследование через митоз не проверено. (верный вариант)Функциональное различие ответов показано, но для установления носителя следа и режима наследования нужны отдельные тесты.Б. Доказано, что метка H3K27me3 передалась дочерним клеткам и определяет усиление ответа в этом эксперименте. (неверный вариант)Деления в условии нет, а значит, нет и дочерних клеток; условие не сообщает ни об измерении H3K27me3, ни о том, что эта метка служит носителем.В. Усиление ответа доказывает, что любой повторный стимул будет сильнее активировать все гены этих клеток. (неверный вариант)Результат относится к заданному протоколу, клеткам и измеренным цитокинам. Другие стимулы и гены могут давать иной ответ.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаSaeed S et al. 2014. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunityCheng SC et al. 2014. mTOR- and HIF-1α-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunityFoster SL. et al. Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications. Nature. 2007;447:972–8. doi:10.1038/nature05836Novakovic B. et al. β-Glucan Reverses the Epigenetic State of LPS-Induced Immunological Tolerance. Cell. 2016;167:1354–1368.e14. doi:10.1016/j.cell.2016.09.034Boonmee A. et al. A polycomb group protein EED epigenetically regulates responses in lipopolysaccharide tolerized macrophages. Epigenetics Chromatin. 2024;17:36. doi:10.1186/s13072-024-00562-6Протокол: моноциты человека, 24 ч с β-глюканом или LPS, отмывка, около пяти суток покоя, повторный LPS; TNF и IL-6 измеряли иммуноферментным анализом; деления клеток в модели нет; эпигеномные данные получены у небольшого числа доноров и носят ассоциативный характер (Novakovic и соавт., 2016, полный текст). Cheng и соавт. (2014) и Saeed и соавт. (2014) — моноциты человека, по рефератам. Foster и соавт. (2007) — макрофаги мыши in vitro, по реферату. Boonmee и соавт. (2024) — макрофаги костного мозга мыши, потеря Eed и ингибитор EED226, полный текст. Направления «выше» и «ниже» взяты из работ; числовых значений нет.
Хроматиновая память · шаг 26 из 28Как регуляция хроматина связана с памятью в нервной системеИзменения хроматина связывают с долговременной памятью, но молекулярный ответ нейронов и поведение животного — разные уровни, а результаты на мышах и крысах не объединяют. Ни для одной отдельной метки не показано, что она служит «записью» воспоминания, а польза ингибиторов HDAC для памяти человека экспериментами на мышах не доказана.Что показывает схема. Мышь. Сниженная ацетилтрансферазная активность CBP ухудшала долговременную память при сохранной кратковременной (Korzus и соавт., 2004). Избыток HDAC2 снижал ацетилирование H4K12 и H4K5, плотность шипиков и длительную потенциацию, а также ухудшал память; ингибитор SAHA улучшал память, но не у мышей без HDAC2 (Guan и соавт., 2009). У старых мышей восстановление ацетилирования H4K12 возвращало экспрессию генов и когнитивные показатели (Peleg и соавт., 2010). Крыса. После контекстного обусловливания страха в гиппокампе возрастала экспрессия DNMT; ген PP1 метилировался, и его транскрипция подавлялась, а ген reelin деметилировался и активировался (Miller и Sweatt, 2007). У транскриптов Bdnf с начальными экзонами I, IV, VI и IX экспрессия менялась по-разному вместе с метилированием ДНК и структурой хроматина; блокада NMDA-рецепторов предотвращала эти изменения и формирование памяти (Lubin и соавт., 2008). Данные двух видов на схеме не объединены; нейроны не делятся, наследование через митоз не обсуждается.У мышей снижение ацетилтрансферазной активности CBP нарушало консолидацию долговременной памяти, а избыток HDAC2 в нейронах снижал ацетилирование гистонов и ухудшал память.У взрослых крыс после контекстного обусловливания страха в гиппокампе менялись экспрессия DNMT и метилирование ДНК отдельных генов, в том числе Bdnf.Зрелые нейроны не делятся, поэтому речь идёт о динамике их состояния, а не о передаче этого состояния дочерним клеткам. При анализе целой ткани отдельно учитывают другие типы клеток.Ацетилирование гистонов и память у мышейУ мышей с трансгеном, снижающим ацетилтрансферазную активность CBP, приобретение и кратковременная память сохранялись, а консолидация долговременной памяти нарушалась; нарушение снималось отключением трансгена или введением трихостатина A, ингибитора HDAC, у взрослых животных (Korzus и соавт., 2004). Избыток HDAC2 в нейронах снижал ацетилирование гистона H4 по лизинам K12 и K5, плотность дендритных шипиков и длительную потенциацию (стойкое усиление синаптической передачи), а также ухудшал память; удаление HDAC2 вызывало обратные изменения. Ингибитор HDAC SAHA улучшал память у мышей дикого типа и с избытком HDAC2, но не у мышей без HDAC2 (Guan и соавт., 2009).У старых мышей при обучении нарушено ацетилирование H4K12; его восстановление возвращало экспрессию генов и когнитивные показатели (Peleg и соавт., 2010). Все эти данные получены на мышах и о пользе ингибиторов HDAC для памяти человека ничего не говорят. Эксперименты показывают, что функция CBP и HDAC2 влияет на результат поведенческого теста, но не показывают, что каждая ацетильная группа гистона хранит отдельное воспоминание.Метилирование ДНК в гиппокампе взрослых крысКонтекстное обусловливание страха — модель, в которой животное связывает обстановку с неприятным стимулом; память проверяют по поведению при возвращении в ту же обстановку. После такого обучения в гиппокампе взрослых крыс повышалась экспрессия ДНК-метилтрансфераз, а ингибирование DNMT нарушало формирование памяти. Метилирование разных генов менялось в разных направлениях: ген PP1 метилировался, и его транскрипция подавлялась, а ген reelin деметилировался и активировался (Miller и Sweatt, 2007). В обучении, значит, участвуют и метилтрансферазы, и деметилирование. Работы на крысах и на мышах выполнены в разных системах, поэтому их результаты не складывают в одну схему.Для Bdnf в гиппокампе показано, что транскрипты с начальными экзонами I, IV, VI и IX регулируются по-разному, и это сопровождается изменениями метилирования ДНК и структуры хроматина. Ингибитор DNMT зебуларин менял и метилирование, и экзон-специфичную экспрессию, а блокада NMDA-рецепторов предотвращала изменения метилирования и экспрессии и формирование памяти (Lubin и соавт., 2008). Разные начальные экзоны соответствуют разным промоторам одного гена, поэтому речь идёт о регуляции промоторов, а не об изменении сплайсинга.Зрелые нейроны не делятся, поэтому разведение метки при репликации само по себе не объясняет динамику метилирования в этих клетках. Кроме того, в работах Miller и Sweatt (2007), а также Lubin и соавт. (2008) изменения оценивали в гиппокампе взрослых крыс, где есть разные типы клеток; без отдельного анализа нейронов нельзя приписать все изменения исключительно им. Изменения экспрессии, метилирования и ацетилирования в нервной системе не тождественны памяти животного. Память оценивают поведенческим тестом, а роль исследуемого молекулярного процесса проверяют вмешательством.Типичная ошибка Эксперименты на мышах показали, что каждая ацетильная группа гистона хранит отдельное воспоминание, а ингибиторы HDAC улучшают память человека.Эксперименты показывают влияние функции CBP, HDAC2 или ингибитора на результат поведенческого теста у мышей. Соответствие отдельных химических групп содержанию воспоминаний они не устанавливают, а перенос на человека требует отдельных исследований.В эксперименте на взрослых мышах нарушена ацетилтрансферазная активность CBP, и долговременная память ухудшилась. Какой вывод не выходит за рамки этого эксперимента?А. Каталитическая функция CBP нужна для консолидации памяти в этой модели мышей. (верный вариант)Вмешательство связывает исследованную функцию CBP с результатом поведенческого теста в заданной системе.Б. Каждая ацетильная группа гистона в нейроне хранит отдельное воспоминание. (неверный вариант)Эксперимент не устанавливает соответствие отдельных химических групп содержанию воспоминаний.В. Показана эффективность любого ингибитора HDAC для улучшения памяти у человека. (неверный вариант)Данные на мышах не являются доказательством клинической эффективности у человека.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKorzus E et al. 2004. CBP histone acetyltransferase activity is a critical component of memory consolidationGuan JS et al. 2009. HDAC2 negatively regulates memory formation and synaptic plasticityMiller CA, Sweatt JD 2007. Covalent modification of DNA regulates memory formationLubin FD, Roth TL, Sweatt JD 2008. Epigenetic regulation of bdnf gene transcription in the consolidation of fear memoryPeleg S et al. 2010. Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in miceВсе данные получены на животных. Работа Guan и соавт. (2009) прочитана полностью (мыши; на схеме только направления изменений, а частоты замирания и дозы SAHA не приводятся). Korzus и соавт. (2004), Peleg и соавт. (2010), Miller и Sweatt (2007), Lubin и соавт. (2008) прочитаны на уровне реферата: у Korzus и Peleg — мыши, у Miller и Sweatt — взрослые крысы, у Lubin — гиппокамп при контекстном обусловливании страха (вид указан только в индексации PubMed). Направления изменения мРНК Bdnf в реферате Lubin не приведены; строение гена на схеме условное. Данные разных видов и работ на схемах не объединены.
Исследование · шаг 27 из 28Как выбрать величину, метод и контрольКаждый метод измеряет свою величину: химическую форму основания, состояние обеих цепей CpG-диады, доступность хроматина, присутствие белка, контакт участков, положение белка в клетке, новосинтезированную РНК или функциональный ответ. От названия метода нельзя перейти к причинному выводу: между ними стоят альтернативное объяснение и контроль, а корреляция, необходимость и достаточность требуют разных дизайнов эксперимента, то есть разных схем эксперимента.Что показывает схема. Бисульфитное секвенирование (BS-seq). Что измеряет: долю цитозинов, не превратившихся в урацил: 5mC и 5hmC читаются одинаково, как цитозин. Не отделяет 5mC от 5hmC и не позволяет сопоставить состояние двух комплементарных цепей одной исходной молекулы ДНК. Альтернативное объяснение: часть сигнала может приходиться на 5hmC, а не на 5mC; неполное превращение цитозина в урацил завышает долю метилирования. Контроль или дополнение: oxBS-seq или TAB-seq на тех же образцах и внутренний контроль полноты превращения. oxBS-seq и TAB-seq. Что измеряет: 5mC (oxBS-seq) и 5hmC (TAB-seq) по отдельности; при oxBS-seq 5hmC определяют по разности с обычным бисульфитным секвенированием. Без дополнительного связывания цепей не позволяет сопоставить их состояние в одной исходной молекуле ДНК. Сам по себе не устанавливает, каким путём изменилась метка: пассивной потерей, активным удалением или метилированием de novo. Альтернативное объяснение: один и тот же итоговый уровень метки могут дать разные процессы, а разность двух независимых запусков включает ошибку каждого из них. Контроль или дополнение: повторные запуски, внутренние контроли превращения и измерение во времени с учётом деления клеток. Метод шпильки (hairpin-бисульфитное секвенирование). Что измеряет: состояние обеих цепей одной молекулы ДНК: доли диад MM, MU и UU. Не показывает, почему появились полуметилированные диады, и в обычном варианте не отделяет 5hmC от 5mC. Альтернативное объяснение: диады MU возникают после репликации, пока новая цепь не метилирована, и при удалении метки с одной цепи. Контроль или дополнение: сравнение делящихся и неделящихся клеток, разные сроки после репликации и дополнительный анализ oxBS-seq. ATAC-секвенирование. Что измеряет: доступность хроматина для транспозазы. Не показывает, какой белок связан с участком, активен ли энхансер и идёт ли транскрипция. Альтернативное объяснение: в смеси клеток сигнал может отражать долю клеток с открытым участком, а не доступность во всех клетках; доступный участок не обязательно занят активатором. Контроль или дополнение: одноклеточный анализ или разделение клеток по типам, ChIP-секвенирование или CUT&Tag нужного белка и измерение новосинтезированной РНК. ChIP-секвенирование и CUT&Tag. Что измеряет: присутствие белка или модификации гистона на участке ДНК. Не показывает, действует ли белок на участке и какой ген регулируется этим участком. Альтернативное объяснение: сигнал может быть обусловлен неспецифическим связыванием антитела; метка гистона на участке не равна активности энхансера. Контроль или дополнение: контрольный образец (контрольное антитело или клетки без белка), измерение РНК предполагаемой мишени и вмешательство в участок. Hi-C. Что измеряет: частоту контактов между участками ДНК в популяции клеток. Не показывает, что контакт активирует промотор, и не отделяет контакт от доступности и транскрипции. Альтернативное объяснение: частота контакта зависит от общей близости участков внутри домена и от технических особенностей метода (Yang и Hansen, 2024); в клетках популяции контакт есть не всегда. Контроль или дополнение: независимый метод, например визуализация, измерение новосинтезированной РНК и вмешательство в контакт или в границу домена. Микроскопия и фракционирование клеток (FOXO). Что измеряет: отношение концентраций FOXO в ядре и цитоплазме (N/C) или распределение белка между фракциями; долю белка в ядре из N/C вычисляют только с учётом объёмов ядра и цитоплазмы. Не показывает связывание FOXO с ДНК и транскрипцию генов-мишеней. Альтернативное объяснение: FOXO в ядре может быть не связан с ДНК-мишенями; положение белка зависит и от ядерного импорта, и от экспорта. Контроль или дополнение: ChIP-секвенирование или CUT&RUN, новосинтезированная РНК мишеней и маркеры чистоты ядерной и цитоплазматической фракций. Новосинтезированная РНК. Что измеряет: РНК, образованную за установленный интервал регистрации, то есть текущую транскрипцию. Не показывает, какой фактор или метка вызвали изменение, и не измеряет стабильность РНК. Альтернативное объяснение: результат зависит от побочного действия вмешательства, жизнеспособности и деления клеток, а общее содержание РНК — ещё и от её распада. Контроль или дополнение: несколько сроков, контрольные гены, измерение жизнеспособности и числа делений. Цитокины (иммуноферментный анализ). Что измеряет: концентрацию TNF или IL-6 в среде как показатель функционального ответа клеток. Не показывает состояние хроматина, число отвечающих клеток и носитель следа. Альтернативное объяснение: остаток первого реагента и смена состава клеток за время покоя могут изменить ответ. Контроль или дополнение: группа, получившая только второй стимул, отмывка, подсчёт клеток и оценка жизнеспособности. Дизайн «Корреляция». Что делают: измеряют метку и транскрипцию в одном и том же состоянии клеток, не вмешиваясь. Допустимый вывод: метка и транскрипция связаны в этих клетках и этих условиях. Дизайн не показывает, что метка вызывает изменение транскрипции: транскрипция могла изменить метку, а обе величины могли зависеть от третьего фактора. Что усиливает вывод: адресное изменение метки и измерение транскрипции после него. Дизайн «Необходимость». Что делают: метку убирают там, где она есть, и измеряют транскрипцию. Допустимый вывод: при удалении метки транскрипция локуса меняется: метка нужна для исходного уровня транскрипции в изученных клетках. Дизайн не показывает, что метка достаточна, и не исключает побочного действия вмешательства на соседние участки и общие ферменты. Что усиливает вывод: контроль побочных эффектов и второе независимое вмешательство, дающее тот же результат. Дизайн «Достаточность». Что делают: метку вносят там, где её нет, и измеряют транскрипцию. Допустимый вывод: появление метки меняет транскрипцию в этой системе: при прочих равных условиях метки достаточно для этого изменения. Дизайн не показывает, что в норме транскрипцию определяет именно эта метка: результат зависит от факторов, имеющихся в клетках. Что усиливает вывод: контрольное вмешательство с каталитически неактивным ферментом, измерение самой метки и несколько сроков. Дизайн «Причинная связь метки с транскрипцией». Что делают: адресно изменяют метку, измеряют новосинтезированную РНК в несколько последовательных сроков и контролируют побочные эффекты вмешательства. Допустимый вывод: изменение метки предшествует изменению транскрипции и вызывает его в изученной системе. Дизайн не показывает, что метка — единственная причина и что вывод верен для других клеток и других локусов. Что усиливает вывод: второе независимое вмешательство или восстановление функции: при возврате метки транскрипция возвращается к исходному уровню.Для предполагаемого механизма определяют, какая величина должна измениться, если он верен, и выбирают метод, измеряющий именно её.Для каждого результата называют альтернативное объяснение — состав клеток, остаток реагента, побочное действие вмешательства — и контроль, который это объяснение проверяет.Причинную связь устанавливают вмешательством в предполагаемое звено и измерением следствия во времени; совпадение изменений двух величин показывает лишь корреляцию.Название метода не говорит о причине наблюдаемого явления, потому что каждый метод измеряет только свою величину. Обычное бисульфитное секвенирование читает 5mC и 5hmC одинаково, поэтому для их разделения применяют oxBS-seq (Booth и соавт., 2013). Метод шпильки показывает состояние обеих цепей CpG-диады, ATAC-секвенирование — доступность хроматина, ChIP-секвенирование и CUT&Tag — присутствие белка или метки, Hi-C — контакты, микроскопия — положение FOXO, анализ новосинтезированной РНК — текущую транскрипцию, измерение цитокинов — функциональный ответ. Регуляторные элементы описывают по независимым эпигеномным признакам (Preissl и соавт., 2023).Для каждого результата называют альтернативное объяснение и контроль. Доступный участок не обязательно занят активатором, метка гистона не равна активности энхансера, контакт не равен транскрипции, а различие между образцами клеток может отражать смену состава популяции. На трактовку данных Hi-C влияют технические особенности метода (Yang и Hansen, 2024). В работе Bergman и соавт. (2022) репортёрный анализ ExP STARR-seq измерял выход РНК для пар «энхансер × промотор» в клетках K562; такой анализ не описывает хроматин собственного локуса.Тип вывода определяет дизайн эксперимента. Корреляция не показывает направления связи; необходимость и достаточность устанавливают соответственно по исчезновению результата в отсутствие фактора и по появлению результата при введении фактора. Чтобы проверить, вызывает ли изменение метки изменение транскрипции, метку изменяют адресно, измеряют новосинтезированную РНК в несколько последовательных сроков и контролируют побочные эффекты вмешательства; второе независимое вмешательство усиливает вывод. Чтобы судить об изменении повторного ответа, нужен контроль того же возраста, получивший только второй стимул (Saeed и соавт., 2014).Типичная ошибка Если метод дал высокий сигнал на участке, значит, измерена причина транскрипции этого гена.Высокий сигнал показывает только ту величину, которую метод измеряет: доступность, присутствие белка или метки, контакт. Причинную роль устанавливают вмешательством в предполагаемое звено, измерением следствия во времени и контролем побочных эффектов.Нужно проверить, вызывает ли изменение конкретной метки изменение транскрипции локуса. Какой дизайн эксперимента проверяет эту гипотезу наиболее строго?А. Адресное изменение метки, измерение новосинтезированной РНК в несколько сроков и контроль побочных эффектов. (верный вариант)Вмешательство и временной порядок проверяют причинную зависимость; независимое вмешательство или восстановление функции дополнительно усиливают вывод.Б. Одновременное измерение высокого уровня метки и низкого уровня РНК в одной конечной точке в тех же образцах. (неверный вариант)Совпадение состояний устанавливает связь, но не направление причинности.В. Измерение общего количества фермента метилирования во всей клетке и сравнение этого количества с контролем. (неверный вариант)Общее количество фермента в клетке не определяет ни метку в конкретном локусе, ни её действие на транскрипцию этого локуса.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаBooth MJ et al. 2013. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosinePreissl S et al. 2023. Characterizing cis-regulatory elements using single-cell epigenomicsBergman DT et al. 2022. Compatibility rules of human enhancer and promoter sequencesSaeed S et al. 2014. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunityYang JH et al. 2024. Enhancer selectivity in space and time: from enhancer-promoter interactions to promoter activationBooth и соавт. (2013), Preissl и соавт. (2023) (обзор), Bergman и соавт. (2022), Yang и Hansen (2024) (обзор) и Saeed и соавт. (2014) прочитаны на уровне реферата. Booth и соавт.: BS-seq и oxBS-seq, 5mC и 5hmC. Preissl и соавт.: эпигеномные признаки регуляторных элементов (номер журнала 2023 г., онлайн-публикация 2022 г.). Bergman и соавт.: репортёрный анализ ExP STARR-seq, клетки человека K562, по 1000 последовательностей энхансеров и промоторов; то, что репортёрная система не отражает хроматин собственного локуса, — общее свойство такого анализа, а не вывод реферата. Yang и Hansen: в реферате названы технические особенности Hi-C, Micro-C и визуализации, влияющие на трактовку. Описания метода шпильки, ATAC-секвенирования, ChIP-секвенирования, CUT&Tag, CUT&RUN, а также требование контрольной группы, получившей только второй стимул (протоколы на моноцитах человека: Saeed и соавт., 2014), — общие сведения о методах и схеме эксперимента, не вывод конкретного реферата. Схема качественная, числовых результатов на ней нет.
Исследование · шаг 28 из 28Исследование одного регуляторного локусаИсследование локуса строят по порядку: сначала предсказывают раннее звено цепи, затем знакомятся с наблюдениями, выбирают измерения и контроли и только после этого формулируют границу вывода. Наблюдения в задачах качественные: числовых эффектов в них нет, а происхождение каждого показания указано.Что показывает схема. Инактивация DNMT1 при сохранном метилировании de novo. Делящаяся культура клеток млекопитающих, в которой DNMT1 инактивирована, а DNMT3A и DNMT3B сохраняют активность. До инактивации DNMT1 CpG-динуклеотиды в исследуемом локусе были метилированы на обеих цепях. Клетки проходят несколько делений. Раннее звено: копирование метки на новую цепь нарушено, и появляются полуметилированные диады. Наблюдения (условие задачи, качественно): в неделящихся клетках той же линии доля метилированных оснований за тот же срок осталась прежней. В делящихся клетках после нескольких делений доля полностью метилированных диад (MM) снизилась, а доля диад MU и UU выросла. 5hmC и участие TET в потере метки отдельно не оценивали. Необходимые измерения и контроли: метод шпильки (состояние обеих цепей диады); сравнение делящихся и неделящихся клеток; oxBS-seq или TAB-seq для 5hmC. Допустимый вывод: наблюдения согласуются с пассивной потерей метилирования при делениях; роль активного удаления ими не установлена. Снижение метилирования сайта CTCF. Между энхансером и промотором гена расположен сайт связывания CTCF, чувствительный к метилированию ДНК. В экспериментальной группе клеток метилирование этого сайта снижают адресным вмешательством; контрольная группа вмешательства не получает. Раннее звено: изменится связывание CTCF с сайтом. Наблюдения (условие задачи, качественно): метилирование сайта в экспериментальной группе снижено по сравнению с контролем. Общая РНК гена в экспериментальной группе в один срок отличается от контрольной. Связывание CTCF, контакты и новосинтезированную РНК в несколько сроков не измеряли. Необходимые измерения и контроли: ChIP-секвенирование или CUT&Tag для CTCF на сайте; Hi-C или другой метод измерения контактов энхансера и промотора; новосинтезированная РНК гена в несколько сроков. Допустимый вывод: метилирование сайта снижено, а общая РНК гена в один срок отличается; роль CTCF и контактов этими данными не установлена. Селективный АТФ-конкурентный ингибитор AKT. В культуре клеток инсулин или IGF-1 активирует PI3K и AKT. Экспериментальную группу обрабатывают селективным АТФ-конкурентным ингибитором AKT, контрольная группа получает растворитель. Срок воздействия — несколько часов. Раннее звено: снизится фосфорилирование субстратов AKT, например GSK3β по Ser9. Наблюдения (условие задачи, качественно): фосфорилирование AKT по Thr308 и Ser473 в экспериментальной группе выше, чем в контрольной. Фосфорилирование субстратов AKT, положение FOXO1, связывание FOXO1 с ДНК и новосинтезированную РНК не измеряли. Жизнеспособность клеток в обеих группах одинакова. Необходимые измерения и контроли: фосфорилирование субстрата AKT, например GSK3β по Ser9; доля FOXO1 в ядре; ChIP-секвенирование или CUT&RUN для FOXO1; новосинтезированная РНК генов-мишеней FOXO1. Допустимый вывод: повышено фосфорилирование AKT по Thr308 и Ser473; активность по субстратам AKT и дальнейшие звенья цепи «FOXO1 → транскрипция» не проверены. Вмешательство в PRC2 в период покоя после первого сигнала. Делящиеся клетки получили первый сигнал, после которого в исследуемом локусе появилась метка H3K27me3. Сигнал убрали; в период покоя клетки делятся. В этой учебной задаче EZH2 обеспечивает всё образование H3K27me3: компенсация через EZH1 исключена, а ингибирование считается полным. В экспериментальной группе в период покоя добавляют ингибитор EZH2 (каталитической субъединицы PRC2), контрольная группа получает растворитель; затем обе группы получают второй сигнал. Раннее звено: на новых гистонах не образуется H3K27me3, и доля метки в локусе снижается по мере делений. Наблюдения (условие задачи, качественно): в период покоя клетки делились; жизнеспособность в обеих группах одинакова. Клетки с первым сигналом и ингибитором ответили на второй сигнал иначе, чем клетки с первым сигналом без ингибитора. Метку H3K27me3 в локусе до и после периода покоя не измеряли. Необходимые измерения и контроли: H3K27me3 в локусе до и после периода покоя; число делений клеток за период покоя; клетки, получившие только второй сигнал, с ингибитором и без него; жизнеспособность и состав клеток. Допустимый вывод: различие ответов связано с вмешательством в PRC2 в этом протоколе; носитель следа и передача потомкам не доказаны. Повторный ответ после отмывки. Моноциты человека в культуре обрабатывают β-глюканом, реагент удаляют отмывкой, клетки выдерживают в покое и затем стимулируют LPS. После стимуляции LPS измеряют концентрацию TNF в среде. Сравниваемая величина: ответ на LPS у клеток после β-глюкана в сравнении с клетками, получившими только LPS. Наблюдения (условие задачи, качественно): ответ клеток на LPS после β-глюкана и покоя сильнее, чем их первый ответ на β-глюкан. Группу, получившую только LPS в тот же срок, не ставили. Удаление β-глюкана, деления и состав клеток не проверяли. Необходимые измерения и контроли: контрольная группа того же возраста, получившая только LPS; проверка удаления β-глюкана после отмывки; жизнеспособность и состав клеток. Допустимый вывод: усиление по сравнению с первым ответом тех же клеток нельзя отнести к первому воздействию: нужна группа, получившая только LPS.Предсказывают, какое звено цепи «воздействие → ранний молекулярный шаг → состояние хроматина → транскрипция или ответ» изменится первым.Знакомятся с наблюдениями и выбирают измерения, позволяющие различить конкурирующие объяснения, и контроли, исключающие остальные объяснения.Формулируют вывод по тому, что измерено: согласие с предсказанием не доказывает механизм, а граница вывода зависит от условий и методов.Каждая задача задаёт исходное состояние, воздействие и наблюдения, не зависящие от выбора студента. Раннее звено цепи предсказывают до знакомства с наблюдениями; в задаче о повторном ответе вместо звена называют величину, которую сравнивают. При инактивации DNMT1 раньше всего нарушается копирование метки на новую цепь, при снижении метилирования сайта CTCF — связывание CTCF, при подавлении активности AKT АТФ-конкурентным ингибитором — фосфорилирование субстратов AKT, при подавлении PRC2 — образование H3K27me3 на новых гистонах.Измерения выбирают в соответствии с выводом, который нужно обосновать. Пассивную потерю метилирования проверяют анализом состояния обеих цепей диады, сравнением делящихся и неделящихся клеток и определением 5hmC; для сайта CTCF измеряют связывание, контакты и новосинтезированную РНК, причём контакт и активация промотора — разные величины (Yang и Hansen, 2024). При подавлении активности AKT нужно измерять фосфорилирование субстрата и положение FOXO1, а не только фосфорилирование самой AKT, которое при таком ингибиторе может расти (Okuzumi и соавт., 2009).Граница вывода зависит от измеренного. Согласие с предсказанием показывает совместимость объяснения с данными, но не исключает других объяснений; механизм считают установленным, когда вмешательство в звено меняет следствие, а контроли исключают конкурирующие объяснения. Если измерено лишь сохранение H3K27ac, обосновано только оно: изменение повторного ответа и передача метки дочерним клеткам не проверены. Метилирование ДНК действует вместе с другими регуляторными уровнями (Smith и соавт., 2025), а первое воздействие связывают с изменением повторного ответа лишь в данном протоколе (Saeed и соавт., 2014).Типичная ошибка Результат измерения согласуется с предсказанием, значит, механизм доказан.Согласие с предсказанием показывает, что объяснение совместимо с данными, но другие объяснения остаются возможными. Механизм подтверждают вмешательством в звено, измерением следствия во времени и контролями; граница вывода определяется измеренной величиной и условиями.После первого воздействия сохраняется H3K27ac, но повторный стимул ещё не подавали. Какое утверждение уже обосновано?А. Сохраняется измеренная метка; изменение повторного ответа ещё не установлено. (верный вариант)Наблюдение относится к метке. Чтобы говорить о памяти ответа, нужны повторный стимул и сопоставимый контроль.Б. Доказан более сильный ответ клеток на повторный стимул после первого воздействия. (неверный вариант)Повторного воздействия в условии ещё нет.В. Доказано наследование этой метки дочерними клетками через неограниченное число делений. (неверный вариант)Число делений и передача состояния дочерним клеткам не исследованы.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаSaeed S et al. 2014. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunityYang JH et al. 2024. Enhancer selectivity in space and time: from enhancer-promoter interactions to promoter activationSmith ZD et al. 2025. DNA methylation in mammalian development and diseaseOkuzumi T. et al. Inhibitor hijacking of Akt activation. Nat Chem Biol. 2009;5:484–93. doi:10.1038/nchembio.183Задачи составлены для курса по механизмам шагов 1–26; наблюдения в них качественные, числовых эффектов нет, а у каждого показания указано происхождение — условие задачи. Okuzumi и соавт. (2009): полный текст основной статьи, клетки HEK293; АТФ-конкурентные ингибиторы AKT вызывали гиперфосфорилирование AKT при подавленном фосфорилировании GSK3β по Ser9 (рисунки и дополнительные материалы не прочитаны). Saeed и соавт. (2014), Yang и Hansen (2024) и Smith и соавт. (2025) прочитаны на уровне реферата; Yang и Hansen и Smith и соавт. — обзоры. Задача о повторном ответе построена по протоколу на моноцитах человека (β-глюкан, отмывка, покой, LPS); сроки в ней не заданы. Связь между этапами цепей в задачах — рабочая учебная схема, а не результат одного эксперимента.
