mTORC1 и сигналы · шаг 1 из 32Что регулирует комплекс mTORC1mTORC1 — белковый комплекс с киназной активностью, который связывает сигналы о доступности аминокислот с регуляцией клеточного метаболизма. Его действие оценивают по конкретным субстратам, а не по одному общему признаку «клетка растёт».Что показывает схема. Слева показан комплекс mTORC1 (киназа mTOR и RAPTOR), справа — четыре его субстрата и процессы, на которые влияет их фосфорилирование: S6K1 (T389, активация, синтез белка), 4E-BP1 (связывание с eIF4E ослаблено), ULK1 (S758 у человека, начало аутофагии ограничено), TFEB (S211 у человека, удержание в цитоплазме). Переключатель показывает отдельно комплекс mTORC2 (mTOR и RICTOR) и его субстрат AKT.Киназа mTOR входит в состав комплекса mTORC1 вместе с RAPTOR и другими белками.mTORC1 фосфорилирует субстраты, влияющие на синтез белка и на аутофагический аппарат.Разные субстраты могут по-разному отвечать на одно воздействие.Фосфорилирование — присоединение фосфорильной группы к молекуле. Для белков эту реакцию катализируют киназы: фермент переносит концевую фосфорильную группу ATP на остаток серина, треонина или тирозина белка-субстрата. mTOR — серин/треониновая киназа. Сама по себе молекула mTOR ещё не определяет, какие субстраты будут фосфорилированы: фермент входит в состав двух разных белковых комплексов, и их свойства задаются также белками-партнёрами. Поэтому в объяснениях различают mTOR — название фермента — и mTORC1 — название комплекса, в котором mTOR связан с белком RAPTOR и другими субъединицами.RAPTOR — регуляторный белок комплекса mTORC1. Он связывает субстраты и участвует во взаимодействии комплекса с белками лизосомной мембраны. Среди субстратов mTORC1 в семинаре рассматриваются четыре. S6K1 — киназа рибосомного белка S6; фосфорилирование S6K1 по T389 комплексом mTORC1 необходимо для её активации, а активная S6K1 стимулирует синтез белка. 4E-BP1 — белок, который связывается с фактором инициации трансляции eIF4E (белком, связывающим кэп-структуру на 5′-конце мРНК) и препятствует инициации трансляции. ULK1 — киназа, участвующая в начале образования аутофагосомы — двухмембранного пузырька, который доставляет участок цитоплазмы в лизосому. TFEB — транскрипционный фактор, который в ядре активирует экспрессию генов лизосомных белков и белков аутофагии.Последствия фосфорилирования у этих белков разные. Фосфорилированная S6K1 активна. Фосфорилирование 4E-BP1 ослабляет его связывание с eIF4E, и eIF4E становится доступен для инициации трансляции: здесь модификация снимает торможение. Фосфорилирование ULK1 по S758 (у человека; у мыши этот участок имеет номер S757) ограничивает участие ULK1 в начале аутофагии. Фосфорилированный TFEB связывается с белками 14-3-3, которые связывают определённые фосфорилированные участки других белков, и удерживается в цитоплазме, поэтому экспрессия его генов-мишеней снижается. Как TFEB, который при голодании преимущественно находится в ядре, вновь оказывается доступен лизосомному mTORC1, объяснено в шаге 6. Один и тот же комплекс стимулирует одни процессы и подавляет другие, поэтому для каждого субстрата нужен свой показатель: фосфорилирование определённого участка, связывание с партнёром или локализация.Второй комплекс, mTORC2, содержит вместо RAPTOR белок RICTOR и фосфорилирует другие субстраты, в частности киназу AKT. Основной материал семинара посвящён mTORC1; сравнительная схема mTORC2 помогает различить состав и субстраты двух комплексов. Значение регуляции mTORC1 видно на примере туберозного склероза. Это наследственное заболевание связано с мутациями генов TSC1 или TSC2, которые кодируют белки комплекса TSC; в норме этот комплекс ограничивает активность mTORC1 через малую ГТФазу RHEB (её действие разобрано в шаге о ростовом сигнале). При утрате функции TSC активность mTORC1 повышена и меньше зависит от ростовых сигналов; с этим связывают образование доброкачественных опухолей (гамартом) в разных органах.Типичная ошибка Фосфорилирование всегда активирует любой белок.Эффект зависит от белка и модифицируемого участка. Например, фосфорилирование 4E-BP1 может ослаблять его связывание с eIF4E, тогда как фосфорилирование TFEB способствует удержанию фактора вне ядра.В препарате обнаружен белок mTOR. Какое дополнительное наблюдение позволит отнести его к комплексу mTORC1?А. Совместное присутствие mTOR и RAPTOR в выделенном комплексе. (верный вариант)RAPTOR — характерный компонент mTORC1; состав комплекса информативнее одного наличия mTOR.Б. Совместное присутствие mTOR и RICTOR в выделенном комплексе. (неверный вариант)RICTOR характерен для mTORC2, а не mTORC1.В. Содержание ATP в клетках, из которых выделен этот препарат. (неверный вариант)Содержание ATP не устанавливает состав выделенного комплекса.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Cui Z., Esposito A., Napolitano G., Ballabio A., Hurley J. H. Structural basis for mTORC1 activation on the lysosomal membrane. Nature. 2025;647:536–543. doi:10.1038/s41586-025-09545-3Основная схема относится к клеткам млекопитающих. Состав и функции представлены качественно; это не результат коиммунопреципитации в новом эксперименте.
mTORC1 и сигналы · шаг 2 из 32Как аминокислотный сигнал меняет положение mTORC1Аминокислотный сигнал регулирует связывание mTORC1 с Rag-ГТФазами на цитозольной поверхности лизосомы. Перемещение к лизосоме и фосфорилирование субстрата — разные события.Что показывает схема. Цитозольная поверхность лизосомы: Ragulator удерживает гетеродимер RagA/B–RagC/D. GATOR1 ускоряет гидролиз GTP у RagA/B, FLCN–FNIP — у RagC/D. В конфигурации RagA/B–GTP и RagC/D–GDP гетеродимер связывает RAPTOR и mTORC1 находится у лизосомы; при поддержанном RHEB–GTP фосфорилируется S6K1. В обратной конфигурации mTORC1 остаётся в цитозоле, фосфорилирование S6K1 низкое.Ragulator удерживает Rag-гетеродимер на лизосомной мембране.Сочетание RagA/B–GTP и RagC/D–GDP способствует связыванию RAPTOR.Связывание привлекает mTORC1 к мембране и создаёт условия для дальнейшей активации.У лизосомы две стороны: цитозольная поверхность мембраны и просвет. Белки, регулирующие mTORC1, собираются на цитозольной поверхности; сам mTORC1 находится на цитозольной стороне мембраны и в просвет лизосомы не переходит. Rag-ГТФазы — малые ГТФазы, которые образуют гетеродимер: RagA или RagB соединена с RagC или RagD. ГТФазой называют белок, который связывает GTP или GDP; в этих двух формах белок взаимодействует с разными партнёрами, а гидролиз связанного GTP переводит его из одной формы в другую.Гетеродимер Rag удерживается на мембране комплексом Ragulator. Ragulator — белковый комплекс, закреплённый на цитозольной поверхности лизосомы; на нём собираются сигнальные белки. Когда аминокислот достаточно, RagA/B связана с GTP, а RagC/D — с GDP. В такой асимметричной конфигурации гетеродимер связывается с RAPTOR, и mTORC1 привлекается к лизосомной мембране. При противоположной конфигурации (RagA/B–GDP и RagC/D–GTP) RAPTOR связывается слабо, и mTORC1 остаётся в цитозоле.Нуклеотидное состояние двух половин гетеродимера регулируют разные белки. GAP (белок, ускоряющий гидролиз GTP) переводит ГТФазу в GDP-форму. Комплекс GATOR1 — GAP для RagA/B: он ускоряет гидролиз GTP у RagA/B и тем самым ослабляет аминокислотный сигнал. При достаточном содержании аминокислот действие GATOR1 ограничено; как это происходит, разобрано в следующем шаге. FLCN в комплексе с белком FNIP — GAP для RagC/D: переводя RagC/D в GDP-форму, он создаёт вторую половину активной конфигурации. Поэтому нельзя сказать, что для активного состояния обе Rag должны связать GTP. Присутствие FLCN–FNIP на лизосоме не равнозначно его GAP-активности: при недостатке аминокислот этот комплекс может входить в неактивный лизосомный комплекс с Rag и Ragulator (подробнее в шаге 6).Схема показывает основной Rag-зависимый путь. Описаны и Rag-независимые пути регуляции mTORC1 аминокислотами; на схеме их нет. Привлечение mTORC1 к мембране и фосфорилирование субстрата — разные события, поэтому на схеме два отдельных показателя: положение mTORC1 и фосфорилирование S6K1. Для фосфорилирования S6K1 у лизосомы нужна ещё ГТФаза RHEB в GTP-форме. На этой схеме RHEB–GTP поддержан как постоянное условие, а его регуляция разобрана в следующих шагах.Типичная ошибка Rag-ГТФазы сами фосфорилируют S6K1.Rag-белки регулируют привлечение mTORC1 и взаимодействия с субстратами. Фосфорильную группу переносит киназа mTOR, а не Rag.Какое сочетание нуклеотидных состояний Rag в основной схеме способствует связыванию RAPTOR?А. RagA/B и RagC/D одновременно связаны с GTP. (неверный вариант)Одинаковое состояние двух Rag не заменяет требуемой асимметричной конфигурации.Б. RagA/B связан с GTP, а RagC/D — с GDP. (верный вариант)Для связывания RAPTOR важна асимметричная конфигурация гетеродимера RagA/B–GTP и RagC/D–GDP.В. RagA/B связан с GDP, а RagC/D — с GTP. (неверный вариант)Это противоположная конфигурация, характерная для подавления основного аминокислотного пути.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Cui Z., Esposito A., Napolitano G., Ballabio A., Hurley J. H. Structural basis for mTORC1 activation on the lysosomal membrane. Nature. 2025;647:536–543. doi:10.1038/s41586-025-09545-3Bar-Peled L. et al. A tumor suppressor complex with GAP activity for the Rag GTPases that signal amino acid sufficiency to mTORC1. Science. 2013;340:1100–1106. doi:10.1126/science.1232044Fromm S. A., Lawrence R. E., Hurley J. H. Structural mechanism for amino acid-dependent Rag GTPase nucleotide state switching by SLC38A9. Nat Struct Mol Biol. 2020;27:1017–1023. doi:10.1038/s41594-020-0490-9Качественная модель основного Rag-зависимого пути в клетках млекопитающих; альтернативные аминокислотные пути не исключаются.
mTORC1 и сигналы · шаг 3 из 32Как ростовой сигнал действует через AKT, TSC и RHEBИнсулиновый сигнал может усиливать фосфорилирование субстратов mTORC1 через регуляцию комплекса TSC и ГТФазы RHEB. PI3K, AKT и RHEB выполняют разные молекулярные действия.Что показывает схема. Цепь инсулинового сигнала: рецептор → IRS1 → PI3K (образует PIP₃ из PIP₂) → AKT. AKT фосфорилирует TSC2 и ослабляет GAP-действие комплекса TSC на RHEB, поэтому доля RHEB–GTP растёт и mTORC1 при поддержанном аминокислотном входе фосфорилирует S6K1. Без инсулинового сигнала TSC переводит RHEB в GDP-форму, фосфорилирование S6K1 низкое.PI3K образует PIP₃ в плазматической мембране и способствует привлечению белков с соответствующими доменами.AKT фосфорилирует TSC2 и в рассматриваемом ростовом пути ослабляет действие комплекса TSC.Снижение GAP-действия TSC способствует сохранению RHEB в GTP-связанном состоянии.Инсулиновый сигнал начинается на плазматической мембране. Инсулин связывается с рецептором — тирозинкиназой, которая после связывания гормона фосфорилирует собственные остатки тирозина и белки-адаптеры IRS (субстраты инсулинового рецептора; на схеме показан IRS1). С фосфорилированными остатками тирозина IRS1 связывается фосфатидилинозитол-3-киназа класса I (PI3K), и фермент оказывается рядом со своим субстратом в мембране.PI3K фосфорилирует мембранный липид, а не белок: из фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата образуется фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфат (PIP₃). С PIP₃ связываются белки, у которых есть PH-домен — участок, связывающий фосфоинозитиды, в том числе киназа AKT и киназа PDK1. PDK1 — киназа, которая фосфорилирует активационную петлю AKT (T308 у AKT1 человека); для полной активности AKT нужна и вторая модификация, по S473, которую вносит mTORC2. На схеме эта часть пути упрощена до последовательности «рецептор → IRS1 → PI3K → PIP₃ → AKT».Активная AKT фосфорилирует TSC2 — белок туберин, компонент комплекса TSC. Кроме TSC2 в комплекс входят TSC1 (гамартин) и белок TBC1D7. TSC2 выполняет функцию GAP в отношении малой ГТФазы RHEB: ускоряет гидролиз связанного с RHEB GTP и переводит RHEB в GDP-форму. Фосфорилирование TSC2 киназой AKT ослабляет это действие комплекса. AKT, следовательно, действует на RHEB не прямо, а через TSC. Есть и вторая ветвь от AKT: AKT фосфорилирует белок PRAS40. Нефосфорилированный PRAS40 связывается с RAPTOR и мешает субстратам связываться с mTORC1; после фосфорилирования под действием AKT это торможение ослабевает (в культивируемых клетках; Sancak и соавт., 2007; Wang и соавт., 2007). Ветвь PRAS40 действует параллельно с TSC–RHEB и не заменяет её.Когда GAP-действие TSC ослаблено, гидролиз GTP у RHEB замедляется и доля RHEB–GTP возрастает. RHEB–GTP взаимодействует с mTORC1 и стимулирует фосфорилирование S6K1 и других субстратов; на схеме это взаимодействие показано стрелкой, а не постоянным закреплением RHEB на лизосоме. RHEB связан с мембранами через липидную модификацию (фарнезильный остаток) и, по данным Angarola и Ferguson (2019), не накапливается преимущественно на лизосомах. Аминокислотный вход на этой схеме поддержан: без него mTORC1 не привлекается к лизосоме, и RHEB–GTP не обеспечивает фосфорилирования S6K1 (следующие шаги).Типичная ошибка RHEB активируется потому, что AKT фосфорилирует его непосредственно.В основном пути AKT регулирует TSC2; изменение состояния RHEB связано с ослаблением GAP-действия TSC.В основной модели AKT ослабила GAP-действие комплекса TSC. Какое изменение RHEB этому соответствует?А. Ускоряется гидролиз GTP и возрастает доля RHEB–GDP. (неверный вариант)Этот результат ожидался бы при усилении GAP-действия, а не его ослаблении.Б. Нуклеотидное состояние RHEB не меняется: TSC регулирует только положение mTORC1. (неверный вариант)TSC выполняет GAP-действие на RHEB; его функцию нельзя свести только к положению mTORC1.В. Замедляется гидролиз GTP и возрастает доля RHEB–GTP. (верный вариант)Ослабление GAP-действия замедляет гидролиз GTP у RHEB и способствует GTP-связанной форме.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Angarola B., Ferguson S. M. Weak membrane interactions allow Rheb to activate mTORC1 signaling without major lysosome enrichment. Mol Biol Cell. 2019;30:2750–2760. doi:10.1091/mbc.E19-03-0146Cui Z., Esposito A., Napolitano G., Ballabio A., Hurley J. H. Structural basis for mTORC1 activation on the lysosomal membrane. Nature. 2025;647:536–543. doi:10.1038/s41586-025-09545-3Sancak Y. et al. PRAS40 is an insulin-regulated inhibitor of the mTORC1 protein kinase. Mol Cell. 2007;25:903–915. doi:10.1016/j.molcel.2007.03.003Wang L. et al. PRAS40 regulates mTORC1 kinase activity by functioning as a direct inhibitor of substrate binding. J Biol Chem. 2007;282:20036–20044. doi:10.1074/jbc.M702376200Рассматривается ростовая ветвь в клетке млекопитающего при достаточном аминокислотном сигнале. Контакт RHEB с mTORC1 изображён условно; длительность и место контакта не измеряются.
mTORC1 и сигналы · шаг 4 из 32Какие молекулы воспринимают лейцин, аргинин и SAMРазные метаболиты связываются с разными сенсорными белками. Сенсор, регулирующий Rag, нужно отличать от транспортёра в лизосомной мембране.Что показывает схема. Четыре входа: лейцин связывается с Sestrin2, цитозольный аргинин — с CASTOR1; без лиганда эти белки подавляют GATOR2, и GATOR1 ускоряет гидролиз GTP у RagA/B. SAM связывается с SAMTOR; без SAM белок SAMTOR связывается с GATOR1–KICSTOR и усиливает торможение mTORC1. SLC38A9 в мембране лизосомы связывает аргинин со стороны просвета, переносит лейцин в цитозоль и через Ragulator–Rag участвует в активации mTORC1.Лейцин связывается с Sestrin2, а цитозольный аргинин — с CASTOR1.SAM взаимодействует с SAMTOR и меняет его связь с GATOR1–KICSTOR.SLC38A9 воспринимает лизосомный аргинин и участвует в выходе аминокислот из лизосомы.Доступность разных аминокислот воспринимают разные белки-сенсоры. Каждый метаболит связывается со своим белком, и каждый из них действует на своё звено регуляторной цепи. Сенсором здесь называют белок, который связывает определённый метаболит и при этом меняет свои взаимодействия с регуляторными комплексами.Лейцин в цитозоле связывается с Sestrin2, а аргинин в цитозоле — с CASTOR1. Без своего лиганда оба белка связываются с комплексом GATOR2 и подавляют его. GATOR2, в свою очередь, ограничивает действие GATOR1 — комплекса, который ускоряет гидролиз GTP у RagA/B. Поэтому при удалении лейцина Sestrin2 связывается с GATOR2, торможение GATOR1 ослабевает, RagA/B переходит в GDP-форму и mTORC1 перестаёт привлекаться к лизосоме. Связавшись с лейцином, Sestrin2 диссоциирует от GATOR2, и цепь действует в обратном направлении.Что известно о действии сенсоров на GATOR2? Sestrin2 и CASTOR1 — белки, связывающие метаболит; ферментативной реакции с участием GATOR2 здесь нет. Без лиганда каждый из них присоединяется к своей поверхности GATOR2, и эти поверхности не перекрываются: GATOR2 образует каркас, в котором β-пропеллеры WD40 разных субъединиц связывают сенсоры и GATOR1, а CASTOR1 удерживается двумя β-пропеллерами MIOS, каждый из которых связывает одну из двух субъединиц димера CASTOR1 (Valenstein и соавт., 2025; Jansen и соавт., 2025). Связывание лейцина с Sestrin2 или аргинина с CASTOR1 изменяет конформацию сенсора: у CASTOR1, например, упорядочивается петля, которая закрывает поверхность контакта с GATOR2, и сенсор отделяется от комплекса. Пока сенсор связан с GATOR2, он ограничивает подвижность β-пропеллера WDR24 — домена, необходимого для зависимой от питательных веществ активации mTORC1. GATOR2 — регуляторный комплекс, а не киназа, и GATOR1 он не фосфорилирует. Структуры показывают связывание сенсоров и изменение подвижности GATOR2; как именно эти изменения затем меняют работу GATOR1 как GAP, в опубликованных работах описано не полностью.S-аденозилметионин (SAM) — донор метильных групп, который образуется из метионина. SAM связывается с SAMTOR. Без SAM белок SAMTOR связывается с GATOR1 и KICSTOR — комплексом, который удерживает GATOR1 на лизосоме, — и тем самым усиливает торможение mTORC1. SAMTOR, следовательно, реагирует на SAM, а не непосредственно на метионин: метионин влияет на этот вход через образование SAM.SLC38A9 устроен иначе. Это белок лизосомной мембраны, переносчик аминокислот. Он связывает аргинин со стороны просвета лизосомы и через Ragulator–Rag участвует в активации mTORC1. Кроме того, при связывании аргинина SLC38A9 переносит лейцин и другие незаменимые аминокислоты из просвета в цитозоль (Wyant и соавт., 2017). Перенос лейцина из лизосомы и связывание цитозольного лейцина с Sestrin2 — разные события: SLC38A9 не является цитозольным сенсором лейцина. Кроме того, цитозольный участок SLC38A9 участвует в перестройке лизосомного комплекса FLCN–FNIP–Rag–Ragulator при возвращении аминокислот (шаг 6). Чувствительность каждого входа зависит от клетки и условий, а список сенсоров на схеме не исчерпывающий.Типичная ошибка SLC38A9 — основной цитозольный сенсор лейцина.В рассматриваемом механизме цитозольный лейцин связывается с Sestrin2; SLC38A9 расположен в лизосомной мембране и участвует в аргинин-зависимом транспорте.Из среды в качественной модели удалили только лейцин. Другие входы поддержаны. Как меняется взаимодействие Sestrin2 с GATOR2?А. Sestrin2 связывается с GATOR2 и подавляет передачу этого сигнала. (верный вариант)Без связанного лейцина Sestrin2 взаимодействует с GATOR2 и ограничивает лейцин-зависимый вход.Б. Sestrin2 отделяется от GATOR2 и усиливает передачу этого сигнала. (неверный вариант)Ослабление этого взаимодействия характерно для связывания лейцина, а не его удаления.В. Связывание не меняется: в этой схеме Sestrin2 воспринимает только аргинин. (неверный вариант)В заданной ветви Sestrin2 связывает лейцин; цитозольный аргинин воспринимает CASTOR1.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Wolfson R. L. et al. Sestrin2 is a leucine sensor for the mTORC1 pathway. Science. 2016;351:43–48. doi:10.1126/science.aab2674Chantranupong L. et al. The CASTOR proteins are arginine sensors for the mTORC1 pathway. Cell. 2016;165:153–164. doi:10.1016/j.cell.2016.02.035Gu X. et al. SAMTOR is an S-adenosylmethionine sensor for the mTORC1 pathway. Science. 2017;358:813–818. doi:10.1126/science.aao3265Wyant G. A. et al. mTORC1 activator SLC38A9 is required to efflux essential amino acids from lysosomes and use protein as a nutrient. Cell. 2017;171:642–654.e12. doi:10.1016/j.cell.2017.09.046Valenstein M. L., Wranik M., Lalgudi P. V. et al. Structural basis for the dynamic regulation of mTORC1 by amino acids. Nature. 2025;646:493–500. doi:10.1038/s41586-025-09428-7Jansen R. M., Maghe C., Tapia K. et al. Structural basis for mTORC1 regulation by the CASTOR1–GATOR2 complex. Nat Struct Mol Biol. 2025;32:1980–1988. doi:10.1038/s41594-025-01635-0Fromm S. A., Lawrence R. E., Hurley J. H. Structural mechanism for amino acid-dependent Rag GTPase nucleotide state switching by SLC38A9. Nat Struct Mol Biol. 2020;27:1017–1023. doi:10.1038/s41594-020-0490-9Основная качественная схема выбранных сенсоров. Это не исчерпывающий перечень сенсоров каждой аминокислоты; чувствительность зависит от клетки и условий. Структурные данные 2025 г. описывают связывание сенсоров с GATOR2; передача изменений GATOR2 на GATOR1 описана не полностью.
mTORC1 и сигналы · шаг 5 из 32Почему привлечение mTORC1 и его активацию проверяют раздельноВ основной модели для фосфорилирования S6K1 нужны аминокислотный вход и разрешающее состояние RHEB. Совпадение входов не означает, что все субстраты mTORC1 регулируются одинаково.Что показывает схема. Таблица двух входов для S6K1 в основной Rag-зависимой модели: аминокислоты и RHEB–GTP — mTORC1 у лизосомы, фосфорилирование S6K1 высокое; только аминокислоты — mTORC1 у лизосомы, фосфорилирование низкое; только RHEB–GTP — mTORC1 в цитозоле, фосфорилирование низкое; без обоих входов оба показателя низкие.Аминокислотный вход через Rag способствует привлечению mTORC1 к мембране.RHEB–GTP и взаимодействия комплекса с мембраной поддерживают киназную активацию.При недостаточности одного входа локализация и p-S6K1 могут изменяться по-разному.Рассмотрим четыре сочетания двух входов при одинаковых прочих условиях: энергии достаточно, все белки комплекса и субстрат S6K1 присутствуют, сравнение проводится в один и тот же момент. Первый вход — аминокислотный: через Rag он определяет, привлечён ли mTORC1 к лизосомной мембране. Второй вход — ростовой: через AKT и TSC он определяет, находится ли RHEB преимущественно в GTP-форме.Для каждого сочетания два показателя описываются отдельно. Когда работают оба входа, mTORC1 находится у лизосомы и фосфорилирует S6K1. Когда работает только аминокислотный вход, mTORC1 привлечён к лизосоме, но RHEB находится преимущественно в GDP-форме, и фосфорилирование S6K1 остаётся низким. Когда работает только ростовой вход, RHEB–GTP есть, но mTORC1 не привлечён к мембране, и фосфорилирование S6K1 тоже низкое. Без обоих входов оба показателя низкие. Слово «низкое» здесь означает существенно сниженный сигнал, а не обязательно нулевой во всех клетках.Такая таблица описывает основную Rag-зависимую ветвь для S6K1. Её нельзя переносить на все генотипы и все субстраты. При утрате TSC RHEB–GTP сохраняется и без ростового сигнала; при утрате GATOR1 Rag-вход меньше зависит от аминокислот. Фосфорилирование TFEB, как показано в следующем шаге, по-другому зависит от RHEB. В схеме нет расчётной формулы: она показывает только, что одного входа недостаточно для высокого фосфорилирования S6K1.Мембрана в этом механизме — не фон рисунка. Она сближает mTORC1, привлечённый Rag, и RHEB, связанный с мембраной липидной модификацией. В реконструированной системе Cui и соавт. (2025) роль мембраны и её белков в активации mTORC1 изучали на очищенных компонентах; такой эксперимент показывает возможность механизма, но не воспроизводит все условия клетки. В клеточном эксперименте локализацию и фосфорилирование измеряют разными методами (шаг о методах исследования mTORC1).Типичная ошибка Если mTORC1 находится на лизосоме, S6K1 обязательно фосфорилирован.Колокализация показывает положение комплекса; для вывода о действии на S6K1 нужен отдельный показатель его фосфорилирования.В модели Rag привлекает mTORC1 к лизосоме, но RHEB сохраняется в GDP-форме. Какой результат ожидается для S6K1?А. Фосфорилирование S6K1 становится высоким вследствие действия RHEB–GDP. (неверный вариант)GDP-связанная форма RHEB не выполняет в этой схеме действие RHEB–GTP.Б. Фосфорилирование S6K1 остаётся низким, несмотря на локализацию mTORC1. (верный вариант)Одной локализации недостаточно: в заданной модели отсутствует необходимое действие RHEB–GTP.В. Фосфорилирование S6K1 становится высоким только из-за локализации mTORC1. (неверный вариант)Положение комплекса не заменяет его киназную активацию.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Cui Z., Esposito A., Napolitano G., Ballabio A., Hurley J. H. Structural basis for mTORC1 activation on the lysosomal membrane. Nature. 2025;647:536–543. doi:10.1038/s41586-025-09545-3Качественная модель Rag-зависимого фосфорилирования S6K1; энергия, белки комплекса и субстрат доступны. «Низко» не означает строго нулевой сигнал во всех реальных клетках.
mTORC1 и сигналы · шаг 6 из 32Почему TFEB и S6K1 могут отвечать по-разномуФосфорилирование TFEB имеет особые требования к RagC/D и комплексу FLCN–FNIP. По состоянию S6K1 нельзя автоматически определить положение TFEB.Что показывает схема. Две ветви одного комплекса: RHEB–GTP стимулирует фосфорилирование S6K1; FLCN–FNIP переводит RagC/D в GDP-форму, и RagC/D подводит TFEB к mTORC1. При сниженной активности RHEB падает p-S6K1, а p-TFEB может сохраниться. Без FLCN p-TFEB резко снижено и TFEB перемещается в ядро, тогда как p-S6K1 в значительной мере сохраняется.Как TFEB возвращается из ядра к лизосомному mTORC1. Пять последовательных состояний показывают, как TFEB, находившийся при голодании преимущественно в ядре, становится доступен mTORC1 у лизосомы. Первая схема шага сравнивает S6K1 и TFEB, а эта показывает перемещение и привлечение TFEB.Голодание: TFEB преимущественно в ядре. Фосфорилирование TFEB комплексом mTORC1 слабое, фосфатазы снимают фосфатные группы, и связь с 14-3-3 ослаблена. Экспорт TFEB ослаблен, поэтому его доля в ядре высока, но обмен с цитозолем продолжается. TFEB не заперт в ядре: переходы между ядром и цитозолем не прекращаются.Восстановление питания: меняются условия экспорта TFEB. Фосфорилирование серинов S142 и S138 рядом с сигналом ядерного экспорта (NES) способствует узнаванию TFEB экспортином XPO1 (CRM1): из ядра выходит часть молекул, а не все сразу. Одновременно восстанавливается Rag-зависимое привлечение mTORC1 к лизосоме, и RagC/D переходит в GDP-форму. Какие киназы фосфорилируют S142 и S138, зависит от условий (описаны mTOR, GSK3β и другие).Рекрутирование: цитозольный TFEB распознаёт RagC/D–GDP. Цитозольный TFEB связывается с RagC/D в GDP-форме на цитозольной поверхности лизосомы. Это специфическое белковое взаимодействие, а не общее свойство TFEB накапливаться у лизосомы. RagA/B–GTP и RAPTOR привлекают mTORC1, а доставку TFEB обеспечивает RagC/D–GDP.Фосфорилирование: лизосомный mTORC1 модифицирует TFEB. Лизосомный mTORC1 фосфорилирует доступный TFEB, в частности по S211 (у TFEB человека). Ядерный mTORC1 для этого не нужен: фосфорилируется молекула, находящаяся у лизосомы. Фосфорилирование S211 — не то же самое, что фосфорилирование S142 и S138 рядом с NES.Удержание: 14-3-3 оставляет фосфо-TFEB в цитозоле. Фосфо-S211 образует участок связывания 14-3-3, и TFEB удерживается преимущественно в цитозоле, поэтому доля TFEB в ядре снижается. Это не экспорт: удержание отличается от XPO1-зависимого вывода из ядра, а обмен с ядром сохраняется. Часть TFEB остаётся в ядре: число значков показывает лишь направление изменения.Условные обозначения: каждый значок TFEB — условная молекула; число значков в зоне лишь показывает направление изменения доли и не отражает измеренных значений. Вид и подпись стрелок показывают относительную силу перехода в данном состоянии, а не скорость. P — фосфатная группа на S211 (TFEB человека). Пунктирный значок — компонент, который в этом состоянии не участвует в процессе. Схема основана на работах Napolitano 2018 и 2020, Li 2018 и Medina 2015.FLCN в комплексе с FNIP регулирует нуклеотидное состояние RagC/D.Rag-зависимые взаимодействия обеспечивают фосфорилирование TFEB комплексом mTORC1.Фосфорилирование TFEB способствует связыванию 14-3-3 и удержанию фактора вне ядра.TFEB — транскрипционный фактор, который в ядре активирует экспрессию генов лизосомных белков и белков аутофагического аппарата. Пока TFEB фосфорилирован комплексом mTORC1, он связывается с белками 14-3-3 и удерживается в цитоплазме. Белки 14-3-3 — семейство белков, связывающих определённые фосфорилированные участки других белков. Когда фосфорилирование TFEB снижается, фактор перемещается в ядро.TFEB фосфорилируется тем же комплексом mTORC1, что и S6K1, но требования к регуляторным белкам у двух субстратов разные. Для фосфорилирования TFEB особенно важна RagC/D в GDP-форме, которую создаёт комплекс FLCN–FNIP. RagC/D в GDP-форме непосредственно связывает TFEB и привлекает его к mTORC1 у лизосомы. Поэтому в клетках без FLCN фосфорилирование TFEB резко снижено, а фосфорилирование S6K1 в значительной мере сохраняется. Наоборот, при сохранённом Rag-сигнале и сниженной активности RHEB фосфорилирование S6K1 падает, а фосфорилирование TFEB может сохраниться (Napolitano и соавт., 2020).На схеме три показателя разделены: фосфорилирование S6K1, фосфорилирование TFEB по S211 (номер участка для TFEB человека) и доля TFEB в ядре. Номер S211 не переносится автоматически на родственный фактор TFE3. Ядерная доля TFEB — показатель локализации фактора. Увеличение ядерной доли ещё не означает, что число лизосом возросло сразу: для этого должны измениться экспрессия генов-мишеней, синтез белков и построение мембран.Как mTORC1 может фосфорилировать TFEB, если при голодании TFEB находится преимущественно в ядре? Ответ состоит в том, что распределение TFEB динамично: белок непрерывно перемещается между цитозолем и ядром. При переходе к голоданию ядерный экспорт TFEB ослабевает, и он накапливается в ядре. Это не означает, что импорт всё время превышает экспорт: после установления нового распределения встречные потоки могут приблизительно уравновеситься, хотя доля TFEB в ядре остаётся высокой (если синтезом и деградацией в этом сравнении можно пренебречь). Поэтому различают три величины: доли TFEB в ядре и цитозоле, скорости переходов между ними и фактические потоки импорта и экспорта. При восстановлении питания регуляция экспорта и последующее удержание в цитозоле вновь смещают распределение TFEB: часть ядерного белка оказывается в цитозоле и становится доступна лизосомному mTORC1. Вся масса TFEB при этом не перемещается к лизосоме одновременно: меняются доли белка в разных состояниях и скорости импорта, экспорта, фосфорилирования и связывания.Экспорт TFEB из ядра регулируется. В последовательности TFEB есть сигнал ядерного экспорта (NES), который узнаёт экспортин XPO1 (CRM1). Сигнал включается фосфорилированием двух остатков серина рядом с ним — S142 и S138, причём реакции идут по порядку: фосфорилирование S142 подготавливает фосфорилирование S138. Napolitano и соавт. (2018) показали, что это иерархическое фосфорилирование зависит от mTOR, а Li и соавт. (2018) — что S138 фосфорилирует киназа GSK3β, активность которой снижается при нехватке глюкозы. Поэтому нельзя приписывать оба остатка одному лизосомному mTORC1: вклад киназ зависит от условий. При достатке питательных веществ фосфорилирование S142 и S138 ускоряет экспорт, а при его ослаблении экспорт замедляется и TFEB накапливается в ядре.Оказавшись в цитозоле, TFEB связывается с RagC/D в GDP-форме на цитозольной поверхности лизосомы. Это специфическое белковое узнавание, а не общее свойство TFEB накапливаться у лизосомы: RagC/D–GDP, которую создаёт FLCN–FNIP, непосредственно связывает TFEB. К этому времени mTORC1 уже привлечён к лизосоме: RAPTOR связывается с Rag-гетеродимером, в котором RagA/B находится в GTP-форме. Лизосомный mTORC1 фосфорилирует доступный TFEB, в частности по S211; фосфо-S211 образует участок связывания 14-3-3, и эти белки удерживают TFEB преимущественно в цитозоле. Таким образом, действуют два разных механизма: S142, S138 и XPO1 определяют скорость вывода TFEB из ядра, а S211 и 14-3-3 удерживают его в цитозоле.При недостатке питательных веществ действие mTORC1 на TFEB ослабевает, а фосфатные группы с него снимают фосфатазы. Один из установленных путей: выход Ca²⁺ из просвета лизосомы через канал TRPML1 (MCOLN1) активирует фосфатазу кальциневрин, которая связывается с TFEB и дефосфорилирует его (Medina и соавт., 2015). После дефосфорилирования TFEB теряет связь с 14-3-3, а его экспорт из ядра ослабевает, поэтому доля ядерного TFEB растёт. Регуляция TFEB не сводится к одной фосфатазе во всех условиях: в разных клетках и при разных воздействиях описаны и другие пути.Коротко цикл можно записать так. Голодание: ослабление сигнала mTORC1 и действие фосфатаз → меньше связей TFEB с 14-3-3 и слабее экспорт → накопление TFEB в ядре и его транскрипционная активность. Восстановление питания: меняются условия ядерного экспорта (NES, S142 и S138, XPO1) → цитозольный TFEB связывается с RagC/D–GDP → лизосомный mTORC1 фосфорилирует S211 → 14-3-3 удерживает TFEB вне ядра. Перераспределение и фосфорилирование белков происходят быстрее, чем изменение экспрессии генов-мишеней и построение новых лизосом. Пять состояний этого цикла по порядку показаны на второй схеме шага («Как TFEB возвращается из ядра к лизосомному mTORC1»).Почему присутствия FLCN у лизосомы недостаточно для фосфорилирования TFEB? Положение белка и его каталитическая активность — разные характеристики. При недостатке аминокислот FLCN–FNIP может входить в лизосомный комплекс FLCN–FNIP–Rag–Ragulator, который удерживает Rag-гетеродимер в неактивной конфигурации; в этом комплексе GAP-активность FLCN–FNIP по отношению к RagC/D подавлена. После возвращения аминокислот комплекс перестраивается: по данным структурного анализа, цитозольный участок SLC38A9 дестабилизирует его и тем самым запускает GAP-действие FLCN–FNIP на RagC (Fromm и соавт., 2020). Возникающая RagC/D–GDP может привлекать TFEB. Здесь различают три Rag-зависимых события: привлечение mTORC1 к лизосоме требует RagA/B–GTP, доставка TFEB — RagC/D–GDP, а фосфорилирование S6K1 — ещё и RHEB. Схема основана на структурах и опытах с определёнными белками (в структурных работах использовали FLCN–FNIP2); её не следует считать универсальной для всех клеток и всех вариантов FNIP.Описанная схема относится к условиям экспериментов Napolitano и соавт. (2020). При хронической утрате TSC2 в некоторых клетках TFEB может перемещаться в ядро через неканонический механизм, связанный с RagC (Alesi и соавт., 2021); у TFEB есть и другие участки фосфорилирования. Независимость фосфорилирования TFEB от RHEB не означает, что TFEB фосфорилируется другой киназой: каталитическую реакцию выполняет mTOR, различается регуляция доступа субстрата к комплексу.Типичная ошибка Любое повышение p-S6K1 означает, что TFEB обязательно удерживается в цитоплазме.S6K1 и TFEB имеют разные требования к взаимодействиям с mTORC1; их фосфорилирование и локализацию измеряют отдельно.В модели с сохранённым Rag-сигналом уменьшили активность RHEB. Какое сравнение корректно для S6K1 и TFEB?А. p-S6K1 и фосфорилирование TFEB обязаны снизиться одинаково. (неверный вариант)Одинаковый фермент не означает одинаковой зависимости каждого субстрата от регуляторных белков.Б. Фосфорилирование TFEB обязательно растёт пропорционально падению p-S6K1. (неверный вариант)Различие зависимостей не устанавливает обязательной обратной пропорциональности двух показателей.В. p-S6K1 может снизиться, а фосфорилирование TFEB — сохраниться. (верный вариант)Для рассматриваемой Rag-зависимой ветви TFEB требования к RHEB отличаются от требований S6K1.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Napolitano G. et al. A substrate-specific mTORC1 pathway underlies Birt–Hogg–Dubé syndrome. Nature. 2020;585:597–602. doi:10.1038/s41586-020-2444-0Roczniak-Ferguson A. et al. The transcription factor TFEB links mTORC1 signaling to transcriptional control of lysosome homeostasis. Sci Signal. 2012;5:ra42. doi:10.1126/scisignal.2002790Alesi N. et al. TSC2 regulates lysosome biogenesis via a non-canonical RAGC and TFEB-dependent mechanism. Nat Commun. 2021;12:4245. doi:10.1038/s41467-021-24499-6Napolitano G., Esposito A., Choi H. et al. mTOR-dependent phosphorylation controls TFEB nuclear export. Nat Commun. 2018;9:3312. doi:10.1038/s41467-018-05862-6Li L., Friedrichsen H. J., Andrews S. et al. A TFEB nuclear export signal integrates amino acid supply and glucose availability. Nat Commun. 2018;9:2685. doi:10.1038/s41467-018-04849-7Medina D. L., Di Paola S., Peluso I. et al. Lysosomal calcium signalling regulates autophagy through calcineurin and TFEB. Nat Cell Biol. 2015;17:288–299. doi:10.1038/ncb3114Fromm S. A., Lawrence R. E., Hurley J. H. Structural mechanism for amino acid-dependent Rag GTPase nucleotide state switching by SLC38A9. Nat Struct Mol Biol. 2020;27:1017–1023. doi:10.1038/s41594-020-0490-9Основная схема сопоставима с механизмом Napolitano 2020; она не описывает любой срок утраты TSC2 и любую клетку. S211 относится к TFEB человека; этот номер не переносить на TFE3. Динамика экспорта и удержания TFEB описана в культивируемых клетках человека (HeLa, HEK293, HT29, MCF-7); вклад киназ и фосфатаз зависит от условий, а участки S142, S138 и S211 относятся к TFEB человека.
mTORC1 и сигналы · шаг 7 из 32Чем различаются рапамицин и Torin1Рапамицин и Torin1 подавляют mTOR разными молекулярными способами. Снижение фосфорилирования одного субстрата не показывает степень подавления всех функций комплекса.Что показывает схема. FKBP12–рапамицин связывается с FRB-областью mTOR и ограничивает доступ части субстратов к активному центру; Torin1 конкурирует с ATP в киназном домене. При остром действии рапамицина сильно снижается фосфорилирование S6K1 T389, а фосфорилирование 4E-BP1 T37/46, ULK1 S758 и TFEB S211 во многом сохраняется; Torin1 снижает все эти показатели и подавляет также mTORC2 (AKT S473).Комплекс FKBP12–рапамицин связывается с FRB-областью mTOR.Torin1 взаимодействует с ATP-связывающим участком киназы mTOR.Чувствительность результата зависит от субстрата, модифицируемого участка и режима воздействия.Рапамицин действует не сам по себе: в клетке он связывается с небольшим белком FKBP12, и уже комплекс FKBP12–рапамицин связывается с FRB-областью mTOR. FRB-область расположена рядом с входом в активный центр киназы. Связавшийся комплекс ограничивает доступ части субстратов к активному центру, но не конкурирует с ATP за его участок связывания (Yang и соавт., 2013). Torin1 устроен иначе: это ATP-конкурентный ингибитор, который занимает ATP-связывающий участок киназного домена mTOR и тем самым подавляет каталитическую реакцию.Из различия механизмов следует различие эффектов. Фосфорилирование S6K1 по T389 чувствительно к острому действию рапамицина. Фосфорилирование 4E-BP1 по T37/46, ULK1 по S758 (у человека) и TFEB по S211 (у человека) при остром действии рапамицина во многом сохраняется, тогда как Torin1 снижает фосфорилирование всех этих участков (для 4E-BP1 и ULK1 — Thoreen и соавт., 2009; Kang и соавт., 2013). Для TFEB Roczniak-Ferguson и соавт. (2012) показали, что рапамицин почти не меняет его локализацию, а Torin1 снижает фосфорилирование S211 и вызывает перемещение TFEB в ядро. Устойчивость относится к определённому участку, а не ко всему белку: у 4E-BP1 есть участки, фосфорилирование которых снижается рапамицином сильнее. Kang и соавт. (2013) связали различия с тем, насколько эффективно mTORC1 фосфорилирует данный участок.Препараты различаются и по действию на комплексы. Torin1 подавляет киназу mTOR в составе обоих комплексов, mTORC1 и mTORC2. Острое действие рапамицина направлено прежде всего на mTORC1, но при длительном воздействии во многих типах клеток рапамицин нарушает и сборку mTORC2 (Sarbassov и соавт., 2006). Поэтому сравнение «рапамицин против Torin1» без указания срока, клеток и измеряемого участка неинформативно.Из этого следуют требования к эксперименту. Для каждого субстрата измеряют фосфорилирование конкретного участка вместе с общим содержанием того же белка и белком контроля нанесения, по которому проверяют, что во все дорожки нанесено одинаковое количество белка. Дозы и сроки из разных работ не объединяются в один условный эксперимент. На схеме шага приведено только качественное сравнение механизмов при остром воздействии; это не рекомендации по применению препаратов.Типичная ошибка Рапамицин — ATP-конкурентный ингибитор, одинаково выключающий все мишени mTORC1.Рапамицин действует через FKBP12 и FRB; разные субстраты и участки имеют разную чувствительность.После острого действия рапамицина p-S6K1 снизился, но часть фосфорилирования других субстратов сохранилась. Как это объяснить?А. Разные субстраты и фосфосайты неодинаково чувствительны к рапамицину. (верный вариант)Рапамицин частично ограничивает функции mTORC1; чувствительность зависит от конкретного взаимодействия и участка.Б. Снижение p-S6K1 означает обязательное исчезновение любого фосфорилирования. (неверный вариант)Один показатель нельзя распространить на все реакции разных субстратов.В. Сохранение другого фосфосайта означает, что препарат вовсе не действовал. (неверный вариант)Препарат может действовать на одну ветвь, оставляя другую относительно устойчивой.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Kang S. A. et al. mTORC1 phosphorylation sites encode their sensitivity to starvation and rapamycin. Science. 2013;341:1236566. doi:10.1126/science.1236566Yang H. et al. mTOR kinase structure, mechanism and regulation. Nature. 2013;497:217–223. doi:10.1038/nature12122Thoreen C. C. et al. An ATP-competitive mTOR inhibitor reveals rapamycin-resistant functions of mTORC1. J Biol Chem. 2009;284:8023–8032. doi:10.1074/jbc.M900301200Roczniak-Ferguson A. et al. The transcription factor TFEB links mTORC1 signaling to transcriptional control of lysosome homeostasis. Sci Signal. 2012;5:ra42. doi:10.1126/scisignal.2002790Sarbassov D. D. et al. Prolonged rapamycin treatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB. Mol Cell. 2006;22:159–168. doi:10.1016/j.molcel.2006.03.029Для экспериментальных чисел потребуются дозы, клетки, срок и конкретный сайт исходной работы. Здесь только качественное сравнение механизмов; не рекомендации применения препаратов.
mTORC1 и сигналы · шаг 8 из 32Какие измерения различают локализацию, фосфорилирование и функциюМикроскопия, иммуноблоттинг и измерение синтеза белка отвечают на разные вопросы. Генетическое вмешательство проверяет зависимость результата от конкретного компонента.Что показывает схема. Три карточки: микроскопия (положение mTOR относительно LAMP1), иммуноблоттинг (p-S6K1 T389 относительно общего S6K1 и контроля нанесения), измерение синтеза белка по включению метки. Для каждой указано, что измеряют, какой нужен контроль и чего метод сам не показывает.Колокализация mTOR с LAMP1 показывает совпадение сигналов в пределах разрешения метода.Фосфоспецифическое антитело измеряет выбранную модификацию субстрата.Функциональный результат проверяют отдельным методом и с подходящими контролями.Пусть клетки сначала держат в среде без аминокислот, а затем добавляют аминокислоты; в другой серии меняют ростовой сигнал. Чтобы описать ответ mTORC1, нужны по меньшей мере два показателя, измеренные в сопоставимых образцах одной экспериментальной серии за одинаковый срок воздействия: положение mTOR относительно лизосом и фосфорилирование субстрата. Эти показатели отвечают на разные вопросы и получаются разными методами: для микроскопии клетки фиксируют, а для иммуноблоттинга лизируют, поэтому образцы для двух методов готовят параллельно.Положение mTOR определяют иммунофлуоресцентной микроскопией. Лизосомы отмечают антителом к LAMP1 — белку лизосомной мембраны, который служит маркером этих органелл. Колокализацией называют совпадение сигналов двух меток в одних и тех же участках изображения. Совпадение ограничено разрешением светового микроскопа (порядка сотен нанометров), поэтому оно показывает распределение mTOR относительно LAMP1-положительных структур, но не доказывает прямого связывания mTOR с LAMP1 и ничего не говорит о киназной активности.Фосфорилирование измеряют иммуноблоттингом: белки пробы разделяют электрофорезом, переносят на мембрану и выявляют антителами. Антитело к S6K1, фосфорилированной по T389, выявляет только модифицированную форму; рядом измеряют общее содержание S6K1 и белок контроля нанесения, по которому проверяют, что во все дорожки нанесено одинаковое количество белка. Без этих контролей рост сигнала p-S6K1 нельзя отличить от роста количества самой S6K1. Синтез белка — третий, функциональный показатель; его измеряют отдельно, например по включению меченой аминокислоты.Генетические вмешательства проверяют, от какого компонента зависит ответ. Утрата Rag или Ragulator нарушает аминокислотную регуляцию локализации, изменение RHEB затрагивает активацию, а возвращение исходного белка в клетки, лишённые этого белка, проверяет специфичность эффекта. При удалении аминокислот Rag-ГТФазы привлекают к лизосоме и TSC2, который там может переводить RHEB в GDP-форму; в клетках без TSC2 (эксперименты на клетках HeLa) mTORC1 при удалении аминокислот не полностью освобождается от лизосомы и не полностью инактивируется (Demetriades и соавт., 2014). Остаточные значения у разных генотипов различаются и измеряются, а не принимаются одинаковыми. Отдельная регуляторная ветвь — отрицательная обратная связь: S6K1 фосфорилирует IRS1 (белок-адаптер инсулинового рецептора) и ослабляет инсулиновый сигнал. В культивируемых клетках S6K1 фосфорилирует и RICTOR — субъединицу mTORC2 — по Thr1135. Сборка и киназная активность mTORC2 при этом не менялись, но в клетках с заменой Thr1135 на аланин фосфорилирование AKT, зависящее от mTORC2, было выше (Julien и соавт., 2010). Это частная обратная связь, а не доказательство общей инактивации mTORC2. С нарушениями TSC и субъединиц GATOR1 связаны определённые наследственные заболевания (туберозный склероз; некоторые формы фокальной эпилепсии при вариантах гена DEPDC5, кодирующего субъединицу GATOR1), однако изменённую регуляцию mTORC1 нельзя считать универсальным объяснением возникновения опухолей.Типичная ошибка Колокализация двух белков доказывает их прямое связывание и активность.Совпадение сигналов ограничено разрешением микроскопии; прямое взаимодействие и киназное действие требуют других измерений.После добавления аминокислот увеличилась колокализация mTOR и LAMP1. Какой вывод непосредственно поддерживает это наблюдение?А. Установлено усиление синтеза белка без дополнительных измерений. (неверный вариант)По положению комплекса нельзя количественно установить скорость синтеза белка.Б. Изменилось распределение mTOR относительно LAMP1-положительных структур. (верный вариант)Микроскопия показывает распределение сигналов; дальнейшие свойства требуют независимой проверки.В. Установлено прямое связывание всех молекул mTOR с белком LAMP1. (неверный вариант)Колокализация не определяет прямой молекулярный контакт с LAMP1.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Cui Z., Esposito A., Napolitano G., Ballabio A., Hurley J. H. Structural basis for mTORC1 activation on the lysosomal membrane. Nature. 2025;647:536–543. doi:10.1038/s41586-025-09545-3Demetriades C., Doumpas N., Teleman A. A. Regulation of TORC1 in response to amino acid starvation via lysosomal recruitment of TSC2. Cell. 2014;156:786–799. doi:10.1016/j.cell.2014.01.024Julien L.-A. et al. mTORC1-activated S6K1 phosphorylates Rictor on threonine 1135 and regulates mTORC2 signaling. Mol Cell Biol. 2010;30:908–921. doi:10.1128/MCB.00601-09Никакие реальные микрофотографии и численные значения нового эксперимента не создаются. Схематические карточки методов явно обозначены как учебные.
AMPK и энергетическое состояние · шаг 9 из 32Что показывают ATP, ADP, AMP и энергетический зарядATP, ADP и AMP образуют аденилатный пул, состояние которого меняется при образовании и расходовании ATP. Энергетический заряд — расчётная характеристика этого пула, а не отдельная молекула.Что показывает схема. Режим «Рассчитать заряд»: по концентрациям ATP, ADP и AMP рассчитывается E = (ATP + 0,5·ADP) / (ATP + ADP + AMP); для 8:1:1 E = 0,85; при нулевой сумме заряд не определяется. Режим «Условное равновесие»: пул равен 1, при K = a·m/d² = 1 доли рассчитываются по доле ATP; при a = 0,98 доля AMP около 0,0004, при a = 0,90 — около 0,009, заряд 0,99 и 0,95.При гидролизе ATP образуется ADP; его содержание возрастает, если образование ADP превышает расходование в других реакциях.Аденилаткиназа катализирует обратимую реакцию 2 ADP ⇌ ATP + AMP.Заряд рассчитывают как ([ATP] + 0,5[ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP]).ATP, ADP и AMP клетки вместе образуют аденилатный пул. Для его описания используют три разные величины. Содержание — количество нуклеотида в клетке или пробе. Концентрация — количество в единице объёма. Доля — концентрация нуклеотида, делённая на сумму концентраций всех трёх. Формулы этого шага используют концентрации, выраженные в одинаковых единицах, или доли.При работе ионных насосов, синтезе белков и других процессах ATP гидролизуется до ADP и фосфата. Пока окислительное фосфорилирование и гликолиз восполняют ATP, доля ADP меняется мало. Если образование ATP отстаёт от расходования, доля ADP возрастает. Аденилаткиназа катализирует обратимую реакцию 2 ADP ⇌ ATP + AMP. При высоком отношении ATP к ADP, характерном для энергетически полноценной клетки, равновесие этой реакции сдвинуто влево, и содержание AMP остаётся очень низким. При росте отношения ADP к ATP реакция идёт слева направо (2 ADP → ATP + AMP), и отношение AMP к ATP растёт ещё сильнее (Steinberg, Hardie, 2023). В этом направлении аденилаткиназа образует ATP и AMP из двух ADP, а не расходует ATP.Поскольку исходная доля AMP мала, даже небольшое абсолютное прибавление AMP даёт большое относительное изменение. Насколько большое, зависит от исходного состава пула, от того, насколько реакция близка к равновесию, и от условий измерения. Поэтому единого для всех клеток процента прироста AMP при небольшом снижении ATP не существует.Энергетический заряд — расчётная характеристика пула: E = ([ATP] + 0,5·[ADP]) / ([ATP] + [ADP] + [AMP]). ADP входит с весом 0,5, поскольку в ADP одна фосфоангидридная связь, а в ATP — две. Заряд принимает значения от 0 (весь пул — AMP) до 1 (весь пул — ATP). Для смеси 8:1:1 заряд равен (8 + 0,5) / 10 = 0,85. AMPK (AMP-активируемая протеинкиназа, следующий шаг) не вычисляет эту формулу: киназа связывает отдельные нуклеотиды, а заряд — сводная величина, удобная исследователю.Во втором режиме схемы задана учебная модель: суммарный пул равен 1, реакция аденилаткиназы находится в условном равновесии с K = a·m/d² = 1 (a, d и m — доли ATP, ADP и AMP). Это допущение модели, а не физиологическая константа свободных нуклеотидов. В такой модели снижение доли ATP с 0,98 до 0,90 повышает долю AMP примерно в 23 раза, а заряд снижается лишь с 0,99 до 0,95. Пример 8:1:1 из первого режима — отдельная задача, к которой условие равновесия не применяется.Типичная ошибка Небольшое снижение ATP всегда даёт один и тот же процент увеличения AMP.Относительное изменение AMP зависит от исходного состава пула, равновесия реакции и условий измерения.В условной смеси концентрации ATP, ADP и AMP равны соответственно 8, 1 и 1 в одинаковых единицах. Чему равен аденилатный энергетический заряд?А. 0,80: учитывается только доля ATP в общем пуле. (неверный вариант)Значение 0,80 — доля ATP; формула заряда дополнительно учитывает ADP с коэффициентом 0,5.Б. 0,90: ATP и ADP имеют одинаковый вес в расчёте. (неверный вариант)Значение 0,90 получилось бы при полном весе ADP, но в определении заряда его вес равен 0,5.В. 0,85: учитываются ATP и половина концентрации ADP. (верный вариант)Заряд равен (8 + 0,5 × 1) / (8 + 1 + 1) = 0,85. Это отдельная расчётная задача без требования равновесия аденилаткиназы.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Steinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xЧисла 8:1:1 — явно заданные учебные концентрации. Модель равновесия — другая задача с условным K=1 и постоянным пулом; не выдавать её за измерение в конкретных клетках.
AMPK и энергетическое состояние · шаг 10 из 32Как нуклеотиды регулируют комплекс AMPKAMPK содержит каталитическую α-субъединицу и регуляторные β- и γ-субъединицы. Связывание нуклеотида и фосфорилирование активационной петли — разные способы изменения активности.Что показывает схема. Гетеротример AMPK: α (киназный домен и петля с Thr172), β, γ (регуляторный участок). AMP в регуляторном участке аллостерически активирует фосфорилированный комплекс, способствует фосфорилированию Thr172 киназой LKB1 и защищает его от фосфатаз; ADP способствует фосфорилированию и защищает петлю, но аллостерически не активирует; ATP противодействует этим эффектам.AMP и ATP конкурируют в части регуляторных участков γ-субъединицы.AMP способствует аллостерической активации и сохранению фосфорилирования активационной петли.ADP может защищать фосфорилированную петлю, но не воспроизводит все эффекты AMP.AMPK (AMP-активируемая протеинкиназа) — гетеротример из трёх субъединиц. α-Субъединица содержит киназный домен с активационной петлёй — участком, конформация которого определяет связывание субстрата и катализ. β-Субъединица связывает α и γ; в ней находится углеводсвязывающий модуль, участвующий в связывании с гликогеном. γ-Субъединица содержит четыре повтора CBS (участки, названные по ферменту цистатионин-β-синтазе, в котором их впервые описали), которые образуют четыре потенциальных участка связывания нуклеотидов. Эти участки неравноценны: один, по-видимому, не используется, два связывают нуклеотиды постоянно, а регуляторным участком, где AMP, ADP и ATP обмениваются, служит один (Steinberg, Hardie, 2023).Связывание AMP с γ-субъединицей действует тремя способами. Во-первых, AMP аллостерически повышает активность уже фосфорилированного комплекса. Аллостерической называют регуляцию, при которой лиганд связывается не в активном центре, а в другом участке и меняет конформацию и активность белка. Во-вторых, AMP способствует фосфорилированию Thr172 в активационной петле. В-третьих, AMP защищает фосфорилированный Thr172 от дефосфорилирования фосфатазами. ATP конкурирует с AMP за регуляторный участок и противодействует этим эффектам. ADP, связываясь с тем же участком, тоже способствует фосфорилированию Thr172 и защищает его от дефосфорилирования, но аллостерической активации, как AMP, не вызывает (Xiao и соавт., 2011; Smith и соавт., 2026).Thr172 фосфорилируется вышестоящей киназой LKB1, которая работает в комплексе с белками STRAD и MO25. Этот комплекс, по-видимому, постоянно активен и не регулируется нуклеотидами напрямую. Чувствительность к AMP обеспечивает γ-субъединица AMPK, а не LKB1: LKB1 переносит фосфорильную группу с ATP, а AMP меняет доступность Thr172 и устойчивость модификации. Защита петли не делает активацию необратимой: когда содержание ATP восстанавливается и AMP вытесняется из регуляторного участка, фосфатазы дефосфорилируют Thr172.Номер участка зависит от изоформы и вида. Thr172 — номер в AMPKα2 человека; в AMPKα1 человека соответствующий треонин имеет номер Thr183. Антитела и подписи «p-AMPK Thr172» в лабораторной практике обычно относятся к этому участку обеих изоформ, поэтому в описании эксперимента указывают изоформу и вид. Влияние нуклеотидов зависит также от состава комплекса: у млекопитающих есть по нескольку изоформ каждой субъединицы.Типичная ошибка AMP — донор фосфорильной группы для активации AMPK.AMP действует как регуляторный лиганд. Фосфорильную группу в киназной реакции переносит вышестоящая киназа с ATP.AMP связывается с регуляторным участком AMPK при сохранённом фосфорилировании активационной петли. Почему активность может возрасти?А. Связывание AMP аллостерически меняет активность комплекса. (верный вариант)Регуляторный лиганд меняет каталитическую активность через изменение состояния комплекса.Б. AMP служит донором фосфорильной группы для α-субъединицы. (неверный вариант)Здесь AMP является регуляторным лигандом, а не донором группы для фосфорилирования AMPK.В. При неизменном фосфорилировании связывание AMP не может менять активность. (неверный вариант)Аллостерическая регуляция позволяет изменить активность при сохранённой модификации петли.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаSteinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Xiao B. et al. Structure of mammalian AMPK and its regulation by ADP. Nature. 2011;472:230–233. doi:10.1038/nature09932Нумерация Thr172 задана для α2 человека; другие паралоги не получают этот номер автоматически. Влияние нуклеотидов зависит от состава комплекса; схема качественная.
AMPK и энергетическое состояние · шаг 11 из 32Как AMPK меняет регуляцию синтеза и окисленияДействие AMPK определяется её субстратами. Результат фосфорилирования нужно описывать отдельно для TSC2, RAPTOR и ACC.Что показывает схема. AMPK фосфорилирует три белка: TSC2 (GAP-действие на RHEB усиливается), RAPTOR (связывание 14-3-3, mTORC1 подавляется даже без TSC2) и ACC (активность и образование малонил-CoA снижаются). Направление действия на TSC2 противоположно действию AKT.AMPK воздействует на TSC2 и RAPTOR, ограничивая часть сигналов mTORC1.AMPK фосфорилирует ACC и снижает образование малонил-CoA.Снижение малонил-CoA может ослабить ингибирование CPT1 при сохранённых остальных условиях окисления.Действие AMPK определяется тем, какие белки она фосфорилирует и как модификация меняет каждый из них. С сигналом mTORC1 AMPK связана двумя путями. Фосфорилирование TSC2 под действием AMPK усиливает GAP-действие комплекса TSC: RHEB переходит в GDP-форму. Фосфорилирование RAPTOR под действием AMPK создаёт участки связывания белков 14-3-3 и подавляет mTORC1 даже в клетках без TSC2 (Gwinn и соавт., 2008, по обзору Smith и соавт., 2026). Направление действия на TSC2 противоположно действию AKT: AKT ослабляет TSC, а AMPK его усиливает. Поэтому направление действия фосфорилирования указывают для каждого белка отдельно. Встречается и обратная связь от пути mTORC1 к AMPK: в гипоталамусе мыши киназа S6K1 (p70S6K) фосфорилировала α2-субъединицу AMPK по Ser491, и это фосфорилирование снижало активность AMPK; оно было необходимо для того, чтобы гормон лептин снижал активность α2-AMPK в гипоталамусе и потребление пищи (Dagon и соавт., 2012). Из этого примера не следует общее правило взаимного торможения двух путей во всех клетках.Третья мишень — ацетил-CoA-карбоксилаза (ACC), фермент, образующий малонил-CoA. Фосфорилирование ACC под действием AMPK снижает активность фермента и образование малонил-CoA. Малонил-CoA служит субстратом синтеза жирных кислот и ингибитором CPT1 — фермента, с которого начинается перенос длинноцепочечных ацильных групп в митохондрии. Подробно эта связь разобрана в разделе 3. Снижение активности ACC ещё не равно усилению метаболического потока β-окисления: поток — количество вещества, проходящее через путь за единицу времени, — зависит и от других звеньев.Ответы AMPK различаются по времени. Быстрые ответы — изменения активности уже имеющихся ферментов за минуты. Так, AMPK фосфорилирует ACC, а также HMGCR (ГМГ-CoA-редуктазу) — фермент, ограничивающий скорость синтеза холестерина, — и снижает активность обоих ферментов. В скелетной мышце AMPK способствует перемещению переносчика глюкозы GLUT4 на плазматическую мембрану; GLUT4 — переносчик глюкозы, содержание которого на мембране регулируется в определённых тканях, включая скелетную мышцу и жировую ткань. В определённых клетках AMPK фосфорилирует отдельные изоформы семейства PFKFB (в обзоре Steinberg, Hardie, 2023 среди мишеней AMPK названы PFKFB2 и PFKFB3); ферменты PFKFB образуют и гидролизуют фруктозо-2,6-бисфосфат — регулятор гликолиза. Эти эффекты зависят от ткани и изоформы и не переносятся одинаково на печень и мышцу. Медленные ответы — изменения экспрессии генов за часы — рассмотрены в шаге об адаптации.Само фосфорилирование ферментов не образует ATP. AMPK снижает скорость процессов, расходующих ATP (синтез жирных кислот, холестерина и белков), и способствует процессам, обеспечивающим образование ATP: поступлению глюкозы в мышечную клетку и окислению жирных кислот. AMPK при этом не прекращает весь синтез веществ в клетке, а ответы разных тканей различаются.Типичная ошибка AMPK ингибирует TSC2 и активирует RAPTOR так же, как ростовой сигнал.В рассматриваемой ветви AMPK ограничивает mTORC1 через TSC2 и RAPTOR, а направление действия отличается от ростового сигнала AKT.В основной модели AMPK фосфорилирует ACC по ингибирующему участку. Какое ближайшее изменение связано с этой реакцией?А. Активность ACC не меняется: AMPK регулирует только экспрессию её гена. (неверный вариант)Указана быстрая модификация фермента; её действие нельзя свести к изменению экспрессии гена.Б. Снижается активность ACC и образование малонил-CoA. (верный вариант)Ингибирующее фосфорилирование ACC уменьшает образование малонил-CoA; дальнейший поток проверяют отдельно.В. Возрастает активность ACC и образование малонил-CoA. (неверный вариант)Для указанного ингибирующего участка направление действия противоположно.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаSteinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Fullerton M. D. et al. Single phosphorylation sites in Acc1 and Acc2 regulate lipid homeostasis and the insulin-sensitizing effects of metformin. Nat Med. 2013;19:1649–1654. doi:10.1038/nm.3372Goul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Dagon Y. et al. p70S6 kinase phosphorylates AMPK on serine 491 to mediate leptin's effect on food intake. Cell Metab. 2012;16:104–112. doi:10.1016/j.cmet.2012.05.010Речь об ингибирующих AMPK-зависимых модификациях ACC и выбранных регуляторных связях; другие участки фосфорилирования и тканевые ответы рассматриваются отдельно.
AMPK и энергетическое состояние · шаг 12 из 32Как AMPK отвечает на снижение глюкозы без обязательного изменения AMPВ некоторых клетках AMPK активируется при снижении глюкозы без обнаружимого изменения соотношений аденилатов. Такой ответ связан с альдолазой и лизосомной организацией регуляторного комплекса.Что показывает схема. Глюкоза → гликолиз → FBP, связанный с альдолазой. При удалении глюкозы альдолаза не занята FBP, через каналы TRPV эндоплазматического ретикулума и V-ATPase способствует сборке комплекса AXIN–LKB1 у лизосомы (локальный выход Ca²⁺ снижается); LKB1 фосфорилирует AMPK. В исследованных клетках это происходило без обнаружимого изменения отношений AMP/ATP и ADP/ATP.Снижение глюкозы может уменьшать содержание фруктозо-1,6-бисфосфата.Меняется занятость альдолазы этим метаболитом; через каналы TRPV эндоплазматического ретикулума и V-ATPase это ведёт к сборке комплекса с AXIN и LKB1 у лизосомы.В выбранных условиях активация AMPK не требует предварительного роста AMP/ATP.Фруктозо-1,6-бисфосфат (FBP) — промежуточный метаболит гликолиза, субстрат альдолазы. Альдолаза расщепляет FBP на две триозы. Фруктозо-1,6-бисфосфат не следует путать с фруктозо-2,6-бисфосфатом — регуляторным метаболитом, который образуют ферменты PFKFB и который не входит в последовательность реакций гликолиза. При удалении глюкозы из среды гликолиз замедляется, и содержание FBP в клетке снижается.Zhang и соавт. (2017) описали путь, в котором сигналом служит не сам AMP, а занятость альдолазы. Альдолаза, не связанная с FBP, передаёт сигнал на лизосому в несколько этапов. Сначала она взаимодействует с каналами TRPV эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и ограничивает их активность, поэтому на контактах ЭПР с лизосомой локальный выход Ca²⁺ из ЭПР уменьшается (Li и соавт., 2019). При низком локальном Ca²⁺ ингибированный TRPV оказывается доступен для связывания с V-ATPase — протонным насосом лизосомной мембраны. Это меняет конфигурацию V-ATPase, и к комплексу V-ATPase–Ragulator привлекаются каркасный белок AXIN и киназа LKB1. Так LKB1 оказывается рядом с AMPK, часть которой находится у лизосомы, и фосфорилирует её Thr172. Альдолаза, TRPV, V-ATPase, Ragulator и AXIN — участники описанного пути, а не универсальные датчики любого стресса. Общая концентрация Ca²⁺ в цитозоле при удалении глюкозы не меняется, и CaMKK2 для этого механизма не требуется (обзор Steinberg, Hardie, 2023).Этот путь отличается от канонического и от кальциевого пути активации AMPK через Ca²⁺–кальмодулин–CaMKK2 (следующий шаг): там активацию вызывает повышение концентрации Ca²⁺ в цитозоле, а здесь — снижение локального выхода Ca²⁺ на контактах ЭПР с лизосомой. В каноническом пути AMP или ADP связываются с γ-субъединицей AMPK. В пути через альдолазу меняется сборка регуляторного комплекса на лизосоме. В исследованных клетках AMPK активировалась после удаления глюкозы, хотя отношения AMP/ATP и ADP/ATP в пределах измерения не менялись. Результат относится к этим клеткам и условиям; он не означает, что в любой ткани реакция на глюкозу совсем не зависит от аденилатов, а аденилатный вход к AMPK остаётся параллельным путём.Поэтому вывод о причине активации требует нескольких независимых измерений: состояния аденилатного пула, фосфорилирования AMPK и её действия на субстрат, например на ACC. Утверждение «AMPK всегда включается раньше падения ATP» неверно: последовательность событий зависит от вида воздействия и измеряется в каждом эксперименте отдельно.Типичная ошибка Активация AMPK обязательно доказывает снижение ATP или увеличение AMP.Существуют дополнительные пути активации; состояние аденилатного пула нужно измерить самостоятельно.В исследованной системе после удаления глюкозы AMPK активировалась, а AMP/ATP и ADP/ATP не изменились в пределах измерения. Какой вывод допустим?А. AMPK не может быть активна, пока не уменьшится измеренное содержание ATP. (неверный вариант)Это отрицает результат и смешивает один канонический вход со всеми возможными входами.Б. Во всех клетках действие глюкозы полностью независимо от состояния аденилатов. (неверный вариант)Отдельная система не устанавливает универсальную независимость от нуклеотидов.В. В этой системе возможен путь активации без обнаружимого изменения аденилатов. (верный вариант)Наблюдение согласуется с дополнительным метаболит-зависимым механизмом, описанным для определённых клеток.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаZhang C.-S. et al. Fructose-1,6-bisphosphate and aldolase mediate glucose sensing by AMPK. Nature. 2017;548:112–116. doi:10.1038/nature23275Steinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Li M., Zhang C.-S., Zong Y. et al. Transient receptor potential V channels are essential for glucose sensing by aldolase and AMPK. Cell Metab. 2019;30:508–524.e12. doi:10.1016/j.cmet.2019.05.018Качественная иллюстрация механизма Zhang 2017; звено TRPV описано по Li и соавт. (2019) в клетках человека и мыши и у нематоды, универсальность для всех тканей не установлена; без переноса конкретной клеточной линии, срока или дозы из другой работы. «Не изменилось» означает пределы выбранного измерения.
AMPK и энергетическое состояние · шаг 13 из 32Как Ca²⁺ и CaMKK2 создают другой вход к AMPKВ подходящем клеточном контексте повышение Ca²⁺ может активировать AMPK через CaMKK2. Этот путь не требует, чтобы каждое повышение активности AMPK предварялось энергетическим дефицитом.Что показывает схема. Две ветви к Thr172 AMPK: LKB1 (её действие усиливается при связывании AMP или ADP с γ-субъединицей) и Ca²⁺ → кальмодулин → CaMKK2. При неизменных аденилатах и повышенном Ca²⁺ AMPK фосфорилируется через CaMKK2, в том числе в клетках без LKB1; без функциональной CaMKK2 этот вход отсутствует.Ca²⁺ связывается с кальмодулином.Кальмодулин регулирует CaMKK2, которая фосфорилирует активационную петлю AMPK.Доступность CaMKK2 и состояние других регуляторов определяют ответ конкретной клетки.Кроме LKB1, Thr172 в AMPK фосфорилируется и киназой CaMKK2 (киназа кальмодулин-зависимых протеинкиназ, β-изоформа). Её активность регулируется ионами кальция не напрямую, а через кальмодулин — небольшой белок, который связывает Ca²⁺ и в связанном с Ca²⁺ виде связывается с другими белками и активирует их. Сам ион Ca²⁺ не является киназой и не переносит фосфорильную группу: он меняет состояние кальмодулина, а комплекс Ca²⁺–кальмодулин активирует CaMKK2.Этот вход отличается от LKB1-зависимого по сигналу. LKB1, по-видимому, постоянно активна, и её действие на AMPK усиливается тогда, когда AMP или ADP связываются с γ-субъединицей. CaMKK2 активируется при повышении концентрации Ca²⁺ в цитозоле, например после действия гормонов, которые высвобождают Ca²⁺ из внутриклеточных депо. Поэтому активация AMPK через CaMKK2 возможна без предварительного энергетического дефицита и без роста отношения AMP к ATP (Hawley и соавт., 2005).Выраженность этого пути зависит от ткани. CaMKK2 много в нейронах и некоторых других клетках, а в разных тканях её содержание различается. Поэтому нельзя приписывать CaMKK2 все ответы AMPK, например в сокращающейся скелетной мышце, где одновременно меняются и концентрация Ca²⁺, и состояние аденилатного пула. Вклад каждого входа проверяют отдельно.Из сказанного следует, что генетическая утрата LKB1 не исключает активацию AMPK полностью. В клетках без LKB1, где CaMKK2 функциональна, повышение Ca²⁺ может усилить фосфорилирование Thr172. Чтобы показать роль CaMKK2, используют утрату или подавление CaMKK2 и измеряют аденилаты независимо, иначе нельзя отличить кальциевый вход от энергетического.Типичная ошибка В клетках без LKB1 AMPK не может активироваться ни при каких условиях.При наличии работающего CaMKK2-зависимого пути фосфорилирование AMPK возможно и без LKB1.В клетке отсутствует LKB1, но CaMKK2 функциональна. При сохранённых аденилатах повысили Ca²⁺. Какой ответ AMPK допускает эта схема?А. Фосфорилирование AMPK через CaMKK2 может усилиться. (верный вариант)CaMKK2 — альтернативная вышестоящая киназа в заданном клеточном контексте.Б. Фосфорилирование AMPK обязательно остаётся невозможным. (неверный вариант)Утрата одного входа не исключает действующего альтернативного входа.В. Ca²⁺ обязательно вытесняет AMP из γ-субъединицы и подавляет AMPK. (неверный вариант)В заданном пути Ca²⁺ действует через кальмодулин и CaMKK2; его не следует помещать вместо AMP в нуклеотидный участок.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаSteinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Hawley S. A. et al. Calmodulin-dependent protein kinase kinase-β is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase. Cell Metab. 2005;2:9–19. doi:10.1016/j.cmet.2005.05.009Это условная клетка с функциональной CaMKK2; не универсальный ответ всех тканей на Ca²⁺. Энергетические показатели сохранены как условие сравнения.
AMPK и энергетическое состояние · шаг 14 из 32Чем быстрые реакции AMPK отличаются от длительной адаптацииAMPK может быстро изменять активность ферментов и позднее влиять на экспрессию генов. Увеличение ядерной доли TFEB не равно немедленному образованию новых лизосом и митохондрий.Что показывает схема. Панели: (1) за минуты AMPK фосфорилирует ACC и HMGCR, а также MFF (деление митохондрий); (2) фосфорилирование FNIP1 ослабляет фосфорилирование TFEB, TFEB перемещается в ядро, меняется РНК генов-мишеней; (3) синтезируются компоненты лизосом и митохондрий, участвуют PGC-1α и ERRα. Отдельная панель: у дрожжей и млекопитающих сохраняются родственные киназы TOR и AMPK/Snf1 и белки Atg, а входные сигналы различаются.Фосфорилирование FNIP1 под действием AMPK меняет работу комплекса FLCN–FNIP1.В описанном ответе TFEB перемещается в ядро и влияет на экспрессию генов.Биогенез органелл требует последующих изменений РНК, белков и мембран.Ответы AMPK развиваются на разных масштабах времени. Фосфорилирование ACC или HMGCR меняет активность уже имеющихся молекул фермента за минуты. Изменение экспрессии генов требует транскрипции, процессинга РНК и синтеза белков и проявляется позже, обычно через часы. Это качественная последовательность: точная длительность каждого этапа зависит от клеток, воздействия и измеряемого показателя.Пример медленного ответа описали Malik и соавт. (2023) в клетках с повреждёнными митохондриями. AMPK фосфорилирует FNIP1 — партнёра FLCN, с которым он образует комплекс, переводящий RagC/D в GDP-форму. После фосфорилирования FNIP1 комплекс FLCN–FNIP1 хуже поддерживает фосфорилирование TFEB комплексом mTORC1, и TFEB перемещается в ядро. В ядре TFEB активирует экспрессию генов лизосомных белков, а также генов транскрипционного коактиватора PGC-1α и транскрипционного фактора ERRα — ядерного рецептора, родственного рецептору эстрогенов. PGC-1α вместе с ERRα стимулирует экспрессию генов митохондриальных белков, необходимых для образования митохондрий. Перемещение TFEB в ядро — первый этап: биогенез лизосом и митохондрий требует новых РНК, белков и мембран и измеряется отдельно. AMPK действует и на другие транскрипционные факторы: она фосфорилировала FOXO3 человека по шести ранее неизвестным участкам; в клетках млекопитающих это фосфорилирование повышало транскрипционную активность FOXO3, не меняя его распределения между ядром и цитоплазмой (Greer и соавт., 2007). Активация FOXO3 сама по себе не означает усиления биогенеза митохондрий.AMPK влияет на митохондрии и через другие мишени. Фосфорилирование MFF — белка наружной митохондриальной мембраны, привлекающего белок деления DRP1, — способствует делению митохондрий. Деление, биогенез и митофагия — разные процессы. Деление меняет число и размер митохондрий, биогенез создаёт новые митохондриальные компоненты, митофагия удаляет повреждённые участки через аутофагию. Ни один из них нельзя установить, измерив только другой.Регуляторы такого рода есть у многих эукариот. У дрожжей киназа Snf1 — гомолог α-субъединицы AMPK — необходима для ответа на снижение глюкозы, а родственные TOR-киназы и многие белки Atg, участвующие в аутофагии, сохраняются от дрожжей до млекопитающих. Snf1 — гомолог AMPK у современного организма, а не её непосредственно наблюдаемый предок. Общее происхождение не означает одинаковых входов: Snf1 активируется при снижении глюкозы, а регуляция AMP, характерная для AMPK млекопитающих, у неё выражена иначе. Из сохранения этих белков не следует «лестница прогресса» от дрожжей к человеку: у каждого вида их регуляция соответствует его собственным условиям жизни.Типичная ошибка После перемещения TFEB в ядро число лизосом мгновенно возрастает.Локализация фактора предшествует ряду изменений экспрессии и построению органелл; каждый этап проверяют отдельным показателем.После активации AMPK TFEB обнаружен в ядре. Какое измерение нужно дополнительно для вывода о митохондриальном биогенезе?А. Подсчёт только точек LC3 без оценки митохондриальных компонентов. (неверный вариант)LC3 связан с аутофагическим аппаратом и не заменяет показатель образования митохондрий.Б. Изменение компонентов и объёма митохондрий с контролем их распада. (верный вариант)Биогенез относится к построению митохондриальных компонентов; их накопление нужно отличить от уменьшения распада.В. Повторное измерение только ядерной доли TFEB в тот же момент. (неверный вариант)Локализация TFEB подтверждает один этап регуляции, но не сам биогенез.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Malik N. et al. Induction of lysosomal and mitochondrial biogenesis by AMPK phosphorylation of FNIP1. Science. 2023;380:eabj5559. doi:10.1126/science.abj5559Steinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Greer E. L. et al. The energy sensor AMP-activated protein kinase directly regulates the mammalian FOXO3 transcription factor. J Biol Chem. 2007;282:30107–30119. doi:10.1074/jbc.M705325200Связь AMPK–FNIP1–TFEB представлена по определённому стрессовому ответу. Не устанавливается обязательная длительность каждого этапа и не утверждается идентичность регуляции всех эукариот.
AMPK и энергетическое состояние · шаг 15 из 32Как проверить активность AMPK и состояние аденилатного пулаФосфорилирование AMPK, действие на ACC и концентрации нуклеотидов — разные показатели. Для причинного вывода нужны согласованные измерения и подходящее вмешательство.Что показывает схема. Четыре карточки: аденилаты (ВЭЖХ или масс-спектрометрия после быстрой остановки реакций), p-AMPK Thr172 относительно общего AMPK, p-ACC относительно общего ACC, генетическое сравнение клеток дикого типа, без AMPK и с возвращённой AMPK. Для каждой указано, чего метод сам не показывает.Аденилаты измеряют после быстрого прекращения метаболических реакций в образце.Фосфорилирование активационной петли сопоставляют с действием на определённый субстрат.Генетический контроль помогает отделить действие AMPK от других действий препарата.Содержание ATP, ADP и AMP измеряют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) или масс-спектрометрией — методами, которые разделяют молекулы и определяют их количество. Аденилатный пул меняется за секунды, поэтому метаболические реакции в образце останавливают сразу: клетки быстро охлаждают или переносят в кислотный или органический экстрагент. При медленном приготовлении образца ATP успевает гидролизоваться, и измеренное отношение AMP к ATP оказывается завышенным.Активность AMPK описывают несколькими показателями. Иммуноблоттинг с антителом к фосфорилированному Thr172 показывает модификацию петли; рядом измеряют общее содержание AMPK. Действие на субстрат оценивают по фосфорилированию ACC по участку, который фосфорилирует AMPK (у мыши Ser79 в Acc1), вместе с общим содержанием ACC. Ни один из этих сигналов не измеряет всю активность AMPK: фосфорилирование петли не учитывает аллостерическую активацию, а фосфорилирование одного субстрата зависит и от фосфатаз этого субстрата.Препараты, действующие на AMPK, различаются механизмом. AICAR — предшественник: в клетке он фосфорилируется до ZMP, аналога AMP, который связывается с γ-субъединицей; ZMP действует и на другие ферменты, связывающие AMP. Метформин активирует AMPK косвенно; среди предложенных механизмов — подавление комплекса I дыхательной цепи и действие через лизосомный путь. Прямые активаторы связываются с участком ADaM (участок связывания аллостерических препаратов и метаболитов) между α- и β-субъединицами. Дорсоморфин (соединение C, dorsomorphin, compound C) подавляет AMPK, но подавляет и многие другие киназы, поэтому эффект этого ингибитора не доказывает роли AMPK. Убедительнее генетическое сравнение: клетки дикого типа, клетки без каталитических субъединиц AMPK и клетки, в которые AMPK возвращена.Генетические варианты субъединиц AMPK связаны с определёнными заболеваниями. Варианты гена PRKAG2, кодирующего γ2-субъединицу, связаны с кардиомиопатией с накоплением гликогена в сердечной мышце и нарушениями проведения возбуждения, например синдромом Вольфа — Паркинсона — Уайта (Arad и соавт., 2003; Thevenon и соавт., 2017). Наследственные мутации STK11 — гена, кодирующего LKB1, — вызывают синдром Пейтца — Егерса. Заболевание нельзя вывести из одного измерения p-AMPK: варианты меняют регуляцию в определённых тканях, и следствия проверяют на уровне этих тканей. Схемы лечения в семинаре не рассматриваются.Типичная ошибка Рост p-AMPK доказывает, что любое действие добавленного препарата зависит только от AMPK.Модификация AMPK — один показатель; препарат может иметь другие мишени. Нужны функциональный показатель и независимый генетический контроль.Какое сравнение лучше проверяет, зависит ли выбранный эффект препарата от AMPK?А. Сравнение только двух концентраций препарата в исходных клетках дикого типа (WT). (неверный вариант)Зависимость от дозы сама по себе не устанавливает мишень: другие действия также могут зависеть от дозы.Б. Сравнение только p-AMPK и общего содержания AMPK в одной группе исходных клеток дикого типа (WT). (неверный вариант)Соотношение фосфосигнала и общего белка не проверяет причинную зависимость выбранного эффекта от AMPK.В. Сравнение исходных клеток дикого типа (WT), клеток с утратой AMPK и клеток с восстановленной AMPK. (верный вариант)Сопоставимые генетические условия помогают проверить зависимость эффекта и контролировать специфичность утраты.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаSteinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Fullerton M. D. et al. Single phosphorylation sites in Acc1 and Acc2 regulate lipid homeostasis and the insulin-sensitizing effects of metformin. Nat Med. 2013;19:1649–1654. doi:10.1038/nm.3372Arad M. et al. Transgenic mice overexpressing mutant PRKAG2 define the cause of Wolff-Parkinson-White syndrome in glycogen storage cardiomyopathy. Circulation. 2003;107:2850–2856. doi:10.1161/01.CIR.0000075270.13497.2BThevenon J. et al. High prevalence of arrhythmic and myocardial complications in patients with cardiac glycogenosis due to PRKAG2 mutations. Europace. 2017;19:651–659. doi:10.1093/europace/euw067Никакая концентрация препарата не задаётся как универсально селективная. Количество белка, степень фосфорилирования и активность различаются; медицинские сведения только о молекулярном механизме.
ACC, малонил-CoA и CPT1 · шаг 16 из 32Как ACC образует малонил-CoAАцетил-CoA-карбоксилаза образует малонил-CoA из ацетил-CoA. Малонил-CoA участвует и в синтезе жирных кислот, и в регуляции их митохондриального окисления.Что показывает схема. ACC превращает ацетил-CoA (CH₃–CO–S-CoA) в малонил-CoA (⁻OOC–CH₂–CO–S-CoA): ацетил-CoA + HCO₃⁻ + ATP → малонил-CoA + ADP + фосфат; карбоксильную группу переносит биотин фермента. Малонил-CoA служит субстратом FASN (с NADPH) и ингибитором CPT1.ACC использует ATP и бикарбонат при карбоксилировании ацетил-CoA.Связанный с ферментом биотин участвует в переносе карбоксильной группы.Образуется малонил-CoA, используемый в синтезе жирных кислот.Коэнзим A (CoA) — переносчик ацильных групп. Он присоединяет ацильный остаток тиоэфирной связью через свою SH-группу, и в таком виде остаток участвует в реакциях. Ацетил-CoA — это ацетильная группа (CH₃–CO–), связанная с CoA; сам CoA не является ни жирной кислотой, ни её частью. Малонил-CoA — малонильная группа (⁻OOC–CH₂–CO–), связанная с CoA, то есть ацетильная группа с дополнительной карбоксильной группой.Ацетил-CoA-карбоксилаза (ACC) катализирует превращение ацетил-CoA в малонил-CoA. Суммарная реакция: ацетил-CoA + HCO₃⁻ + ATP → малонил-CoA + ADP + фосфат. Реакция идёт в два этапа на одном ферменте. Сначала биотин, ковалентно связанный с ферментом, карбоксилируется за счёт бикарбоната; энергию для этого даёт гидролиз ATP. Затем карбоксильная группа переносится с биотина на ацетил-CoA. Углерод новой карбоксильной группы происходит из бикарбоната, а не из ATP: ATP расходуется на активацию бикарбоната.Малонил-CoA используется синтазой жирных кислот (FASN) — многофункциональным ферментом, который последовательно удлиняет растущую ацильную цепь на два атома углерода за цикл. Для синтеза пальмитата (C16) FASN использует одну молекулу ацетил-CoA и семь молекул малонил-CoA, а восстановителем служит NADPH; при каждом удлинении освобождается CO₂ той самой карбоксильной группы, которую присоединила ACC. Образование малонил-CoA и реакции FASN — разные этапы: снижение активности ACC ограничивает поступление субстрата для FASN, но по активности ACC нельзя судить о скорости синтеза жирных кислот.Синтез жирных кислот de novo — образование жирных кислот из ацетил-CoA с участием ACC и FASN. Его следует отличать от сборки триацилглицеролов: в этом процессе к глицерол-3-фосфату присоединяются уже имеющиеся жирные кислоты, в том числе поступившие с пищей. Слово «липогенез» в литературе используют для обоих процессов, поэтому в описании эксперимента указывают, что именно измерено. Кроме того, малонил-CoA ингибирует CPT1 — фермент начала переноса длинноцепочечных ацильных групп в митохондрии; эта вторая функция той же молекулы разобрана в следующих шагах.Типичная ошибка Малонил-CoA — только тормозящий сигнал и не участвует в синтезе жирных кислот.Это также субстрат синтеза жирных кислот; регуляторное действие на CPT1 представляет другую функцию той же молекулы.Активность ACC снижена, остальные условия образования и использования малонил-CoA сохранены. Какое непосредственное изменение ожидается?А. Снижается скорость образования малонил-CoA из ацетил-CoA. (верный вариант)ACC катализирует образование малонил-CoA; снижение её активности ограничивает эту реакцию.Б. Возрастает скорость образования малонил-CoA из ацетил-CoA. (неверный вариант)Это противоположно влиянию снижения активности катализирующего фермента при прочих равных условиях.В. Скорость образования малонил-CoA не меняется: ACC регулирует только карнитиновый перенос. (неверный вариант)ACC выполняет реакцию образования малонил-CoA; влияние на CPT1 — последующая регуляторная связь.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Fullerton M. D. et al. Single phosphorylation sites in Acc1 and Acc2 regulate lipid homeostasis and the insulin-sensitizing effects of metformin. Nat Med. 2013;19:1649–1654. doi:10.1038/nm.3372Прогноз относится к скорости указанной реакции при неизменных субстратах и других процессах. Скорость образования и установившаяся концентрация — разные величины.
ACC, малонил-CoA и CPT1 · шаг 17 из 32Как длинноцепочечная ацильная группа достигает матриксаДля окисления длинноцепочечной жирной кислоты её ацильная группа переносится через внутреннюю мембрану в составе ацилкарнитина. CPT1, CACT и CPT2 выполняют последовательные, но разные действия.Что показывает схема. Цитозоль: жирная кислота + CoA + ATP → ацил-CoA. CPT1 в наружной мембране переносит ацильную группу с CoA на карнитин: образуется ацилкарнитин, CoA остаётся в цитозоле. CACT во внутренней мембране переносит ацилкарнитин в матрикс в обмен на карнитин. CPT2 на матриксной стороне переносит ацил на CoA матрикса; ацил-CoA вступает в β-окисление.CPT1 переносит ацильную группу с CoA на карнитин у наружной мембраны.CACT переносит ацилкарнитин через внутреннюю мембрану в обмен на карнитин.CPT2 восстанавливает ацил-CoA на матриксной стороне внутренней мембраны.Митохондрия окружена двумя мембранами. Между ними находится межмембранное пространство, внутри внутренней мембраны — матрикс, где идёт β-окисление. Наружная мембрана проницаема для небольших молекул, а внутренняя мембрана для ацил-CoA непроницаема. Поэтому длинноцепочечные ацильные группы переносятся в матрикс особым путём — карнитиновым челноком.Перенос начинается после активации жирной кислоты. В цитозоле ацил-CoA-синтетаза, связанная с наружной митохондриальной мембраной, присоединяет жирную кислоту к CoA; энергию даёт расщепление ATP до AMP и пирофосфата. Образовавшийся ацил-CoA — субстрат CPT1 (карнитин-пальмитоилтрансферазы 1). CPT1 находится в наружной мембране и переносит ацильную группу с CoA на карнитин. Образуется ацилкарнитин, а CoA остаётся в цитозоле. CPT1 — фермент, а не канал внутренней мембраны.Через внутреннюю мембрану ацилкарнитин переносит CACT (карнитин-ацилкарнитинтранслоказа). Это переносчик-антипортер: на каждую молекулу ацилкарнитина, поступающую в матрикс, из матрикса выходит молекула свободного карнитина. На матриксной стороне внутренней мембраны CPT2 переносит ацильную группу с карнитина на CoA матрикса. Ацил-CoA образуется вновь, а освободившийся карнитин возвращается через CACT. Таким образом, через внутреннюю мембрану проходит ацильная группа в составе ацилкарнитина, а не целая молекула ацил-CoA: CoA цитозоля и CoA матрикса — разные молекулы.После CPT2 ацил-CoA вступает в β-окисление — повторяющийся цикл из четырёх реакций, в котором ацильная цепь укорачивается на два атома углерода с образованием ацетил-CoA, NADH и FADH₂. Перенос через мембраны и реакции окисления — разные этапы, и нарушение любого звена челнока прерывает перенос на соответствующем этапе. Схема относится к длинноцепочечным жирным кислотам; поступление других субстратов и различия тканей рассмотрены в отдельном шаге.Типичная ошибка CPT1 переносит целую молекулу ацил-CoA непосредственно через внутреннюю мембрану.CPT1 образует ацилкарнитин; мембранный перенос выполняет CACT, а ацил-CoA в матриксе образуется вновь при участии CPT2.В карнитиновом челноке избирательно нарушена CACT. Какой этап непосредственно затронут?А. Восстановление ацил-CoA на матриксной стороне при действии CPT2. (неверный вариант)Это реакция CPT2 после доставки ацилкарнитина; она отличается от действия CACT.Б. Перенос ацилкарнитина через внутреннюю мембрану митохондрии. (верный вариант)CACT — транспортёр внутренней мембраны, выполняющий обмен ацилкарнитина и карнитина.В. Перенос ацильной группы с CoA на карнитин при действии CPT1. (неверный вариант)Это реакция CPT1 до этапа переноса через внутреннюю мембрану.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Houten S. M. et al. The Biochemistry and Physiology of Mitochondrial Fatty Acid β-Oxidation and Its Genetic Disorders. Annu Rev Physiol. 2016;78:23–44. doi:10.1146/annurev-physiol-021115-105045Схема относится к длинноцепочечным субстратам; перенос других субстратов и других тканей рассматривается в отдельном шаге.
ACC, малонил-CoA и CPT1 · шаг 18 из 32Как AMPK связывает образование малонил-CoA с действием CPT1Малонил-CoA ингибирует CPT1 и одновременно служит субстратом синтеза жирных кислот. AMPK-зависимое снижение активности ACC меняет обе ветви, но их реальные потоки не обязаны изменяться одинаково.Что показывает схема. AMPK фосфорилирует ACC (у мыши Ser79 в Acc1, Ser212 в Acc2) и снижает её активность; образование малонил-CoA уменьшается. Одна и та же молекула малонил-CoA служит субстратом синтеза жирных кислот и ингибитором CPT1, поэтому синтез получает меньше субстрата, а ингибирование CPT1 ослабевает. Рост потока окисления требует сохранения субстрата, ферментов β-окисления и дыхательной цепи.Ингибирующее фосфорилирование ACC уменьшает образование малонил-CoA.Снижается доступность малонил-CoA для синтеза жирных кислот.Ослабляется ингибирование CPT1, что создаёт возможность усиления переноса длинноцепочечных ацильных групп.Малонил-CoA — одна молекула с двумя функциями. Для синтазы жирных кислот она служит субстратом, а для CPT1 — ингибитором: связываясь с CPT1, малонил-CoA снижает её активность. Ингибирующее действие малонил-CoA на CPT1 впервые описали McGarry и соавт. (1977) на препаратах печени крысы. Поэтому одно изменение содержания малонил-CoA одновременно меняет условия синтеза и условия окисления жирных кислот.В причинной цепи три разные величины. Первая — активность ACC: AMPK фосфорилирует ACC по ингибирующему участку, и активность фермента снижается. Вторая — содержание малонил-CoA: оно определяется скоростью образования при участии ACC и скоростью использования и распада, поэтому снижение активности ACC уменьшает содержание малонил-CoA, если остальные скорости не изменились. Третья — активность CPT1: при меньшей концентрации ингибитора CPT1 ингибируется слабее. Кроме фосфорилирования, активность ACC1 регулирует цитрат: в экспериментах с очищенным ферментом человека цитрат аллостерически активировал ACC1 и вызывал сборку её активных нитевидных полимеров (Hunkeler и соавт., 2018). Длинноцепочечные ацил-CoA, например пальмитоил-CoA, напротив, описаны как аллостерические ингибиторы ACC. По представлению, на которое опираются Pinkosky и соавт. (2020), снижая образование малонил-CoA, они ослабляют ингибирование CPT1 и тем самым способствуют собственному окислению; насколько выражено это действие для ACC1 или ACC2 в конкретной клетке, здесь не задаётся.Номера фосфорилируемых участков зависят от вида и изоформы. В работе Fullerton и соавт. (2013) у мышей участки AMPK в Acc1 (Ser79) и Acc2 (Ser212) заменили аланином. У таких мышей на стандартном корме ACC не ингибировалась фосфорилированием, синтез жирных кислот в печени был повышен, окисление жирных кислот снижено, и развивались инсулинорезистентность, нарушение толерантности к глюкозе и неалкогольная жировая болезнь печени (стеатоз — накопление жира в клетках печени; в современной номенклатуре — метаболически ассоциированная жировая болезнь печени), но не ожирение. У человека соответствующие участки имеют номера Ser80 (ACC1) и Ser221 (ACC2) (Steinberg, Hardie, 2023); мышиные номера на ферменты человека не переносятся. Фосфорилирование ACC обратимо: фосфатазы удаляют фосфорильную группу с участка ACC, фосфорилирование которого подавляет активность фермента. Например, в первичных гепатоцитах мыши повышенная экспрессия фосфатазы PP4 снижала долю ACC1, фосфорилированной по Ser79 (Meng и соавт., 2014). Этот пример не означает, что PP4 — единственная фосфатаза ACC. После снятия фосфорилирования содержание малонил-CoA зависит ещё и от скорости его использования и распада.Ослабление ингибирования CPT1 создаёт возможность для усиления переноса длинноцепочечных ацильных групп в митохондрии, но не гарантирует роста потока β-окисления. Для этого должны сохраняться ещё три условия: поступление жирных кислот в клетку и их активация, работа ферментов β-окисления и реокисление NADH и FADH₂ в дыхательной цепи. Поэтому рост фосфорилирования ACC — признак регуляции, а поток окисления измеряют отдельно.Типичная ошибка Рост p-ACC непосредственно измеряет увеличение потока β-окисления.p-ACC отражает модификацию фермента; поток зависит ещё от транспорта, субстрата и последующих реакций и измеряется отдельно.В основной модели после действия AMPK снизилась концентрация малонил-CoA, доступного CPT1. Остальные условия сохранены. Как меняется ингибирование CPT1?А. Ингибирование CPT1 усиливается вследствие снижения малонил-CoA. (неверный вариант)При неизменной чувствительности CPT1 это противоположное направление регуляции.Б. Ингибирование не меняется: малонил-CoA участвует только в синтезе жирных кислот. (неверный вариант)Малонил-CoA не только используется в синтезе жирных кислот, но и ингибирует CPT1.В. Ингибирование CPT1 ослабевает; рост потока окисления ещё требует проверки. (верный вариант)Меньшая доступность ингибитора ослабляет его действие при сохранённой чувствительности CPT1; весь путь оценивают отдельно.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Fullerton M. D. et al. Single phosphorylation sites in Acc1 and Acc2 regulate lipid homeostasis and the insulin-sensitizing effects of metformin. Nat Med. 2013;19:1649–1654. doi:10.1038/nm.3372McGarry J. D., Mannaerts G. P., Foster D. W. A possible role for malonyl-CoA in the regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketogenesis. J Clin Invest. 1977;60:265–270. doi:10.1172/JCI108764Steinberg G. R., Hardie D. G. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:255–272. doi:10.1038/s41580-022-00547-xHunkeler M. et al. Structural basis for regulation of human acetyl-CoA carboxylase. Nature. 2018;558:470–474. doi:10.1038/s41586-018-0201-4Meng X. et al. Protein phosphatase 4 promotes hepatic lipogenesis through dephosphorylating acetyl-CoA carboxylase 1 on serine 79. Mol Med Rep. 2014;10:1959–1963. doi:10.3892/mmr.2014.2397Pinkosky S. L. et al. Long-chain fatty acyl-CoA esters regulate metabolism via allosteric control of AMPK β1 isoforms. Nat Metab. 2020;2:873–881. doi:10.1038/s42255-020-0245-2Качественная схема при фиксированной чувствительности CPT1 и указанных доступных субстратах. Номера Ser79/Ser212 относятся к мыши.
ACC, малонил-CoA и CPT1 · шаг 19 из 32Зачем различать ACC1, ACC2 и изоформы CPT1Изоформы отличаются распределением и свойствами регуляции. Локальное образование метаболита не означает существования непроницаемых изолированных пулов.Что показывает схема. Печень: ACC1 в цитозоле образует малонил-CoA для синтеза жирных кислот, ACC2 у наружной митохондриальной мембраны — рядом с CPT1A. Скелетная мышца: преобладает ACC2, рядом CPT1B, более чувствительная к малонил-CoA. Нейрон: CPT1C в мембране ЭПР связывает малонил-CoA, но в карнитиновом челноке не участвует. Малонил-CoA — общий метаболит, а не два изолированных пула.ACC1 связана преимущественно с обеспечением синтеза жирных кислот.ACC2 ассоциирована с наружной митохондриальной мембраной и влияет на образование малонил-CoA рядом с системой переноса.CPT1A и CPT1B различаются тканевым распределением и чувствительностью к малонил-CoA.Изоформы — варианты белка со сходной функцией, которые кодируются разными генами или образуются из одного гена и различаются строением, распределением по тканям или регуляцией. У млекопитающих две ACC. ACC1 находится в цитозоле и преимущественно обеспечивает малонил-CoA для синтеза жирных кислот; её много в печени и жировой ткани. ACC2 имеет N-концевой участок, которым связана с наружной митохондриальной мембраной; её много в скелетной мышце и сердце, есть она и в печени. Малонил-CoA, образованный ACC2, оказывается рядом с CPT1.CPT1 также представлена изоформами. CPT1A преобладает в печени, CPT1B — в скелетной мышце и сердце. CPT1B заметно чувствительнее к малонил-CoA, чем CPT1A, однако единого значения константы ингибирования для «CPT1 вообще» нет: чувствительность зависит от изоформы, ткани и состояния мембраны, и параметр одной ткани не переносится на другую.Третья изоформа, CPT1C, отличается от первых двух. Она экспрессируется прежде всего в нейронах, находится в мембране эндоплазматического ретикулума и связывает малонил-CoA, но в переносе ацильных групп в митохондрии не участвует. Поэтому в схеме карнитинового челнока CPT1C не изображают.Локальное образование малонил-CoA рядом с CPT1 не означает, что в клетке существуют два полностью изолированных пула этого метаболита: такая изоляция требует отдельного доказательства. Генетические модели показывают, насколько осторожно надо делать выводы. У мышей без Acc2 в работе Abu-Elheiga и соавт. (2001) окисление жирных кислот было повышено, а запасы жира снижены. В независимо полученной линии мышей без Acc2 (Olson и соавт., 2010) масса тела, масса жира и потребление пищи почти не отличались от контроля. Изменение одного потока, следовательно, не позволяет автоматически предсказать массу тела, расход энергии или клинический результат.Типичная ошибка ACC1 и ACC2 создают два одинаковых полностью изолированных пула малонил-CoA.Место образования и доступность метаболита различаются, но жёсткая изоляция двух пулов требует отдельного доказательства.В модели утраты Acc2 изменился поток окисления жирных кислот. Как проверить предположение об уменьшении массы тела?А. Измерить массу тела в сопоставимых группах с учётом условий эксперимента. (верный вариант)Другой уровень результата требует самостоятельного измерения; обмен, питание и другие условия сохраняются или учитываются.Б. Пересчитать поток окисления в массу тела по универсальному коэффициенту. (неверный вариант)Универсального пересчёта одного потока в изменение массы организма нет.В. Заменить измерение массы тела анализом одного пула малонил-CoA. (неверный вариант)Малонил-CoA характеризует регуляторный метаболит, а не массу тела.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Abu-Elheiga L. et al. Continuous fatty acid oxidation and reduced fat storage in mice lacking acetyl-CoA carboxylase 2. Science. 2001;291:2613–2616. doi:10.1126/science.1056843Olson D. P. et al. Gene knockout of Acc2 has little effect on body weight, fat mass, or food intake. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:7598–7603. doi:10.1073/pnas.0913492107Houten S. M. et al. The Biochemistry and Physiology of Mitochondrial Fatty Acid β-Oxidation and Its Genetic Disorders. Annu Rev Physiol. 2016;78:23–44. doi:10.1146/annurev-physiol-021115-105045Сведения об изоформах не задают общей численной чувствительности. Генетические результаты у мышей не становятся предсказанием терапии человека.
ACC, малонил-CoA и CPT1 · шаг 20 из 32Почему длина жирной кислоты и ткань меняют результатЗависимость окисления от карнитиновой системы определяется не одним названием «жирная кислота». Нужно назвать длину цепи, ткань и форму субстрата.Что показывает схема. Таблица по Pereyra и соавт. (2023), гомогенаты тканей мыши: свободный октаноат (C8) окисляется без карнитина в печени и почке, но не в сердце и скелетной мышце; свободный пальмитат (C16) без карнитина не окисляется ни в одной ткани; пальмитоилкарнитин окисляется во всех четырёх тканях.Окисление длинноцепочечных субстратов связано с карнитиновым челноком.В исследованных системах печени среднецепочечные свободные жирные кислоты могут использоваться без карнитина.Результат для печени нельзя автоматически переносить на сердце и скелетную мышцу.Жирные кислоты различаются длиной углеродной цепи. Пальмитиновая кислота содержит 16 атомов углерода (C16) и относится к длинноцепочечным; её ацильная группа поступает в матрикс митохондрий через карнитиновый челнок. Октановая кислота (C8) относится к среднецепочечным. Принято считать, что среднецепочечные жирные кислоты проходят внутреннюю мембрану и активируются в матриксе без участия CPT1 и карнитина. Однако граница длины цепи, начиная с которой нужен карнитин, не одинакова для всех тканей.Pereyra и соавт. (2023) измеряли дыхание гомогенатов тканей мышей при добавлении свободных жирных кислот длиной от 6 до 18 атомов углерода или их эфиров с карнитином. Гомогенат печени окислял без добавленного карнитина свободные жирные кислоты длиной от C6 до C14, гомогенат почки — от C6 до C10. Гомогенаты сердца и скелетной мышцы свободные жирные кислоты любой длины в этих условиях не окисляли; после добавления CoA и карнитина гомогенат мышцы окислял и свободный октаноат. Эфиры длинноцепочечных жирных кислот (C10–C18) с карнитином окислялись во всех четырёх тканях. Авторы связывают различие с тем, что в печени, в отличие от мышц, много среднецепочечных ацил-CoA-синтетаз, активирующих жирные кислоты в митохондриях.Эти данные описывают возможность окисления субстрата в препарате ткани. Они не описывают, как свободный октаноат распределяется в целом организме, сколько его поступает в каждую ткань и во что он превращается: например, среднецепочечные жирные кислоты пищи из кишечника поступают с кровью воротной вены прежде всего в печень. Поэтому результат для одной ткани проверяют в другой ткани отдельно.Это важно при наследственных нарушениях карнитинового челнока, например при недостаточности CPT2. Среднецепочечные субстраты не являются обходом карнитиновой системы во всех тканях: по данным той же работы, мышечная ткань мыши в описанных условиях без карнитина их не окисляла. Схема шага не описывает лечебную диету и не содержит рекомендаций.Типичная ошибка Все жирные кислоты средней длины во всех тканях обходят карнитиновую систему.Карнитин-независимое использование свободных среднецепочечных субстратов тканеспецифично; в частности, результаты для печени и мышцы различаются.Для печени показано окисление свободного октаноата без карнитина. Как правильно использовать этот результат при обсуждении скелетной мышцы?А. По этому результату определить активность CPT1 в мышце без дополнительных измерений. (неверный вариант)Превращения октаноата в печени не являются измерением CPT1 в другом органе.Б. Проверить отдельно: ткань может иметь другую зависимость от карнитина. (верный вариант)Показана тканевая специфичность, поэтому один орган не служит универсальной моделью остальных.В. Принять тот же результат: длина цепи гарантирует одинаковый путь во всех тканях. (неверный вариант)Длина цепи важна, но не устраняет различий ферментов и транспорта между тканями.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаPereyra A. S., McLaughlin K. L., Buddo K. A., Ellis J. M. Medium-chain fatty acid oxidation is independent of l-carnitine in liver and kidney but not in heart and skeletal muscle. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2023;325:G287–G294. doi:10.1152/ajpgi.00105.2023Smith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Houten S. M. et al. The Biochemistry and Physiology of Mitochondrial Fatty Acid β-Oxidation and Its Genetic Disorders. Annu Rev Physiol. 2016;78:23–44. doi:10.1146/annurev-physiol-021115-105045Детали эксперимента взяты из полного текста Pereyra и соавт. (2023; PMC10642992: методы, результаты, обсуждение): гомогенаты тканей самцов мыши, респирометрия с малатом и ADP. Скорости и проценты не переносятся. Результат относится к препаратам тканей и не описывает распределение субстратов в организме и лечебную диету.
ACC, малонил-CoA и CPT1 · шаг 21 из 32Как отличить регуляторный признак от потока окисленияСодержание малонил-CoA и p-ACC помогают описать регуляцию, но не заменяют измерение окислительного потока. Изменение дыхания после ингибитора требует проверки специфичности воздействия.Что показывает схема. Четыре подхода: этомоксир и дыхание (возможны другие действия препарата в высоких концентрациях), генетическая утрата CPT1 или CPT2 с восстановлением фермента, меченый субстрат с моделью расчёта потока, малонил-CoA и p-ACC как регуляторные показатели. Для каждого указано, чего метод сам не показывает.Масс-спектрометрия определяет выбранный метаболит или набор его форм.Меченый субстрат позволяет проследить его превращения при заданной модели расчёта.Этомоксир может иметь другие действия, особенно при высоких концентрациях.В регуляции окисления жирных кислот различают четыре величины, и каждую измеряют своим методом. Активность CPT1 — скорость реакции, которую катализирует фермент в заданных условиях. Концентрация малонил-CoA — количество метаболита в единице объёма; её определяют масс-спектрометрией. Синтез новых жирных кислот — скорость их образования de novo. Окисление субстрата — поток: количество жирной кислоты, которое за единицу времени проходит путь до конечных продуктов.Поток оценивают с помощью изотопного индикатора — субстрата, в котором часть атомов заменена стабильным или радиоактивным изотопом. Например, к клеткам добавляют пальмитат, меченный ¹³C, и прослеживают метку в ацетил-CoA, в метаболитах цикла трикарбоновых кислот или в выделенном CO₂. Метка в промежуточном метаболите или пуле ещё не равна скорости полного окисления: метка разбавляется немеченым веществом клетки, а её распределение зависит от других путей. Поток рассчитывают по выбранной модели с указанными допущениями.Ингибиторы требуют особой осторожности. Этомоксир необратимо ингибирует CPT1, и для подавления её активности достаточно низких микромолярных концентраций. Divakaruni и соавт. (2018) показали на макрофагах мыши, что в концентрациях, намного превышающих необходимые для ингибирования CPT1, этомоксир нарушал поляризацию макрофагов под действием интерлейкина-4 даже в клетках без Cpt1a или Cpt2. При избытке препарата подавлялся переносчик адениновых нуклеотидов митохондрий и истощался свободный CoA клетки. Это пример того, как ограничен вывод, основанный на действии ингибитора, в определённых клетках; универсальной «селективной дозы» для всех клеток из этой работы не следует.Поэтому снижение дыхания после этомоксира не равно потоку β-окисления. Расход кислорода зависит и от других субстратов — глюкозы, глутамина — и от сопряжения дыхания с синтезом ATP. Для вывода о роли CPT1 сравнивают клетки дикого типа, клетки с генетической утратой CPT1 или CPT2 и клетки с восстановленным ферментом, проверяют дозу препарата и измеряют превращение меченого субстрата.Типичная ошибка Любое снижение дыхания после этомоксира количественно равно потоку β-окисления.Препарат и дыхательный показатель имеют дополнительные зависимости; нужен контроль субстрата, дозы и генетической мишени.После высокой концентрации этомоксира снизилось дыхание. Что требуется для вывода о роли CPT1?А. Только повторное измерение общего ATP в той же группе клеток. (неверный вариант)Общий ATP полезен для описания состояния, но не проверяет специфичность этого воздействия.Б. Только совпадение падения дыхания с изменением p-ACC, принятое за доказательство селективности препарата. (неверный вариант)Совместное изменение показателей не устанавливает, что препарат действует исключительно на CPT1.В. Проверка дозы, других действий препарата и независимый контроль CPT1. (верный вариант)Специфичность и причинную зависимость нельзя установить одним изменением дыхания.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаDivakaruni A. S. et al. Etomoxir inhibits macrophage polarization by disrupting CoA homeostasis. Cell Metab. 2018;28:490–503.e7. doi:10.1016/j.cmet.2018.06.001Smith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Houten S. M. et al. The Biochemistry and Physiology of Mitochondrial Fatty Acid β-Oxidation and Its Genetic Disorders. Annu Rev Physiol. 2016;78:23–44. doi:10.1146/annurev-physiol-021115-105045Результат Divakaruni относится к исследованным макрофагам и режимам воздействия. Никакой универсальный порог селективности препарата не задаётся.
ACC, малонил-CoA и CPT1 · шаг 22 из 32Почему ослабление ингибирования CPT1 ещё не гарантирует усиления окисленияПосле переноса ацильной группы должны работать ферменты β-окисления и пути реокисления восстановленных коферментов. Изменение одного регуляторного звена создаёт возможность ответа, но не гарантирует его при любом состоянии системы.Что показывает схема. Последовательность: поступление субстрата → CPT1, CACT, CPT2 → цикл β-окисления (ацетил-CoA, NADH, восстановленный FAD ацил-CoA-дегидрогеназы) → реокисление: NADH → комплекс I, FAD → ETF → ETFDH → убихинон → комплекс III. Ограничение любого звена ограничивает поток; ослабление ингибирования CPT1 не ускоряет путь, если ограничено последующее звено.CPT1 регулирует один из входных этапов для длинноцепочечного субстрата.β-окисление образует ацетил-CoA и восстановительные эквиваленты.Доступность субстрата и последующих реакций ограничивает итоговый поток.β-Окисление — повторяющийся цикл из четырёх реакций в матриксе. Ацил-CoA-дегидрогеназа окисляет ацильную цепь с образованием двойной связи и восстанавливает FAD до FADH₂. Еноил-CoA-гидратаза присоединяет воду. 3-Гидроксиацил-CoA-дегидрогеназа окисляет гидроксильную группу и восстанавливает NAD⁺ до NADH. Тиолаза при участии свободного CoA отщепляет ацетил-CoA, и цепь укорачивается на два атома углерода. CPT1 в этих реакциях не участвует: она регулирует вход длинноцепочечной ацильной группы в митохондрию.Куда идут электроны, отнятые на этих двух стадиях? FADH₂ не покидает фермент как свободный переносчик: FAD, прочно связанный с ацил-CoA-дегидрогеназой, восстанавливается при первой реакции цикла и передаёт электроны белку ETF (electron-transfer flavoprotein). От ETF электроны переходят к ETF:убихинон-оксидоредуктазе (ETFDH, ETF-QO) во внутренней мембране митохондрий, затем к убихинону (коферменту Q) и через него к комплексу III дыхательной цепи. NADH, образовавшийся при окислении 3-гидроксиацил-CoA, отдаёт электроны преимущественно комплексу I. Следовательно, у цикла два разных входа в дыхательную цепь (Wanders и соавт., 2020; Missaglia и соавт., 2021).Поэтому поток β-окисления ограничивают несколько звеньев. Нужен субстрат: жирные кислоты должны поступить в клетку и активироваться. Нужен перенос через карнитиновый челнок. Нужны ферменты цикла для цепей разной длины, а для продолжения цикла нужны окисленные коферменты: NADH и FAD ацил-CoA-дегидрогеназы должны реокисляться в дыхательной цепи по двум описанным путям. Если реокисление ограничено, ослабление ингибирования CPT1 не ускорит путь: следующие реакции остаются ограничивающими.Скорость реакций регулируется на разных масштабах времени. Фосфорилирование ACC меняет активность фермента за минуты. Экспрессия генов меняется медленнее. В печени после приёма пищи инсулиновый сигнал через AKT повышает активность транскрипционного фактора SREBP1c, который активирует гены синтеза жирных кислот (Yecies и соавт., 2011). При голодании организма ядерный рецептор PPARα активирует гены окисления жирных кислот. Подачу субстрата в организме тоже регулируют гормоны. Катехоламины, в том числе норадреналин, усиливают в жировой ткани липолиз — гидролиз триацилглицеролов — через β-адренорецепторы адипоцитов (α2-адренорецепторы, напротив, его тормозят); инсулин липолиз подавляет, и при голодании снижение инсулина ослабляет это торможение (Frikke-Schmidt и соавт., 2016). Прямое действие глюкагона на липолиз зависит от условий и концентрации: у здоровых мужчин повышение глюкагона в крови в пределах физиологических концентраций, при базальном уровне инсулина, не усиливало липолиз в подкожной жировой ткани живота (Gravholt и соавт., 2001), поэтому здесь оно не принимается за общий механизм. Жировая ткань выделяет в кровь глицерол и свободные жирные кислоты; другие ткани окисляют эти жирные кислоты в β-окислении, а глицерол печень и почки используют для глюконеогенеза (Smith и соавт., 2026). Гормональное состояние организма — не то же самое, что состав среды культивируемых клеток: в культуре условия задают составом среды, а в организме — приёмом пищи, голоданием и гормонами.Наследственные дефекты затрагивают разные звенья пути: CPT1, CPT2 или MCAD — среднецепочечную ацил-CoA-дегидрогеназу, первый фермент цикла для цепей средней длины. Общая черта таких состояний — нарушение обеспечения тканей энергией при голодании, когда запас глюкозы ограничен (Houten и соавт., 2016); конкретные проявления и подходы к лечению различаются и в семинаре не рассматриваются. Согласованная регуляция синтеза и окисления (малонил-CoA одновременно субстрат синтеза и ингибитор CPT1) ограничивает одновременное протекание противоположных путей и связанные с этим затраты. Это функциональная интерпретация, а не установленная история отбора, и она не означает полного запрета одновременного синтеза и окисления во всех компартментах.Типичная ошибка Если ингибирование CPT1 снято, β-окисление обязательно идёт с максимальной скоростью независимо от состояния дыхательной цепи.Транспорт — только часть пути; последующие реакции должны обеспечивать переработку субстрата и реокисление коферментов.Ингибирование CPT1 ослаблено, но реокисление NADH в рассматриваемой системе сильно ограничено. Что можно заключить о потоке β-окисления?А. Его рост не гарантирован: ограничение последующих реакций сохраняется. (верный вариант)Ослабление входного ограничения не устраняет ограничение дальнейших реакций.Б. Он обязательно становится максимальным, поскольку CPT1 доступна. (неверный вариант)Максимум не следует из изменения одного этапа при нарушенных остальных условиях.В. Он определяется только содержанием малонил-CoA и не связан с коферментами. (неверный вариант)Малонил-CoA регулирует CPT1, но весь путь зависит и от других молекулярных процессов.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Houten S. M. et al. The Biochemistry and Physiology of Mitochondrial Fatty Acid β-Oxidation and Its Genetic Disorders. Annu Rev Physiol. 2016;78:23–44. doi:10.1146/annurev-physiol-021115-105045Yecies J. L. et al. Akt stimulates hepatic SREBP1c and lipogenesis through parallel mTORC1-dependent and independent pathways. Cell Metab. 2011;14:21–32. doi:10.1016/j.cmet.2011.06.002Frikke-Schmidt H. et al. Does bariatric surgery improve adipose tissue function? Obes Rev. 2016;17:795–809. doi:10.1111/obr.12429Gravholt C. H. et al. Physiological levels of glucagon do not influence lipolysis in abdominal adipose tissue as assessed by microdialysis. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:2085–2089. doi:10.1210/jcem.86.5.7460Wanders R. J. A., Visser G., Ferdinandusse S., Vaz F. M., Houtkooper R. H. Mitochondrial fatty acid oxidation disorders: laboratory diagnosis, pathogenesis, and the complicated route to treatment. J Lipid Atheroscler. 2020;9:313–333. doi:10.12997/jla.2020.9.3.313Missaglia S., Tavian D., Angelini C. ETF dehydrogenase advances in molecular genetics and impact on treatment. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2021;56:360–372. doi:10.1080/10409238.2021.1908952Прогноз качественный и относится к заданному ограничению реокисления. Не задаётся универсальный поток для печени, мышцы и других тканей. Путь электронов ETF–ETFDH–убихинон показан как общая схема митохондриального переноса; вклад входов зависит от ткани.
Аутофагия и лизосомы · шаг 23 из 32Как регулируется начало канонической макроаутофагииКаноническая макроаутофагия доставляет цитоплазматический материал в лизосомы через образование аутофагосомы. Её начало и завершённое расщепление содержимого — разные стадии.Что показывает схема. Основная ветвь: аминокислоты → mTORC1 ⊣ комплекс ULK1 (ULK1, ATG13, FIP200, ATG101) → начало образования фагофора. Без аминокислот торможение ULK1 ослабевает и образование фагофоров усиливается. Сравнительная таблица: при удалении глюкозы AMPK стимулировала аутофагию (Kim 2011), фосфорилирование ULK1 AMPK было необходимо для митофагии (Egan 2011); при дефиците глюкозы и нарушении функции митохондрий сдерживала её начало (Park 2023); при длительном лишении аминокислот подавляла аутофагию (Kazyken 2024).Комплекс ULK1 с ATG13, FIP200 и ATG101 участвует в запуске формирования фагофора.В основной аминокислотной ветви снижение действия mTORC1 ослабляет ингибирующую регуляцию этого аппарата.Влияние AMPK зависит от вида, силы и длительности воздействия.Аутофагией называют доставку собственного материала клетки в лизосомы для расщепления. Путей доставки несколько. При макроаутофагии участок цитоплазмы окружается новой двухмембранной структурой — аутофагосомой, которая затем сливается с лизосомой. При микроаутофагии материал захватывается впячиванием мембраны самой лизосомы, а при шаперон-опосредованной аутофагии отдельные белки переносятся через лизосомную мембрану. Далее речь идёт о канонической макроаутофагии клеток млекопитающих.Образование аутофагосомы начинается с фагофора — плоской мембранной цистерны, которая растёт и охватывает участок цитоплазмы. В запуске участвует комплекс ULK1 (или родственной ULK2) с белками ATG13, FIP200 и ATG101. У млекопитающих этот комплекс собран постоянно, а его киназная активность регулируется фосфорилированием. Начало образования фагофора и замыкание его краёв в аутофагосому — разные этапы; второй этап зависит от других белков и рассматривается в следующих шагах.В основной аминокислотной ветви активный mTORC1 фосфорилирует ULK1 (S758 у человека, S757 у мыши) и ATG13 и тем самым тормозит запуск. При удалении аминокислот активность mTORC1 снижается, это торможение ослабевает, и образование фагофоров усиливается при сохранённом энергетическом состоянии клетки. Ослабление торможения относится к начальной стадии: аутофагический поток — количество материала, которое за единицу времени проходит весь путь до расщепления в лизосомах, — зависит и от следующих этапов.Как ULK1 передаёт сигнал комплексу VPS34? Комплекс ULK1 образуют киназа ULK1 и белки ATG13, FIP200 (RB1CC1) и ATG101. Белок ATG13 способствует взаимодействию этого аппарата с ATG14-содержащим комплексом VPS34 (PIK3C3), а киназа ULK1 фосфорилирует его компоненты: Beclin 1 (BECN1; S15 у человека, S14 у мыши) и ATG14 (S29). Эти фосфорилирования способствуют активации липидкиназы VPS34, которая образует PI3P на мембране будущего фагофора (Russell и соавт., 2013; Park и соавт., 2016). Цепь выглядит так: ослабление торможения ULK1 → фосфорилирование компонентов комплекса VPS34 → PI3P → привлечение WIPI2 → последующие события ATG-пути (следующий шаг). ULK1 не создаёт фагофор в одиночку, а перечисленные участки не обязательно необходимы всегда и в каждой клетке: их вклад показан в определённых клетках и условиях.Роль AMPK описана противоречиво, и различие связано с условиями экспериментов. В классических работах AMPK фосфорилировала ULK1 по участкам, отличным от участка mTORC1: при удалении глюкозы это стимулировало аутофагию (Kim и соавт., 2011), а у Egan и соавт. (2011) такое фосфорилирование оказалось необходимо для митофагии и выживания клеток при голодании. По более новым данным, при дефиците глюкозы и нарушении функции митохондрий AMPK сдерживает начало аутофагии (Park и соавт., 2023), а при длительном лишении аминокислот подавляет аутофагию и поддерживает повторную активацию mTORC1 (Kazyken и соавт., 2024). Эти результаты получены при разных видах стресса и не складываются в одно правило: ни «AMPK всегда усиливает аутофагию», ни «AMPK всегда её тормозит». Для каждого вывода нужно назвать условия и измеренный этап.Типичная ошибка Любая активация AMPK неизбежно усиливает аутофагический поток.В исследованных условиях дефицита глюкозы и длительного дефицита аминокислот описаны и другие ответы; необходимо назвать условия и измеренный этап.В основной модели аминокислотного дефицита при сохранённом энергетическом состоянии снизилось действие mTORC1 на аппарат ULK1. Какой ближайший результат допускает это изменение?А. Обязательное исчезновение всех лизосом независимо от последующих процессов. (неверный вариант)Количество лизосом определяется другими процессами и не обнуляется из-за такого изменения регуляции.Б. Ослабление ингибирующей регуляции начала канонической макроаутофагии. (верный вариант)Изменение регуляции ULK1 относится к начальной стадии; итоговый поток зависит от дальнейших этапов.В. Немедленное завершение гидролиза всего содержимого существующих аутофагосом. (неверный вариант)Начало образования структур и завершённый гидролиз не являются одним событием.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаNoda N. N. Structural view on autophagosome formation. FEBS Lett. 2024;598:84–106. doi:10.1002/1873-3468.14742Kim J., Kundu M., Viollet B., Guan K.-L. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1. Nat Cell Biol. 2011;13:132–141. doi:10.1038/ncb2152Egan D. F. et al. Phosphorylation of ULK1 (hATG1) by AMP-activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy. Science. 2011;331:456–461. doi:10.1126/science.1196371Park J. M., Lee D. H., Kim D. H. Redefining the role of AMPK in autophagy and the energy stress response. Nat Commun. 2023;14:2994. doi:10.1038/s41467-023-38401-zKazyken D. et al. Unexpected roles for AMPK in the suppression of autophagy and the reactivation of MTORC1 signaling during prolonged amino acid deprivation. Autophagy. 2024;20:2017–2040. doi:10.1080/15548627.2024.2355074Smith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Russell R. C., Tian Y., Yuan H. et al. ULK1 induces autophagy by phosphorylating Beclin-1 and activating VPS34 lipid kinase. Nat Cell Biol. 2013;15:741–750. doi:10.1038/ncb2757Park J.-M., Jung C. H., Seo M. et al. The ULK1 complex mediates MTORC1 signaling to the autophagy initiation machinery via binding and phosphorylating ATG14. Autophagy. 2016;12:547–564. doi:10.1080/15548627.2016.1140293Главная схема — каноническая макроаутофагия в клетке млекопитающего. Различные стрессовые работы представлены раздельно; для воспроизведения конкретного эксперимента нужны его полные условия. Участки S15/S14 в Beclin 1 и S29 в ATG14 показаны в определённых клетках и условиях.
Аутофагия и лизосомы · шаг 24 из 32Как собирается и расширяется мембрана фагофораФагофор — растущая мембранная структура, которая охватывает цитоплазматический материал. Её формирование требует регуляторных белков и доставки липидов.Что показывает схема. Этап 1: комплекс VPS34–VPS15–Beclin1–ATG14 (PI3K класса III) образует PI3P в мембране фагофора. Этап 2: WIPI2 связывается с PI3P и привлекает комплекс ATG12–ATG5–ATG16L1. Этап 3: ATG2 переносит фосфолипиды из ЭПР к фагофору, ATG9 перераспределяет их между слоями мембраны. При сниженной активности VPS34 меньше PI3P и меньше связанных с мембраной WIPI2 и ATG16L1.Комплекс VPS34–VPS15–Beclin1–ATG14 образует PI3P в мембране.PI3P связывают эффекторные белки, включая WIPI2.Перенос липидов ATG2 и их перераспределение ATG9 участвуют в расширении мембраны.В аутофагии работает фосфатидилинозитол-3-киназа другого класса, чем в инсулиновом сигнале. PI3K класса I фосфорилирует PIP₂ в плазматической мембране и образует PIP₃. VPS34 — PI3K класса III. В составе комплекса с белками VPS15, Beclin1 и ATG14 она фосфорилирует фосфатидилинозитол в 3-м положении инозитольного кольца и образует фосфатидилинозитол-3-фосфат (PI3P) в мембране, из которой растёт фагофор. PI3P — фосфолипид мембраны, а не нуклеотид. ATG14 направляет комплекс к месту образования фагофора, а комплекс ULK1 стимулирует его активность, фосфорилируя Beclin 1 и ATG14 (предыдущий шаг).С PI3P связываются белки, у которых есть PI3P-связывающие участки. Среди них WIPI2. Связавшись с PI3P на мембране фагофора, WIPI2 привлекает комплекс ATG16L1 — комплекс ATG12–ATG5 с белком ATG16L1 (Dooley и соавт., 2014). Этот комплекс определяет, на какой мембране будет присоединяться к липиду белок LC3 (следующий шаг). Если VPS34 образует меньше PI3P, на мембране связывается меньше WIPI2 и ATG16L1.Чтобы фагофор вырос, к нему должны поступить липиды. Белок ATG2 образует мостик между мембраной эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и краем фагофора и переносит фосфолипиды из одной мембраны в другую (Osawa и соавт., 2019; Valverde и соавт., 2019). ATG2 переносит липиды, а не служит каналом для груза: груз захватывается растущей мембраной и попадает в лизосому позже, после слияния. Поступающие липиды встраиваются в один слой бислоя. ATG9 — скрамблаза: она перераспределяет фосфолипиды между двумя слоями мембраны, позволяя расти обоим (Matoba и соавт., 2020). ATG9 не синтезирует липиды.Контакт ЭПР с фагофором — это участок сближения мембран с переносом липидов, а не слияние мембран ЭПР и фагофора. Рисунок показывает выбранные звенья и не утверждает, что вся мембрана фагофора происходит из одного источника: в её образовании участвуют и пузырьки с ATG9, и другие мембраны. Замыкание фагофора в аутофагосому разобрано ниже, а слияние аутофагосомы с лизосомой — в шаге 26.Как открытый фагофор становится замкнутой аутофагосомой? Рост фагофора и герметичное замыкание его краёв — разные события. У открытого фагофора уже есть будущие внутренняя и наружная мембраны, непрерывно переходящие одна в другую по его краю. При замыкании края сближаются, и в области отверстия происходит мембранное разделение (scission): груз оказывается полностью изолирован внутри замкнутой двухмембранной аутофагосомы. Здесь речь идёт о мембранах, а не о листках одного бислоя: каждая из двух мембран остаётся целым липидным бислоем со своими двумя листками. В исследованных системах в этом участвуют ESCRT-III, его компонент CHMP2A и АТФаза VPS4: в клетках HeLa CHMP2A перемещается к фагофору, а подавление VPS4 нарушает завершение аутофагосом (Takahashi и соавт., 2018). Это не означает, что ESCRT-III — единственный и универсальный для всех эукариот способ замыкания. Последовательность такова: рост фагофора → сближение краёв → замыкание (мембранное разделение у края; ESCRT-III, VPS4) → закрытая двухмембранная аутофагосома с изолированным грузом → слияние с лизосомой. Замыкание нужно отличать от слияния: слияние наружной мембраны уже закрытой аутофагосомы с мембраной лизосомы происходит позже и обеспечивается SNARE-белками, комплексом HOPS и RAB7 (шаг 26).Типичная ошибка ATG2 — мембранный канал, через который груз входит в лизосому.ATG2 участвует в переносе липидов между мембранами при формировании фагофора; транспорт груза к лизосоме происходит иначе.В основной схеме снизилось образование PI3P комплексом VPS34. Какой процесс непосредственно становится менее обеспеченным?А. Связывание PIP₃-зависимых белков с плазматической мембраной через PI3K класса I. (неверный вариант)PI3P и PIP₃ — разные липиды, а VPS34 и PI3K класса I выполняют разные реакции.Б. Прямое липидирование LC3 ферментом VPS34 без системы ATG7–ATG3. (неверный вариант)VPS34 образует PI3P; липидирование LC3 выполняется другой системой, а не прямой реакцией этой киназы.В. Связывание PI3P-зависимых эффекторов с мембраной фагофора. (верный вариант)WIPI2 и другие эффекторные звенья связаны с локальным PI3P в рассматриваемом процессе.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаNoda N. N. Structural view on autophagosome formation. FEBS Lett. 2024;598:84–106. doi:10.1002/1873-3468.14742Nakatogawa H. Mechanisms governing autophagosome biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:439–458. doi:10.1038/s41580-020-0241-0Dooley H. C. et al. WIPI2 links LC3 conjugation with PI3P, autophagosome formation, and pathogen clearance by recruiting Atg12–5-16L1. Mol Cell. 2014;55:238–252. doi:10.1016/j.molcel.2014.05.021Osawa T. et al. Atg2 mediates direct lipid transfer between membranes for autophagosome formation. Nat Struct Mol Biol. 2019;26:281–288. doi:10.1038/s41594-019-0203-4Valverde D. P. et al. ATG2 transports lipids to promote autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 2019;218:1787–1798. doi:10.1083/jcb.201811139Matoba K. et al. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nat Struct Mol Biol. 2020;27:1185–1193. doi:10.1038/s41594-020-00518-wTakahashi Y., He H., Tang Z. et al. An autophagy assay reveals the ESCRT-III component CHMP2A as a regulator of phagophore closure. Nat Commun. 2018;9:2855. doi:10.1038/s41467-018-05254-wRussell R. C., Tian Y., Yuan H. et al. ULK1 induces autophagy by phosphorylating Beclin-1 and activating VPS34 lipid kinase. Nat Cell Biol. 2013;15:741–750. doi:10.1038/ncb2757Park J.-M., Jung C. H., Seo M. et al. The ULK1 complex mediates MTORC1 signaling to the autophagy initiation machinery via binding and phosphorylating ATG14. Autophagy. 2016;12:547–564. doi:10.1080/15548627.2016.1140293Качественная схема канонического аппарата; подробный рисунок каждой белковой структуры требует её структурного источника. Не постулируется один исключительный источник всей мембраны. Роль ESCRT-III в замыкании показана в клетках HeLa и не принимается за единственный механизм.
Аутофагия и лизосомы · шаг 25 из 32Как LC3 связывается с мембраной и что означает LC3-IIВ каноническом аппарате липидированная форма LC3 связана с фосфатидилэтаноламином мембраны. Содержание LC3-II отражает соотношение его образования и удаления.Что показывает схема. ATG4 превращает про-LC3 в LC3-I. ATG7 (E1-подобный) активирует LC3 за счёт ATP, ATG3 (E2-подобный) принимает его, комплекс ATG12–ATG5–ATG16L1 (E3-подобный) ускоряет перенос LC3 на фосфатидилэтаноламин: образуется LC3-II. LC3-II удаляется ATG4 с наружной мембраны или расщепляется в лизосоме с внутренней. Без ATG7 LC3-II не образуется, LC3-I сохраняется.После обработки ATG4 LC3 может включаться в систему липидирования.ATG7, ATG3 и ATG12–ATG5–ATG16L1 обеспечивают присоединение LC3 к липиду.LC3-II может удаляться с мембраны и подвергаться лизосомной деградации в зависимости от его положения.LC3 — белок семейства ATG8, который в каноническом пути присоединяется к мембране фагофора. LC3-I и LC3-II — две формы одного белка, а не номера стадий аутофагии. Сначала синтезированный белок расщепляется протеазой ATG4: она отщепляет C-концевой участок и открывает остаток глицина. Получается растворимая форма LC3-I. Когда этот глицин ковалентно соединяется с фосфолипидом мембраны, образуется LC3-II.Присоединение LC3 к липиду похоже по устройству на присоединение убиквитина к белку. В этой реакции фермент E1 активирует убиквитин, E2 принимает его от E1, а E3 обеспечивает перенос убиквитина на белок-мишень. Но присоединение LC3 к липиду — другая реакция. ATG7 действует как E1-подобный фермент: за счёт ATP активирует LC3 и образует с ним тиоэфирную связь. ATG3 действует как E2-подобный фермент: принимает LC3 от ATG7. Комплекс ATG12–ATG5–ATG16L1, привлечённый к мембране белком WIPI2, действует как E3-подобный: ускоряет перенос LC3 с ATG3 на липид. Липид-акцептор — фосфатидилэтаноламин (PE). Убиквитин присоединяется к белкам, а LC3 — к фосфолипиду; описаны и другие пути липидирования белков ATG8, но в основную схему они не входят.Содержание LC3-II определяется соотношением его образования и удаления. LC3-II на наружной мембране аутофагосомы может снова отщепляться от PE протеазой ATG4. LC3-II на внутренней мембране попадает вместе с грузом в аутолизосому и расщепляется. Поэтому одно содержание LC3-II не показывает, усилилось ли образование аутофагосом или замедлилось их удаление; об этом — шаг об обороте LC3-II и потоке.Без функциональной ATG7 система липидирования LC3 не работает: LC3-I сохраняется, а полоса LC3-II на иммуноблоте не появляется. Но утрата ATG7 не означает, что в клетке перестали работать лизосомы или расщепляться белки, доставленные другими путями. ATG7 нужна для конкретной реакции; другие процессы оценивают своими показателями.Типичная ошибка Высокое содержание LC3-II непосредственно равно высокому аутофагическому потоку.LC3-II может накапливаться и при усиленном образовании, и при замедленном удалении; нужно измерение динамики и условий деградации.В канонической системе отсутствует функциональная ATG7. Какое образование непосредственно нарушается?А. Образование липидированной формы LC3-II через соответствующую систему конъюгации. (верный вариант)ATG7 необходима для рассматриваемой системы липидирования LC3; это не диагноз всех путей деградации.Б. Образование PI3P при действии киназы VPS34. (неверный вариант)VPS34 катализирует другую реакцию; ATG7 не является ферментом образования PI3P.В. Образование LC3-I при протеолитической обработке исходной LC3 белком ATG4. (неверный вариант)Начальная протеолитическая обработка LC3 относится к ATG4; её следует отличать от ATG7-зависимой конъюгации.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаNoda N. N. Structural view on autophagosome formation. FEBS Lett. 2024;598:84–106. doi:10.1002/1873-3468.14742Nakatogawa H. Mechanisms governing autophagosome biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:439–458. doi:10.1038/s41580-020-0241-0Klionsky D. J. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382. doi:10.1080/15548627.2020.1797280Основная модель — LC3/ATG8-зависимая каноническая макроаутофагия с PE. Альтернативные пути не объявляются отсутствующими только по генотипу ATG7.
Аутофагия и лизосомы · шаг 26 из 32Почему слияние, закисление и гидролиз — разные процессыАутофагосома должна доставить материал в лизосомный компартмент. После слияния эффективность гидролиза зависит от условий среды и конкретных ферментов.Что показывает схема. Аутофагосома и лизосома сливаются при участии SNARE-комплекса STX17–SNAP29–VAMP8 и комплекса HOPS; образуется аутолизосома. V-ATPase поддерживает кислый pH, гидролаза расщепляет субстрат. Нарушение слияния, закисления или отсутствие гидролазы меняют каждое своё звено. Бафиломицин A1 ингибирует V-ATPase; его действие на слияние зависит от условий.SNARE-белки и другие регуляторы обеспечивают мембранное слияние.V-ATPase участвует в поддержании кислого pH лизосомного просвета.Кислые гидролазы расщепляют определённые связи в доставленных субстратах.Когда фагофор замкнулся (шаг 24), существует закрытая аутофагосома — пузырёк с двумя мембранами, внутри которого заключён участок цитоплазмы. Чтобы содержимое расщепилось, наружная мембрана аутофагосомы сливается с мембраной лизосомы. Образуется аутолизосома: внутренняя мембрана аутофагосомы вместе с грузом оказывается в просвете лизосомы, где её и груз расщепляют лизосомные ферменты.Слияние обеспечивают белки SNARE, закреплённые на двух мембранах; их спирали скручиваются в комплекс и стягивают мембраны. На замкнутой аутофагосоме находится синтаксин 17 (STX17), который образует комплекс с SNAP29 и лизосомным VAMP8 (Itakura и соавт., 2012). Сближению мембран способствуют малая ГТФаза RAB7 и связывающий комплекс HOPS — комплекс, удерживающий мембраны рядом и способствующий сборке SNARE. STX17 — не единственный возможный путь: в клетках без STX17 слияние может обеспечивать комплекс с белком YKT6 (Matsui и соавт., 2018).Слияние, кислая среда и реакция гидролазы — три разных свойства. Кислый pH лизосомного просвета поддерживает V-ATPase — протонный насос, который за счёт гидролиза ATP переносит протоны в просвет. Кислые гидролазы — протеазы, гликозидазы, липазы и другие ферменты — расщепляют определённые связи в субстратах и лучше работают в кислой среде. Если нет нужной гидролазы, доставленный субстрат не расщепится даже после слияния и при кислом pH. Поэтому нарушение одного свойства нельзя автоматически считать нарушением двух других.Бафиломицин A1 прежде всего ингибирует V-ATPase. В его присутствии кислотность лизосом и уже образовавшихся аутолизосом не поддерживается, и они перестают быть кислыми; активность кислых гидролаз падает. Действие на слияние зависит от условий. В жировом теле дрозофилы при генетической утрате субъединиц V-ATPase лизосомы не закислялись, но с аутофагосомами сливались; бафиломицин в тех же клетках слияние подавлял, и это действие было связано с другой его мишенью — Ca²⁺-насосом эндоплазматического ретикулума SERCA (Mauvezin и соавт., 2015). Поэтому для каждого эксперимента указывают концентрацию, срок и метод, которым проверено слияние.Типичная ошибка Бафиломицин — только селективный ингибитор слияния, который не меняет pH.Его основная мишень V-ATPase связана с кислотностью; действие на слияние и другие процессы требует указания условий.В учебной схеме слияние произошло, но выбранная гидролаза отсутствует. Что из этого следует?А. Установлен первичный дефект образования аутофагосом через ATG7. (неверный вариант)Дефект выбранной гидролазы не устанавливает первичную утрату системы ATG7 и образования аутофагосом.Б. Доставка субстрата не гарантирует его расщепления без нужного фермента. (верный вариант)Мембранная доставка и химическое расщепление — разные необходимые звенья для выбранного субстрата.В. Слияние обеспечивает прежнюю скорость расщепления независимо от состава гидролаз. (неверный вариант)Слияние объединяет компартменты, но не заменяет каталитического действия нужного фермента.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаNoda N. N. Structural view on autophagosome formation. FEBS Lett. 2024;598:84–106. doi:10.1002/1873-3468.14742Klionsky D. J. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382. doi:10.1080/15548627.2020.1797280Itakura E., Kishi-Itakura C., Mizushima N. The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes. Cell. 2012;151:1256–1269. doi:10.1016/j.cell.2012.11.001Matsui T. et al. Autophagosomal YKT6 is required for fusion with lysosomes independently of syntaxin 17. J Cell Biol. 2018;217:2633–2645. doi:10.1083/jcb.201712058Mauvezin C., Nagy P., Juhász G., Neufeld T. P. Autophagosome–lysosome fusion is independent of V-ATPase-mediated acidification. Nat Commun. 2015;6:7007. doi:10.1038/ncomms8007Возможное сохранение слияния при нарушении закисления является условием учебного сравнения, а не обещанием одинакового действия бафиломицина во всех экспериментах.
Аутофагия и лизосомы · шаг 27 из 32Как лизосомное расщепление связано с повторной активацией mTORC1Продукты расщепления могут вновь участвовать в регуляции аминокислотного входа к mTORC1. Повторную активацию, образование новых аутофагосом и восстановление лизосомного пула нужно различать.Что показывает схема. Четыре фазы: (1) после удаления аминокислот активность mTORC1 снижается, образование аутофагосом усиливается; (2) аутофагосомы сливаются с лизосомами, протеазы освобождают аминокислоты; (3) аминокислоты через лизосомные переносчики и Rag частично восстанавливают mTORC1, образование новых аутофагосом снижается, расщепление в уже образовавшихся аутолизосомах продолжается; (4) из аутолизосом через тубулы и протолизосомы восстанавливается пул лизосом. Блок протеаз лишает модель этого входа; блок выхода продуктов разделяет сигнал из просвета и доступность цитозольных аминокислот, и направление ответа mTORC1 без уточнения системы не задано.Лизосомные протеазы освобождают аминокислоты из доставленных белков.Доступные аминокислоты и их транспорт могут поддержать повторную активацию mTORC1 при остальных разрешающих условиях.В описанных системах восстановление действия mTOR связано с образованием тубул и протолизосом из аутолизосом.После удаления аминокислот события идут в определённом порядке. Сначала снижается активность mTORC1 и ослабевает торможение запуска аутофагии. Затем образуются аутофагосомы, они сливаются с лизосомами, и лизосомные протеазы расщепляют доставленные белки до аминокислот. Аминокислоты выходят из просвета в цитозоль через переносчики лизосомной мембраны. Если остальные условия разрешающие — есть RHEB–GTP, энергии достаточно, — часть активности mTORC1 восстанавливается.Связь продуктов расщепления с mTORC1 идёт через тот же аминокислотный вход. Аргинин в просвете лизосомы связывается с SLC38A9, а SLC38A9 переносит лейцин и другие незаменимые аминокислоты в цитозоль; цитозольные аминокислоты действуют через сенсоры на Rag. По данным Wyant и соавт. (2017), без SLC38A9 клетки хуже используют аминокислоты, освобождённые в лизосомах при расщеплении белка. Аминокислоты не заменяют RHEB, энергию и другие условия: они восстанавливают только свой вход.Восстановленный mTORC1 ограничивает образование новых аутофагосом и участвует в восстановлении пула лизосом. Восстановление лизосомного пула из аутолизосом (autophagic lysosome reformation) описали Yu и соавт. (2010) на клетках NRK (эпителиальная линия почки крысы) в среде без сыворотки и глутамина: из аутолизосом вытягиваются мембранные тубулы, от них отделяются протолизосомы, которые созревают в функциональные лизосомы. Этот процесс отличается от биогенеза лизосом через TFEB: в первом случае лизосомы формируются из уже существующих мембран аутолизосом, во втором — меняется экспрессия генов и синтезируются новые лизосомные белки.Какие физические стадии лежат в основе восстановления лизосом? Это не обычное слияние аутофагосом с лизосомами, а образование новых лизосом из мембран уже существующих аутолизосом. По данным обзора Nanayakkara и соавт. (2023), в изученных системах стадий три. Первая — выпячивание: на мембране аутолизосомы локально образуется PI(4,5)P₂, который привлекает адаптерный комплекс AP-2 и клатрин, и мембрана выпячивается в виде почки. Вторая — вытягивание трубочки: двигательный белок KIF5B, привлекаемый тем же PI(4,5)P₂, тянет мембрану вдоль микротрубочек (Du и соавт., 2016), а белок WHAMM запускает на поверхности аутолизосомы локальную полимеризацию актина (Dai и соавт., 2019). Третья — отделение: от конца трубочки отделяется протолизосома; в этом участвуют механизмы мембранного деления, включая динамин 2 (DNM2) (Schulze, McNiven, 2014), и образование PI3P комплексом VPS34–UVRAG (Munson, Ganley, 2015). Затем протолизосомы созревают в функциональные лизосомы. Повторная активация mTORC1 связана с регуляцией этого процесса, но сама мембрану не вытягивает: она влияет на перечисленные белки и липиды. Эффект фосфорилирования UVRAG и последующего образования PI3P на поздних этапах аутофагии зависит от субкомплекса, участка и условий, поэтому единой схемы для всех клеток нет.Сроки и роль отдельных аминокислот зависят от системы. В экспериментах Yu и соавт. (2010) активность mTOR снижалась в первые часы и восстанавливалась к 6 ч, а восстановление лизосом продолжалось дольше. Tan и соавт. (2017) изучали лишение аминокислот и показали, что повторная активация mTORC1 зависит от метаболизма глутамина. Kazyken и соавт. (2024) показали участие AMPK при длительном лишении аминокислот. Это три разных эксперимента, и их нельзя объединить в одну кривую; график практикума — результат его собственной учебной модели. Повторная активация не прекращает мгновенно расщепление в уже образовавшихся аутолизосомах.Типичная ошибка Повторная активация mTORC1 означает мгновенное прекращение гидролиза в уже возникших аутолизосомах.Она может ограничивать образование новых структур и участвовать в восстановлении лизосом; уже доставленный материал не обязан мгновенно перестать расщепляться.В модели повторная активация mTORC1 зависит от аминокислот, освобождённых лизосомными протеазами; внешнее поступление исключено. Протеазы блокированы. Что ожидается для этого входа?А. Освобождение аминокислот усиливается и автоматически заменяет все другие входы. (неверный вариант)Ингибирование протеаз не усиливает их каталитическое образование аминокислот.Б. Нерасщеплённый белковый груз непосредственно заменяет свободные аминокислоты. (неверный вариант)Сенсорная доступность свободных аминокислот не эквивалентна присутствию нерасщеплённого белка.В. Освобождение аминокислот снижается и повторная активация через этот вход ограничивается. (верный вариант)Блок гидролиза ограничивает источник продуктов в специально заданной модели.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаYu L. et al. Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR. Nature. 2010;465:942–946. doi:10.1038/nature09076Tan H. W. S., Sim A. Y. L., Long Y. C. Glutamine metabolism regulates autophagy-dependent mTORC1 reactivation during amino acid starvation. Nat Commun. 2017;8:338. doi:10.1038/s41467-017-00369-yKazyken D. et al. Unexpected roles for AMPK in the suppression of autophagy and the reactivation of MTORC1 signaling during prolonged amino acid deprivation. Autophagy. 2024;20:2017–2040. doi:10.1080/15548627.2024.2355074Wyant G. A. et al. mTORC1 activator SLC38A9 is required to efflux essential amino acids from lysosomes and use protein as a nutrient. Cell. 2017;171:642–654.e12. doi:10.1016/j.cell.2017.09.046Smith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Nanayakkara R., Gurung R., Rodgers S. J. et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 2023;19:1378–1395. doi:10.1080/15548627.2022.2128019Du W., Su Q. P., Chen Y. et al. Kinesin 1 drives autolysosome tubulation. Dev Cell. 2016;37:326–336. doi:10.1016/j.devcel.2016.04.014Dai A., Yu L., Wang H.-W. WHAMM initiates autolysosome tubulation by promoting actin polymerization on autolysosomes. Nat Commun. 2019;10:3699. doi:10.1038/s41467-019-11694-9Schulze R. J., McNiven M. A. A well-oiled machine: DNM2/dynamin 2 helps keep hepatocyte lipophagy running smoothly. Autophagy. 2014;10:388–389. doi:10.4161/auto.27486Munson M. J., Ganley I. G. MTOR, PIK3C3, and autophagy: Signaling the beginning from the end. Autophagy. 2015;11:2375–2376. doi:10.1080/15548627.2015.1106668Задан зависимый от протеолиза вход без альтернативного поступления. Это условная модель, не доказательство одинакового срока и полноты повторной активации во всех системах. Детали ALR (PI(4,5)P₂, AP-2 и клатрин, KIF5B, WHAMM, DNM2) получены главным образом на культивируемых клетках крысы и человека и не равны универсальной схеме.
Аутофагия и лизосомы · шаг 28 из 32Как измеряют поток и оборот LC3-IIОдно содержание LC3-II не показывает, сколько материала прошло весь путь до расщепления. Сравнение с ингибитором проводится за одинаковый срок и требует учёта его дополнительных действий.Что показывает схема. Две культуры из одного исходного состояния собирают в один момент. Без ингибитора запас LC3-II постоянен (образование равно удалению); с ингибитором удаления LC3-II накапливается, и разность за срок экспозиции отражает оборот. Если ингибитор меняет и образование, разность включает оба эффекта. Если удаление LC3-II в обеих культурах уже полностью заблокировано, дополнительная разность равна 0, если ингибитор не меняет образование, но содержания LC3-II ненулевые (пример: 10 и 10).Без ингибитора образование и удаление LC3-II происходят одновременно.Во втором образце ингибитор изменяет процессы во время заданной экспозиции.Разность сигналов описывает результат этой экспозиции и не всегда равна единственному физиологическому потоку.Для оценки потока важно различать четыре величины. Запас маркера — содержание LC3-II в образце в данный момент, например в условных единицах интенсивности полосы. Скорость образования — сколько LC3-II появляется за единицу времени. Скорость удаления — сколько его исчезает за то же время, в основном при расщеплении в аутолизосомах. Изменение запаса за интервал — разность запаса в конце и в начале интервала. Если образование и удаление равны, запас не меняется, хотя через систему идёт поток.Поэтому поток оценивают по обороту LC3-II в двух параллельных культурах. Обе культуры берут из одного исходного состояния. В одну добавляют ингибитор лизосомного расщепления, например бафиломицин A1, в другую — нет; обе собирают в один и тот же момент. Если ингибитор полностью блокирует удаление и не меняет образование LC3-II, разность содержаний в конце экспозиции отражает количество маркера, удалённого за этот интервал в контрольной культуре. В него может входить и маркер, присутствовавший до начала эксперимента. Если исходное состояние стационарно, а скорости сохраняются, удаление равно образованию за тот же интервал. Результат каждой культуры нельзя получить, прибавив к исходному сигналу заранее назначенную величину: он зависит от того, что происходило в культуре за время экспозиции.Ингибитор может менять и само образование аутофагосом. Например, если он нарушает расщепление белков в лизосомах, в цитозоль поступает меньше аминокислот, и через mTORC1 меняется запуск аутофагии. Тогда разность между культурами включает и изменение образования, и прекращение удаления, и её называют потоком только с этой оговоркой (контроль срока, концентрации и исходного состояния обязателен).Отдельно стоит случай уже полной блокады. Если удаление LC3-II (его расщепление в аутолизосомах) в обеих культурах уже было полностью заблокировано, второе добавление ингибитора того же пути удаления не создаёт дополнительной разности, если ингибитор не меняет образование: при 10 и 10 условных единицах разность равна 0. Но это не означает, что LC3-II нет: сами содержания остаются ненулевыми. LC3-II не равен количеству расщеплённого белкового груза. Содержание белка p62 (SQSTM1) — рецептора, связывающего груз с LC3 и расщепляющегося вместе с ним, — тоже зависит от образования и удаления этого белка, в том числе от его синтеза, и не является универсальным прямым измерением всего потока.Типичная ошибка Нулевая разность между образцами означает отсутствие LC3-II в обоих.Одинаковое ненулевое содержание маркера даёт нулевую разность; содержание и дополнительный эффект — разные величины.В двух сопоставимых образцах содержание LC3-II равно 10 условным единицам; разность после ингибитора равна нулю. Что установлено?А. Дополнительной разности нет, но ненулевой сигнал маркера сохраняется в обоих образцах. (верный вариант)Разность 10 − 10 равна 0, но это не равенство каждого содержания нулю; причинную интерпретацию нужно обосновать отдельно.Б. LC3-II отсутствует в обоих образцах, поскольку разность сигналов нулевая. (неверный вариант)Здесь смешаны разность двух значений и сами значения.В. Любая аутофагия отсутствует во всех клетках независимо от выбранного метода. (неверный вариант)Один маркер и одно сравнение не исключают всех путей и всех стадий аутофагии.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKlionsky D. J. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382. doi:10.1080/15548627.2020.1797280Smith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Kazyken D. et al. Unexpected roles for AMPK in the suppression of autophagy and the reactivation of MTORC1 signaling during prolonged amino acid deprivation. Autophagy. 2024;20:2017–2040. doi:10.1080/15548627.2024.2355074Числа 10 и 10 — отдельный явно условный арифметический пример; они не взяты из клеточного эксперимента. Нулевой дополнительный эффект не устанавливает автоматически причину отсутствия разности.
Аутофагия и лизосомы · шаг 29 из 32Что показывает цвет тандемного репортёра LC3Тандемный репортёр сочетает зелёный и красный флуорофоры с LC3. Изменение цвета связано с условиями компартмента и не является само по себе измерением всего потока.Что показывает схема. Тандемный репортёр LC3 (GFP и красный флуоресцентный белок). До слияния: оба сигнала, в наложении жёлтый. После слияния с кислой лизосомой: GFP гаснет, красный сохраняется. После слияния при нарушенной кислотности: оба сигнала, жёлтый, как до слияния, поэтому по цвету слияние не установить.До кислого лизосомного этапа могут регистрироваться оба флуорофора.В кислых деградативных условиях зелёный сигнал уменьшается сильнее красного.Нарушение кислотности меняет интерпретацию цвета независимо от простого подсчёта точек.Тандемный репортёр LC3 — LC3, соединённый одновременно с зелёным флуоресцентным белком GFP и красным флуоресцентным белком. Kimura и соавт. (2007) описали вариант mRFP–GFP–LC3; в практикуме семинара используется близкий по смыслу вариант mCherry–GFP–LC3. Это разные конструкции с разными красными белками, и названия не следует смешивать. Репортёр включается в мембраны аутофагосом так же, как собственный LC3.Флуоресценция GFP в кислой среде гасится, а красные белки mRFP и mCherry к кислотности устойчивее. При наложении двух каналов изображения структура, в которой регистрируются оба сигнала, выглядит жёлтой, а структура, в которой остался только красный, — красной. Аутофагосома до слияния с лизосомой имеет нейтральный просвет, поэтому выглядит жёлтой. После слияния с кислой лизосомой зелёный сигнал гаснет и структура становится красной.Цвет зависит от кислотности, а не от самого факта слияния. Если кислотность нарушена, например бафиломицином, уже слившаяся аутолизосома сохраняет зелёный сигнал и выглядит жёлтой, как аутофагосома. Поэтому жёлтый цвет при нарушенном закислении не доказывает, что слияния не было; слияние проверяют другим методом, например по совпадению репортёра с маркером лизосом.Число красных точек не измеряет непосредственно скорость полного расщепления груза. Оно зависит от скорости образования аутофагосом, скорости слияния, времени жизни аутолизосомы и от того, насколько полно гаснет GFP. Для вывода о потоке нужны динамика во времени, условия расщепления и независимый метод, например оборот LC3-II. В режиме «Без цвета» каналы на схеме подписаны словами.Типичная ошибка После бафиломицина все жёлтые точки обязательно являются аутофагосомами, которые ещё не слились с лизосомой.Если кислотность снижена, уже слившаяся структура тоже может сохранять зелёный сигнал; её стадию нельзя установить только по цвету.После нарушения кислотности структура сохраняет зелёный и красный сигналы LC3-репортёра. Что можно заключить о слиянии только по цвету?А. Слияние доказано: любые два сигнала означают завершённую доставку. (неверный вариант)Наличие двух сигналов также возможно до слияния и потому не доказывает завершённую доставку.Б. Одного цвета недостаточно; слияние проверяют независимым методом. (верный вариант)В менее кислой слившейся структуре зелёный сигнал может сохраниться; цвет не различает эти варианты самостоятельно.В. Слияние исключено: оба сигнала возможны только до контакта с лизосомой. (неверный вариант)Это игнорирует изменение среды и возможность сохранения зелёного сигнала после слияния.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаKimura S., Noda T., Yoshimori T. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3. Autophagy. 2007;3:452–460. doi:10.4161/auto.4451Klionsky D. J. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382. doi:10.1080/15548627.2020.1797280Mauvezin C., Nagy P., Juhász G., Neufeld T. P. Autophagosome–lysosome fusion is independent of V-ATPase-mediated acidification. Nat Commun. 2015;6:7007. doi:10.1038/ncomms8007Схема не назначает реальный pH по цвету и не калибрует флуорофоры. mRFP исходной статьи и mCherry варианта практикума названы раздельно.
Аутофагия и лизосомы · шаг 30 из 32Как различить дефект образования, слияния и гидролизаРазные нарушения могут приводить к накоплению материала, но имеют разные молекулярные причины. Недостаточность одной лизосомной гидролазы не равнозначна отсутствию кислой среды или всей аутофагии.Что показывает схема. Путь: образование аутофагосомы (ATG-системы) → слияние с лизосомой → расщепление в лизосоме: белки — протеазами, гликоген — GAA, гликозаминогликаны — своими ферментами. Утрата ATG7 нарушает конъюгацию и эффективное созревание аутофагических структур, нарушение слияния — доставку, недостаточность GAA (болезнь Помпе) — гидролиз гликогена, мукополисахаридозы — расщепление гликозаминогликанов.ATG-зависимые системы участвуют в образовании аутофагической структуры.Системы мембранного слияния обеспечивают доставку материала.Кислая α-глюкозидаза GAA расщепляет гликоген в лизосоме.Накопление материала в клетке может иметь разные молекулярные причины, и каждая затрагивает своё звено. При утрате ATG7 нарушается ATG7-зависимая конъюгация, в том числе липидирование LC3, и эффективность аутофагической переработки резко снижается. Однако отсутствие LC3-II само по себе не доказывает отсутствия всех аутофагосомных структур: их образование, замыкание и слияние с лизосомами проверяют отдельно. В описанных экспериментах в клетках, лишённых систем конъюгации ATG, структуры, похожие на аутофагосомы, всё же образовывались, хотя медленнее, и сливались с лизосомами, но внутренняя мембрана в аутолизосомах расщеплялась со значительной задержкой (Tsuboyama и соавт., 2016). При нарушении слияния аутофагосомы образуются, но не сливаются с лизосомами и накапливаются. При отсутствии определённой лизосомной гидролазы доставка и кислая среда сохраняются, но субстрат этого фермента не расщепляется и накапливается в лизосомах.Болезнь Помпе — наследственное заболевание, вызванное мутациями гена GAA. Он кодирует лизосомную кислую α-глюкозидазу — фермент, который в лизосоме гидролизует гликоген до глюкозы. GAA расщепляет полисахарид, а не белковый груз. При недостаточности GAA гликоген, поступивший в лизосомы, накапливается в них; сильнее всего страдают сердце и скелетные мышцы. Первичный дефект при болезни Помпе — недостаточность гидролазы, а не утрата ATG7 или ULK1.В мышечных волокнах при болезни Помпе находят и нарушения аутофагии: накопление аутофагического материала и изменение сигналов mTORC1 (Lim и соавт., 2014; Settembre, Perera, 2024). Это вторичные изменения: они развиваются в ответ на переполнение лизосом и зависят от ткани и стадии болезни. Результаты, полученные на животных моделях, не переносятся автоматически на людей.Для сравнения, при мукополисахаридозах нарушено лизосомное расщепление гликозаминогликанов — полисахаридных цепей из повторяющихся дисахаридных единиц, входящих в состав внеклеточного матрикса. Каждой форме соответствует недостаточность своего фермента, а накапливается не гликоген, а гликозаминогликаны. Общий смысл аутофагии и лизосомного расщепления — поддержание состава белков и органелл клетки. Избирательное удаление повреждённых митохондрий через белки PINK1 и Parkin (митофагия) относится к материалу другого семинара.Типичная ошибка При болезни Помпе первично отсутствует ATG7 или ULK1.Основной дефект связан с GAA и лизосомным расщеплением гликогена; состояние аутофагического аппарата рассматривают отдельно.В лизосоме сохранены кислая среда и доставка гликогена, но активность GAA резко снижена. Какое ближайшее изменение ожидается?А. Гликоген расщепляется с прежней скоростью только благодаря кислому pH. (неверный вариант)Кислотность создаёт условия реакции, но не катализирует её вместо недостаточно активной гидролазы.Б. Первично нарушается липидирование LC3, поскольку GAA входит в систему ATG7. (неверный вариант)GAA — гидролаза гликогена, а не компонент системы липидирования LC3; вторичные нарушения требуют отдельного исследования.В. Ограничивается гидролиз гликогена, даже при сохранённых указанных условиях. (верный вариант)Подходящая среда и доставка не заменяют каталитического действия нужного фермента.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаLim J.-A., Li L., Raben N. Pompe disease: from pathophysiology to therapy and back again. Front Aging Neurosci. 2014;6:177. doi:10.3389/fnagi.2014.00177Noda N. N. Structural view on autophagosome formation. FEBS Lett. 2024;598:84–106. doi:10.1002/1873-3468.14742Klionsky D. J. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382. doi:10.1080/15548627.2020.1797280Settembre C., Perera R. M. Lysosomes as coordinators of cellular catabolism, metabolic signalling and organ physiology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25:223–245. doi:10.1038/s41580-023-00676-xTsuboyama K. et al. The ATG conjugation systems are important for degradation of the inner autophagosomal membrane. Science. 2016;354:1036–1041. doi:10.1126/science.aaf6136Качественная модель выбранного дефекта GAA; не устанавливает клиническую тяжесть и не предлагает лечение. Первичный дефект и вторичные изменения аутофагии различены.
Исследование · шаг 31 из 32Как выбрать величину, метод и контрольИсследование начинается с конкретного вопроса и измеряемой величины. Одно наблюдение не заменяет одновременно локализацию, ферментативную активность и поток.Что показывает схема. Четыре темы и методы: локализация mTORC1 (микроскопия с LAMP1), аденилаты и AMPK (ВЭЖХ или масс-спектрометрия, иммуноблоттинг p-AMPK и p-ACC), малонил-CoA и окисление (масс-спектрометрия, меченый субстрат), стадии аутофагии (оборот LC3-II, тандемный репортёр, расщепление субстрата). Для каждой указаны контроль и граница вывода.Для локализации выбирают метод распределения сигнала в клетке.Для химической модификации или метаболита выбирают соответствующий молекулярный анализ.Для причинного вывода добавляют сопоставимое вмешательство, контроль и при необходимости восстановление компонента.Исследование начинается с вопроса, сформулированного через измеряемую величину. «Работает ли mTORC1?» — плохой вопрос: неясно, что измерять. «Изменилась ли доля mTOR, совпадающего с LAMP1, через 30 минут после добавления аминокислот?» и «Изменилось ли отношение p-S6K1 к общему S6K1?» — вопросы, на которые можно ответить. Для четырёх тем семинара это выглядит так. Локализацию mTORC1 определяют микроскопией с маркером лизосом. Состояние аденилатов и AMPK — ВЭЖХ или масс-спектрометрией и иммуноблоттингом. Малонил-CoA и окисление субстрата — масс-спектрометрией и меченым субстратом. Стадии аутофагии и лизосомное расщепление — оборотом LC3-II, тандемным репортёром и измерением расщепления определённого субстрата. Двухмембранные аутофагосомы видны на снимках электронной микроскопии; именно так аутофагию открыли в клетках мыши и крысы в конце 1950-х — начале 1960-х годов (Nakatogawa, 2020). Снимок показывает число и вид структур в момент фиксации, но не поток.Для каждого измерения указывают нормировку, срок и то, чего метод сам по себе не доказывает. Фосфорилированный белок нормируют на общее содержание того же белка, общий белок — на белок контроля нанесения, по которому проверяют одинаковое количество белка в дорожках, метаболит — на количество клеток или белка в пробе. Сравниваемые образцы обрабатывают одинаково и собирают в один момент: аденилаты меняются за секунды, фосфорилирование — за минуты.Повторы бывают двух видов. Биологические повторы — независимые культуры, животные или отдельно полученные биологические пробы; они позволяют проверить, воспроизводится ли результат на независимом материале. Технические повторы — несколько измерений одной и той же пробы; они позволяют оценить повторяемость измерения, но сами по себе не выявляют систематическую ошибку и не проверяют биологическую воспроизводимость. Вывод о воспроизводимости на биологическом материале делают по биологическим повторам.Совместное изменение двух признаков ещё не доказывает причинной связи между ними. Если после активации AMPK одновременно выросли p-ACC и окисление жирных кислот, каждое из этих изменений могло быть вызвано действием AMPK на разные мишени. Чтобы проверить участие ACC в изменении окисления, вмешиваются именно в эту ветвь: например, сравнивают исходные клетки с клетками, где серин в участке ACC, фосфорилируемом AMPK, заменён аланином, при сохранённой регуляции других мишеней AMPK. Утрата AMPK и возвращение её исходного варианта проверяют другой вывод — зависит ли эффект от AMPK вообще. Несколько разных методов полезны, только если они измеряют звенья именно этой причинной цепи и имеют подходящие контроли.Типичная ошибка Несколько разных методов автоматически доказывают любой предложенный механизм.Методы должны измерять звенья именно рассматриваемой причинной связи, иметь подходящие контроли и позволять проверить альтернативные объяснения результата.Нужно проверить, изменилось ли окисление заданной жирной кислоты после активации AMPK. Какой подход наиболее прямо отвечает на этот вопрос?А. Измерение превращения заданного меченого субстрата с подходящим расчётом потока и контролями. (верный вариант)Метод направлен на заданный субстрат и его превращения; модель расчёта и контроли остаются необходимыми.Б. Измерение только p-AMPK без регистрации превращений самой жирной кислоты. (неверный вариант)p-AMPK показывает регуляторный признак, а не окислительный поток конкретного субстрата.В. Измерение только концентрации малонил-CoA без регистрации превращений самой жирной кислоты. (неверный вариант)Концентрация регуляторного метаболита не заменяет измерения скорости окисления субстрата.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаSmith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Divakaruni A. S. et al. Etomoxir inhibits macrophage polarization by disrupting CoA homeostasis. Cell Metab. 2018;28:490–503.e7. doi:10.1016/j.cmet.2018.06.001Klionsky D. J. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382. doi:10.1080/15548627.2020.1797280Goul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Nakatogawa H. Mechanisms governing autophagosome biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:439–458. doi:10.1038/s41580-020-0241-0Методические карточки, а не готовый протокол исследований на пациентах. Без незаданных доз, числа образцов и выдуманных измерений.
Исследование · шаг 32 из 32Как проверить согласование четырёх механизмовВ итоговой учебной модели различаются аминокислотный вход, энергетическое состояние, регуляция ACC–CPT1 и переработка материала в лизосомах. Вывод должен соответствовать именно выбранному вмешательству и сохранённым условиям.Что показывает схема. Четыре слоя: (1) аминокислоты и лизосомный источник → Rag → mTORC1 → S6K1, mTORC1 тормозит запуск аутофагии; (2) аденилаты → AMPK ⊣ mTORC1; (3) AMPK → ACC → малонил-CoA ⊣ CPT1; (4) аутофагия доставляет груз в лизосомы, протеолиз даёт аминокислоты. Случаи: удаление внешних аминокислот снижает p-S6K1, но AMPK автоматически не активирует; блок протеолиза без внешних аминокислот лишает модель источника для Rag-входа; некомпенсированный дополнительный расход ATP при заданном повышении AMP/ATP активирует AMPK и тормозит mTORC1 через RAPTOR, а также снижает активность ACC; при блоке выхода продуктов направление ответа mTORC1 без уточнения системы не задано.Изменение доступности аминокислот влияет на Rag-зависимую ветвь mTORC1.Энергетическое состояние и AMPK могут менять регуляцию mTORC1 и ACC.Лизосомный гидролиз и выход продуктов создают дополнительный источник аминокислот в заданной модели.Итоговая модель объединяет четыре механизма семинара, но каждый вход задаётся отдельно. В исходном состоянии внешние аминокислоты есть, аденилатный пул в энергетически полноценном состоянии, RHEB–GTP поддержан, карнитиновый челнок работает. Затем меняется только одно условие, и прослеживается, какое звено затронуто непосредственно, а какие изменения следуют из этого при заданных условиях.Удаление внешних аминокислот при сохранённых аденилатах ослабляет Rag-вход: mTORC1 перестаёт привлекаться к лизосоме, фосфорилирование S6K1 снижается, торможение запуска аутофагии ослабевает. Состояние AMPK от этого автоматически не меняется: слово «голодание» не задаёт энергетического стресса, и активацию AMPK назначают только при заданном изменении аденилатов, Ca²⁺ или другого её входа. Позже материал, доставленный в лизосомы, расщепляется, и освобождённые аминокислоты могут частично восстановить Rag-вход — если протеолиз и выход продуктов работают.Каждое вмешательство затрагивает своё звено. Блок лизосомных протеаз при отсутствии внешних аминокислот лишает модель единственного источника аминокислот: Rag-вход остаётся слабым, и повторной активации через этот вход нет. Блок выхода продуктов из лизосомы сложнее: аргинин в просвете может по-прежнему связываться с SLC38A9, а аминокислоты в цитозоле остаются недоступны, поэтому без уточнения системы направление ответа mTORC1 не задано. Если повышенный расход ATP не компенсируется образованием ATP, в заданном энергетическом случае растёт отношение AMP к ATP и активируется AMPK. При сохранённом RHEB–GTP в этой модели AMPK тормозит mTORC1 через RAPTOR и снижает активность ACC; ингибирование CPT1 ослабевает, но поток β-окисления этим ещё не доказан. Изменение ACC само по себе меняет регуляцию входа в карнитиновый челнок, но не аминокислотный вход.Для каждого вывода нужно независимое измерение: локализация mTORC1 и p-S6K1, аденилаты и p-AMPK, малонил-CoA и превращение меченого субстрата, оборот LC3-II и расщепление определённого субстрата. Возможные результаты модели — предсказания, а не экспериментальные данные. Если эксперимент даёт неожиданный результат, это повод проверить предпосылку — например, не изменились ли аденилаты при удалении аминокислот, — а не подгонять формулу под результат.Типичная ошибка Все показания можно вывести из одного общего ползунка «голод».Разные воздействия меняют разные входы и стадии; состав среды, энергия и работа лизосом задаются отдельно.В итоговой качественной модели удалили внешние аминокислоты. Их лизосомное освобождение заблокировано, другого источника нет. Аденилаты, Ca²⁺ и другие входы AMPK сохранены; RHEB–GTP поддержан. Какой ответ соответствует этим условиям?А. p-S6K1 сохраняется при исходной AMPK: RHEB–GTP заменяет аминокислотный вход. (неверный вариант)В рассматриваемой Rag-зависимой ветви RHEB–GTP не заменяет необходимый аминокислотный вход.Б. p-S6K1 снижается; обязательная активация AMPK из этих условий не следует. (верный вариант)В модели нарушен Rag-зависимый вход к S6K1; удаления аминокислот недостаточно, чтобы автоматически назначить энергетический или кальциевый вход к AMPK.В. p-S6K1 снижается; AMPK обязательно активируется при любом удалении аминокислот. (неверный вариант)Это смешение аминокислотного воздействия с заданным изменением энергии или Ca²⁺; универсального обязательного ответа здесь нет.Исследование использует материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаGoul C., Peruzzo R., Zoncu R. The molecular basis of nutrient sensing and signalling by mTORC1 in metabolism regulation and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:857–875. doi:10.1038/s41580-023-00641-8Smith T. K. T. et al. AMPK at the interface of nutrient sensing, metabolic flux and energy homeostasis. Nat Metab. 2026;8:27–51. doi:10.1038/s42255-025-01442-3Wyant G. A. et al. mTORC1 activator SLC38A9 is required to efflux essential amino acids from lysosomes and use protein as a nutrient. Cell. 2017;171:642–654.e12. doi:10.1016/j.cell.2017.09.046Yu L. et al. Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR. Nature. 2010;465:942–946. doi:10.1038/nature09076Klionsky D. J. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 2021;17:1–382. doi:10.1080/15548627.2020.1797280Kazyken D. et al. Unexpected roles for AMPK in the suppression of autophagy and the reactivation of MTORC1 signaling during prolonged amino acid deprivation. Autophagy. 2024;20:2017–2040. doi:10.1080/15548627.2024.2355074Итог — качественная модель со специально ограниченными источниками и фиксированными предпосылками. Лизосомное распознавание аргинина и выход продуктов в цитозоль различаются; блок одного транспортёра не объявляет автоматически нулём весь сигнал mTORC1.
