Аэробный гликолиз и распределение углерода · шаг 1 из 32Чем метаболический поток отличается от содержания метаболитаКоличество вещества в клетке показывает, сколько его есть в данный момент, а метаболический поток — сколько вещества превращается за единицу времени. Два пула одинакового размера могут обновляться с разной скоростью.Метаболит образуется в одних реакциях и расходуется в других; изменение его количества равно разности притока и расхода.В стационарном состоянии приток равен расходу, поэтому количество постоянно, хотя вещество непрерывно превращается.Чем больше равные друг другу приток и расход, тем быстрее обновляется пул при том же количестве вещества.Метаболит клетки находится в метаболическом пуле: его молекулы образуются в одних реакциях и расходуются в других. Содержание вещества в пуле выражают как количество вещества или, если известен объём компартмента, как концентрацию. Поток — другая величина. Он показывает, сколько вещества проходит через реакцию или путь за единицу времени, и относится к названной реакции и системе; его нормируют, например, на число клеток или массу белка.Изменение количества одного промежуточного соединения описывает баланс dN/dt = J(вх) − J(вых). Здесь N — количество вещества в пуле, J(вх) — суммарный поток его образования и поступления, J(вых) — суммарный поток его расхода и выхода. Если приток больше расхода, количество растёт, если меньше — снижается.Особый случай — стационарное состояние: приток равен расходу, и количество не меняется. Это не значит, что превращений нет. Возьмём две клетки с одинаковым количеством цитрата, например 12 условных единиц. В первой клетке образование и расход цитрата равны 3 условным единицам в минуту, во второй — 6. Количество цитрата в обеих клетках постоянно, но пул второй обновляется вдвое быстрее: среднее время пребывания молекулы в пуле, то есть частное от деления количества на поток, составляет 4 мин в первой клетке и 2 мин во второй.Поэтому содержание метаболита само по себе не показывает скорость превращения. Оно может не измениться ни при ускорении притока и расхода, ни при их замедлении. В стационарном состоянии количество не меняется, поэтому его изменение о потоке не говорит. Поток оценивают отдельно: по накоплению или убыли вещества после блокирования одной из реакций, по потреблению субстрата в заданной системе или по динамике включения изотопной метки с учётом модели. Доля меченых молекул сама потоком не является (см. шаг про прослеживание происхождения углерода). Если же меняется объём клетки, концентрация может измениться и при неизменном количестве, поэтому каждую величину нужно называть точно.Типичная ошибка Если количество метаболита не изменилось, его потоки тоже не изменились.Постоянное количество совместимо с любыми значениями притока и расхода, если они равны. Поток определяют отдельно: по скорости превращения в названной системе.В двух клетках содержится одинаковое количество цитрата. В первой его образование и расход равны 2, во второй — 8 условным единицам в минуту. Какое различие между клетками следует из этих данных?А. Во второй клетке пул цитрата обновляется быстрее при том же его количестве. (верный вариант)Постоянное количество совместимо с разными скоростями образования и расхода.Б. Во второй клетке концентрация цитрата выше, так как через пул проходит больше вещества. (неверный вариант)Количество цитрата в клетках одинаково; концентрация определяется количеством и объёмом, а не потоком через пул.В. В обеих клетках пул обновляется одинаково, так как количество цитрата то же. (неверный вариант)Количество характеризует состояние, а не скорость превращений: при потоках 2 и 8 пул обновляется с разной скоростью.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Baker S. A., Rutter J. Metabolites as signalling molecules. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:355–374.Схема — расчёт по заданным условным параметрам: единицы потока, количество и время не являются данными эксперимента и не относятся к реальным клеткам. Различие между содержанием метаболита и потоком изложено в учебнике биохимии (Ленинджер, т. 2) и в обзоре Baker и Rutter (2023); у обзора прочитаны выбранные фрагменты о потоках.
Аэробный гликолиз и распределение углерода · шаг 2 из 32Как образование лактата поддерживает гликолизОкислительная реакция гликолиза восстанавливает NAD⁺ до NADH, а реакция лактатдегидрогеназы вновь окисляет NADH, восстанавливая пируват до лактата. Поэтому ЛДГ позволяет гликолизу продолжаться, хотя сама ATP не образует.Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа окисляет глицеральдегид-3-фосфат и восстанавливает NAD⁺ до NADH.Лактатдегидрогеназа восстанавливает пируват до лактата за счёт NADH, и NAD⁺ образуется вновь.Окислительной реакции гликолиза (GAPDH) нужен NAD⁺, а ATP образуется в других реакциях пути.В гликолизе (здесь — путь от глюкозы до лактата; в узком смысле гликолиз заканчивается пируватом) есть окислительная реакция: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) превращает глицеральдегид-3-фосфат в 1,3-бисфосфоглицерат и переносит электроны на NAD⁺. Кофермент восстанавливается до NADH. Если NADH не окисляется вновь, количество свободного NAD⁺ уменьшается, и эта реакция замедляется. Поэтому гликолизу нужна регенерация NAD⁺: образование окисленной формы из восстановленной. Новых молекул NAD при этом не появляется, уже имеющиеся лишь возвращаются в окисленную форму.Один из способов регенерации — реакция лактатдегидрогеназы (ЛДГ): пируват + NADH + H⁺ ⇄ лактат + NAD⁺. Пируват принимает электроны и превращается в лактат, а NADH окисляется. Образовавшийся NAD⁺ снова доступен для GAPDH, и гликолиз продолжается без участия митохондрий. Стрелки на схеме показывают оборот кофермента: NAD⁺ восстанавливается в одной реакции и вновь образуется в другой, а углеродная цепь идёт отдельным путём от глицеральдегид-3-фосфата к пирувату и лактату. Гликолиз до лактата окислительно-восстановительно нейтрален: NADH, образованный в GAPDH, окисляется в реакции ЛДГ, поэтому образование лактата само по себе не создаёт дополнительного NAD⁺ для других окислительных синтезов (шаг про аспартат).Реакции ЛДГ не следует приписывать синтез ATP. ATP образуется в гликолизе при субстратном фосфорилировании: фосфорильная группа переносится с метаболита на ADP, как в реакциях фосфоглицераткиназы и пируваткиназы. В реакции ЛДГ такого переноса нет. Реакция ЛДГ лишь поддерживает содержание NAD⁺, необходимое для окислительной реакции GAPDH. Если NAD⁺ не регенерируется ни в реакции ЛДГ, ни челночными системами, не идут и следующие за GAPDH реакции с образованием ATP.Реакция ЛДГ обратима: фермент ускоряет приближение к химическому равновесию, но не задаёт его положения. Направление чистого потока определяют концентрации пирувата, лактата, NADH и NAD⁺ и значение pH. В клетках, где митохондрии быстро окисляют NADH и пируват, реакция ЛДГ может идти в обратном направлении, и лактат становится источником пирувата. Поэтому образование лактата зависит от баланса этих процессов, а не от свойств одного фермента.Типичная ошибка Лактат образуется потому, что реакция ЛДГ сама даёт ATP.ATP при восстановлении пирувата до лактата не синтезируется. Реакция окисляет NADH до NAD⁺; ATP образуется в других реакциях гликолиза, а NAD⁺ нужен окислительной реакции GAPDH, которая поставляет для них субстрат.Передача электронов NADH в митохондрии ограничена, но ЛДГ активна и пируват доступен. Что обеспечивает реакция ЛДГ для окислительной реакции гликолиза в этих условиях?А. Образует ATP из ADP при восстановлении пирувата до лактата. (неверный вариант)В реакции ЛДГ переноса фосфорильной группы на ADP нет.Б. Образует дополнительный NADH, который нужен для реакции GAPDH. (неверный вариант)При восстановлении пирувата NADH расходуется, а NAD⁺ образуется.В. Окисляет NADH и тем самым возвращает NAD⁺ для реакции GAPDH. (верный вариант)NAD⁺ вновь используется глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Luengo A. et al. Increased demand for NAD⁺ relative to ATP drives aerobic glycolysis. Mol Cell. 2021;81:691–707.e6.Схема показывает механизм без концентраций. Связь регенерации NAD⁺ с продолжением гликолиза рассмотрена в работе Luengo и соавт. (2021) на пролиферирующих клетках; стехиометрия реакций GAPDH и ЛДГ приведена по учебнику Ленинджера (т. 2).
Аэробный гликолиз и распределение углерода · шаг 3 из 32Почему лактат образуется в присутствии кислородаАэробный гликолиз — образование лактата из глюкозы при достаточном содержании кислорода. Он отличается от усиления образования лактата при гипоксии и не исключает работы митохондрий.При достаточном O₂ дыхательная цепь может работать, но часть пирувата всё равно восстанавливается до лактата.При ограничении O₂ дыхание снижается, и образование лактата усиливается по другой причине.Образование лактата и потребление O₂ в одной клетке могут идти одновременно.Лактат обычно связывают с недостатком кислорода. При гипоксии дыхательная цепь окисляет NADH хуже, поэтому гликолиз и образование лактата усиливаются; к этому добавляется HIF-зависимое торможение PDH через киназу PDK1: окисление пирувата в митохондриях снижается, и больше пирувата восстанавливается до лактата (Kim и соавт., 2006). Однако многие делящиеся клетки образуют много лактата и при достаточном содержании кислорода. Такое состояние называют аэробным гликолизом, а когда его описывают для опухолевых клеток, говорят об эффекте Варбурга.Различают три состояния. В первом кислород доступен, лактата образуется немного, и значительная часть пирувата окисляется. Во втором кислород тоже доступен, но лактата образуется много: это аэробный гликолиз. В третьем кислород ограничен, дыхание снижено, и лактата образуется много. Во втором состоянии митохондрии работают. Это показано на культивируемых клетках: при активации конканавалином А тимоциты крысы превращали в лактат непропорционально большую часть дополнительно поглощённой глюкозы, а окисление пирувата при этом тоже возрастало (Hume и соавт., 1978). Поэтому образование лактата не показывает, что дыхание остановлено или цепь повреждена.Причины аэробного гликолиза не сводятся к одному механизму. По одной модели, в части делящихся клеток потребность в NAD⁺ для окислительных реакций превышает потребность в ATP; тогда дыхание ограничено сопряжением с оборотом ATP, а образование лактата поддерживает NAD⁺ (Luengo и соавт., 2021). По другой, в ряде линий клеток панели NCI-60 ёмкость челноков, переносящих восстановительные эквиваленты в митохондрии, оказывается насыщенной (Wang и соавт., 2022). Оба результата получены на конкретных клеточных моделях; ни один из них не объясняет явление во всех клетках и не исключает другой.Аэробный гликолиз не служит специфическим признаком рака, и не всякое образование лактата называют эффектом Варбурга. Эритроциты, в которых нет митохондрий, образуют лактат, поскольку не могут окислять пируват в митохондриях; в скелетных мышцах при интенсивной нагрузке лактат образуется и при достаточном содержании O₂, когда скорость гликолиза превышает скорость окисления пирувата, а локальное ограничение O₂ возможно, но не обязательно (Gladden, 2004). Чтобы говорить об аэробном гликолизе, нужно назвать клетки, указать содержание O₂ и показать образование лактата в этих условиях.Типичная ошибка Лактат образуется только при недостатке O₂.Лактат образуется и при достаточном содержании O₂. В таком состоянии гликолиз и дыхание идут одновременно. Недостаток O₂ — одна из причин усиления образования лактата, но не единственная.Активированные лимфоциты в культуре при достаточном содержании O₂ выделяют больше лактата, чем покоящиеся, и продолжают потреблять O₂. Какое объяснение согласуется с этими данными?А. Лактат образуется потому, что кислород в культуре расходуется быстрее, чем поступает. (неверный вариант)Условие указывает на достаточное содержание O₂; ограничение его поступления не показано.Б. Часть пирувата восстанавливается до лактата, а часть окисляется в митохондриях. (верный вариант)Образование лактата в присутствии O₂ не требует остановки дыхания.В. В активированных клетках дыхательная цепь повреждена, и лактат образуется вместо дыхания. (неверный вариант)Потребление O₂ продолжается, поэтому образование лактата не означает, что цепь повреждена.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаLuengo A. et al. Increased demand for NAD⁺ relative to ATP drives aerobic glycolysis. Mol Cell. 2021;81:691–707.e6.Wang Y. et al. Saturation of the mitochondrial NADH shuttles drives aerobic glycolysis in proliferating cells. Mol Cell. 2022;82:3270–3283.e9.Hume D. A., Radik J. L., Ferber E., Weidemann M. J. Aerobic glycolysis and lymphocyte transformation. Biochem J. 1978;174:703–709.Kim J. W., Tchernyshyov I., Semenza G. L., Dang C. V. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab. 2006;3:177–185.Vander Heiden M. G., Cantley L. C., Thompson C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009;324:1029–1033.Gladden L. B. Lactate metabolism: a new paradigm for the third millennium. J Physiol. 2004;558:5–30.Схема качественная: лактат и дыхание показаны словами, числовых значений нет. Механизмы потребности в NAD⁺ и насыщения челноков получены на пролиферирующих культивируемых клетках (Luengo и соавт., 2021; Wang и соавт., 2022). Пример активированных тимоцитов крысы дан по аннотации Hume и соавт. (1978); данные о потреблении O₂ в ней не приводятся, сохранение дыхания показано по окислению пирувата. Статья Wang и соавт. (1976) о лимфоцитах мыши (DOI 10.1038/261702a0) при подготовке страницы не читалась: аннотации в PubMed нет. Положение о мышцах дано по аннотации обзора Gladden (2004): повышение образования лактата при гипоксии или дисоксии часто оказывается скорее исключением, чем правилом; детали механизма в мышце при нагрузке в аннотации не рассматриваются. Обзор Vander Heiden и соавт. (2009) использован как общая ссылка по теме, прочитана аннотация. Об HIF-зависимом торможении PDH прочитана аннотация Kim и соавт. (2006).
Аэробный гликолиз и распределение углерода · шаг 4 из 32Как углерод глюкозы поступает в биосинтезОт глюкозо-6-фосфата отходят гликолиз и окислительная ветвь пентозофосфатного пути (ПФП), а от 3-фосфоглицерата — синтез серина. Продукты этих ответвлений нужны для биосинтеза, а сами ответвления не исключают образования лактата.Окислительная ветвь ПФП превращает глюкозо-6-фосфат в рибулозо-5-фосфат и образует NADPH и CO₂; из рибулозо-5-фосфата получают рибозо-5-фосфат.Окисление 3-фосфоглицерата — первая реакция синтеза серина; серин служит источником одноуглеродных групп для одноуглеродного обмена.Если приток глюкозо-6-фосфата возрастает и ферменты ответвлений не насыщены, потоки в ответвления и в лактат могут расти одновременно.Глюкоза фосфорилируется до глюкозо-6-фосфата (G6P), от которого начинаются гликолиз и ПФП. Промежуточные соединения этих путей служат биосинтетическими предшественниками: из их атомов образуются другие вещества. Для прослеживания углерода на схеме указано число его атомов в каждом соединении.Первое ответвление — окислительная ветвь ПФП. Три последовательные реакции — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6PD), 6-фосфоглюконолактоназа и 6-фосфоглюконатдегидрогеназа — превращают G6P в рибулозо-5-фосфат и образуют две молекулы NADPH и одну молекулу CO₂ на молекулу G6P (Stincone и соавт., 2015). Из рибулозо-5-фосфата изомераза образует рибозо-5-фосфат для нуклеотидов. Рибозо-5-фосфат можно получить и в неокислительной ветви из фруктозо-6-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата, но NADPH эта ветвь не образует. В гликолизе NADPH не образуется; его образуют также малик-фермент и цитозольная изоцитратдегидрогеназа (IDH1).Второе ответвление начинается от 3-фосфоглицерата. Его окисление до 3-фосфогидроксипирувата, катализируемое фосфоглицератдегидрогеназой (PHGDH), — первая реакция синтеза серина de novo. Серин служит источником одноуглеродных групп для одноуглеродного обмена, где работают фолатный и метиониновый циклы; эти группы используются для синтеза нуклеотидов и реакций метилирования. В части опухолевых клеток в синтез серина направлялось около 10 % 3-фосфоглицерата, а в других клетках поток в него не выявлялся (по обзору Locasale, 2013).Остальной углерод превращается в пируват, который восстанавливается до лактата или окисляется до ацетил-CoA. Поток в ответвление определяют приток G6P и активность ферментов ответвления, поэтому при ускорении поступления глюкозы потоки в ПФП, к серину и в лактат могут расти одновременно. Усиление потока в ответвление не создаёт новых путей: клетки человека, например, не синтезируют триптофан. Кроме того, в биомассе делящихся культивируемых клеток преобладает углерод аминокислот среды, а не глюкозы (Hosios и соавт., 2016).Типичная ошибка NADPH образуется в самом гликолизе при превращении пирувата в лактат.В реакции ЛДГ окисляется NADH, а NADPH в гликолизе не образуется. Его образуют окислительная ветвь ПФП и ряд других ферментов, например малик-фермент.При неизменном поступлении глюкозо-6-фосфата возрастает его поток через окислительную ветвь пентозофосфатного пути. Как изменится образование NADPH и пентозофосфатов?А. NADPH образуется в реакции ЛДГ, поэтому растёт образование лактата, а не пентозофосфатов. (неверный вариант)В реакции ЛДГ окисляется NADH, а NADPH не образуется; пентозофосфаты образует окислительная ветвь.Б. Образование NADPH снижается, поскольку окислительная ветвь потребляет NADPH и CO₂. (неверный вариант)Окислительная ветвь образует NADPH и CO₂, а не потребляет их.В. Образование NADPH и пентозофосфатов усиливается, а поток в гликолиз снижается. (верный вариант)Эта ветвь образует NADPH и рибулозо-5-фосфат, из которого получают рибозо-5-фосфат; при неизменном притоке в гликолиз остаётся меньше глюкозо-6-фосфата.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаStincone A. et al. The return of metabolism: biochemistry and physiology of the pentose phosphate pathway. Biol Rev Camb Philos Soc. 2015;90:927–963.Locasale J. W. Serine, glycine and one-carbon units: cancer metabolism in full circle. Nat Rev Cancer. 2013;13:572–583.Hosios A. M. et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Dev Cell. 2016;36:540–549.Схема качественная: числа атомов углерода — по структуре соединений, потоки заданы относительно и не получены в эксперименте. Две молекулы NADPH на G6P и неокислительная ветвь взяты из полного текста обзора Stincone и соавт. (2015), синтез серина и одноуглеродный обмен — из полного текста обзора Locasale (2013); значение около 10 % приведено в обзоре по данным ¹³C-глюкозы для части линий опухолевых клеток и не характеризует все клетки; вклад глюкозы в массу культивируемых клеток — по работе Hosios и соавт. (2016; полный текст).
Аэробный гликолиз и распределение углерода · шаг 5 из 32Почему выход ATP и регенерация NAD⁺ могут ограничивать разные процессыВыход ATP на молекулу глюкозы и скорость образования ATP — разные величины. Окисление NADH в митохондриях зависит от сопряжения дыхания с расходом ATP, поэтому присутствие O₂ само по себе не означает окисления всего NADH.Выход ATP на молекулу глюкозы при полном окислении больше, чем при образовании лактата, но скорость образования ATP равна произведению потока на выход.Цитозольный NADH не проходит через внутреннюю мембрану: его электроны передают в матрикс челноки, а комплекс I окисляет NADH матрикса, и электроны переходят к O₂.Если ATP расходуется медленно, ATP-синтаза использует градиент медленно, он остаётся высоким и ограничивает перенос электронов.При превращении глюкозы в лактат образуются 2 молекулы ATP на молекулу глюкозы, при полном окислении — около 30 (учебное значение по Ленинджеру; в разных учебниках от 30 до 38 из-за разных допущений о стехиометрии). Это выход. Скорость образования ATP равна произведению потока через путь на выход, поэтому путь с малым выходом при большом потоке может давать столько же ATP за единицу времени, сколько путь с большим выходом при малом потоке.NADH, образованный в цитозоле, внутреннюю митохондриальную мембрану не проходит. Восстановительные эквиваленты — электроны, связанные с переносчиком, — передаёт в матрикс челночная система. В малат-аспартатном челноке цитозольный NADH восстанавливает оксалоацетат до малата, а в матриксе малат вновь окисляется с образованием NADH; глицерол-3-фосфатный челнок передаёт электроны на убихинон, минуя комплекс I. Комплекс I окисляет NADH матрикса, электроны через убихинон и комплексы III и IV переходят к O₂, и этот перенос сопровождается переносом протонов через мембрану. Протонный градиент использует ATP-синтаза: так осуществляется окислительное фосфорилирование.Перенос электронов и синтез ATP сопряжены, поэтому скорость дыхания зависит от оборота ATP. Если ATP расходуется медленно, ATP-синтаза использует градиент медленно, он остаётся высоким, и NADH окисляется медленнее даже при достаточном содержании O₂. В работе Luengo и соавт. (2021) на клеточных линиях человека активация пируватдегидрогеназного комплекса (PDH) ингибитором его киназы (PDK) AZD7545 повышала мембранный потенциал и отношение NADH/NAD⁺; FCCP или дополнительный гидролиз ATP возвращали оба показателя к исходным значениям. Общее отношение ATP/ADP при этом не менялось, поэтому нехватка ADP у ATP-синтазы остаётся предположением авторов.Вмешательства различаются по мишеням: олигомицин подавляет ATP-синтазу, FCCP рассеивает градиент, пиерицидин ингибирует комплекс I, дихлорацетат (DCA) подавляет PDK; их действие показано на схеме переключателем «Вмешательство». Присутствие O₂ не снимает блок комплекса I; остаточное дыхание зависит от других входов электронов, например комплекса II (SDH). В клетках с дефицитом комплекса I дыхание поддерживали проникающие пролекарства сукцината (Ehinger и соавт., 2016).Типичная ошибка Если O₂ доступен, митохондрии окисляют весь цитозольный NADH.Присутствие O₂ не гарантирует окисления всего NADH: при медленном обороте ATP высокий градиент тормозит перенос электронов, а передача электронов из цитозоля ограничена ёмкостью челноков.В клетках снижен расход ATP, а O₂ достаточно. Рассматривается сопряжённое дыхание без разобщителей и ингибиторов цепи. Что ограничивает окисление NADH в митохондриях?А. Перенос электронов тормозится протонным градиентом, который медленно используется ATP-синтазой. (верный вариант)Если ATP расходуется медленно, ATP-синтаза использует градиент медленно, и перенос электронов замедляется (в рамках модели Luengo и соавт., 2021).Б. Скорость переноса электронов определяется количеством NADH и не зависит от оборота ATP. (неверный вариант)Перенос электронов сопряжён с использованием градиента ATP-синтазой, поэтому его скорость зависит от оборота ATP.В. Снижение расхода ATP повышает потребность в ADP и ускоряет ATP-синтазу, поэтому NADH окисляется быстрее. (неверный вариант)При меньшем обороте ATP ATP-синтаза использует градиент медленнее, поэтому она не ускоряется.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Luengo A. et al. Increased demand for NAD⁺ relative to ATP drives aerobic glycolysis. Mol Cell. 2021;81:691–707.e6.Wang Y. et al. Saturation of the mitochondrial NADH shuttles drives aerobic glycolysis in proliferating cells. Mol Cell. 2022;82:3270–3283.e9.Ehinger J. K. et al. Cell-permeable succinate prodrugs bypass mitochondrial complex I deficiency. Nat Commun. 2016;7:12317.Схема качественная: уровни показывают направление изменений, а не значения. Значения выхода ATP — учебные, по Ленинджеру; в этой работе по первоисточнику не перепроверялись. Сопряжение дыхания с оборотом ATP показано у Luengo и соавт. (2021) на клеточных линиях человека (по тексту статьи — 143B и H1299; список линий по легендам рисунков не проверялся) при 21 % O₂ с ингибитором PDK AZD7545, а не с DCA; отношение NAD⁺/NADH определяли в экстракте целой клетки и приводили как NAD⁺/NADH (здесь дана обратная запись NADH/NAD⁺); общее ATP/ADP не менялось, нехватка ADP у ATP-синтазы — гипотеза авторов. Насыщение челноков в клетках панели NCI-60 — у Wang и соавт. (2022). Эти работы выполнены на разных моделях и не исключают друг друга; один механизм нельзя считать общей причиной эффекта Варбурга. Возможность поддержать дыхание при блоке комплекса I через комплекс II показана на клетках с дефицитом комплекса I при подаче проникающих пролекарств сукцината (Ehinger и соавт., 2016; по аннотации).
Аэробный гликолиз и распределение углерода · шаг 6 из 32Зачем делящейся клетке дыхание помимо синтеза ATPДыхание нужно делящейся клетке не только для синтеза ATP: окисление NADH поддерживает содержание NAD⁺, необходимое для реакций синтеза аспартата. Аспартат — исходное вещество для синтеза нуклеотидов и белков, поэтому его нехватка может замедлять деление клеток, хотя ATP достаточно.Малатдегидрогеназа окисляет малат до оксалоацетата, и для этой реакции нужен NAD⁺.Аспартатаминотрансфераза переносит аминогруппу с глутамата на оксалоацетат: образуются аспартат и α-КГ.Если комплекс I подавлен, NAD⁺ может регенерироваться за счёт другого акцептора электронов: добавленного в среду пирувата в реакции ЛДГ или O₂ в реакции LbNOX.Аспартат образуется из оксалоацетата в реакции трансаминирования: аспартатаминотрансфераза (GOT) переносит аминогруппу с глутамата на оксалоацетат, и образуются аспартат и α-кетоглутарат (α-КГ). Оксалоацетат возникает при окислении малата малатдегидрогеназой (MDH), которой нужен NAD⁺; если оксалоацетат образуется в окислительном пути из α-КГ, акцепторы электронов нужны также α-кетоглутаратдегидрогеназе и сукцинатдегидрогеназе (Sullivan и соавт., 2015). Образовавшийся NADH необходимо окислить, чтобы реакции продолжались: в матриксе это делает комплекс I, а в цитозоле — реакции, в которых другие соединения принимают электроны.Эти положения проверяли на культивируемых клетках. В клетках 143B без функциональной дыхательной цепи (делеция в гене цитохрома b; среда с уридином) деление возвращали добавленные в среду пируват и α-кетобутират. Добавленные соединения служат экзогенными акцепторами электронов; пируват, образованный в клетке из глюкозы, такой функции не выполняет, поскольку гликолиз до лактата окислительно-восстановительно нейтрален (NADH из GAPDH окисляется в реакции ЛДГ). Дегидрогеназы, в том числе ЛДГ, восстанавливают α-кетобутират до α-гидроксибутирата за счёт NADH. Оба соединения снижали отношение NADH/NAD⁺, а α-кетобутират возвращал и содержание аспартата, но потребление O₂ не повышал. Добавление аспартата в избытке тоже возвращало деление, но не меняло ни потребление O₂, ни отношение NADH/NAD⁺: аспартат не принимает электроны, а восполняет недостающий предшественник (Sullivan и соавт., 2015).В клетках Jurkat при подавлении комплекса I содержание аспартата снижалось, а добавленный в среду пируват (1 мМ) возвращал это содержание и деление клеток; для этого были нужны цитозольные MDH1 и GOT1, но не пируваткарбоксилаза (Birsoy и соавт., 2015). Эти данные согласуются с моделью, по которой NAD⁺, образованный при восстановлении добавленного пирувата, служит субстратом MDH1, а GOT1 синтезирует аспартат; без пирувата аспартат при подавлении комплекса I образовывался, в частности, путём восстановительного карбоксилирования α-КГ, образованного из глутамина.Аналогичные результаты получены с водообразующей NADH-оксидазой LbNOX: она окисляет NADH до NAD⁺, восстанавливая O₂ до воды, и не синтезирует ATP. В клетках HeLa (среда с уридином, без пирувата) с подавленными комплексами I или III её экспрессия в цитозоле или в матриксе возвращала деление (Titov и соавт., 2016). Доступность аспартата зависит от типа клеток, транспорта аспартата и состава среды.Типичная ошибка Аспартат возвращает деление клеток без дыхания, потому что служит акцептором электронов.Аспартат не принимает электроны: добавление аспартата не повышало потребление O₂ и не меняло отношение NADH/NAD⁺ в клетках 143B, а восполняло нехватку самого предшественника (Sullivan и соавт., 2015).Содержание ATP достаточное, но регенерация NAD⁺ нарушена. Какое последствие может объяснить замедление деления?А. Аспартат принимает электроны, и без него дыхательная цепь не окисляет NADH. (неверный вариант)Аспартат не принимает электроны: его добавление не меняет потребление O₂ и отношение NADH/NAD⁺.Б. Нехватка аспартата как предшественника ограничивает синтез нуклеотидов. (верный вариант)Нуклеотиды синтезируются из аспартата; ATP этот субстрат не заменяет.В. Нехватка NAD⁺ нарушает синтез белков, а синтез нуклеотидов не затрагивает. (неверный вариант)Аспартат нужен и для синтеза нуклеотидов; при его нехватке они синтезируются хуже.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаSullivan L. B. et al. Supporting Aspartate Biosynthesis Is an Essential Function of Respiration in Proliferating Cells. Cell. 2015;162:552–563.Birsoy K. et al. An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis. Cell. 2015;162:540–551.Titov D. V. et al. Complementation of mitochondrial electron transport chain by manipulation of the NAD⁺/NADH ratio. Science. 2016;352:231–235.Схема показывает механизм без концентраций и времён. Результаты получены на культивируемых клетках разных линий: 143B с делецией в гене цитохрома b (среда с уридином; Sullivan и соавт., 2015), Jurkat (Birsoy и соавт., 2015) и HeLa (Titov и соавт., 2016). Пируват и α-кетобутират добавляли в среду экзогенно (у Birsoy и соавт. пируват — 1 мМ); среда для HeLa содержала уридин, но не содержала пирувата; аспартат добавляли в сверхфизиологических концентрациях (у Birsoy и соавт. 10 мМ против 150 мкМ в стандартной среде RPMI). Вывод не переносится на любые клетки и ткани: возвращение деления аспартатом не гарантировано.
Аэробный гликолиз и распределение углерода · шаг 7 из 32Что показывают потребление O₂ и внеклеточное закислениеВнеклеточный анализ потоков (в литературе — анализатор Seahorse XF) регистрирует убыль O₂ и снижение pH в малом объёме над клетками и рассчитывает OCR и ECAR. Это косвенные показатели: ECAR не равен скорости образования лактата, а OCR — скорости синтеза ATP.Что показывает схема. Схема метода (текстовая копия). Клетки в монослое находятся под малым объёмом среды; O₂-датчик регистрирует убыль кислорода, pH-датчик — закисление. Скорости OCR и ECAR рассчитывают по наклону кривых во времени после последовательных добавлений олигомицина, FCCP и ингибиторов комплексов I и III. Закисление складывается из лактата с протоном и из CO₂ (CO₂ + H₂O ⇄ HCO₃⁻ + H⁺), поэтому ECAR не равен скорости образования лактата. Контроли: число клеток или белок, буферная ёмкость среды, лунка без клеток, немитохондриальное потребление O₂, отдельное измерение лактата в среде. Значения учебные.Датчики регистрируют O₂ и pH во времени, и скорость определяют по наклону кривой, а не по значению в точке.Закисление создают лактат, выходящий вместе с протоном, и CO₂, который гидратируется до HCO₃⁻ и H⁺, поэтому ECAR включает вклад дыхания.Чтобы оценить скорость образования лактата, переводят ECAR в скорость выхода протонов с помощью буферной ёмкости среды, вычитают вклад CO₂ и сверяют результат с измерением лактата в среде.На схеме клетки в монослое покрыты малым объёмом среды, в котором O₂-датчик и pH-датчик регистрируют изменения во времени. OCR — скорость убыли O₂, ECAR — скорость снижения pH, в единицах mpH/мин. Обе величины — наклоны кривых и зависят от числа клеток в лунке, поэтому показания нормируют на число клеток или содержание белка. Последовательность добавлений показана на схеме: потребление O₂, подавляемое олигомицином, соответствует дыханию, связанному с синтезом ATP; после FCCP достигается максимальное потребление O₂; остаточное потребление O₂ после ингибиторов комплексов I и III считают немитохондриальным (Brand и Nicholls, 2011).Закисление среды вызывают два основных процесса: лактат, выходящий вместе с протоном, и CO₂, образующийся при окислении субстратов (в том числе в цикле трикарбоновых кислот). В замкнутом объёме CO₂ остаётся в среде, гидратируется до HCO₃⁻ и отдаёт протон. В работе Mookerjee и соавт. (2015) на миобластах C2C12 с глюкозой дыхательный CO₂ составлял 34 % закисления; при отсутствии глюкозы или замене её пальмитатом либо пируватом — 67–100 %; в разных линиях клеток эта доля составляла от 3 до 100 %. При малой и постоянной доле CO₂ изменение ECAR примерно пропорционально изменению потока в лактат; при изменении дыхания (после олигомицина или FCCP) это допущение нарушается.Поэтому ECAR пересчитывают: переводят в скорость выхода протонов с помощью буферной ёмкости среды, определённой титрованием кислотой (на схеме — контроль «буферная ёмкость среды»), вычитают вклад CO₂, рассчитанный по OCR за вычетом немитохондриального потребления O₂, и нормируют результат. Для проверки лактат измеряют в среде отдельным методом (на схеме — строка «лактат в среде: отдельное измерение»; Mookerjee и Brand, 2015). Расчёт скорости образования ATP требует ещё и модели сопряжения: OCR включает немитохондриальную часть и потребление O₂, не связанное с синтезом ATP.Типичная ошибка ECAR прямо измеряет скорость образования лактата.ECAR — скорость изменения pH. Чтобы перейти к потоку лактата, нужны буферная ёмкость, поправка на дыхательный CO₂ и нормировка, а результат сверяют с измерением лактата в среде.При одинаковом числе жизнеспособных клеток ECAR возрос; доля дыхательного CO₂ в закислении не измерена. Какой вывод допустим?А. Поток в лактат вырос пропорционально ECAR, поскольку закисление определяется образованием лактата. (неверный вариант)Пропорциональность выполняется только при малой и постоянной доле дыхательного CO₂ и известной буферной ёмкости; здесь доля не измерена.Б. Скорость синтеза ATP митохондриями выросла, так как закисление среды усилилось. (неверный вариант)ECAR непосредственно не измеряет митохондриальный синтез ATP; закисление создают и лактат, и CO₂.В. Внеклеточное закисление усилилось; доля лактата в нём без дополнительных измерений не определена. (верный вариант)pH-датчик регистрирует суммарный эффект, включая вклад дыхательного CO₂.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаMookerjee S. A. et al. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 2015;1847:171–181.Mookerjee S. A., Brand M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. JoVE. 2015;106:53464.Brand M. D., Nicholls D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 2011;435:297–312.Кривые и числа на схеме учебные: условные единицы, постоянное образование лактата и 1 H⁺ на 1 молекулу O₂ (при дыхательном коэффициенте около 1 это соответствует 1 H⁺ на 1 молекулу CO₂) — допущения модели, а не данные эксперимента. Доли CO₂ (34 %; 67–100 %; 3–100 %) приведены по Mookerjee и соавт. (2015; полный текст) для C2C12 и других линий; пересчёт ECAR и контроль — по методической статье Mookerjee и Brand (JoVE, 2015), прочитанной в полном тексте. Назначение ингибиторов в тесте и показатели клеточного дыхательного контроля — по Brand и Nicholls (2011; по аннотации).
ЦТК, катаплероз и анаплероз · шаг 8 из 32Почему цикл трикарбоновых кислот участвует и в окислении, и в биосинтезеЦикл трикарбоновых кислот (ЦТК) окисляет ацетильную группу ацетил-CoA и регенерирует оксалоацетат. Его промежуточные соединения служат также исходными веществами для биосинтеза, поэтому ЦТК называют амфиболическим путём: он сочетает катаболическую и анаболическую роли.Цитратсинтаза присоединяет ацетильную группу к оксалоацетату с образованием цитрата; в конце оборота оксалоацетат регенерируется.За один полный окислительный оборот на одну вошедшую ацетильную группу образуются три NADH, одна молекула убихинола (QH₂; электроны от сукцината через связанный с SDH FAD), одна молекула GTP или ATP и две молекулы CO₂.Электроны NADH и QH₂ передаются дыхательной цепи; если передача электронов нарушена, NAD⁺ и окисленный убихинон не регенерируются, и дегидрогеназные реакции цикла замедляются.Цикл начинается реакцией цитратсинтазы: ацетильная группа ацетил-CoA присоединяется к оксалоацетату, и образуется цитрат. Затем аконитаза превращает цитрат в изоцитрат, изоцитратдегидрогеназа IDH3 окисляет изоцитрат до α-кетоглутарата (α-КГ), α-кетоглутаратдегидрогеназа (α-КГДГ) — α-КГ до сукцинил-CoA, а сукцинил-CoA-синтетаза (SCS) образует сукцинат. Сукцинат окисляется сукцинатдегидрогеназой (SDH, комплекс II) до фумарата, фумараза присоединяет воду с образованием малата, и малатдегидрогеназа вновь образует оксалоацетат.Окислительные реакции переносят электроны на коферменты. IDH3, α-КГДГ и малатдегидрогеназа восстанавливают NAD⁺ до NADH, причём IDH3 и α-КГДГ выделяют по одной молекуле CO₂. SDH восстанавливает прочно связанный с ней FAD и передаёт электроны убихинону; свободный FADH₂ из фермента не выходит. SCS использует энергию тиоэфирной связи сукцинил-CoA для фосфорилирования GDP или ADP. Эти количества относятся к одному полному обороту на одну ацетильную группу. Два выделяющихся CO₂ образуются из углерода оксалоацетата, а не из ацетильной группы, вошедшей в том же обороте; углерод этой группы выделится в виде CO₂ в последующих оборотах (см. шаг про катаплероз).В реакциях цикла O₂ не является субстратом. Однако работа цикла зависит от дыхательной цепи: NADH и QH₂ должны окисляться, а NAD⁺ и окисленный убихинон — регенерироваться. Если передача электронов дыхательной цепи нарушена, доступность NAD⁺ и окисленного убихинона снижается, и дегидрогеназные реакции цикла замедляются.Те же промежуточные соединения служат исходными веществами для биосинтеза: из цитрата образуется ацетил-CoA для липидов, из оксалоацетата — аспартат, из α-КГ — глутамат, из сукцинил-CoA — гем. Поэтому ЦТК одновременно окисляет субстраты и поставляет предшественники. Это не значит, что каждая реакция выполняет обе функции. В открытой сети с ответвлениями стехиометрия полного оборота не задаёт величину каждого реального потока.Типичная ошибка В каждой реакции цикла непосредственно расходуется O₂.O₂ не субстрат реакций цикла. Цикл зависит от дыхательной цепи, которая окисляет NADH и QH₂ и передаёт электроны на O₂; без этой передачи NAD⁺ и убихинон не регенерируются.Почему цикл трикарбоновых кислот называют амфиболическим путём?А. Кислород служит субстратом нескольких реакций цикла, поэтому цикл связан и с окислением, и с синтезом. (неверный вариант)В реакциях цикла O₂ не является субстратом; связь с ним опосредована дыхательной цепью.Б. Цикл образует ATP субстратным фосфорилированием и одновременно расходует его на синтез промежуточных соединений. (неверный вариант)В реакциях цикла ATP (GTP) образует только SCS, а расходуют его не реакции цикла; «амфиболический» — сочетание катаболической и анаболической функций.В. Его реакции окисляют ацетильную группу, а промежуточные соединения служат источником предшественников для биосинтеза. (верный вариант)Обе функции связаны общими промежуточными соединениями.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Альбертс Б. и др. Основы молекулярной биологии клетки.Схема качественная: показаны реакции, коферменты и ответвления без концентраций и скоростей; ферменты цикла находятся в матриксе митохондрий, кроме SDH, встроенной во внутреннюю мембрану. Стехиометрия полного окислительного оборота приведена по учебникам биохимии (Ленинджер, т. 2; Альбертс); количества не относятся к конкретным клеткам.
ЦТК, катаплероз и анаплероз · шаг 9 из 32Как отток промежуточных соединений связывает цикл с биосинтезомКатаплероз — чистый отток промежуточных соединений ЦТК в другие метаболические пути. Он связывает цикл с биосинтезом; без компенсации притоком углеродных скелетов количество промежуточных соединений в цикле убывает.Цитрат выходит из матрикса через переносчик внутренней мембраны; в цитозоле ATP-цитратлиаза образует из него ацетил-CoA для синтеза липидов.Оксалоацетат превращается в аспартат, α-КГ — в глутамат, сукцинил-CoA вступает в синтез гема.Если приток углеродных скелетов не равен оттоку, количество промежуточных соединений изменяется; при преобладании оттока оно снижается.Промежуточные соединения ЦТК образуются в одних реакциях цикла и расходуются в других, поэтому при полном обороте их количество не изменяется. Но те же соединения служат исходными веществами для биосинтеза. Выход соединения из цикла в другой путь называют катаплерозом, если он приводит к чистому оттоку. Не всякое превращение, при котором вещество покидает цикл, считают катаплерозом: обратимая обменная реакция, у которой прямое и обратное направления уравновешены, чистого оттока не создаёт.Цитрат покидает матрикс митохондрии через переносчик внутренней мембраны. В цитозоле ATP-цитратлиаза (ACLY) расщепляет его на ацетил-CoA и оксалоацетат с затратой ATP, и ацетил-CoA используется для синтеза липидов. Остальные три отведения происходят в матриксе: оксалоацетат превращается в аспартат, α-КГ — в глутамат, а сукцинил-CoA вступает в синтез гема. Оксалоацетат практически не проходит через внутреннюю мембрану; из матрикса выходит аспартат. Оксалоацетат, образованный ACLY в цитозоле, может превращаться в аспартат (цитозольная аминотрансфераза GOT1; см. шаг про аспартат) или в малат, а малат — в пируват с образованием NADPH (малик-фермент).Чтобы количество промежуточных соединений сохранялось, отток должен компенсироваться анаплерозом: поступлением углеродных скелетов из других путей, например из пирувата или глутамина (см. следующие шаги). Если отток цитрата на синтез липидов длительно усилен, а приток не изменился, количество промежуточных соединений в матриксе снижается до установления нового стационарного состояния (см. шаг про поток и содержание метаболита), и скорость реакций цикла может ограничиваться их доступностью. При преобладании притока количество, наоборот, может расти, пока не изменятся скорости других реакций.Для иллюстрации (условные единицы): при оттоке 3 условные единицы в минуту и притоке 1 условной единице в минуту чистая потеря составляет 2 условные единицы в минуту. Ацетил-CoA, входящий в цикл, чистого притока промежуточных соединений не создаёт. Два его атома углерода в последующих оборотах выделяются в виде CO₂, а реакций, превращающих ацетил-CoA в оксалоацетат без потери углерода, в клетках человека нет. Поэтому для восполнения нужны реакции, вводящие в цикл дополнительный углерод.Типичная ошибка Отток цитрата не влияет на цикл, потому что цитрат синтезируется заново из ацетил-CoA.Для образования нового цитрата нужен оксалоацетат, а ацетил-CoA его не пополняет. Если отток не компенсирован притоком углерода, количество промежуточных соединений убывает.Отведение цитрата на синтез липидов длительно усилилось, а восполнение промежуточных соединений не изменилось. Что может ограничить дальнейший поток через цикл?А. Снижение количества оксалоацетата и других промежуточных соединений цикла в матриксе. (верный вариант)Без компенсации оттока количество промежуточных соединений в цикле снижается.Б. Избыток NADPH, образующегося при переносе цитрата в цитозоль и подавляющего реакции цикла. (неверный вариант)Перенос цитрата NADPH не образует; образование NADPH зависит от последующих реакций в цитозоле.В. Накопление цитрата в матриксе, которое по принципу обратной связи блокирует цитратсинтазу. (неверный вариант)При усиленном выходе цитрата его содержание в матриксе снижается, а не растёт.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема качественная: показаны положение реакций (матрикс, цитозоль) и направления оттока и притока; числа не заданы. Расположение реакций приведено по учебнику биохимии (Ленинджер, т. 2).
ЦТК, катаплероз и анаплероз · шаг 10 из 32Как пируваткарбоксилаза восполняет оксалоацетатПируваткарбоксилаза (PC) присоединяет CO₂ в форме бикарбоната к пирувату и образует оксалоацетат, то есть восполняет промежуточные соединения цикла. Образование ацетил-CoA пируватдегидрогеназным комплексом (PDH) — другой вход пирувата в цикл, при котором оксалоацетат не восполняется.PC катализирует ATP-зависимое карбоксилирование пирувата до оксалоацетата; простетическая группа PC — ковалентно связанный биотин; в клетках человека реакция идёт в митохондриальном матриксе.PDH окисляет пируват до ацетил-CoA с выделением CO₂ и образованием NADH; PC и PDH дают разные продукты и служат разными входами в цикл.Ацетил-CoA — аллостерический активатор PC, но поступление ацетил-CoA в цикл само по себе чистого восполнения оксалоацетата не даёт.Пируваткарбоксилаза катализирует реакцию: пируват + HCO₃⁻ + ATP → оксалоацетат + ADP + Pi. Реакция идёт в два этапа. Сначала ковалентно связанный с ферментом биотин (простетическая группа) карбоксилируется за счёт бикарбоната и ATP, затем карбоксильная группа переносится на пируват. Реакция не расходует NADH и не выделяет CO₂, а присоединяет его. В клетках человека PC находится в митохондриальном матриксе.Пируват может войти в цикл двумя путями. PDH окисляет его до ацетил-CoA с выделением CO₂ и образованием NADH. Ацетильная группа присоединяется цитратсинтазой к уже имеющемуся оксалоацетату, поэтому общее количество промежуточных соединений не увеличивается. PC превращает пируват непосредственно в оксалоацетат, то есть в промежуточное соединение цикла, и количество четырёхуглеродных промежуточных соединений растёт. Таким образом, PC и PDH — разные входы пирувата в цикл.Ацетил-CoA — аллостерический активатор PC: он связывается вне активного центра и повышает активность фермента, поэтому при высоком содержании ацетил-CoA в матриксе образование оксалоацетата из пирувата может усиливаться. Сам по себе ацетил-CoA оксалоацетат не восполняет: чистый приток даёт реакция, вводящая в цикл дополнительный углерод. Анаплеротический эффект проявляется, если образовавшийся оксалоацетат не потребляется целиком реакциями отведения (см. шаг про катаплероз).PC — не единственный путь анаплероза, а её вклад различается между клетками. В клетках глиобластомы подавление глутаминазы вызывало компенсаторное усиление анаплероза с участием PC, а клетки (в том числе других линий) с высокой активностью PC не зависели от глутамина, но для роста им была необходима PC (Cheng и соавт., 2011). В клетках мыши с утратой SDH PC существенно поддерживает синтез аспартата (см. шаг про SDH).Типичная ошибка Если ацетил-CoA поступает в цикл, оксалоацетат тем самым восполняется.Ацетил-CoA присоединяется к уже имеющемуся оксалоацетату. Чистое восполнение даёт реакция, вводящая дополнительный углерод, например карбоксилирование пирувата, катализируемое PC.Для восполнения оксалоацетата из пирувата усилена реакция PC. Какие вещества непосредственно необходимы для этой реакции?А. Пируват, бикарбонат (источник CO₂) и ATP как источник энергии. (верный вариант)PC катализирует ATP-зависимое карбоксилирование пирувата; простетическая группа фермента — биотин.Б. Пируват, NAD⁺ и CoA с выделением CO₂ при образовании продукта. (неверный вариант)Так описывается окислительное декарбоксилирование пирувата комплексом PDH; PC присоединяет CO₂, а не выделяет его.В. Пируват, ацетил-CoA и ATP: ацетил-CoA присоединяется к пирувату. (неверный вариант)Ацетил-CoA — аллостерический активатор PC, а не субстрат; к пирувату он не присоединяется.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Cheng T. et al. Pyruvate carboxylase is required for glutamine-independent growth of tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:8674–8679.Cardaci S. et al. Pyruvate carboxylation enables growth of SDH-deficient cells by supporting aspartate biosynthesis. Nat Cell Biol. 2015;17:1317–1326.Схема качественная: показаны вещества, коферменты и два входа пирувата в цикл; числа не заданы. Реакция PC и активация ацетил-CoA приведены по учебнику биохимии (Ленинджер, т. 2); различия вклада PC описаны на культивируемых клетках (Cheng и соавт., 2011 — прочитана аннотация; Cardaci и соавт., 2015).
ЦТК, катаплероз и анаплероз · шаг 11 из 32Как углерод глутамина пополняет циклУглерод глутамина входит в цикл в несколько этапов: глутаминаза (GLS) превращает глутамин в глутамат, а затем другая реакция превращает глутамат в α-КГ. Вклад глутамина в анаплероз различается между клетками и не во всех клетках является главным.GLS гидролизует амидную группу глутамина с образованием глутамата и NH₄⁺; α-КГ в этой реакции не образуется.Глутамат превращается в α-КГ трансаминированием, при котором аминогруппа переходит на кетокислоту, или окислительным дезаминированием глутаматдегидрогеназой (GDH) с выделением NH₄⁺.α-КГ превращается по окислительному пути в сукцинил-CoA или по восстановительному в изоцитрат; вклад глутамина и PC различается между клеточными линиями.Глутамин содержит пять атомов углерода и два атома азота, амидный и аминный. GLS гидролизует амидную группу: глутамин + H₂O → глутамат + NH₄⁺. Углеродный скелет при этом не меняется, и α-КГ не образуется, поэтому одной активности GLS недостаточно, чтобы углерод глутамина вошёл в цикл.Превращение глутамата в α-КГ идёт двумя способами. При трансаминировании аминотрансфераза переносит аминогруппу глутамата на кетокислоту-акцептор, например на оксалоацетат, и образуются α-КГ и аминокислота, в этом примере аспартат. Глутаматдегидрогеназа окисляет глутамат до α-КГ и отщепляет аммоний; NAD⁺ или NADP⁺ при этом восстанавливается до NADH или NADPH. В первом случае азот остаётся в составе аминокислоты, во втором выходит в виде NH₄⁺.Далее α-КГ превращается в окислительном направлении через сукцинил-CoA и сукцинат или в восстановительном через изоцитрат и цитрат. Восстановительное направление — это реакция IDH1 или IDH2, обратная образованию NADPH: α-КГ + CO₂ + NADPH → изоцитрат (см. шаг про восстановительное карбоксилирование). Вклад глутамина различается. В одной линии клеток глиобластомы оксалоацетат для цикла образовывался из глутамина при низкой активности карбоксилирования пирувата (DeBerardinis и соавт., 2007), а при подавлении GLS возрастала роль PC (Cheng и соавт., 2011). О судьбе углерода глутамина при утрате SDH см. шаг про SDH.Есть и другие входы. Пропионил-CoA, образующийся, например, при расщеплении некоторых аминокислот (валина, изолейцина, метионина, треонина) и жирных кислот с нечётным числом атомов углерода, карбоксилируется до метилмалонил-CoA; B₁₂-зависимая метилмалонил-CoA-мутаза превращает его в сукцинил-CoA. Поэтому глутамин нельзя считать главным источником восполнения для всех клеток. Какой вход преобладает, зависит от типа клеток и условий; это определяют экспериментально, например по распределению метки ¹³C; метод показан на схеме в шаге про прослеживание углерода.Типичная ошибка GLS превращает глутамин в α-КГ, поэтому её активности достаточно для восполнения цикла.GLS освобождает аммоний из амидной группы глутамина. α-КГ образуется только после следующего превращения глутамата: трансаминирования или окислительного дезаминирования.В клетке активна GLS, но превращение глутамата в α-КГ ограничено. Достаточно ли активности GLS для поступления углерода глутамина в цикл?А. Да: глутамат, образованный GLS, сам является промежуточным соединением цикла. (неверный вариант)Глутамат не относится к промежуточным соединениям цикла; его углерод поступает в цикл через α-КГ.Б. Нет: необходима следующая реакция, которая образует α-КГ из глутамата. (верный вариант)GLS образует глутамат; для включения его углерода в цикл нужен дополнительный этап.В. Нет: глутамат входит в цикл только после превращения в оксалоацетат. (неверный вариант)Глутамат превращается в α-КГ трансаминированием или с участием GDH, а не в оксалоацетат.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.DeBerardinis R. J. et al. Beyond aerobic glycolysis: transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:19345–19350.Cheng T. et al. Pyruvate carboxylase is required for glutamine-independent growth of tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:8674–8679.Lussey-Lepoutre C. et al. Loss of succinate dehydrogenase activity results in dependency on pyruvate carboxylation for cellular anabolism. Nat Commun. 2015;6:8784.Схема качественная: показаны превращения углерода и азота глутамина. Различия вклада глутамина и PC получены на культивируемых клетках (глиобластома; SDH-дефицитные клетки мыши) и не обобщаются на все клетки (DeBerardinis и соавт., 2007 — полный текст; Cheng и соавт., 2011 — прочитана аннотация; Lussey-Lepoutre и соавт., 2015).
ЦТК, катаплероз и анаплероз · шаг 12 из 32Почему обходной приток не устраняет потерю SDHЕсли SDH утрачена, сукцинат не окисляется до фумарата и накапливается. Приток углерода через PC может поддерживать синтез аспартата, но сам по себе не устраняет нарушение реакции SDH.SDH окисляет сукцинат до фумарата и передаёт электроны от связанного FAD убихинону; фумараза присоединяет воду к фумарату.При утрате SDH сукцинат накапливается, образование фумарата из сукцината прерывается, а содержание фумарата и малата снижается; в исследованных моделях снижено и содержание аспартата.Оксалоацетат образуется из пирувата под действием PC независимо от SDH, что поддерживает синтез аспартата; реакция сукцинат → фумарат при этом остаётся нарушенной.SDH — комплекс II дыхательной цепи и единственный фермент ЦТК, встроенный во внутреннюю мембрану митохондрии. Она окисляет сукцинат до фумарата: электроны переходят на прочно связанный FAD, а затем на убихинон. Фумараза (FH) гидратирует фумарат до малата. Потеря FH и потеря SDH — разные нарушения: при потере FH накапливается фумарат, при потере SDH — сукцинат.При утрате SDH реакция сукцинат → фумарат не идёт, а сукцинат продолжает образовываться, поэтому он накапливается. В хромаффинных клетках мыши с делецией Sdhb и в опухолях человека с мутациями SDH накапливается сукцинат и снижено содержание аспартата; в клетках мыши ниже также содержание фумарата, малата и цитрата (Lussey-Lepoutre и соавт., 2015). Углерод глутамина включается в сукцинат, но по окислительному пути метка в малат и аспартат не переходит.Аспартат образуется из оксалоацетата, а его синтез требует акцепторов электронов, которые регенерируются при работе дыхательной цепи (Sullivan и соавт., 2015). Образование оксалоацетата из пирувата реакцией PC акцептора электронов не требует, в отличие от окисления малата малатдегидрогеназой, которой нужен NAD⁺. При утрате SDH оксалоацетат в митохондриях образуется из пирувата под действием PC: по включению метки ¹³C из глюкозы (метод показан на схеме в шаге про прослеживание углерода) выявлен возросший вклад PC в аспартат, а подавление PC прекращало рост клеток без SDH и мало влияло на клетки дикого типа (Lussey-Lepoutre и соавт., 2015; Cardaci и соавт., 2015). Эксперименты проводили на клетках в среде с пируватом.Поддержание содержания аспартата обходным путём не возвращает активность комплекса II. Реакция сукцинат → фумарат остаётся нарушенной, сукцинат продолжает накапливаться, и накопление сукцината конкурентно с α-КГ ингибирует α-КГ-зависимые диоксигеназы, в том числе деметилазы гистонов (Xiao и соавт., 2012; см. шаг про нарушения SDH, FH и IDH). Степень компенсации зависит от типа клеток и от других потоков углерода.Типичная ошибка Если усиленная PC поддерживает синтез аспартата, функция SDH возвращена.Обходной путь пополняет оксалоацетат и поддерживает аспартат; реакция сукцинат → фумарат остаётся нарушенной, и сукцинат продолжает накапливаться.При утрате SDH усиление PC ослабило нехватку аспартата. Что это означает для реакции SDH?А. Усиленная PC частично взяла на себя окисление сукцината, поэтому его накопление уменьшилось. (неверный вариант)У PC другая реакция и другие субстраты; окисление сукцината катализирует SDH.Б. Поддержание аспартата показывает, что комплекс II частично возобновил работу в дыхательной цепи. (неверный вариант)Аспартат можно поддержать обходным путём, не устраняя первичный дефект; по его содержанию активность SDH не определяют.В. Нехватка аспартата ослаблена за счёт PC, но превращение сукцината в фумарат по-прежнему нарушено. (верный вариант)PC образует оксалоацетат независимо от реакции сукцинат → фумарат.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Lussey-Lepoutre C. et al. Loss of succinate dehydrogenase activity results in dependency on pyruvate carboxylation for cellular anabolism. Nat Commun. 2015;6:8784.Cardaci S. et al. Pyruvate carboxylation enables growth of SDH-deficient cells by supporting aspartate biosynthesis. Nat Cell Biol. 2015;17:1317–1326.Xiao M. et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes Dev. 2012;26:1326–1338.Схема качественная: показано, какие реакции остаются при утрате SDH. Данные получены на клетках мыши с делецией Sdhb (хромаффинные клетки, фибробласты надпочечника, клетки почки) и на опухолях человека с мутациями SDH; в других клетках вклад PC и степень компенсации могут отличаться (Lussey-Lepoutre и соавт., 2015; Cardaci и соавт., 2015).
ЦТК, катаплероз и анаплероз · шаг 13 из 32Как α-кетоглутарат может использоваться для образования цитратаВосстановительное карбоксилирование α-КГ образует изоцитрат из α-КГ, CO₂ и NADPH, а затем изоцитрат может превращаться в цитрат. Это обращение лишь части реакций ЦТК; оно не связано с образованием R-2-HG.В окислительном направлении α-КГ превращается в сукцинил-CoA с выделением одного CO₂ и образованием NADH.В обратном направлении NADPH-зависимые IDH1 (преимущественно цитозоль) и IDH2 (матрикс) присоединяют CO₂ к α-КГ и расходуют NADPH; образуется изоцитрат, из которого получается цитрат.Мутантная IDH1 катализирует другую реакцию: α-КГ + NADPH → R-2-HG, и цитрат при этом не образуется.У α-КГ есть два направления превращения. В окислительном направлении α-кетоглутаратдегидрогеназа (α-КГДГ) превращает α-КГ в сукцинил-CoA с выделением CO₂ и образованием NADH, и углерод переходит дальше к сукцинату и оксалоацетату. В восстановительном направлении изоцитратдегидрогеназы IDH1 и IDH2 катализируют реакцию, обратную прямой: прямая реакция — изоцитрат → α-КГ + CO₂ с образованием NADPH, обратная — α-КГ + CO₂ + NADPH → изоцитрат, то есть NADPH расходуется. Изоцитрат аконитаза превращает в цитрат. IDH1 находится преимущественно в цитозоле (и в пероксисомах), IDH2 — в митохондриальном матриксе; какая изоформа обеспечивает реакцию, зависит от клеток и условий.Метка, характерная для этого пути, обнаруживалась во многих культивируемых линиях; вклад пути в чистый поток различается и возрастает при гипоксии, утрате белка VHL и нарушении работы дыхательной цепи. В части гипоксических линий глутамин становился главным источником цитрата (Wise и соавт., 2011). По данным Metallo и соавт. (2012), при гипоксии и при утрате белка VHL синтез липидов в большей мере зависел от восстановительного использования глутамина через IDH1. Путь преобладал в опухолевых клетках с мутациями комплексов I и III дыхательной цепи, при утрате FH и при острой блокаде дыхательной цепи (Mullen и соавт., 2012). Эксперименты проводили на культивируемых клетках, и вклад пути различался между линиями.Это обращение только части реакций цикла, от α-КГ к цитрату, а не всего ЦТК. Вклад пути зависел от отношения содержания α-КГ к содержанию цитрата: восстановительный путь усиливался при воздействиях, которые повышали это отношение, например при нарушении превращения ацетил-CoA в цитрат (Fendt и соавт., 2013). Реакции IDH1 и IDH2 обратимы, поэтому часть метки ¹³C в цитрате может отражать обмен изоцитрат ⇄ α-КГ без чистого потока (метод показан на схеме в шаге про прослеживание углерода).Мутантная IDH1 катализирует другую реакцию. Для IDH1 R132H показано, что фермент приобретает способность восстанавливать α-КГ до R-2-гидроксиглутарата (R-2-HG) за счёт NADPH (Dang и соавт., 2009). R-2-HG не входит в путь образования цитрата. 2-Гидроксиглутарат и α-КГ (2-оксоглутарат) — разные вещества (см. шаг про нарушения SDH, FH и IDH).Типичная ошибка Восстановительное карбоксилирование — то же, что образование R-2-HG мутантной IDH.Это разные реакции. Восстановительное карбоксилирование образует изоцитрат и цитрат и расходует NADPH и CO₂, а мутантная IDH превращает α-КГ в R-2-HG.Что непосредственно образуется при восстановительном карбоксилировании α-КГ ферментами IDH1 и IDH2?А. R-2-HG, который затем служит предшественником цитрата. (неверный вариант)R-2-HG не входит в путь образования цитрата; его образует мутантная IDH отдельной реакцией.Б. Изоцитрат, из которого далее может образоваться цитрат. (верный вариант)Реакция включает карбоксилирование и восстановление α-КГ за счёт NADPH; она обратна образованию NADPH при окислении изоцитрата.В. Сукцинил-CoA с выделением CO₂ и образованием NADH. (неверный вариант)Так описывается окислительное превращение α-КГ с участием α-КГДГ; при восстановительном карбоксилировании CO₂ присоединяется, а NADPH расходуется.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Wise D. R. et al. Hypoxia promotes isocitrate dehydrogenase-dependent carboxylation of α-ketoglutarate to citrate to support cell growth and viability. PNAS. 2011;108:19611–19616.Metallo C. M. et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature. 2012;481:380–384.Mullen A. R. et al. Reductive carboxylation supports growth in tumour cells with defective mitochondria. Nature. 2012;481:385–388.Fendt S.-M. et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the α-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nat Commun. 2013;4:2236.Dang L. et al. Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate. Nature. 2009;462:739–744.Схема качественная: показаны два направления превращения α-КГ и отдельная реакция мутантной IDH. Восстановительный путь описан в культивируемых клетках при гипоксии, дефектах дыхательной цепи, утрате FH или VHL; результат зависит от линии и условий (Metallo и соавт., 2012; Mullen и соавт., 2012; Wise и соавт., 2011 — прочитана аннотация; Dang и соавт., 2009 — аннотация).
ЦТК, катаплероз и анаплероз · шаг 14 из 32Как проследить происхождение углерода и не спутать мечение с потокомПри прослеживании углерода в среду вводят ¹³C-меченый субстрат и по изотопологам продуктов судят, по какому пути превращался углерод. Это определение маршрута при названных условиях, а не измерение величины потока.Меченый субстрат вносят в среду, и атомы ¹³C переходят в продукты реакций.LC–MS разделяет вещества и различает изотопологи по массе; доля изотополога показывает, какая часть молекул содержит n меченых атомов.В первом обороте цикла из [U-¹³C₅]глутамина окислительный путь даёт цитрат M+4, восстановительный — M+5; доля изотополога при этом не равна величине потока.¹³C — стабильный изотоп углерода. Если часть глутамина в среде заменить на универсально меченый [U-¹³C₅]глутамин, во всех его молекулах пять атомов углерода будут ¹³C, и на схеме (панель M02) видно, какие из них сохранятся в продукте. При окислительном превращении α-КГ в сукцинил-CoA один атом ¹³C выделяется в виде CO₂, а немеченый ацетил-CoA добавляет два атома ¹²C, поэтому в первом обороте цикла цитрат содержит четыре меченых атома. Если же α-КГ присоединяет CO₂, не теряя углерода, а источник CO₂ немечен, в цитрате остаются все пять меченых атомов.Вещества извлекают из клеток и анализируют методом LC–MS (на схеме — панель M03): жидкостная хроматография разделяет компоненты смеси по времени удерживания, а масс-спектрометр регистрирует ионы по отношению массы к заряду. Молекулы, различающиеся числом ¹³C, называют изотопологами и обозначают M+n, где n — число меченых атомов. Молекулы с тем же числом ¹³C в разных положениях — изотопомеры; подсчёт M+n их не различает. Доля меченого изотополога — отношение его количества к сумме всех изотопологов соединения после поправки на естественный ¹³C.Доля изотополога не равна потоку. Она зависит от доли ¹³C в источнике, от разведения метки немечеными источниками, от времени мечения и числа оборотов, от обмена изоцитрата и α-КГ. Кроме того, экстракт целых клеток усредняет компартменты. В этом учебном примере показан первый оборот цикла, то есть мечение до установления изотопного стационарного состояния. При количественной интерпретации различают изотопное стационарное состояние и переходное мечение; способ расчёта выбирают с учётом времени мечения и того, находится ли метаболизм в стационарном состоянии (Buescher и соавт., 2015). Поэтому одну и ту же долю M+4 могут дать разные сочетания вклада пути и доли метки, а абсолютный поток требует модели и дополнительных измерений.Типичная ошибка Доля M+5 в цитрате равна скорости восстановительного карбоксилирования.Доля изотополога показывает долю в пуле при заданных условиях, а не скорость; поток требует учёта разведения метки, обмена, времени мечения и модели.Клетки культивировали с [U-¹³C₅]глутамином, остальные источники углерода и CO₂ немечены. В первом обороте цикла обнаружен цитрат M+5. Какой вывод допустим?А. M+5 согласуется с окислительным превращением α-КГ, при котором меченый CO₂ выделяется. (неверный вариант)При окислительном превращении один меченый атом выделяется в виде ¹³CO₂, и в первом обороте образуется цитрат M+4, а не M+5.Б. M+5 согласуется с восстановительным карбоксилированием α-КГ; чистый поток нужно подтверждать отдельно. (верный вариант)Пять атомов ¹³C исходного α-КГ сохраняются, а присоединённый CO₂ немечен, что даёт M+5. Однако M+5 не доказывает чистый поток по этому пути: часть M+5 может возникать при обмене изоцитрат ⇄ α-КГ.В. Доля M+5 в цитрате допускает расчёт скорости потока по этому пути без дополнительной модели. (неверный вариант)Доля изотополога — не скорость: поток требует учёта разведения метки, обмена и модели.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаBuescher J. M. et al. A roadmap for interpreting ¹³C metabolite labeling patterns from cells. Curr Opin Biotechnol. 2015;34:189–201.Metallo C. M. et al. Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia. Nature. 2012;481:380–384.Mullen A. R. et al. Reductive carboxylation supports growth in tumour cells with defective mitochondria. Nature. 2012;481:385–388.Fendt S.-M. et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the α-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nat Commun. 2013;4:2236.Схемы M02 и M03 учебные: значения долей условные и не относятся к реальным клеткам; показан первый оборот цикла при немеченых остальных источниках. Принципы интерпретации мечения приведены по обзору Buescher и соавт. (2015, прочитан полный текст), примеры маршрутов — по работам Metallo, Mullen и Fendt с соавт.
Метаболиты и модификации хроматина · шаг 15 из 32Откуда берётся ацетил-CoA для ацетилирования гистоновВнутренняя мембрана митохондрий не пропускает ацетил-CoA, поэтому его митохондриальный пул отделён от пула в цитозоле и ядре. Вне митохондрий основными источниками ацетил-CoA служат цитрат (фермент ACLY) и ацетат (фермент ACSS2); вклад других путей, в том числе ацетилкарнитина, зависит от клеток.Главный путь выхода ацетильных групп из матрикса: ацетил-CoA конденсируется с оксалоацетатом в цитрат, и цитрат выходит в цитозоль через переносчик SLC25A1. Второй путь проходит через ацетилкарнитин.В цитозоле и ядре ACLY расщепляет цитрат с участием CoA и ATP на ацетил-CoA и оксалоацетат, а ACSS2 образует ацетил-CoA из ацетата, CoA и ATP.Гистонацетилтрансферазы используют ацетил-CoA ядра и цитозоля. Этот пул пополняется цитратом и ацетатом, а по данным отдельных работ также ацетилкарнитином и локальным синтезом в ядре; митохондриальный пул пополняется иначе и с ним напрямую не смешивается.В митохондриях ацетил-CoA образуется при окислении пирувата, жирных кислот и аминокислот и расходуется в ЦТК. Внутренняя мембрана митохондрий не пропускает ацетил-CoA, поэтому ацетильные группы покидают матрикс главным образом в составе цитрата: ацетил-CoA конденсируется с оксалоацетатом, и цитрат выходит через переносчик SLC25A1. Второй путь — через ацетилкарнитин: карнитинацетилтрансфераза (CrAT) переносит ацетильную группу на карнитин, и ацетилкарнитин выходит из митохондрий через переносчик SLC25A20.Вне митохондрий ацетил-CoA образуется двумя основными путями. ACLY в присутствии CoA и ATP расщепляет цитрат на ацетил-CoA и оксалоацетат. ACSS2 присоединяет CoA к ацетату за счёт ATP. Оба фермента обнаружены и в цитозоле, и в ядре. Кроме того, ацетил-CoA из пирувата образует ядерный пируватдегидрогеназный комплекс (Sutendra и соавт., 2014). В клетках мышиной карциномы печени без ACLY и ACSS2 ацетильные группы поступали из митохондрий в виде ацетилкарнитина, а в клетках с ACLY отсутствие CrAT на синтез жирных кислот не влияло (Izzo и соавт., 2023).Вклад путей зависит от клеток и условий. В клетках колоректальной карциномы человека HCT116 при снижении количества ACLY ацетилирование гистонов уменьшалось, а сверхфизиологические концентрации ацетата в среде возвращали ацетилирование гистонов (с участием ACSS2; Wellen и соавт., 2009). В фибробластах мыши (MEF) без ACLY ацетат в концентрации 100 мкМ поддерживал выживание, но не возвращал ацетилирование гистонов, а при 1 мМ ацетилирование повышалось (Zhao и соавт., 2016). В дифференцированных нейрональных клетках мыши ACSS2 расположена преимущественно в ядре, а ACLY — в цитозоле, и подавление ACSS2 снижало ацетилирование гистонов (Mews и соавт., 2017).Из-за разделения пулов содержание ацетил-CoA в митохондриях не определяет, сколько субстрата получают ферменты хроматина. Пулы ядра и цитозоля обмениваются через ядерные поры, но по обзору Sivanand и соавт. (2018) локальный синтез в ядре и поступающий ацетат вносят в ацетилирование гистонов иной вклад, чем в синтез жирных кислот в цитозоле. Содержание ацетил-CoA в ядре измерено в ядерной фракции методом LC–MS с изотопно меченным внутренним стандартом (SILEC-SF; схема LC–MS — в шаге про величины, связывающие метаболизм с модификацией гистона): при дифференцировке адипоцитов оно возрастало примерно в 5 раз вместе с ацетилированием гистонов (Trefely и соавт., 2022). Ацетил-CoA ядра определяет лишь возможность поставить метку: повлияет ли образовавшийся ацетил-лизин на транскрипцию данного гена, зависит от белков, которые его узнают (следующий шаг).Типичная ошибка Если содержание ацетил-CoA в митохондриях увеличилось, то ацетилирование гистонов автоматически возрастает.Ацетил-CoA матрикса не проходит внутреннюю мембрану: ядерно-цитозольный пул образуется из цитрата (ACLY), ацетата (ACSS2) и, по отдельным данным, из пирувата в ядре и ацетилкарнитина. Для вывода об ацетилировании нужны сведения об этих путях и о содержании ацетил-CoA в нужном компартменте, а не только о митохондриях.Содержание ацетил-CoA в митохондриях увеличилось. Почему из этого нельзя автоматически заключить об усилении ацетилирования гистонов?А. Доступность ядерно-цитозольного субстрата зависит от переноса предшественников и локального синтеза. (верный вариант)Внутренняя митохондриальная мембрана разделяет пулы ацетил-CoA; они связаны переносом предшественников (цитрат, ацетилкарнитин), а не самого ацетил-CoA.Б. Гистонацетилтрансферазы используют не ацетил-CoA, а свободный ацетат как донор ацетильной группы. (неверный вариант)Гистонацетилтрансферазы переносят ацетильную группу именно с ацетил-CoA; ацетат служит лишь одним из его предшественников.В. Ацетил-CoA матрикса переносится через внутреннюю мембрану специальным переносчиком и попадает в ядро. (неверный вариант)Внутренняя мембрана не пропускает ацетил-CoA: ацетильные группы покидают матрикс в составе цитрата или ацетилкарнитина.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Wellen K. E. et al. ATP-citrate lyase links cellular metabolism to histone acetylation. Science. 2009;324:1076–1080.Mews P. et al. Acetyl-CoA synthetase regulates histone acetylation and hippocampal memory. Nature. 2017;546:381–386.Sivanand S., Viney I., Wellen K. E. Spatiotemporal control of acetyl-CoA metabolism in chromatin regulation. Trends Biochem Sci. 2018;43:61–74.Zhao S. et al. ATP-citrate lyase controls a glucose-to-acetate metabolic switch. Cell Rep. 2016;17:1037–1052.Sutendra G. et al. A nuclear pyruvate dehydrogenase complex is important for the generation of acetyl-CoA and histone acetylation. Cell. 2014;158:84–97.Trefely S. et al. Quantitative subcellular acyl-CoA analysis reveals distinct nuclear metabolism and isoleucine-dependent histone propionylation. Mol Cell. 2022;82:447–462.Izzo L. T. et al. Acetylcarnitine shuttling links mitochondrial metabolism to histone acetylation and lipogenesis. Sci Adv. 2023;9:eadf0115.Схема качественная: числа не заданы, состояния показывают направление сдвига при прочих равных. Данные об ACLY и ацетате получены на клетках HCT116 (Wellen и соавт., 2009) и на фибробластах мыши MEF (Zhao и соавт., 2016), об ACSS2 — на нейрональных клетках CAD и нейронах мыши (Mews и соавт., 2017), о ядерном ацетил-CoA — на модели дифференцировки адипоцитов (Trefely и соавт., 2022). Ацетилкарнитиновый путь показан на схеме пунктиром, его вклад в клетках с ACLY мал (данные получены на мышиных клетках карциномы печени: Izzo и соавт., 2023). Ядерный пируватдегидрогеназный комплекс (Sutendra и соавт., 2014) на схеме не показан. Объединение пулов ядра и цитозоля в одну стрелку обмена — упрощение.
Метаболиты и модификации хроматина · шаг 16 из 32Как устанавливается и удаляется ацетилирование гистоновГистонацетилтрансфераза переносит ацетильную группу с ацетил-CoA на остаток лизина, а деацетилазы — HDAC и сиртуины — её удаляют. Поэтому доля ацетилированных сайтов определяется соотношением скоростей этих реакций, а не только количеством субстрата.От ацетил-лизина к транскрипции: какие звенья нужны дополнительно. Модель баланса выше описывает только долю ацетилированных сайтов. Эта схема — отдельный фрагмент: на примере BRD4 и P-TEFb она показывает, через какие белки метка может повлиять на транскрипцию и почему результат не гарантирован.Метка: ацетил-CoA и KAT образуют ацетил-лизин. KAT переносит ацетильную группу с ацетил-CoA на ε-аминогруппу лизина гистона, и на нуклеосоме возникает локальная метка — ацетил-лизин. Доля меченых сайтов определяется балансом присоединения и удаления (модель выше). Сама метка транскрипцию ещё не включает: нужен белок, который её узнаёт. Метку удаляют HDAC и сиртуины, поэтому она есть не на всех сайтах и не постоянно.Узнавание: бромодомен BRD4 связывает ацетил-лизин. Бромодомен белка BRD4 связывается с ацетилированным хроматином: у метки появляется «читатель», который удерживается на этом участке. Это химическое узнавание метки белковым доменом, отличное от изменения электростатики нуклеосомы. Бромодомены разных белков различаются по специфичности; BRD4 — лишь один из примеров.Привлечение: BRD4 взаимодействует с P-TEFb. BRD4 взаимодействует с P-TEFb. В изученных клетках это нужно для образования активной формы P-TEFb и его привлечения к промотору, где он контактирует с комплексом Медиатор; до этого часть P-TEFb находится в неактивном комплексе с 7SK и HEXIM1. Привлечение P-TEFb показано для BRD4 в исследованных клетках; для другого читателя или другого гена его нельзя предполагать.Фосфорилирование: CDK9 и переход к элонгации. CDK9 в составе P-TEFb фосфорилирует С-концевой домен РНК-полимеразы II. В изученных системах это способствует переходу полимеразы к продуктивной элонгации и усиливает транскрипцию данного локуса: именно на этом шаге метка приводит к изменению транскрипции. Эффект показан для отдельных генов в изученных системах и не означает усиления транскрипции у каждого гена с ацетилированным хроматином.Когда ацетил-лизин не меняет транскрипцию. Любое звено может не сработать: сайт недоступен для бромодомена, метку уже удалили деацетилазы, на локусе нет BRD4 или другого подходящего читателя, P-TEFb остаётся в неактивном комплексе с 7SK и HEXIM1, а транскрипцию определяют другие факторы промотора и энхансера. Поэтому рост ядерного ацетил-CoA и доли ацетилированных сайтов не гарантирует роста транскрипции заданного гена. Это перечень условий, при которых результат не гарантирован, а не итог отдельного опыта.Условные обозначения: значок показывает компонент, а не измеренное количество. Рамка вокруг значка — компонент, который появился или изменился в этом состоянии; пунктирный значок — компонент в данном состоянии не участвует. Стрелка ↓ означает передачу влияния к следующему уровню, пунктирная полоска у стрелки — звено не срабатывает. Схема отражает один изученный путь, а не общее правило для любого ацетилирования, бромодомена или гена.Гистонацетилтрансфераза переносит ацетильную группу с ацетил-CoA на ε-аминогруппу лизина: образуются ацетил-лизин и CoA, а положительный заряд боковой группы нейтрализуется.HDAC — Zn²⁺-зависимые ферменты, которые гидролизуют амидную связь ацетил-лизина; сиртуины катализируют другую реакцию, для которой необходим NAD⁺.Доля ацетилированных сайтов при постоянстве условий определяется соотношением скоростей присоединения и удаления ацетильной группы и обновлением гистонов. Влияние метки на транскрипцию требует дополнительных звеньев: узнавания ацетил-лизина белком-«читателем» (например, бромодоменом BRD4) и привлечения P-TEFb; оно не вытекает из доли ацетилированных сайтов.Ацетилирование гистона — перенос ацетильной группы с ацетил-CoA на ε-аминогруппу лизина. Реакцию катализирует гистонацетилтрансфераза (HAT, или KAT); кроме ацетил-лизина, образуется свободный CoA. Боковая группа лизина NH₃⁺ несёт положительный заряд, а ацетилированная боковая группа NH–CO–CH₃ заряда не имеет; потеря заряда может менять взаимодействие гистона с ДНК. Кроме того, ацетилированные остатки узнают особые белки, например белки с бромодоменами.Удаляют ацетильную группу деацетилазы двух химических типов. Классические HDAC (классы I, II и IV; в этом шаге под HDAC понимают именно их) — Zn²⁺-зависимые ферменты: они гидролизуют амидную связь и освобождают ацетат (Seto и Yoshida, 2014). Сиртуины (по номенклатуре — класс III) катализируют другую реакцию: ацетильная группа переносится на ADP-рибозу, а из NAD⁺ образуется никотинамид. Поэтому активность сиртуинов зависит от доступности NAD⁺ в соответствующем компартменте и от их сродства к NAD⁺ (см. шаг про отношение NADH/NAD⁺), а HDAC в NAD⁺ не нуждаются. Не все сиртуины действуют на гистоны: SIRT6 деацетилирует H3K9ac в теломерном хроматине (Michishita и соавт., 2008), а многие другие сиртуины действуют на негистоновые белки.Доля ацетилированных сайтов зависит от нескольких реакций сразу. Пусть сайт ацетилируется с константой скорости k₁, в которую входит доступность ацетил-CoA, и деацетилируется с константой k₂ (обе константы псевдопервого порядка и постоянны). Тогда в стационарном состоянии доля ацетилированных сайтов равна k₁/(k₁ + k₂): она растёт и при ускорении присоединения, и при замедлении удаления. В клетках HCT116 ингибитор HDAC трихостатин A подавлял снижение ацетилирования гистонов, вызванное уменьшением количества ACLY (Wellen и соавт., 2009): когда удаление ацетильных групп замедлено, нехватка ацетил-CoA меньше влияет на ацетилирование.Кроме того, гистоны обновляются: при репликации ДНК к родительским гистонам добавляются новые. По данным Alabert и соавт. (2015), модификации новых гистонов в основном устанавливались в течение одного клеточного цикла, а H3K9me3 и H3K27me3 — дольше; эти данные относятся главным образом к метилированию, и переносить их на ацетилирование без отдельной проверки нельзя. Итак, рост доли ацетилированных сайтов сам по себе не доказывает усиления присоединения ацетила: он мог возникнуть при ослаблении удаления. Нельзя также считать ацетилирование сигналом активации всех генов: связь метки с транскрипцией зависит от локуса.Чтобы метка повлияла на транскрипцию, нужны дополнительные звенья, и путей влияния два. Первый — физический: потеря положительного заряда ослабляет электростатическое притяжение участка гистона к отрицательно заряженной ДНК и может изменять взаимодействия внутри нуклеосомы и доступность ДНК; вклад этого эффекта зависит от остатка и контекста и для многих сайтов прямо не показан. Второй — химическое узнавание: ацетил-лизин служит участком связывания для белков с бромодоменами, которые удерживаются на меченом хроматине и приводят к нему другие регуляторы транскрипции. Эти пути не исключают друг друга, но и не обязаны действовать вместе.Один из лучше изученных примеров — BRD4. Его бромодомен связывает ацетилированный хроматин; в клетках млекопитающих BRD4 взаимодействовал через бромодомен с P-TEFb (киназа CDK9 с циклином T), а привлечение P-TEFb к промотору зависело от BRD4 и усиливалось при повышении ацетилирования хроматина (Jang и соавт., 2005). Эти данные относятся к читательской функции BRD4: метка → белок → P-TEFb. Привлечение P-TEFb исследовано и отдельно: в клетках HeLa BRD4 был необходим для образования транскрипционно активной формы P-TEFb, привлекал её к промотору и обеспечивал контакт с комплексом Медиатор, а около половины P-TEFb находилось в неактивном комплексе с РНК 7SK и белком HEXIM1 (Yang и соавт., 2005). CDK9 фосфорилирует С-концевой домен РНК-полимеразы II, и в изученных системах это способствует переходу полимеразы к продуктивной элонгации: повышение содержания BRD4 усиливало такое фосфорилирование и транскрипцию, а его снижение (siRNA) ослабляло (Jang и соавт., 2005).Этот пример нельзя переносить на любое ацетилирование H3 и H4, на все бромодомены и на все гены. Исход зависит от того, доступен ли сайт, какие другие метки и регуляторы находятся на промоторе или энхансере, в каком состоянии находится P-TEFb и не удалили ли деацетилазы метку раньше, чем её узнали. Поэтому увеличение ядерного ацетил-CoA ещё не гарантирует роста транскрипции заданного гена: между меткой и транскрипцией остаются узнавание, привлечение P-TEFb и фосфорилирование РНК-полимеразы II, и каждое из этих звеньев может не сработать. Модель k₁/(k₁ + k₂) выше описывает только долю ацетилированных сайтов, а не экспрессию генов.Типичная ошибка Если доля ацетилированных сайтов гистона возросла, то гистонацетилтрансфераза стала работать быстрее.Доля ацетилированных сайтов зависит от присоединения, удаления и обновления гистонов. Тот же результат даёт замедление удаления при неизменном присоединении, например при подавлении HDAC.Скорость ацетилирования гистона сохранена, а скорость удаления ацетильной группы снижена. Как при прочих равных изменится доля ацетилированных сайтов?А. Возрастёт, поскольку баланс присоединения и удаления ацетила сместится. (верный вариант)Накопление модификации возможно и без ускорения присоединения: достаточно замедлить удаление.Б. Снизится, поскольку избыток ацетилированных сайтов тормозит присоединение ацетила. (неверный вариант)По условию скорость присоединения сохранена; замедление удаления увеличивает, а не уменьшает долю ацетилированных сайтов.В. Не изменится, поскольку доля определяется скоростью присоединения ацетила. (неверный вариант)Доля зависит и от удаления ацетильной группы, и от обновления гистонов.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаWellen K. E. et al. ATP-citrate lyase links cellular metabolism to histone acetylation. Science. 2009;324:1076–1080.Seto E., Yoshida M. Erasers of histone acetylation: the histone deacetylase enzymes. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;6:a018713.Michishita E. et al. SIRT6 is a histone H3 lysine 9 deacetylase that modulates telomeric chromatin. Nature. 2008;452:492–496.Alabert C. et al. Two distinct modes for propagation of histone PTMs across the cell cycle. Genes Dev. 2015;29:585–590.Jang M. K. et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 2005;19:523–534.Yang Z. et al. Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4. Mol Cell. 2005;19:535–545.Схема качественная: числа не заданы, направление изменения указано для одного сайта при прочих равных. Если изменены и присоединение, и удаление, итог зависит от величины сдвигов и на схеме показан как неопределяемый. Влияние ACLY и ингибитора HDAC описано на клетках HCT116 (Wellen и соавт., 2009), деацетилирование H3K9 сиртуином SIRT6 — на теломерном хроматине человека (Michishita и соавт., 2008), обновление гистонов — на культивируемых клетках человека, главным образом для метилирования (Alabert и соавт., 2015). Схема «От метки к транскрипции» качественная: она показывает один изученный путь (BRD4 → P-TEFb → РНК-полимераза II), а не общее правило. Выводы о связывании ацетилированного хроматина бромодоменом BRD4, о его взаимодействии с P-TEFb и о фосфорилировании С-концевого домена РНК-полимеразы II при изменении содержания BRD4 приведены по Jang и соавт. (2005, аннотация); выводы о привлечении P-TEFb к промотору, об активной форме P-TEFb и о контакте с Медиатором — по Yang и соавт. (2005, аннотация; клетки HeLa). Перенос на другие клетки, сайты гистонов и гены не показан.
Метаболиты и модификации хроматина · шаг 17 из 32Как обмен метионина связан с переносом метильных группS-аденозилметионин (SAM) образуется из метионина и ATP ферментом MAT и служит донором метильной группы для метилтрансфераз. После переноса метильной группы остаётся S-аденозилгомоцистеин (SAH), который может тормозить метилтрансферазу.MAT присоединяет аденозильную группу ATP к атому серы метионина и образует SAM; из ATP при этом освобождаются фосфат и пирофосфат.Метилтрансфераза переносит метильную группу с SAM на субстрат, например на лизин гистона; SAM превращается в SAH, который у многих метилтрансфераз связывается в активном центре и конкурирует с SAM.SAH гидролизуется до гомоцистеина и аденозина, а гомоцистеин превращается в метионин: метионинсинтазой (кофермент — производное витамина B₁₂, донор метильной группы — 5-метилтетрагидрофолат) или, в печени и почках, бетаин-гомоцистеин-метилтрансферазой.Метионин служит источником метильных групп не сам по себе, а после активации. Метионинаденозилтрансфераза (MAT) переносит аденозильную группу ATP на атом серы метионина и образует SAM — соединение с сульфониевым центром, легко отдающее метильную группу. SAM служит донором метильной группы при метилировании гистонов, ДНК, РНК и малых молекул; по обзору Ducker и Rabinowitz (2017), среди используемых ферментами молекул SAM по распространённости уступает только ATP.Метилтрансфераза катализирует реакцию: SAM + субстрат → SAH + метилированный субстрат. У многих метилтрансфераз SAH связывается в активном центре и конкурирует с SAM, поэтому скорость метилирования зависит и от содержания SAM, и от содержания SAH. SAH гидролизуется аденозилгомоцистеиназой (AHCY) до гомоцистеина и аденозина; реакция обратима, поэтому при накоплении гомоцистеина и аденозина растёт и содержание SAH. Гомоцистеин превращается в метионин метионинсинтазой (MTR): её кофермент, производное витамина B₁₂, принимает метильную группу от 5-метилтетрагидрофолата (5-метил-ТГФ), а в печени и почках гомоцистеин метилирует также бетаин-гомоцистеин-метилтрансфераза (BHMT), для которой донором служит бетаин. Так метиониновый цикл связан с обменом фолатов; метильные группы 5-метил-ТГФ происходят из одноуглеродного обмена (см. шаг про поступление углерода глюкозы в биосинтез), но выраженность этой связи зависит от клеток и условий. Метилирование цитозина в ДНК (образование 5mC) катализируют ДНК-метилтрансферазы (DNMT), также использующие SAM; окисление 5mC — в шаге про диоксигеназы.SAM можно рассматривать двояко. Как косубстрат конкретной реакции он расходуется в каждом каталитическом цикле, и скорость реакции зависит от его концентрации вблизи фермента. Под «метильным пулом» клетки понимают суммарное содержание SAM; оно зависит от синтеза SAM из метионина, от его расхода в реакциях метилирования и от реметилирования гомоцистеина. Изменение суммарного содержания SAM неодинаково сказывается на разных реакциях, потому что ферменты различаются по сродству к SAM и по чувствительности к SAH.В клетках HCT116 при снижении концентрации метионина в среде до 3 мкМ в течение 24 ч уменьшалось содержание и SAM, и SAH, а метилирование гистона H3 по нескольким лизинам снижалось; после возвращения метионина метилирование возвращалось к исходному уровню (Mentch и соавт., 2015). Отношение SAM/SAH не служит универсальным порогом: значение имеют концентрации SAM и SAH, их локализация и свойства фермента.Типичная ошибка Пока SAM доступен, метилтрансфераза работает с прежней скоростью.Продукт реакции SAH связывается с метилтрансферазой и конкурирует с SAM при сохранённом содержании SAM. Скорость зависит от концентраций SAM и SAH вблизи фермента и от его свойств, а не только от содержания SAM.Содержание SAM остаётся прежним, а SAH в ядре накапливается. Как при прочих равных изменится скорость метилирования лизина гистона метилтрансферазой, чувствительной к SAH?А. Скорость возрастёт, поскольку SAH служит вторым донором метильной группы. (неверный вариант)В этой реакции донор — SAM, а SAH является продуктом.Б. Скорость не изменится, поскольку содержание SAM осталось прежним. (неверный вариант)SAH конкурирует с SAM за активный центр, поэтому скорость снижается и при прежнем содержании SAM.В. Скорость снизится, поскольку фермент тормозится продуктом реакции — SAH. (верный вариант)Сохранение донора метильной группы не устраняет действие SAH.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMentch S. J. et al. Histone Methylation Dynamics and Gene Regulation Occur through the Sensing of One-Carbon Metabolism. Cell Metab. 2015;22:861–873.Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Ducker G. S., Rabinowitz J. D. One-carbon metabolism in health and disease. Cell Metab. 2017;25:27–42.Схема качественная: концентраций и числовых порогов на ней нет. Зависимость метилирования гистонов от метионина, SAM и SAH показана на клетках HCT116 и в печени мышей на диете с ограничением метионина, где снижались SAM, SAH и H3K4me3 при неизменном содержании метионина в печени (Mentch и соавт., 2015); для других клеток и ферментов она может быть иной. Компартменты показаны условно: в цитируемой работе измерено содержание в клетке целиком.
Метаболиты и модификации хроматина · шаг 18 из 32Почему разные модификации гистонов изменяются неодинаковоЗапись H3K4me3 означает гистон H3, лизин в положении 4 и три метильные группы; для H3K9me3 это лизин в положении 9. Эти метки устанавливают и удаляют разные ферменты, поэтому при ограничении общего донора (SAM) их содержание может изменяться неодинаково.Метилтрансферазы KMT2 (для H3K4) и KMT1A/B (для H3K9) переносят метильные группы с SAM на лизин; у каждой метки свои ферменты установления.Деметилазы JmjC KDM5 (для H3K4me3) и KDM4 (для H3K9me3 и H3K9me2) снижают степень метилирования на одну ступень; для этого им нужны α-КГ, O₂ и Fe(II), а не SAM.Доля сайтов с меткой в области генома определяется балансом скоростей установления и удаления метки, а также обновлением нуклеосом; SAM нужен для установления метки, но не для её удаления деметилазами JmjC.H3K4me3 сильно обогащена вблизи старта транскрипции и найдена как на активных, так и на неактивных промоторах, в том числе у генов, которые могут активироваться (Black и соавт., 2012). H3K9me3 характерна для ряда областей гетерохроматина. Эти ассоциации не означают, что метка сама достаточна для активации или репрессии гена. Как и в случае ацетил-лизина (шаг про ацетилирование), влияние метки на транскрипцию зависит от того, какие белки узнают её на данном локусе, и не вытекает из самого наличия метки.У этих меток разные ферменты. KMT1A и KMT1B (SUV39H1/2) триметилируют H3K9 из состояния H3K9me1. Очищенная KMT2A (MLL1) образует H3K4me2, а в комплексе со своими партнёрами триметилирует H3K4; H3K4me3 в клетках создают и комплексы с SETD1A/B (Wu и соавт., 2008). Удаляют метки деметилазы JmjC: KDM4 снимает H3K9me3 и H3K9me2, но не H3K9me1, а деметилазы KDM5 снимают H3K4me3 (Klose и соавт., 2007). FAD-зависимая LSD1 (KDM1A) к JmjC не относится и удаляет метильные группы с H3K4me2 и H3K4me1 (Black и соавт., 2012); в комплексе с рецептором андрогенов она действует на H3K9me1 и H3K9me2, но не на H3K9me3 (Metzger и соавт., 2005). Метилтрансферазы, о которых идёт речь, используют SAM, а деметилазы JmjC — α-КГ (см. шаг про диоксигеназы).Скорость установления метки зависит от сродства фермента к SAM, от торможения продуктом SAH и от доступа к нужному участку хроматина. Скорость удаления зависит от деметилазы и её косубстратов, а на долю метки влияют также обновление нуклеосом и репликация. Поэтому уменьшение содержания общего донора метильных групп не приводит к одинаковому снижению разных меток.В клетках HCT116 при ограничении метионина (24 ч) снижалось триметилирование лизинов 4, 9 и 27 гистона H3, и наибольшим было снижение H3K4me3. Оно проявлялось уже при 10–25 мкМ метионина, когда изменялись содержание SAM и SAH (Mentch и соавт., 2015); наиболее сильное ограничение (3 мкМ) приведено в шаге про метиониновый цикл. Снижение H3K4me3 при ограничении метионина наблюдали в каждой из шести проверенных линий. Авторы допускают, что чувствительность определяют кинетические свойства метилтрансфераз, в частности сродство к SAM, но причина большего снижения H3K4me3 в работе не установлена.Типичная ошибка Если H3K4me3 снизилась сильнее других меток, то так будет в любых клетках, и причина состоит в меньшей стабильности этой метки.Относительная чувствительность показана в конкретных условиях. Её причина в работе не установлена: возможны разные объяснения, и каждое требует отдельной проверки; без отдельной проверки переносить результат на другие клетки и метки нельзя.После ограничения метионина H3K4me3 уменьшилась сильнее H3K9me3. Какой механизм допускает такой результат?А. Обе метки изменяются одинаково, поскольку метилтрансферазам обеих нужен SAM. (неверный вариант)Общий донор не устраняет различия ферментов и скоростей удаления.Б. Различаются кинетика ферментов этих меток и скорость обновления самих меток. (верный вариант)Общий метаболит может по-разному ограничивать разные реакции.В. Деметилазы JmjC используют SAM, поэтому удаление H3K4me3 зависит от него сильнее. (неверный вариант)Деметилазы JmjC используют α-КГ, O₂ и Fe(II), а не SAM.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаMentch S. J. et al. Histone Methylation Dynamics and Gene Regulation Occur through the Sensing of One-Carbon Metabolism. Cell Metab. 2015;22:861–873.Black J. C., Van Rechem C., Whetstine J. R. Histone lysine methylation dynamics: establishment, regulation, and biological impact. Mol Cell. 2012;48:491–507.Metzger E. et al. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen-receptor-dependent transcription. Nature. 2005;437:436–439.Klose R. J. et al. The retinoblastoma binding protein RBP2 is an H3K4 demethylase. Cell. 2007;128:889–900.Wu M. et al. Molecular regulation of H3K4 trimethylation by Wdr82, a component of human Set1/COMPASS. Mol Cell Biol. 2008;28:7337–7344.Схема качественная; различие параметров ферментов принято в ней как допущение, чтобы показать механизм. Данные о метионине получены на клетках человека при ограничении метионина в среде на 24 ч (Mentch и соавт., 2015). Связь метки с активностью генов ассоциативна.
Метаболиты и модификации хроматина · шаг 19 из 32Как α-кетоглутарат участвует в удалении метильных модификацийα-Кетоглутарат (α-КГ, 2-оксоглутарат) служит косубстратом Fe(II)- и O₂-зависимых диоксигеназ и в каждой реакции превращается в сукцинат и CO₂. К этим ферментам относятся JmjC-деметилазы гистонов и белки TET, окисляющие 5-метилцитозин (5mC) в ДНК.Диоксигеназа связывает Fe(II), α-КГ и субстрат; α-КГ декарбоксилируется до сукцината и CO₂, а один атом кислорода из O₂ переходит в субстрат.JmjC-деметилаза окисляет метильную группу лизина, которая отщепляется в виде формальдегида; степень метилирования снижается на одну ступень, например с me3 до me2.Белки TET окисляют 5mC до 5hmC, затем до 5-формилцитозина (5fC) и 5-карбоксилцитозина (5caC); в клетках немодифицированный цитозин образуется прежде всего после вырезания основания с репарацией, а метка может убывать и при разбавлении репликацией.У диоксигеназ три компонента, которые не следует смешивать. α-КГ и O₂ — косубстраты: в каждом цикле реакции они расходуются, и α-КГ превращается в сукцинат и CO₂. Fe(II) — кофактор: он удерживается в активном центре и не расходуется. Активность этих ферментов зависит от доступности α-КГ и O₂ в ядре, от содержания Fe(II) и от соединений, конкурирующих с α-КГ (см. шаг про нарушения SDH, FH и IDH). α-КГ — другое название 2-оксоглутарата; 2-гидроксиглутарат — другое соединение.JmjC-деметилазы удаляют метильные группы лизинов гистонов окислением: метильная группа гидроксилируется и отщепляется в виде формальдегида. Степень метилирования при этом снижается на одну ступень: KDM4 переводит H3K9me3 в H3K9me2 и далее в H3K9me1, но H3K9me1 не удаляет (Black и соавт., 2012). Не все деметилазы гистонов относятся к семейству JmjC: FAD-зависимая LSD1 работает без α-КГ.Белки TET окисляют 5mC последовательно: 5mC → 5hmC → 5fC → 5caC. Превращение 5mC в 5hmC белком TET1 показано в клетках и in vitro (Tahiliani и соавт., 2009), а окисление до 5fC и 5caC — на очищенных TET1–3 in vitro, в клетках с TET2 и в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши (Ito и соавт., 2011). Ни одна из этих реакций не возвращает немодифицированный цитозин. Тимин-ДНК-гликозилаза (TDG) вырезает основания 5fC и 5caC, после чего эксцизионная репарация оснований (BER) вставляет на их место немодифицированный цитозин (He и соавт., 2011; Maiti и Drohat, 2011); прямое декарбоксилирование 5caC предполагали, но фермент не найден (Ito и соавт., 2011). Отдельный путь — пассивное разбавление при репликации: в новой цепи 5hmC и продукты его окисления не поддерживаются DNMT1-зависимым метилированием, и метка в дочерней ДНК убывает. Поэтому снижение содержания 5mC само по себе не доказывает работу TET.Типичная ошибка Одна реакция TET или JmjC полностью удаляет метку: метилированный лизин сразу становится лизином, а 5mC — цитозином.JmjC-деметилаза снижает степень метилирования лизина на одну ступень. TET окисляет 5mC последовательно до 5hmC, 5fC и 5caC; цитозин образуется прежде всего после вырезания основания (TDG) и репарации либо при разбавлении метки репликацией.Активность TET снижена, а доступность 5mC, α-КГ, O₂ и Fe(II) не изменилась. Как изменится скорость образования 5hmC из 5mC?А. Не изменится: 5hmC образуется при метилировании цитозина без участия TET. (неверный вариант)Метилирование цитозина даёт 5mC, а 5hmC — продукт окисления 5mC.Б. Снизится, поскольку 5hmC образуется при окислении 5mC белками TET. (верный вариант)При этих условиях снижение активности TET уменьшает скорость окисления 5mC до 5hmC. Содержание 5hmC зависит ещё от его дальнейшего окисления и разбавления при репликации.В. Возрастёт, поскольку TET превращают 5hmC обратно в 5mC. (неверный вариант)TET окисляют 5mC и его производные; обратного превращения 5hmC в 5mC они не катализируют.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаBlack J. C., Van Rechem C., Whetstine J. R. Histone lysine methylation dynamics: establishment, regulation, and biological impact. Mol Cell. 2012;48:491–507.Tahiliani M. et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 2009;324:930–935.Ito S. et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 2011;333:1300–1303.He Y.-F. et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 2011;333:1303–1307.Maiti A., Drohat A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. J Biol Chem. 2011;286:35334–35338.Схема качественная: скорости и концентрации на ней не заданы. Окисление 5mC показано для TET1 в клетках и in vitro, для TET1–3 in vitro и в клетках с TET2 (Tahiliani и соавт., 2009; Ito и соавт., 2011); доли 5hmC, 5fC и 5caC в разных тканях различаются и здесь не рассматриваются.
Метаболиты и модификации хроматина · шаг 20 из 32Как нарушения SDH, FH и IDH по-разному меняют метаболитыПотеря сукцинатдегидрогеназы (SDH) ведёт к накоплению сукцината, потеря фумаразы (FH) — к накоплению фумарата, а мутация IDH1 R132H — к образованию R-2-гидроксиглутарата (R-2-HG). Эти метаболиты образуются разными путями, но каждый может тормозить α-КГ-зависимые диоксигеназы.SDH окисляет сукцинат до фумарата, а FH гидратирует фумарат до малата; при потере SDH накапливается сукцинат, при потере FH — фумарат.Мутантная IDH1 R132H утрачивает способность катализировать реакцию изоцитрат → α-КГ и приобретает неоморфную активность: NADPH-зависимое восстановление α-КГ до R-2-HG.Сукцинат, фумарат и 2-гидроксиглутарат (2-HG) структурно сходны с α-КГ и конкурируют с ним за активный центр α-КГ-зависимых диоксигеназ, в том числе JmjC-деметилаз и белков TET; эффект зависит от фермента, изомера и концентрации.При потере SDH сукцинат не окисляется до фумарата и накапливается; при потере FH накапливается фумарат. Для обоих метаболитов показано конкурентное ингибирование α-КГ-зависимых деметилаз гистонов и ДНК (Xiao и соавт., 2012). Первичные дефекты при этом разные: при потере SDH или FH нарушена реакция ЦТК, а мутантная IDH1 приобретает новую реакцию.Мутации IDH1 по остатку R132 не сводятся к потере функции. На очищенном рекомбинантном ферменте и в лизатах клеток 293T IDH1 R132H утрачивал способность превращать изоцитрат в α-КГ и приобретал способность восстанавливать α-КГ до R-2-HG с расходом NADPH. В линиях глиобластомы человека U87MG и LN-18 с исходно немутантной IDH1 экспрессия R132H приводила к накоплению 2-HG, углерод которого происходил из глутамина. В образцах глиом измеряли только содержание 2-HG: в опухолях с мутациями R132 оно составляло 5–35 мкмоль на 1 г ткани, более чем в 100 раз выше, чем в опухолях без мутаций (12 мутантных и 10 немутантных образцов; Dang и соавт., 2009). α-КГ и 2-HG — разные соединения: у 2-HG при втором атоме углерода вместо кетогруппы находится гидроксильная группа.Действие 2-HG на разные ферменты различается. По более ранним биохимическим данным, на которые ссылаются Losman и соавт. (2013), оба энантиомера тормозят ряд α-КГ-зависимых ферментов, S-2-HG сильнее тормозит TET2, а на пролилгидроксилазы EglN энантиомеры действуют противоположно. В клетках эритролейкоза человека TF-1 мутантная IDH1 и R-2-HG, но не S-2-HG, вызывали независимость от цитокинов и блок дифференцировки, а в мышиных клетках SCF ER-Hoxb8 — блок дифференцировки, хотя TET2 сильнее тормозит S-2-HG; авторы объясняют это различным действием энантиомеров на EglN. Когда из среды убирали проникающий в клетку эфир R-2-HG, способность клеток дифференцироваться быстро возвращалась, а возврат зависимости от цитокинов требовал тем больше времени, чем выше были доза и длительность прежнего воздействия. Модификации хроматина в этой работе не измеряли, поэтому по ней нельзя судить о скорости возврата меток.Сходный итог для хроматина, например повышенное метилирование H3K9, может возникать при разных первичных дефектах. По состоянию метки нельзя судить, какой метаболит накопился, а по накоплению метаболита — какие ферменты заторможены в данной клетке.Типичная ошибка Мутантная IDH1 просто накапливает α-КГ, а потеря SDH, потеря FH и мутация IDH1 одинаково влияют на хроматин.α-КГ и 2-HG — разные соединения: мутантная IDH1 образует R-2-HG из α-КГ. Сукцинат, фумарат и R-2-HG возникают разными путями, а их действие на диоксигеназы зависит от фермента, изомера и концентрации.В двух клеточных линиях содержание H3K9me3 повышено сходно. В одной утрачена активность SDH, в другой присутствует мутантная IDH1 R132H. Какие первичные метаболические изменения ожидаются?А. В первой накапливается сукцинат, во второй образуется R-2-HG. (верный вариант)Сходный результат для хроматина может возникать через разные метаболиты.Б. В обеих накапливается α-КГ, поскольку 2-HG — другое название α-КГ. (неверный вариант)α-КГ — 2-оксоглутарат; 2-гидроксиглутарат является другим соединением.В. В обеих накапливается сукцинат, поскольку оба нарушения затрагивают ЦТК. (неверный вариант)SDH окисляет сукцинат, а мутантная IDH1 R132H непосредственно образует R-2-HG. Наличие мутации IDH1 само по себе не позволяет заключить о накоплении сукцината.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаXiao M. et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes Dev. 2012;26:1326–1338.Dang L. et al. Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate. Nature. 2009;462:739–744.Losman J. A. et al. (R)-2-hydroxyglutarate is sufficient to promote leukemogenesis and its effects are reversible. Science. 2013;339:1621–1625.Данные об R-2-HG получены на очищенном рекомбинантном ферменте, лизатах клеток 293T, трансфицированных линиях глиобластомы U87MG и LN-18 и образцах глиом (Dang и соавт., 2009), а также на клетках эритролейкоза человека TF-1 и мышиных клетках SCF ER-Hoxb8 (Losman и соавт., 2013; сравнение R- и S-2-HG по силе действия на TET2 приведено в этой работе по более ранним биохимическим данным); для сукцината и фумарата приведены выводы работы Xiao и соавт. (2012) без числовых данных. Схема качественная, пороговых концентраций на ней нет.
Метаболиты и модификации хроматина · шаг 21 из 32Какие величины связывают изменение метаболизма с модификацией гистонаСодержание метаболита, доля модифицированного гистона и транскрипция гена — разные величины, и каждую измеряют отдельным способом. Здесь рассмотрено, какие величины определяют методы LC–MS и иммуноблот и какие остаются неизмеренными; на схеме ниже эти методы показаны по режимам.При LC–MS (на схеме — режим «LC–MS: метаболит») метаболиты разделяют по времени удерживания, определяют по отношению массы к заряду и после калибровки и учёта внутреннего стандарта получают количество метаболита в экстракте; экстракт целых клеток не разделяет компартменты.При иммуноблоте (на схеме — режим «Иммуноблот: H3K9ac») сигнал антитела к модификации сравнивают с сигналом общего гистона H3 в линейном диапазоне регистрации; отношение показывает относительное изменение доли модифицированного гистона.Ни один из этих методов не указывает положение модификации в геноме и не измеряет транскрипцию; 5hmC в ДНК определяют отдельным дот-блотом с контролем количества ДНК (на схеме — режим «Дот-блот: 5hmC»).Содержание метаболита определяют методом LC–MS (на схеме — режим «LC–MS: метаболит»). Принцип метода описан в шаге про прослеживание углерода. Площадь пика не равна количеству вещества: её связывают с ним калибровкой, а потери при экстракции учитывают внутренним стандартом, добавленным до экстракции. Экстракт целых клеток не разделяет компартменты, и по нему нельзя судить о содержании ацетил-CoA или SAM именно в ядре; ядерный ацетил-CoA измеряли в ядерной фракции с меченым внутренним стандартом (SILEC-SF; Trefely и соавт., 2022). Более 300 метаболитов в клетках HCT116 при ограничении метионина Mentch и соавт. (2015) измеряли в экстрактах целых клеток.Модификацию гистона определяют иммуноблотом (на схеме — режим «Иммуноблот: H3K9ac»): белки разделяют электрофорезом, переносят на мембрану и выявляют антителом к модификации и антителом к общему H3. Сигнал модификации зависит и от количества гистона в дорожке, и от доли модифицированных молекул, поэтому его сравнивают с сигналом общего H3 в линейном диапазоне регистрации. Антитело должно быть специфичным: при проверке около 200 антител к 57 модификациям гистонов более 25 % не прошли тесты на специфичность (Egelhofer и соавт., 2011).Для 5hmC в ДНК применяют дот-блот (на схеме — режим «Дот-блот: 5hmC»): ДНК наносят на мембрану точками и нормируют сигнал антитела к 5hmC на количество ДНК, а не на белок H3. Ни иммуноблот, ни дот-блот не показывают положение модификации в геноме и не измеряют транскрипцию. Модификацию гистонов на определённом участке генома выявляют иммунопреципитацией хроматина (ChIP; на схеме — режим «ChIP: метка у промотора»): фрагменты хроматина с модифицированным гистоном осаждают антителом к модификации, а количество ДНК выбранного участка в осадке определяют количественной ПЦР и выражают долей от входной ДНК. Каждый из этих методов измеряет свою величину, поэтому связь метаболита, доли метки и работы гена требует отдельных измерений. Так, по Wellen и соавт. (2009), подавление ATP-цитратлиазы (ACLY) снижало ацетилирование гистонов в клетках HCT116. В адипоцитах 3T3-L1 оно снижало экспрессию генов Glut4, HK2, PFK-1 и LDHA, которую возвращал ацетат. Ацетилирование гистонов H3 и H4 на промоторе Glut4 определяли методом ChIP: при подавлении ACLY оно снижалось, а ацетат его возвращал.Типичная ошибка Содержание метаболита, измеренное в экстракте клеток, показывает его концентрацию в ядре, где работают ферменты модификации хроматина.Экстракт целых клеток не разделяет компартменты, а площадь пика соответствует количеству только после калибровки и учёта внутреннего стандарта. Содержание метаболита в ядре и изменение метки на конкретном участке хроматина требуют отдельных измерений.После воздействия сигнал H3K9ac уменьшился вдвое, а сигнал общего H3 тоже уменьшился вдвое. Что можно заключить по этим полосам о доле ацетилированного H3?А. По этим полосам доля H3K9ac не изменилась: отношение к общему H3 осталось прежним. (верный вариант)При линейной регистрации одинаковое уменьшение обеих полос не доказывает изменения доли.Б. Доля снизилась вдвое: сигнал H3K9ac стал вдвое слабее, чем в контроле. (неверный вариант)Сигнал зависит и от количества загруженного гистона.В. Долю иммуноблотом оценить нельзя: метод показывает лишь наличие модификации. (неверный вариант)Сравнение сигнала модификации с сигналом общего H3 позволяет оценить долю модифицированного гистона.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаWellen K. E. et al. ATP-citrate lyase links cellular metabolism to histone acetylation. Science. 2009;324:1076–1080.Mentch S. J. et al. Histone Methylation Dynamics and Gene Regulation Occur through the Sensing of One-Carbon Metabolism. Cell Metab. 2015;22:861–873.Egelhofer T. A. et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 2011;18:91–93.Trefely S. et al. Quantitative subcellular acyl-CoA analysis reveals distinct nuclear metabolism and isoleucine-dependent histone propionylation. Mol Cell. 2022;82:447–462.Схема учебная: площади пиков, сигналы полос и точек даны в условных единицах и не взяты из эксперимента. Результаты Mentch и соавт. (2015) получены на клетках HCT116 при ограничении метионина, результаты Wellen и соавт. (2009) — на клетках HCT116 и адипоцитах 3T3-L1 при подавлении ATP-цитратлиазы (полный текст), данные Trefely и соавт. (2022) — на субклеточных фракциях клеток, а данные Egelhofer и соавт. (2011) относятся к проверке антител к модификациям гистонов. В эксперименте ChIP Wellen и соавт. (2009) использовали адипоциты 3T3-L1, антитела к ацетилированным H3 и H4 и контрольную геномную последовательность; IgG на схеме — общий контроль метода, а высота столбцов условная.
NADH/NAD⁺, сигнальное окисление и повреждение · шаг 22 из 32Что означает отношение NADH/NAD⁺ в конкретном компартментеОтношение NADH/NAD⁺ — частное содержаний восстановленной и окисленной форм кофермента в одном компартменте. Оно не задаёт ни общее количество кофермента, ни универсальную норму для клетки.NAD⁺ принимает от субстрата гидрид-ион и превращается в NADH, а в обратной реакции NADH отдаёт электроны акцептору.Отношение форм описывает окислительно-восстановительное состояние пары, а сумма NAD⁺ и NADH — размер пула; при одном отношении пул может быть разным.Мембраны свободно не пропускают NAD(H), поэтому у цитозоля и матрикса отдельные пулы и свои отношения форм; электроны между ними переносят челночные системы.Никотинамидадениндинуклеотид существует в окисленной (NAD⁺) и восстановленной (NADH) формах. В реакциях дегидрогеназ NAD⁺ принимает от субстрата гидрид-ион, то есть два электрона и протон, и превращается в NADH; в обратной реакции NADH отдаёт эти электроны акцептору, как в реакции лактатдегидрогеназы (см. шаг про образование лактата). Частное содержаний двух форм, отношение NADH/NAD⁺, характеризует окислительно-восстановительное состояние пары, а сумма NAD⁺ и NADH составляет общий пул.Отношение и пул — разные величины. Рассмотрим два состояния с одинаковым отношением 0,1 (учебные значения). В первом пул равен 110 условным единицам: 100 приходится на NAD⁺ и 10 на NADH. Во втором пул вдвое меньше, 55 единиц: 50 на NAD⁺ и 5 на NADH. Отношение прежнее, а количество NAD⁺ уменьшилось вдвое. Отношение NADH/NAD⁺ не равно доле NADH в пуле: в первом состоянии она составляет 10/110, то есть около 0,09.Отношение определяют для конкретного компартмента. Внутренняя мембрана митохондрий свободно не пропускает NAD(H) и NADP(H), а электроны между цитозолем и митохондриями передают многоступенчатые челночные системы (Lewis и соавт., 2014). Для самого NAD⁺ описан митохондриальный переносчик SLC25A51 (Luongo и соавт., 2020), так что обмен NAD⁺ между компартментами возможен, но у цитозоля и матрикса остаются отдельные пулы и свои отношения форм, и значение для одного компартмента нельзя переносить на другой или на клетку в целом.Результат зависит и от того, какую форму кофермента измеряют: свободную или связанную с белками. Часть кофермента связана с белками, причём NADH — в большей степени, чем NAD⁺, поэтому отношение суммарных форм в образце может намного превышать отношение свободных форм в живой клетке (Hung и соавт., 2011; измерение свободных форм сенсорами показано в шаге про сенсоры NADH/NAD⁺ и H₂O₂). Отношение меняется при реакциях образования и окисления NADH, а размер пула — при синтезе кофермента из предшественников и при его расходовании ферментами, не окисляющими NADH. К ним относятся сиртуины и PARP: они используют NAD⁺ как субстрат, а концентрация свободного NAD⁺ в компартментах близка к константам Михаэлиса этих ферментов (Cambronne и соавт., 2016). Универсальной нормы NADH/NAD⁺ нет: значение зависит от типа клеток, компартмента и способа измерения.Типичная ошибка Если отношение NADH/NAD⁺ не изменилось, то и количество NAD⁺ осталось прежним.Отношение двух форм не задаёт размер пула. При том же отношении общее количество кофермента, а с ним и количество NAD⁺, может быть другим.В обоих состояниях NADH/NAD⁺ = 1/4, но общий пул во втором состоянии втрое меньше. Как соотносятся количества NAD⁺ в этих состояниях?А. Количество NAD⁺ в состояниях одинаково, поскольку отношение форм не изменилось. (неверный вариант)Отношение не задаёт абсолютное количество кофермента: при том же отношении оно зависит от размера пула.Б. Во втором состоянии NAD⁺ втрое меньше, хотя отношение форм одинаково. (верный вариант)При неизменном отношении уменьшение общего пула во столько же раз уменьшает обе формы.В. Во втором состоянии NAD⁺ в четыре раза меньше, поскольку NADH/NAD⁺ = 1/4. (неверный вариант)Отношение форм не задаёт, во сколько раз меняется количество NAD⁺: оно уменьшается во столько же раз, во сколько уменьшен пул.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаLewis C. A. et al. Tracing compartmentalized NADPH metabolism in the cytosol and mitochondria of mammalian cells. Mol Cell. 2014;55:253–263.Hung Y. P. et al. Imaging Cytosolic NADH–NAD⁺ Redox State with a Genetically Encoded Fluorescent Biosensor. Cell Metab. 2011;14:545–554.Cambronne X. A. et al. Biosensor reveals multiple sources for mitochondrial NAD⁺. Science. 2016;352:1474–1477.Luongo T. S. et al. SLC25A51 is a mammalian mitochondrial NAD⁺ transporter. Nature. 2020;588:174–179.Схема — расчёт по заданным учебным значениям: отношения, размеры пула и доли связанных форм не взяты из эксперимента и не являются нормой. Раздельность пулов описана в работе Lewis и соавт. (2014), а более сильное связывание NADH белками — в работе Hung и соавт. (2011); обе прочитаны в полном тексте. Близость содержания свободного NAD⁺ к константам Михаэлиса сиртуинов и PARP — по аннотации работы Cambronne и соавт. (2016); переносчик SLC25A51 — по аннотации работы Luongo и соавт. (2020). Синтез NAD⁺ из предшественников — общепринятое положение без отдельного прочитанного источника.
NADH/NAD⁺, сигнальное окисление и повреждение · шаг 23 из 32От чего зависит образование супероксида в митохондрияхВ дыхательной цепи электроны в основном передаются O₂ в комплексе IV с образованием воды, но при переносе одного электрона на O₂ на других участках цепи возникает супероксид-анион-радикал. Скорость его образования зависит от участка цепи и состояния переносчиков, а не от одного отношения NADH/NAD⁺.Присоединение одного электрона к O₂ даёт супероксид; скорость этой побочной реакции определяют доля восстановленного донора в данном участке и содержание O₂.На флавине FMN комплекса I супероксид образуется при высоком NADH/NAD⁺ в матриксе; при обратном переносе электронов от восстановленного Q-пула место его образования остаётся предметом обсуждения (флавин или участок связывания Q).Комплекс I сопрягает перенос электронов и протонов: при восстановленном Q-пуле и высокой Δp энергия протонов, возвращающихся в матрикс, может обеспечить перенос электронов от QH₂ к NAD⁺ (RET). Небольшое снижение Δp резко подавляет RET, поэтому одинаковое отношение NADH/NAD⁺ не гарантирует одинаковой скорости образования супероксида.В дыхательной цепи O₂ в основном восстанавливается до воды: в комплексе IV он принимает четыре электрона. Супероксид (O₂•⁻) возникает в побочной реакции, когда восстановленный переносчик, например флавин, отдаёт молекуле O₂ один электрон. Супероксид относится к активным формам кислорода (АФК). В матриксе он быстро превращается в H₂O₂ ферментативно (см. шаг про удаление H₂O₂), поэтому его содержание мало, и рассматривают прежде всего скорость его образования.Первый источник — флавин FMN комплекса I. Электроны от NADH поступают на FMN, и доля полностью восстановленного FMN определяется отношением NADH/NAD⁺ в матриксе. Если это отношение высоко, например при нарушении цепи, скорость образования супероксида на FMN возрастает; протондвижущая сила влияет на это образование лишь косвенно, через потребление NADH и степень восстановленности переносчиков (Murphy, 2009).Второй источник — обратный перенос электронов (RET). Чтобы понять, за счёт чего он возможен, нужно учесть, что комплекс I сопрягает два процесса: окислительно-восстановительную реакцию между NADH и Q и перенос протонов через внутреннюю мембрану. При обычном дыхании энергия, освобождаемая при переносе электронов от NADH к Q, расходуется на перенос протонов из матрикса в межмембранное пространство против градиента, и комплекс I вносит вклад в протондвижущую силу (Δp) (Wikström и соавт., 2023). Это сопряжение обратимо: если Q-пул сильно восстановлен (велика доля QH₂), а Δp высока, протоны могут возвращаться в матрикс через комплекс I по градиенту, и освобождающаяся энергия тратится на реакцию, идущую против привычного направления: электроны от QH₂ переходят через железосерные центры к флавину FMN и далее на NAD⁺, который восстанавливается до NADH (Murphy, 2009; Pryde и Hirst, 2011). Протоны при этом не сталкиваются с электронами и не толкают их: энергию градиента передаёт сопряжение внутри белкового комплекса, и детали этого сопряжения остаются предметом структурных исследований.В этой цепочке различают четыре звена. Источник электронов — например, сукцинат: сукцинатдегидрогеназа (комплекс II) окисляет его и восстанавливает Q до QH₂ (Chouchani и соавт., 2014). Источник свободной энергии — высокая Δp, которую поддерживает перенос электронов через комплексы III и IV. Изменение направления работы комплекса I состоит в том, что электроны идут от QH₂ к NAD⁺, а не от NADH к Q. Возможные точки побочного восстановления O₂ — восстановленный флавин (Pryde и Hirst, 2011, субмитохондриальные частицы сердца быка) или участок связывания Q (Murphy, 2009). Таким образом, обратный перенос электронов определяется энергетикой сопряжения, а место, где при нём возникает супероксид, остаётся предметом обсуждения; эти два вопроса нельзя смешивать.Из того, что энергию для RET даёт Δp, следует и сильная зависимость от неё: небольшое снижение Δp резко подавляет RET и связанное с ним образование супероксида (Murphy, 2009). Это не означает, что снижение Δp всегда уменьшает образование АФК: при прямом переносе от NADH супероксид образуется на FMN и зависит от Δp лишь косвенно, а ротенон подавляет RET, но при прямом переносе усиливает образование супероксида. Из высокого NADH/NAD⁺ также не следует, что идёт RET: при прочих равных избыток NADH противодействует восстановлению NAD⁺, а для RET существенны восстановленность Q-пула и высокая Δp. Скорость образования супероксида при RET зависит от ткани, субстрата и условий, и здесь она не приводится.Супероксид образуют и другие участки, например Qo-участок комплекса III и 2-оксокислотные дегидрогеназы; вклад зависит от ткани, субстрата и условий. В изолированных митохондриях без антимицина A вклад комплекса III обычно меньше вклада комплекса I (Murphy, 2009; Brand, 2016). В модели ишемии и реперфузии сердца мыши сукцинат накапливался при ишемии, а при восстановлении кровотока быстро окислялся; по заключению авторов, это поддерживало образование АФК при RET (Chouchani и соавт., 2014). У дрозофилы АФК, образованные при RET через комплекс I, продлевали жизнь (Scialò и соавт., 2016): действие АФК зависит от места образования, а не только от количества. Обе работы получены на моделях и не переносятся на другие ткани.Типичная ошибка Чем выше NADH/NAD⁺, тем быстрее митохондрии образуют супероксид.Общей зависимости нет: скорость задают источник электронов, субстрат и направление переноса. Одно отношение NADH/NAD⁺ эти различия не отражает.Почему одинаковое отношение NADH/NAD⁺ не гарантирует одинаковую скорость образования митохондриального супероксида?А. Потому что скорость определяется суммарным пулом NAD⁺ и NADH, а не отношением этих форм. (неверный вариант)На каждом источнике скорость зависит от восстановленности его донора электронов и от условий, а не от размера пула NAD(H) как такового.Б. Потому что у источников своя зависимость: при RET скорость связана с Q-пулом и протондвижущей силой. (верный вариант)При RET скорость зависит от восстановленности Q-пула и протондвижущей силы, а не только от отношения NADH/NAD⁺.В. Потому что основная часть супероксида образуется в комплексе IV при восстановлении O₂ до воды. (неверный вариант)В комплексе IV O₂ принимает четыре электрона и превращается в воду; супероксид возникает в побочной реакции на других участках.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаMurphy M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 2009;417:1–13.Pryde K. R., Hirst J. Superoxide is produced by the reduced flavin in mitochondrial complex I: a single, unified mechanism that applies during both forward and reverse electron transfer. J Biol Chem. 2011;286:18056–18065.Brand M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 2016;100:14–31.Chouchani E. T. et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 2014;515:431–435.Scialò F. et al. Mitochondrial ROS produced via reverse electron transport extend animal lifespan. Cell Metab. 2016;23:725–734.Wikström M., Djurabekova A., Sharma V. On the role of ubiquinone in the proton translocation mechanism of respiratory complex I. FEBS Lett. 2023;597:224–236.Схема качественная: состояния показаны условно, измеренных значений нет. Источники и режимы описаны для изолированных митохондрий в обзоре Murphy (2009, полный текст); место образования супероксида при RET Murphy называет неясным, а Pryde и Hirst (2011, аннотация) связывают с флавином. Вклад других участков — по Brand (2016, аннотация). Сопряжение окисления NADH убихиноном с переносом четырёх протонов и роль убихинона описаны по обзору Wikström и соавт. (2023, аннотация); сама аннотация не рассматривает RET, и вывод об обратимости сопряжения опирается на данные об RET (Murphy, 2009; Pryde и Hirst, 2011; Chouchani и соавт., 2014). На схеме протонный перенос показан качественно: стехиометрия и скорости не заданы, а место образования супероксида при RET не закреплено. Реперфузионный механизм получен на модели сердца мыши (Chouchani и соавт., 2014, полный текст); роль RET при избыточном восстановлении Q-пула у дрозофилы показана Scialò и соавт. (2016, полный текст).
NADH/NAD⁺, сигнальное окисление и повреждение · шаг 24 из 32Как образование и удаление H₂O₂ формируют его содержаниеСупероксиддисмутаза превращает супероксид в пероксид водорода и O₂, но не удаляет окислитель полностью. Содержание H₂O₂ определяется соотношением скоростей его образования и ферментативного удаления.SOD ускоряет дисмутацию двух молекул супероксида до H₂O₂ и O₂; нерадикальный H₂O₂ остаётся и удаляется другими ферментами.H₂O₂ восстанавливают до воды пероксиредоксины (в матриксе, в частности, Prx3) и глутатионпероксидазы, а каталаза, находящаяся преимущественно в пероксисомах, разлагает его на воду и O₂.При постоянной скорости образования содержание H₂O₂ достигает значения, при котором скорость удаления равна скорости образования; замедление удаления повышает это значение.Супероксид превращается в H₂O₂ реакцией дисмутации: 2 O₂•⁻ + 2 H⁺ → H₂O₂ + O₂. Её ускоряет SOD; в матриксе митохондрий действует форма с марганцем, MnSOD, а спонтанная дисмутация при этом вносит малый вклад (Murphy, 2009). Продукт реакции — H₂O₂, а не вода, поэтому SOD снижает содержание супероксида, но не удаляет активные формы кислорода в целом. H₂O₂ не является радикалом и относительно стабилен, поэтому способен диффундировать от места образования (Pak и соавт., 2020); время жизни H₂O₂ в клетке задают системы его удаления.Удаляют H₂O₂ три группы ферментов. Пероксиредоксины (Prx) восстанавливают его до воды за счёт тиола каталитического цистеина; у типичных 2-Cys-пероксиредоксинов окисленный фермент затем восстанавливается тиоредоксином (Trx), а окисленный Trx — тиоредоксинредуктазой за счёт NADPH (см. шаг про NADPH и антиоксидантные системы). Глутатионпероксидазы (GPx) восстанавливают H₂O₂ за счёт глутатиона (GSH), который окисляется до GSSG. Каталаза превращает две молекулы H₂O₂ в воду и O₂ и находится преимущественно в пероксисомах. Какой путь работает, зависит от локализации: в матриксе митохондрий действует, в частности, Prx3.Содержание H₂O₂ задаётся соотношением скоростей его образования и удаления. Изменение количества H₂O₂ (N) в одном компартменте, как и для метаболического пула, описывает уравнение dN/dt = J(обр) − J(уд), где J(обр) и J(уд) — скорости образования и удаления. Если скорость удаления пропорциональна количеству, J(уд) = k·N (k — константа скорости удаления), то при постоянном образовании количество стремится к J(обр)/k, и уменьшение k вдвое удваивает его. Это учебная модель без числовых значений.Итак, скорость образования окислителя и его содержание — разные величины. Окислительное повреждение — третья величина: оно зависит ещё от мишеней и длительности воздействия (см. шаг про окислительное повреждение). Локализация ферментов тоже важна: подавление каталазы пероксисом прямо не меняет удаление H₂O₂ в матриксе, где действуют Prx3 и GPx.Типичная ошибка Супероксиддисмутаза удаляет активные формы кислорода из клетки.SOD превращает супероксид в H₂O₂ и O₂. Образовавшийся H₂O₂ удаляют другие ферменты, поэтому SOD снижает содержание супероксида, но не удаляет все АФК.Скорость образования H₂O₂ не изменилась, а скорость его ферментативного удаления снизилась. Как изменится содержание H₂O₂ в компартменте при прочих равных?А. Увеличится до нового состояния баланса скоростей образования и удаления. (верный вариант)Содержание H₂O₂ задаётся соотношением скоростей образования и удаления; при замедлении удаления оно растёт до нового баланса.Б. Уменьшится, поскольку при замедлении удаления снижается и скорость образования H₂O₂. (неверный вариант)По условию скорость образования не изменилась; снижена именно скорость удаления.В. Не изменится, поскольку содержание H₂O₂ определяется скоростью его образования. (неверный вариант)Скорость удаления также входит в баланс, поэтому её снижение меняет содержание.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаMurphy M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 2009;417:1–13.Pak V. V. et al. Ultrasensitive Genetically Encoded Indicator for Hydrogen Peroxide Identifies Roles for the Oxidant in Cell Migration and Mitochondrial Function. Cell Metab. 2020;31:642–653.e6.Sies H., Mailloux R. J., Jakob U. Fundamentals of redox regulation in biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024. DOI 10.1038/s41580-024-00730-2.Схема качественная: состояния показаны условно, числовых значений нет. Дисмутация и MnSOD в матриксе — по обзору Murphy (2009, полный текст); участие Prx, GPx и тиоредоксиновой и глутатионовой систем — по введению работы Pak и соавт. (2020, полный текст); каталаза пероксисом — по обзору Sies и соавт. (2024). Положение Prx3 и GPx в матриксе — общепринятые сведения, которые отдельным прочитанным источником здесь не подтверждены.
NADH/NAD⁺, сигнальное окисление и повреждение · шаг 25 из 32Как NADPH поддерживает восстановление антиоксидантных системПара NADPH/NADP⁺ отличается от пары NADH/NAD⁺ дополнительной фосфатной группой и набором реакций. За счёт NADPH восстанавливаются глутатион и тиоредоксин — компоненты глутатионовой системы и тиоредоксиновой системы, которые поддерживают работу ферментов удаления H₂O₂.Глутатионредуктаза восстанавливает GSSG до GSH за счёт NADPH, а GSH необходим глутатионпероксидазе для восстановления H₂O₂.Тиоредоксинредуктаза восстанавливает тиоредоксин за счёт NADPH, а тиоредоксин восстанавливает окисленные пероксиредоксины и другие белки.NADPH образуется в нескольких реакциях и расходуется не только в системах защиты, но и NADPH-оксидазой, которая образует супероксид.Пары NADH/NAD⁺ и NADPH/NADP⁺ различаются: NADPH содержит дополнительную фосфатную группу, и ферменты различают эти коферменты. NADH в основном передаёт электроны дыхательной цепи, а NADPH используется в восстановительных биосинтезах и в системах защиты от окислителей, хотя чёткой границы между ними нет: восстановление окислительных модификаций обеспечивают оба кофермента (Sies и соавт., 2024). Содержание NADPH в клетке невелико и непрерывно обновляется, поэтому по нему одному нельзя судить о скорости использования NADPH, то есть о потоке.От NADPH начинаются две цепи. В глутатионовой системе глутатионредуктаза (GR) переносит электроны с NADPH на окисленный глутатион (GSSG), а восстановленный глутатион (GSH) служит донором электронов для глутатионпероксидазы (GPx), которая восстанавливает H₂O₂ до воды. В тиоредоксиновой системе тиоредоксинредуктаза (TrxR) передаёт электроны с NADPH на тиоредоксин (Trx), а тиоредоксин восстанавливает окисленные пероксиредоксины (Prx). Электроны от звена к звену передают конкретные ферменты (GR, TrxR, Trx, Prx); NADPH не восстанавливает H₂O₂ напрямую (Pak и соавт., 2020).NADPH образуется в окислительной ветви пентозофосфатного пути и в реакциях фолатного обмена (ферменты MTHFD). Его образуют также малик-фермент (малат → пируват) и изоцитратдегидрогеназы IDH1 (цитозоль) и IDH2 (митохондрии) — в прямой реакции изоцитрат → α-кетоглутарат. При восстановительном карбоксилировании (α-кетоглутарат → изоцитрат; см. шаг про образование цитрата из α-кетоглутарата) те же ферменты, напротив, расходуют NADPH. Трансгидрогеназа внутренней мембраны митохондрий тоже образует NADPH: при высокой протондвижущей силе она переносит электроны с NADH на NADP⁺, а направление реакции зависит от Δp и соотношения пар. Вклад путей зависит от клеток и компартмента. В клетках рака лёгкого A549 и H1299 по включению ²H из [3-²H]глюкозы в липогенный NADPH окислительная ветвь пентозофосфатного пути вносила заметный вклад, а вклад MTHFD1 был минимальным (Lewis и соавт., 2014); в пролиферирующих клетках в другой работе обнаружен вклад одноуглеродного обмена с серином, почти сопоставимый с вкладом пентозофосфатного пути (Fan и соавт., 2014).NADPH расходуется не только в защите. NADPH-оксидазы (NOX) передают с него электроны на O₂ и образуют супероксид или H₂O₂, поэтому по содержанию NADPH одному нельзя судить об эффективности защиты: результат зависит от ферментов, локализации и скорости регенерации кофермента.Типичная ошибка NADPH восстанавливает H₂O₂ и другие окислители напрямую, поэтому чем его больше, тем сильнее защита.NADPH отдаёт электроны ферментам GR и TrxR. H₂O₂ удаляют GPx и Prx, а результат зависит также от локализации и от скорости регенерации NADPH, который расходуется и в реакции NOX.Как снижение доступности NADPH для глутатионредуктазы отразится на удалении H₂O₂ глутатионпероксидазой при сохранённой скорости образования H₂O₂?А. Скорость удаления снизится, потому что GSSG медленнее восстанавливается до GSH, который нужен глутатионпероксидазе. (верный вариант)NADPH поддерживает оборот восстановленной формы глутатиона через редуктазу, а GSH необходим глутатионпероксидазе.Б. Скорость удаления не изменится, потому что глутатионпероксидаза получает электроны от NADPH напрямую, минуя глутатион. (неверный вариант)Глутатионпероксидаза получает электроны от GSH; NADPH передаёт электроны глутатионредуктазе, а не пероксидазе.В. Скорость удаления не изменится, потому что глутатионредуктаза использует NADH, а NADPH нужен лишь для биосинтезов. (неверный вариант)Глутатионредуктаза использует NADPH; NADH в основном передаёт электроны дыхательной цепи.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаSies H., Mailloux R. J., Jakob U. Fundamentals of redox regulation in biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024. DOI 10.1038/s41580-024-00730-2.Lewis C. A. et al. Tracing compartmentalized NADPH metabolism in the cytosol and mitochondria of mammalian cells. Mol Cell. 2014;55:253–263.Fan J. et al. Quantitative flux analysis reveals folate-dependent NADPH production. Nature. 2014;510:298–302.Pak V. V. et al. Ultrasensitive Genetically Encoded Indicator for Hydrogen Peroxide Identifies Roles for the Oxidant in Cell Migration and Mitochondrial Function. Cell Metab. 2020;31:642–653.e6.Схема качественная, числовых значений нет. Различие вкладов путей в образование NADPH получено на конкретных клеточных линиях (Lewis и соавт., 2014 — полный текст; Fan и соавт., 2014 — прочитана аннотация: наибольший вклад окислительного ПФП и почти сопоставимый — одноуглеродного обмена) и не обобщается на все клетки. Реакция трансгидрогеназы, малик-фермент (кроме упоминания в аннотации Fan и соавт.), направление реакций IDH и роль NADPH в синтезе — общепринятые сведения, отдельным прочитанным источником здесь не подтверждённые.
NADH/NAD⁺, сигнальное окисление и повреждение · шаг 26 из 32Как локальное образование H₂O₂ меняет передачу сигналаКраткое локальное образование H₂O₂ может обратимо окислять определённые остатки цистеина и тем менять активность белков. Пространство и время такого сигнала ограничивают ферменты, которые удаляют H₂O₂ и восстанавливают окисленные белки.После активации рецептора NADPH-оксидаза образует супероксид, из которого возникает H₂O₂ в ограниченной области клетки.H₂O₂ обратимо окисляет реакционноспособный цистеин фосфатазы; при сохранённой активности киназы фосфорилирование мишени возрастает.Окисление может передаваться и через пероксиредоксин (редокс-реле), а восстановление белков тиоредоксиновой системой ограничивает сигнал.Образование окислителя при действии сигнала связывают с NADPH-оксидазами (NOX; Sies и соавт., 2024). Изоформы NOX активируются по-разному (например, NOX2 — фосфорилированием субъединиц и сборкой комплекса, NOX5 и DUOX — ионами Ca²⁺). Большинство изоформ передаёт электроны с NADPH на O₂ и образует супероксид, из которого ферментативной дисмутацией возникает H₂O₂, а NOX4 и DUOX образуют преимущественно H₂O₂. Внеклеточный H₂O₂ может проходить в клетку через специальные каналы, пероксипорины. Так в ограниченной области клетки на короткое время повышается содержание H₂O₂.При прямом окислении H₂O₂ реагирует с тиолатом определённого остатка цистеина, например в каталитическом центре протеинтирозинфосфатазы, и активность фермента снижается. Если окисленный остаток затем восстанавливается, воздействие обратимо. Если активность киназы сохранена, а активность фосфатазы снижена, доля фосфорилированной мишени возрастает; повышения активности киназы для этого не требуется. Реакционная способность цистеинов различна, и не все остатки окисляются H₂O₂ одинаково; при активных пероксиредоксинах прямое окисление таких мишеней возможно при высоком локальном содержании H₂O₂ или ослаблении его удаления, этот механизм обсуждается.Многие регулируемые белки реагируют с H₂O₂ медленно, а Prx2 — один из наиболее реакционноспособных к H₂O₂ белков клетки. В редокс-реле Prx2 окисляется H₂O₂ и передаёт окислительный эквивалент транскрипционному фактору STAT3; образуются дисульфидно связанные олигомеры STAT3 с ослабленной транскрипционной активностью (Sobotta и соавт., 2015). Прямое окисление и реле — разные механизмы: во втором мишень окисляется белком-посредником, а не самим H₂O₂.Область и длительность сигнала ограничивают пероксидазы и системы восстановления. В клетках HeLa с адресным образованием H₂O₂ его распределение по компартментам, по данным одной работы, определяла тиоредоксиновая, а не глутатионовая система (Mishina и соавт., 2019); результат относится к этой модели. Время действия сигнала зависит и от образования, и от удаления H₂O₂. Прекращение сигнала не означает защиты клетки от повреждения: это разные процессы.Типичная ошибка Окисление белка пероксидом водорода всегда неспецифично и повреждает белок.Локальное обратимое окисление определённых остатков цистеина может менять активность белка и входить в передачу сигнала. Повреждением называют стойкое нарушение функции, а не само окисление.Локальный H₂O₂ обратимо снизил активность фосфатазы при сохранённой активности киназы. Как изменится доля фосфорилированного субстрата этой фосфатазы?А. Уменьшится, поскольку окисленный остаток цистеина блокирует присоединение фосфатной группы к субстрату. (неверный вариант)Фосфатную группу присоединяет киназа, активность которой сохранена, а фосфатаза её удаляет.Б. Не изменится, поскольку фосфорилирование субстрата определяется активностью киназы, а она сохранена. (неверный вариант)Доля фосфорилированного субстрата определяется балансом киназы и фосфатазы, а не одной киназой; при сниженной активности фосфатазы она растёт.В. Увеличится, поскольку удаление фосфатных групп от субстрата замедлилось при сохранённой активности киназы. (верный вариант)Доля фосфорилированного субстрата определяется балансом активностей киназы и фосфатазы; при сниженной активности фосфатазы баланс смещается и без усиления киназы.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаSies H., Mailloux R. J., Jakob U. Fundamentals of redox regulation in biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024. DOI 10.1038/s41580-024-00730-2.Sobotta M. C. et al. Peroxiredoxin-2 and STAT3 form a redox relay for H₂O₂ signaling. Nat Chem Biol. 2015;11:64–70.Mishina N. M. et al. Which antioxidant system shapes intracellular H₂O₂ gradients? Antioxid Redox Signal. 2019;31:664–670.Pak V. V. et al. Ultrasensitive Genetically Encoded Indicator for Hydrogen Peroxide Identifies Roles for the Oxidant in Cell Migration and Mitochondrial Function. Cell Metab. 2020;31:642–653.e6.Схема качественная: состояния показаны условно, числа не заданы. Реле Prx2–STAT3 показано в клетках человека (Sobotta и соавт., 2015, прочитана аннотация) и не обобщается на все пероксиредоксины и мишени. Роль тиоредоксиновой системы показана в клетках HeLa (Mishina и соавт., 2019, прочитана аннотация). Участие NOX в сигнале — по обзору Sies и соавт. (2024); различия изоформ NOX и окисление фосфатаз — общепринятые положения без отдельного прочитанного источника.
NADH/NAD⁺, сигнальное окисление и повреждение · шаг 27 из 32Когда окислительное воздействие приводит к повреждениюЛокальное обратимое окисление отличается от повреждения длительностью, местом и мишенью воздействия. О повреждении говорят, когда нарушение функции стойко, а удаление окислителя и восстановление мишеней не компенсируют воздействие.H₂O₂ окисляет тиол цистеина до сульфеновой формы, которая может образовать дисульфид (его затем восстанавливают) либо окисляться дальше до сульфиновой и сульфоновой форм.Сульфиновую форму каталитического цистеина типичных 2-Cys-пероксиредоксинов восстанавливает сульфиредоксин за счёт ATP, а сульфоновую форму обычно считают необратимой.Стойкое нарушение возникает при длительном воздействии на важные мишени; расходование NAD⁺ при активации PARP после повреждения ДНК — отдельный процесс, не относящийся к окислению цистеина.Краткий локальный импульс окислителя, после которого мишень восстанавливается, меняет активность белка обратимо и входит в регуляцию. Окислительным стрессом называют нарушение баланса окислителей и защитных систем, при котором нарушаются редокс-регуляция и (или) возникает молекулярное повреждение (Sies и соавт., 2024). Его нельзя определить только по наличию H₂O₂ или по одному пороговому значению: общего числа, разделяющего «полезные» и «вредные» АФК, и универсального времени перехода от регуляции к повреждению нет.Окисление тиола цистеина пероксидом водорода даёт сульфеновую форму (Cys-SOH). Она может образовать дисульфид с другим тиолом, и дисульфид восстанавливают тиоредоксин или глутатион. При избытке окислителя сульфеновая форма окисляется до сульфиновой (Cys-SO₂H), а затем до сульфоновой (Cys-SO₃H). Сульфиновая форма каталитического цистеина типичных 2-Cys-Prx не всегда необратима: её восстанавливает до сульфеновой формы сульфиредоксин (Srx) за счёт ATP (Rhee и соавт., 2007; Lowther, Haynes, 2011). Сульфоновую форму обычно считают необратимой. Srx не является универсальным восстановителем сульфиновых групп любых белков.Обратимое сульфинирование 2-Cys-Prx снижает их пероксидазную активность; предполагают, что оно предотвращает преждевременное удаление H₂O₂ в области сигнала, но физиологическое значение этого остаётся предметом обсуждения (Jeong и соавт., 2012). Окисление становится повреждением, когда оно длительно, затрагивает функционально важные мишени и не компенсируется удалением окислителя и восстановлением мишеней. Окисление затрагивает не только белки: возможны перекисное окисление липидов мембран и окисление оснований ДНК, а ионы железа усиливают повреждение, катализируя образование из H₂O₂ гидроксильного радикала (реакция Фентона); вклад этих процессов зависит от условий. Поэтому важны длительность, компартмент и мишень, а не содержание одного окислителя.Повреждение ДНК активирует PARP1. Фермент расщепляет NAD⁺, присоединяет остатки ADP-рибозы к белкам и высвобождает никотинамид (Shah и соавт., 2011); при повреждении ДНК такой расход снижал содержание NAD⁺ и менял метаболизм клеток (Murata и соавт., 2019). Это не окислительно-восстановительная реакция кофермента: NADH не образуется. Ингибирование PARP1 может сохранить NAD⁺, но само не устраняет повреждение ДНК и его причины, в том числе образование окислителей.Типичная ошибка Сульфинирование цистеина всегда необратимо.Сульфиновую форму каталитического цистеина типичных 2-Cys-пероксиредоксинов восстанавливает сульфиредоксин за счёт ATP. Необратимой обычно считают сульфоновую форму.При повреждении ДНК активировалась PARP1 и снизилось содержание NAD⁺. Ингибирование PARP1 уменьшило расход NAD⁺. Какой вывод следует из этого непосредственно?А. Повреждение ДНК устраняется быстрее, поскольку NAD⁺ не расходуется на работу PARP1. (неверный вариант)Снижение расхода NAD⁺ не показывает, что повреждение ДНК устранено.Б. Потеря NAD⁺ из-за PARP1 уменьшается, но повреждение ДНК этим не устраняется. (верный вариант)Расход кофермента и само повреждение ДНК — разные звенья.В. Отношение NADH/NAD⁺ во всех компартментах выравнивается, поскольку расход NAD⁺ снизился. (неверный вариант)Расход NAD⁺ при активации PARP1 не образует NADH, но может менять отношение NADH/NAD⁺, поскольку изменяет количество NAD⁺. Из снижения этого расхода не следует выравнивание отношений во всех компартментах.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаSies H., Mailloux R. J., Jakob U. Fundamentals of redox regulation in biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024. DOI 10.1038/s41580-024-00730-2.Rhee S. G. et al. Sulfiredoxin, the cysteine sulfinic acid reductase specific to 2-Cys peroxiredoxin: its discovery, mechanism of action, and biological significance. Kidney Int Suppl. 2007;(106):S3–S8.Lowther W. T., Haynes A. C. Reduction of cysteine sulfinic acid in eukaryotic, typical 2-Cys peroxiredoxins by sulfiredoxin. Antioxid Redox Signal. 2011;15:99–109.Jeong W. et al. Role of sulfiredoxin as a regulator of peroxiredoxin function and regulation of its expression. Free Radic Biol Med. 2012;53:447–456.Shah G. M. et al. Approaches to detect PARP-1 activation in vivo, in situ, and in vitro. Methods Mol Biol. 2011;780:3–34.Murata M. M. et al. NAD⁺ consumption by PARP1 in response to DNA damage triggers metabolic shift critical for damaged cell survival. Mol Biol Cell. 2019;30:2584–2597.Временные кривые — расчёт по заданным учебным параметрам: они иллюстрируют различие импульса и длительного воздействия и не задают порогов. Химия Prx и Srx дана по обзорам Rhee и соавт. (2007), Lowther и Haynes (2011), Jeong и соавт. (2012): прочитаны аннотации. Расход NAD⁺ при активации PARP1 — по Shah и соавт. (2011) и Murata и соавт. (2019): прочитаны аннотации. Необратимость сульфоновой формы, перекисное окисление липидов, окисление ДНК и реакция Фентона — общепринятые положения без отдельного прочитанного источника (об окислении оснований ДНК см. также Sies и соавт., 2024).
NADH/NAD⁺, сигнальное окисление и повреждение · шаг 28 из 32Как соотносятся сигналы сенсоров NADH/NAD⁺ и H₂O₂Peredox (схема M05) сообщает об отношении NADH/NAD⁺ в цитозоле, а HyPer7 (схема M06) — о степени окисления сенсора пероксидом водорода в том компартменте, в который направлен сенсор. Один сенсор отвечает на состояние пары NADH/NAD⁺, другой — на окисление пероксидом водорода; сигнал каждого читают с учётом калибровки, диапазона и локализации.Peredox состоит из NADH-связывающего белка Rex и флуоресцентного белка: NAD⁺ и NADH конкурируют за Rex, и флуоресценция приближённо отражает отношение форм.HyPer7 окисляется H₂O₂ и восстанавливается клеточными системами; отношение интенсивностей флуоресценции при двух длинах волн возбуждения показывает долю окисленного сенсора.Для интерпретации сигнала нужны калибровка по крайним состояниям, диапазон отклика, локализация и контроли; показания сенсоров в разных компартментах могут не совпадать, потому что сенсоры измеряют разные величины.Peredox (схема M05) — генетически кодируемый сенсор цитозольного NADH/NAD⁺. В нём циркулярно пермутированный флуоресцентный белок T-Sapphire встроен между двумя субъединицами димера NADH-связывающего белка Rex, а для нормировки на количество сенсора присоединён красный белок mCherry. NAD⁺ и NADH конкурируют за связывание с Rex, поэтому отклик зависит от обеих форм и лишь приближённо отражает отношение NADH/NAD⁺: трёхкратное изменение общего содержания NAD⁺ сдвигало диапазон отношений, в котором сенсор чувствителен, примерно вдвое. Калибруют сенсор добавлением лактата и пирувата. Ранний вариант реагировал на величину [NADH]·[H⁺]/[NAD⁺]; зависимость от pH у Peredox сильно снижена мутагенезом (Hung и соавт., 2011).HyPer7 (схема M06) — сенсор H₂O₂, в котором флуоресцентный белок встроен в регуляторный домен белка OxyR (Pak и соавт., 2020). H₂O₂ окисляет цистеины сенсора, и отношение интенсивностей флуоресценции при двух длинах волн возбуждения меняется; восстановление клеточными системами возвращает исходное состояние. При регистрации по этому отношению показание устойчиво к изменению pH; контролем служит вариант C121S, не реагирующий на H₂O₂.Выводы по показаниям сенсоров ограничены. Peredox описан для цитозоля (в первичных клетках для этого использовали и версию с ядерной локализацией) и не измеряет суммарный пул NAD(H); при направлении в матрикс его сигнал не менялся при метаболических воздействиях. HyPer7 показывает степень окисления сенсора в своём компартменте, то есть баланс между окислением сенсора пероксидом водорода и его восстановлением, а не все АФК и не повреждение. Для каждого сенсора определяют крайние состояния, проверяют насыщение, содержание сенсора в клетках и его локализацию. Поэтому показания двух сенсоров в разных компартментах могут расходиться; это не противоречие, поскольку сенсоры измеряют разные величины.Типичная ошибка Если HyPer7 в матриксе показывает окисление, то в клетке выросло содержание всех АФК.HyPer7 отвечает на H₂O₂ в том компартменте, куда направлен сенсор. Среди АФК он практически специфичен к H₂O₂ (на органические гидропероксиды отвечает при высоких концентрациях), не показывает повреждение и не заменяет измерение NADH/NAD⁺.Сигнал матриксного HyPer7 вырос, а цитозольный Peredox почти не изменился. Какой вывод допустим?А. Один из сенсоров работает неверно, поскольку оба отражают одну и ту же величину — NADH/NAD⁺. (неверный вариант)HyPer7 не является сенсором NADH/NAD⁺: он отвечает на окисление пероксидом водорода.Б. В матриксе возросло содержание всех АФК, включая супероксид, а в цитозоле оно не менялось. (неверный вариант)HyPer7 практически специфичен к H₂O₂, поэтому по его сигналу нельзя судить о содержании всех АФК, включая супероксид.В. Сенсоры отражают разные величины в разных компартментах, поэтому результаты не противоречат друг другу. (верный вариант)Первый отражает степень окисления сенсора пероксидом водорода в матриксе, второй — приближённо цитозольное NADH/NAD⁺.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаHung Y. P. et al. Imaging Cytosolic NADH–NAD⁺ Redox State with a Genetically Encoded Fluorescent Biosensor. Cell Metab. 2011;14:545–554.Pak V. V. et al. Ultrasensitive Genetically Encoded Indicator for Hydrogen Peroxide Identifies Roles for the Oxidant in Cell Migration and Mitochondrial Function. Cell Metab. 2020;31:642–653.e6.Схемы упрощены; числа и кривые на них учебные и не являются данными эксперимента. Устройство и калибровка Peredox даны по работе Hung и соавт. (2011), устройство HyPer7 — по работе Pak и соавт. (2020); обе прочитаны в полном тексте. Версия с ядерной локализацией использована в работе как приближение для цитозоля; при направлении в матрикс сигнал не менялся.
Исследование · шаг 29 из 32Как одновременно поддерживаются образование лактата и биосинтезУглерод глюкозы одновременно распределяется между лактатом, пентозофосфатным путём, синтезом серина и окислением в митохондриях. Поэтому выделение лактата не означает, что биосинтез или дыхание остановлены.Что показывает схема. Карта объединяет четыре механизма: углерод глюкозы идёт к лактату (ЛДГ, NADH → NAD⁺), в пентозофосфатный путь (NADPH), к серину и в митохондрии (PDH, PC); цикл трикарбоновых кислот пополняется глутамином (GLS образует глутамат, из которого затем образуется α-КГ), цитрат экспортируется для образования ацетил-CoA. Состояния: исходное, ускоренное поступление глюкозы, подавленная ЛДГ, отсутствие глутамина.От глюкозо-6-фосфата и 3-фосфоглицерата ответвляются пентозофосфатный путь, образующий NADPH, и синтез серина, а остальной углерод доходит до пирувата.Пируват восстанавливается до лактата за счёт NADH, который при этом окисляется до NAD⁺, и параллельно поступает в митохондрии.Цитрат отводится в биосинтез, а промежуточные соединения цикла пополняются глутамином и пируватом.Углерод глюкозы поступает в несколько путей одновременно, и на карте каждый показан своей линией. Глюкозо-6-фосфат может превращаться в ходе гликолиза или входить в окислительную ветвь пентозофосфатного пути, где образуются NADPH и рибозо-5-фосфат; от 3-фосфоглицерата ответвляется синтез серина. На карте обозначены раздельно NADH гликолиза и NADPH пентозофосфатного пути: это разные коферменты. Пируват тоже может превращаться несколькими путями. В реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ) он принимает электроны от NADH и превращается в лактат, а NAD⁺ регенерируется (шаг «Как образование лактата поддерживает гликолиз»). Другая часть пирувата поступает в митохондрии, где пируватдегидрогеназный комплекс (PDH) превращает его в ацетил-CoA, а пируваткарбоксилаза (PC) — в оксалоацетат.Цикл трикарбоновых кислот служит и путём окисления, и источником предшественников для биосинтеза. Цитрат переносится в цитозоль, где ATP-цитратлиаза (ACLY) образует из него ацетил-CoA. Отток не истощает цикл, потому что его промежуточные соединения пополняются: глутаминаза превращает глутамин в глутамат, из которого образуется α-кетоглутарат (α-КГ). Подавление PDH киназой PDK и вклад PC различаются между клетками, поэтому доли ветвей схема не задаёт. В культивируемых клетках глиобластомы, выделявших в среду значительную часть углерода глюкозы в виде лактата, цикл оставался активным, из него отводились предшественники биосинтеза, а оксалоацетат пополнялся преимущественно глутамином при подавленном карбоксилировании пирувата (DeBerardinis и соавт., 2007); при высокой активности PC соотношение иное.Выделение лактата показывает, что часть углерода глюкозы превратилась в лактат, но не означает, что остальной углерод глюкозы и углерод других субстратов не используются в биосинтезе. Углерод глутамина может и окисляться до CO₂, и оставаться в предшественниках. Нельзя складывать доли с разной нормировкой, например долю углерода глюкозы, превратившуюся в лактат, и долю цитрата, происходящую из глутамина: это разные величины, а не потоки одной реакции. Одна из моделей объясняет высокую скорость образования лактата тем, что скорость окисления NADH в дыхательной цепи недостаточна для регенерации NAD⁺ (Luengo и соавт., 2021).Типичная ошибка Если клетка выделяет много лактата, то весь углерод глюкозы потерян для биосинтеза, а цикл не работает.Лактат — лишь один из путей превращения пирувата. Углерод глюкозы одновременно идёт в пентозофосфатный путь и к серину, а цикл, пополняемый глутамином, служит и путём окисления, и источником предшественников.Клетка выделяет много лактата, а цикл пополняется углеродом глутамина. Может ли клетка при этом одновременно окислять пируват в цикле и отводить промежуточные соединения цикла в биосинтез?А. Да: цикл может окислять пируват и одновременно отдавать цитрат и другие промежуточные соединения в биосинтез. (верный вариант)Образование лактата не исключает входа пирувата в митохондрии, а глутамин пополняет цикл, поэтому окисление и отток предшественников в биосинтез могут идти одновременно.Б. Нет: выделение лактата означает, что пируват в митохондрии не поступает, а цикл окисляет другие субстраты. (неверный вариант)Выделение лактата показывает, что часть пирувата превратилась в лактат; это не исключает, что другая часть поступает в митохондрии через пируватдегидрогеназный комплекс или пируваткарбоксилазу.В. Да, но углерод глутамина в цикле окисляется до CO₂ и в биосинтетические предшественники не попадает. (неверный вариант)Углерод глутамина может и окисляться до CO₂, и оставаться в предшественниках, например в цитрате; эти судьбы не исключают друг друга.Этот шаг объединяет материал нескольких вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаНельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Luengo A. et al. Increased demand for NAD⁺ relative to ATP drives aerobic glycolysis. Mol Cell. 2021;81:691–707.e6.Baker S. A., Rutter J. Metabolites as signalling molecules. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24:355–374.DeBerardinis R. J. et al. Beyond aerobic glycolysis: transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:19345–19350.Схема качественная: числа и доли ветвей не заданы, она объединяет механизмы разделов 1–2. Работа цикла при пополнении глутамином показана на культивируемых клетках глиобластомы при подавленном карбоксилировании пирувата (DeBerardinis и соавт., 2007), зависимость от регенерации NAD⁺ — на пролиферирующих клетках (Luengo и соавт., 2021); в других клетках вклад ветвей иной. Реакции пентозофосфатного пути, синтеза серина и цикла приведены по учебникам биохимии.
Исследование · шаг 30 из 32Почему метаболиты и модификации хроматина восстанавливаются с разной скоростьюПосле подавления мутантной IDH содержание R-2-HG, содержание модификаций хроматина и фенотип клетки могут изменяться в разное время. Это разные звенья цепи с собственными скоростями обновления; полный возврат к прежнему состоянию не гарантирован.Что показывает схема. Схема: четыре кривые после подавления мутантной IDH в условных единицах времени; по оси — доля исходного избытка (до подавления 1, как в контроле 0). Активность фермента снижается ступенчато в момент вмешательства; избыток R-2-HG, избыток метки на хроматине и отклонение фенотипа клетки от контроля убывают последовательно и с разной скоростью. Переключатели: быстрее или медленнее обновляется метка; полное или частичное подавление (остаточная активность 0 или 0,4). Кружки отмечают половину итогового изменения. Кривые учебные.Мутантная IDH образует R-2-HG; после её подавления содержание R-2-HG убывает за счёт расходования и выхода из клетки.Содержание метки на гистоне или ДНК меняется по мере сдвига баланса скоростей её внесения, удаления и разбавления новым материалом.Фенотип клетки зависит ещё от экспрессии генов, содержания белков и РНК, поэтому может меняться в другое время, чем метка.Ожидаемая цепь событий, которую проверяют в каждой системе, такова: снижается активность фермента, затем скорость образования R-2-HG, затем содержание R-2-HG в клетке, затем скорость реакций, которые тормозит R-2-HG, и лишь затем количество модификации. R-2-HG — метаболит, а не ковалентная модификация гистона. На схеме эти звенья показаны отдельными кривыми: активность фермента меняется ступенчато в момент вмешательства, а остальные величины постепенно приближаются к новому стационарному значению.Содержание метаболита уменьшается, когда образование прекращается, а расходование и выход из клетки продолжаются. Вместе с ним ослабевает торможение α-КГ-зависимых диоксигеназ, к которым относятся деметилазы гистонов и белки TET. Для сукцината и фумарата такое торможение показано на деметилазах гистонов и ДНК (Xiao и соавт., 2012), а R-2-HG тормозит ряд α-КГ-зависимых ферментов (Losman и соавт., 2013). Эффект R-2-HG не сводится к одному ферменту: R-2-HG слабее, чем S-2-HG, подавляет TET2, но воспроизводит блок дифференцировки в использованных моделях.Содержание накопленной метки убывает, когда её удаляют ферменты или когда она разбавляется при обновлении, например при синтезе новых гистонов в ходе деления. Скорость удаления и обновления различается у разных меток. В клетках HEK293 ацетилирование гистонов обновляется в целом медленнее, чем фосфорилирование, но быстрее, чем метилирование; скорость зависит от гистона, остатка и соседних модификаций (Evertts и соавт., 2013). В клетках TF-1 с IDH2 R140Q обработка ингибитором мутантного фермента AGI-6780 снижала гиперметилирование гистонов уже через 7 дней, а число участков ДНК со сниженным метилированием возрастало при продлении обработки с 7 до 28 дней (Kernytsky и соавт., 2015).Фенотип определяется не только меткой, но и накопленными белками и РНК, у которых тоже есть оборот, поэтому порядок «метаболит, метка, фенотип» не универсален. В клетках TF-1, обработанных проникающим в клетку эфиром R-2-HG, после его удаления способность к дифференцировке возвращалась быстро, а время возврата зависимости от цитокинов определялось дозой и длительностью воздействия; метки в этой работе не измеряли, и авторы допускают, что они динамичнее, чем считалось, либо что фенотип связан с другими функциями ферментов (Losman и соавт., 2013). Содержание метаболита или метки не равно скорости образования: один и тот же пул возможен при разных потоках.Типичная ошибка Если содержание R-2-HG уже снизилось, а метка ещё не вернулась, то R-2-HG не влияет на метку.Содержание метаболита и содержание метки определяются разными процессами: расходом метаболита, с одной стороны, и удалением или разбавлением накопленной модификации — с другой. Различие во времени не опровергает связь.После подавления неоморфной активности IDH избыток R-2-HG устранился раньше, чем убыл избыток модификаций. Противоречит ли это метаболической регуляции хроматина?А. Да: если R-2-HG влиял на метку, она должна была вернуться к исходному уровню вместе со снижением R-2-HG. (неверный вариант)Метаболит убывает за счёт расходования и выхода из клетки, а метка — за счёт удаления и разбавления; скорости этих процессов различны, поэтому одновременного возврата ожидать нельзя.Б. Да: если метка не вернулась к исходному уровню, то R-2-HG не влиял на её содержание в этой системе. (неверный вариант)Запаздывание метки не отменяет влияния R-2-HG: накопленная метка сохраняется и после снижения метаболита, пока её не удалят ферменты или не разбавит новый материал.В. Нет: после снижения R-2-HG избыток метки убывает по мере её удаления и разбавления, на что нужно время. (верный вариант)Расход метаболита и удаление накопленной метки — разные процессы со своими скоростями, поэтому запаздывание метки не противоречит регуляции.Этот шаг объединяет материал нескольких вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаLosman J. A. et al. (R)-2-hydroxyglutarate is sufficient to promote leukemogenesis and its effects are reversible. Science. 2013;339:1621–1625.Xiao M. et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes Dev. 2012;26:1326–1338.Evertts A. G. et al. Quantitative dynamics of the link between cellular metabolism and histone acetylation. J Biol Chem. 2013;288:12142–12151.Kernytsky A. et al. IDH2 mutation-induced histone and DNA hypermethylation is progressively reversed by small-molecule inhibition. Blood. 2015;125:296–303.Кривые построены в условных единицах времени и не соответствуют ни одному эксперименту: порядок «метаболит, метка, фенотип» — гипотеза, проверяемая измерением в каждой системе, а не закон. В клетках TF-1 с IDH2 R140Q ингибитор AGI-6780 снижал гиперметилирование гистонов через 7 дней, а гиперметилирование ДНК уменьшалось постепенно: число участков со сниженным метилированием возрастало от 7 к 28 дням (Kernytsky и соавт., 2015; полный текст); для других меток, сайтов и клеток сроки иные.
Исследование · шаг 31 из 32Как изменение углеродного потока связано с редокс-адаптациейОкислительная ветвь пентозофосфатного пути образует NADPH, за счёт которого восстанавливаются тиоредоксиновая и глутатионовая системы, поддерживающие пероксидазы, удаляющие H₂O₂. В клетках A549 окисление PKM2 снижает её активность, а при действии диамида усиливается поток глюкозы в эту ветвь; механизм не универсален.Что показывает схема. Схема: глюкозо-6-фосфат → окислительная ветвь пентозофосфатного пути → NADPH → восстановление тиоредоксина и глутатиона → удаление H₂O₂ (по механизму). Отдельная петля: H₂O₂ окисляет Cys358 PKM2, активность PKM2 снижается, а при действии диамида выше по пути накапливается глюкозо-6-фосфат (клетки A549). Переключатели: белок PKM2 (дикий тип или C358S) и окислительное воздействие (нет или есть).Окислительная ветвь пентозофосфатного пути превращает глюкозо-6-фосфат с образованием NADPH.NADPH служит донором электронов для восстановления тиоредоксина и глутатиона, которые поддерживают пероксидазы, удаляющие H₂O₂.В клетках A549 окисление Cys358 снижало активность PKM2, а при действии диамида накапливался глюкозо-6-фосфат и усиливался поток в окислительную ветвь.Окислительная ветвь пентозофосфатного пути превращает глюкозо-6-фосфат в рибулозо-5-фосфат; на каждую молекулу субстрата образуются две молекулы NADPH. Через тиоредоксинредуктазу и глутатионредуктазу электроны NADPH восстанавливают тиоредоксин (Trx) и глутатион (GSH): Trx восстанавливает пероксиредоксины, а GSH служит донором электронов для глутатионпероксидаз, удаляющих H₂O₂ (шаг «Как NADPH поддерживает восстановление антиоксидантных систем»; Sies и соавт., 2024). Углеродный обмен связан с этими системами через NADPH, а не через NADH.Один из механизмов перераспределения потока описали Anastasiou и соавт. (2011) на клетках рака лёгкого человека A549. Пируваткиназа M2 (PKM2) переносит фосфорильную группу с фосфоенолпирувата на ADP. H₂O₂ (1 мМ), диамид (250 мкМ) и гипоксия (1 % O₂ в газовой смеси, а не измеренная концентрация кислорода в клетке) снижали активность PKM2; замена Cys358 на серин (C358S) устраняла окисление этого остатка, и активность варианта была менее чувствительна к окислителю. Усиление потока в окислительную ветвь и рост содержания глюкозо-6-фосфата в 2,3 раза за 30 мин показаны для диамида; активатор PKM2 препятствовал и снижению активности, и этому усилению потока.В клетках с вариантом C358S было ниже содержание восстановленного глутатиона и выше чувствительность к диамиду; при концентрации глюкозы в среде 5,6 мМ, но не 25 мМ, такие клетки росли медленнее. Для тиоредоксиновой системы измерений в работе нет, и на схеме она показана по механизму. Данные получены на одной клеточной линии и не позволяют судить о других клетках: поток через пентозофосфатный путь определяется всей сетью, включая поступление глюкозы, активность других ферментов и расход NADPH в биосинтезе.Устойчивость к повреждению и сохранение физиологического редокс-сигнала не равнозначны. В физиологических концентрациях H₂O₂ служит сигнальной молекулой, а при избытке повреждает биомолекулы; избыток восстановительных эквивалентов (редуктивный дистресс) тоже может нарушать функции клетки (Sies и соавт., 2024). Поэтому большее содержание NADPH само по себе не означает лучшей адаптации.Типичная ошибка PKM2 сама образует NADPH, поэтому её активность поддерживает антиоксидантные системы.PKM2 переносит фосфорильную группу с фосфоенолпирувата на ADP, а NADPH образуется в окислительной ветви пентозофосфатного пути. Окисление PKM2 снижает её активность, и больше глюкозо-6-фосфата может входить в эту ветвь.В клетках A549 при действии диамида окисление PKM2 снижало её активность, а поток глюкозы в пентозофосфатный путь усиливался. Какое звено связывает усиление этого потока с удалением H₂O₂?А. Образование NADPH самой PKM2 при её окислении: оно снабжает электронами глутатион и тиоредоксин. (неверный вариант)PKM2 переносит фосфорильную группу с фосфоенолпирувата на ADP и NADPH не образует; NADPH образуется в окислительной ветви пентозофосфатного пути.Б. Образование NADH в гликолизе: им напрямую восстанавливаются пероксидазы, удаляющие H₂O₂. (неверный вариант)Глутатионредуктаза и тиоредоксинредуктаза используют NADPH, а не NADH; NADH гликолиза окисляется в других реакциях.В. Образование NADPH в окислительной ветви: этот кофермент передаёт электроны глутатиону и тиоредоксину. (верный вариант)Электроны NADPH через глутатионредуктазу и тиоредоксинредуктазу восстанавливают глутатион и тиоредоксин, а те поддерживают пероксидазы, удаляющие H₂O₂. В этом эксперименте измеряли глутатион, но не тиоредоксин.Этот шаг объединяет материал нескольких вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаAnastasiou D. et al. Inhibition of pyruvate kinase M2 by reactive oxygen species contributes to cellular antioxidant responses. Science. 2011;334:1278–1283.Sies H., Mailloux R. J., Jakob U. Fundamentals of redox regulation in biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024. DOI 10.1038/s41580-024-00730-2.Схема качественная, числа не заданы. Снижение активности PKM2 в клетках A549 вызывали H₂O₂ (1 мМ), диамид (250 мкМ) и гипоксия (1 % O₂); окисление Cys358 непосредственно показано для диамида и гипоксии, а усиление потока в окислительную ветвь и рост глюкозо-6-фосфата — только для диамида (Anastasiou и соавт., 2011); у варианта C358S измеряли глутатион, чувствительность к окислителю и рост, но не поток. Тиоредоксиновая система и связь NADPH с Trx и GSH показаны по механизму (Sies и соавт., 2024); универсальность механизма не показана.
Исследование · шаг 32 из 32Как проверить предполагаемую связь метаболита и модификацииЧтобы проверить, влияет ли метаболит на модификацию, изменяют количество или активность фермента и сравнивают четыре состояния при одинаковых условиях. Вывод ограничен измеренным показателем и заданными условиями.Что показывает схема. Схема M07: контрольная РНК, снижение ACLY малой РНК, введение устойчивой к РНК функциональной ACLY и каталитически неактивного варианта; в каждом состоянии оценивают активность ACLY, ацетил-CoA и H3K9ac относительно общего H3. Вывод зависит от того, восстанавливает ли ацетилирование неактивный вариант, измерены ли ацетил-CoA и количество вариантов. Схема M08: ингибитор подавляет ACLY, образуется ацетил-CoA, ацетилируется H3; отдельно показаны побочная мишень вещества и обходной источник ацетат. Методы LC–MS (M03) и иммуноблот (M04) показаны в шаге про величины, связывающие метаболизм и модификацию гистона.Воздействие (РНК-интерференция или вещество) изменяет фермент, и это изменение проверяют отдельно от измерения метки.Введение функционального и каталитически неактивного вариантов фермента показывает, нужен ли катализ.Метаболит и модификацию измеряют отдельно, а побочные мишени и обходные источники исключают независимыми контролями.Совпадение двух изменений не показывает, что одно вызвало другое. Поэтому гипотезу «ATP-цитратлиаза (ACLY) образует ацетил-CoA, из которого ацетилируется гистон H3 по лизину 9 (H3K9ac)» проверяют вмешательством и выделяют три этапа: воздействие на ACLY, проверку изменения мишени и измерение метаболита и модификации.На схеме M07 показан эксперимент с РНК-интерференцией: малая РНК, комплементарная мРНК ACLY, уменьшает количество мРНК, а уменьшение белка и активности проверяют отдельно. Затем вводят ACLY в функциональном или каталитически неактивном варианте; её мРНК устойчива к этой малой РНК (эксперимент с возвращением функции, рескью). Сравнивают четыре состояния при одинаковых условиях и времени: контроль; снижение ACLY; снижение с введением функциональной ACLY; снижение с введением неактивного варианта. Если ацетилирование H3K9 восстанавливается только при введении функционального варианта, а количество и локализация белка сопоставимы, это согласуется с тем, что в данных условиях для ацетилирования H3K9 необходима каталитическая активность ACLY. Ацетил-CoA измеряют методом LC–MS (схема M03), а H3K9ac нормируют на общий H3 при иммуноблоте (схема M04); обе схемы — в шаге «Какие величины связывают изменение метаболизма с модификацией гистона».На схеме M08 показано фармакологическое воздействие. Оно требует других контролей: растворителя, диапазона концентраций, жизнеспособности клеток и независимого вмешательства. Вещество может действовать на побочные мишени, и обходной источник, например ацетат в сверхфизиологических концентрациях, способен вернуть метку, не устраняя нарушения ACLY: введение фермента и обходной источник субстрата отвечают на разные вопросы. Восстановление одной модификации поддерживает конкретную связь, но не доказывает восстановления всех функций клетки.Типичная ошибка Если после снижения ACLY снизились и содержание ацетил-CoA, и ацетилирование H3K9, то связь доказана.Совпадение изменений не отличает причину от сопутствующего эффекта. Связь поддерживают подтверждённое изменение мишени, восстановление показателя при введении функционального варианта и отсутствие такого восстановления при введении неактивного, а также независимое вмешательство.После подавления ACLY (РНК-интерференция) ацетилирование H3 уменьшилось. Введение функциональной ACLY, синтезируемой с мРНК, устойчивой к РНК-интерференции, восстановило ацетилирование, а введение каталитически неактивного варианта с таким же количеством и локализацией белка — нет. Какой вывод наиболее обоснован?А. Результат показывает, что ACLY образует основную часть ацетил-CoA для ацетилирования гистонов в этих клетках. (неверный вариант)В эксперименте не измеряли ацетил-CoA и не сравнивали вклад других источников, например ацетата; нужен катализ ACLY для этого показателя, но доля её вклада не определена.Б. Результат поддерживает вывод, что в этих условиях для ацетилирования H3 нужна каталитическая активность ACLY. (верный вариант)При сопоставимых количестве и локализации вариантов сравнение поддерживает роль катализа, но не устанавливает все промежуточные механизмы.В. Восстановление ацетилирования H3 показывает, что восстановлены и другие функции клетки, зависящие от ACLY. (неверный вариант)Измеряли одно ацетилирование H3; восстановление других функций клетки (экспрессии генов, пролиферации) в эксперименте не проверяли.Этот шаг объединяет материал нескольких вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаWellen K. E. et al. ATP-citrate lyase links cellular metabolism to histone acetylation. Science. 2009;324:1076–1080.Схемы M07 и M08 учебные, без экспериментальных чисел; результаты А–В — условный план эксперимента, а не воспроизведение работы Wellen и соавт. (2009). В этой работе подавление ACLY (РНК-интерференция) снижало ацетилирование коровых гистонов, а сверхфизиологический ацетат его возвращал. В адипоцитах 3T3-L1 снижалась экспрессия генов Glut4, HK2, PFK-1 и LDHA, и ацетат эту экспрессию возвращал; ацетилирование гистонов на промоторе определяли только для Glut4. Прямой связи экспрессии остальных генов с ацетилированием в работе не измеряли, а функциональный и неактивный варианты ACLY не сопоставляли. Результаты клеточных культур не переносятся на организм без отдельной проверки.
