Хемиосмотическое сопряжение · шаг 1 из 30Как перенос электронов связан с синтезом ATPОкислительное фосфорилирование объединяет два процесса, которые идут в разных белковых комплексах: перенос электронов к O₂ и синтез ATP. Их связывает не общее химическое соединение, а электрохимический градиент H⁺ на внутренней мембране митохондрии.Комплексы дыхательной цепи переносят электроны от NADH к O₂ и при этом переносят H⁺ из матрикса в межмембранное пространство.Внутренняя мембрана плохо проницаема для H⁺, поэтому возникают разность электрических потенциалов и разность концентраций H⁺ — две составляющие протондвижущей силы Δp.H⁺ возвращается в матрикс через ATP-синтазу, и энергия этого движения используется для синтеза ATP из ADP и неорганического фосфата.Митохондрия ограничена двумя мембранами. Наружная мембрана проницаема для небольших ионов, а внутренняя мембрана для H⁺ проницаема плохо. Она отделяет матрикс — внутренний водный компартмент — от межмембранного пространства. В этой мембране находятся дыхательные комплексы и ATP-синтаза.Когда электроны NADH передаются по дыхательной цепи к O₂, комплексы I, III и IV переносят H⁺ из матрикса в межмембранное пространство. Снаружи от внутренней мембраны накапливается положительный заряд, а концентрация H⁺ в матриксе становится ниже, чем в межмембранном пространстве. Электрическая составляющая (мембранный потенциал) и химическая составляющая (ΔpH) вместе образуют протондвижущую силу Δp. При обычном состоянии митохондрии обе составляющие направлены одинаково: матрикс заряжен отрицательно и имеет более высокий pH, поэтому H⁺ стремится войти в матрикс.Основным путём входа служит ATP-синтаза: поток H⁺ через её мембранную часть сопряжён с синтезом ATP из ADP и неорганического фосфата (Pi). Такую связь двух процессов через градиент ионов называют хемиосмотическим сопряжением; эту гипотезу предложил П. Митчелл в 1961 г. Электроны при этом не переносятся на ADP: фосфатную группу ATP образует Pi, а энергию для реакции поставляет градиент H⁺.Хемиосмотический принцип не ограничен митохондриями. В эксперименте Э. Рэкера и В. Штокениуса (1974) в искусственные фосфолипидные пузырьки встроили светозависимый протонный насос бактериородопсин и ATP-синтазу митохондрий сердца быка; на свету пузырьки накапливали H⁺ и синтезировали ATP без дыхательной цепи. В эксперименте А. Ягендорфа и Э. Урибе (1966) тилакоиды хлоропластов шпината выдерживали при pH 4, затем переносили в среду с pH 8, ADP и Pi, и в темноте образовывался ATP. Эти эксперименты показывают, что градиента H⁺ достаточно для синтеза ATP, но это искусственные системы, а не митохондрии человека.Типичная ошибка Синтез ATP требует непосредственного переноса электрона на ADP.Электроны дыхательной цепи восстанавливают O₂ и на ADP не переносятся. Перенос электронов создаёт градиент H⁺, а ATP-синтаза использует его энергию для присоединения Pi к ADP.Матрикс отрицателен относительно межмембранного пространства, а pH в матриксе выше. Какие составляющие протондвижущей силы способствуют поступлению H⁺ в матрикс?А. Электрическая составляющая способствует входу, а химическая — выходу H⁺. (неверный вариант)При более высоком pH концентрация H⁺ в матриксе ниже. Поэтому химическая составляющая также способствует входу H⁺.Б. Электрическая и химическая составляющие действуют в одном направлении. (верный вариант)Положительно заряженный H⁺ переносится к отрицательной стороне мембраны и из области большей концентрации H⁺ в область меньшей. При заданных условиях оба вклада направлены в матрикс.В. Химическая составляющая способствует входу, а электрическая — выходу H⁺. (неверный вариант)Отрицательный потенциал матрикса способствует поступлению положительно заряженных протонов. Электрический вклад здесь направлен внутрь.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаMitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961;191:144–148.Racker E., Stoeckenius W. Reconstitution of purple membrane vesicles catalyzing light-driven proton uptake and adenosine triphosphate formation. J Biol Chem. 1974;249:662–663. doi:10.1016/S0021-9258(19)43080-9Jagendorf A. T., Uribe E. ATP formation caused by acid-base transition of spinach chloroplasts. Proc Natl Acad Sci USA. 1966;55:170–177. doi:10.1073/pnas.55.1.170Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма; знаки и составляющие показаны качественно, без численных значений. Δψm определён как потенциал матрикса относительно межмембранного пространства: в рассматриваемом состоянии матрикс отрицателен и имеет более высокий pH. Эксперимент Racker 1974 — фосфолипидные пузырьки с бактериородопсином Halobacterium halobium и олигомицинчувствительной ATPазой митохондрий сердца быка; эксперимент Jagendorf 1966 — изолированные тилакоиды хлоропластов шпината, кислотно-основной переход в темноте. Оба эксперимента не относятся к митохондриям человека.
Хемиосмотическое сопряжение · шаг 2 из 30Как комплексы дыхательной цепи создают градиент H⁺Электроны поступают в дыхательную цепь двумя путями: от NADH через комплекс I и от сукцината через комплекс II. Оба пути сходятся на убихиноне. H⁺ через мембрану переносят комплексы I, III и IV; комплекс II H⁺ не переносит, но его электроны проходят через III и IV.Комплекс I окисляет NADH матрикса, а комплекс II окисляет сукцинат; оба комплекса восстанавливают убихинон (Q) во внутренней мембране.Восстановленный убихинон передаёт электроны комплексу III, затем цитохром c переносит их к комплексу IV, который восстанавливает O₂ до воды.По принятой учебной схеме на пару электронов комплексы I, III и IV выводят в межмембранное пространство 4, 4 и 2 H⁺: 10 H⁺ от NADH и 6 H⁺ от сукцината.Дыхательная цепь — это не один ряд переносчиков, а сеть, в которую электроны входят в разных местах. NADH, образованный дегидрогеназами матрикса, окисляется комплексом I. Сукцинат окисляется комплексом II (сукцинатдегидрогеназой): электроны переходят на прочно связанный с ферментом FAD, затем через железосерные центры — на убихинон. Оба пути сходятся на пуле убихинона во внутренней мембране.Восстановленный убихинон окисляется комплексом III, который передаёт электроны небольшому гемсодержащему белку цитохрому c. Цитохром c находится со стороны межмембранного пространства и переносит электроны к комплексу IV. Комплекс IV восстанавливает O₂ до воды; для этого он использует H⁺ матрикса. Поэтому матрикс теряет H⁺ двумя способами: при переносе H⁺ через мембрану и при образовании воды.Комплексы I, III и IV сопрягают перенос электронов с перемещением H⁺ из матрикса в межмембранное пространство. Комплекс II такой функции не имеет. Это не значит, что окисление сукцината бесполезно для синтеза ATP: его электроны проходят через комплексы III и IV, и эти комплексы создают протондвижущую силу. Различается только число перенесённых H⁺: по принятой схеме 10 на пару электронов NADH и 6 на пару электронов сукцината.Отсюда разное отношение P/O — число молекул ATP на атом восстановленного кислорода: для субстратов NADH в изолированных митохондриях обычно приводят около 2,5, для сукцината — около 1,5. Это оценки при заданных условиях эксперимента, а не постоянные величины любой клетки: фактический выход зависит от протонной утечки и затрат на перенос ADP, ATP и Pi.Типичная ошибка Если комплекс II не перекачивает H⁺, окисление сукцината не может поддерживать синтез ATP.Комплекс II восстанавливает убихинон, и его электроны проходят через комплексы III и IV, которые переносят H⁺. Поэтому сукцинат поддерживает Δp и синтез ATP, хотя на пару электронов переносится меньше H⁺, чем при окислении NADH.В изолированных митохондриях комплекс I заблокирован. Доступны сукцинат, O₂, ADP и Pi; остальные комплексы сохранны. Возможны ли образование протондвижущей силы и синтез ATP?А. Возможны: электроны проходят через II, III и IV, а H⁺ переносят III и IV. (верный вариант)Комплекс II восстанавливает убихинон. Последующий перенос электронов через III и IV сопряжён с перемещением H⁺, поэтому Δp может поддерживаться.Б. Возможны: комплекс II заменяет комплекс I как самостоятельный насос H⁺. (неверный вариант)У II нет функции протонного насоса. Он обеспечивает вход электронов в общую цепь переносчиков.В. Невозможны: комплекс II сам не переносит H⁺ через внутреннюю мембрану. (неверный вариант)Вариант учитывает отсутствие протонного переноса у II, но пропускает последующие комплексы III и IV.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаHinkle P. C. P/O ratios of mitochondrial oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 2005;1706:1–11. doi:10.1016/j.bbabio.2004.09.004Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма. Изолированные митохондрии или пермеабилизованные клетки с доступными сукцинатом, O₂, ADP и Pi; комплексы II, III, IV и ATP-синтаза сохранны. Стехиометрия 4 + 4 + 2 H⁺ на пару электронов — принятая учебная схема для митохондрий млекопитающих; значения P/O около 2,5 и 1,5 — оценки для изолированных митохондрий (Hinkle 2005). Внешний NADH через внутреннюю мембрану не проходит: в экспериментах с интактными митохондриями задают субстраты, образующие NADH в матриксе.
Хемиосмотическое сопряжение · шаг 3 из 30Как ATP-синтаза преобразует движение H⁺ в синтез ATPATP-синтаза состоит из мембранной части F₀ и каталитической части F₁. H⁺ не проходят через F₀ по сквозному каналу: в субъединице a есть два отдельных полуканала, а от одного к другому H⁺ переносит вращающееся кольцо c-субъединиц. Через γ-субъединицу это вращение меняет состояния каталитических центров F₁. Энергия градиента расходуется прежде всего не на образование связи в активном центре, а на высвобождение прочно связанного ATP.H⁺ из межмембранного пространства по первому водному полуканалу субъединицы a подходит к карбоксильной группе c-субъединицы и присоединяется к ней. Нейтральная c-субъединица входит в липидный бислой, кольцо поворачивается на один шаг, и спустя почти полный оборот эта субъединица достигает второго полуканала и отдаёт H⁺ в матрикс.Кольцо c и центральная ножка (γ-субъединица) вращаются вместе. Асимметричная γ-субъединица поочерёдно меняет конформацию трёх β-субъединиц F₁: центр связывает ADP и Pi, затем прочно удерживает образовавшийся ATP и, наконец, открывается и высвобождает его. Шаг кольца c₈ составляет 45° на один H⁺, а состояния β меняются через каждые 120°.Направление работы обратимо: при недостаточной Δp и наличии ATP фермент гидролизует ATP и вращается в обратную сторону. Те же два полуканала работают в обратном порядке: H⁺ присоединяется у полуканала, открытого в матрикс, и отдаётся в межмембранное пространство.ATP-синтаза (F₀F₁) — ферментный комплекс внутренней мембраны. Мембранная часть F₀ содержит кольцо из c-субъединиц и субъединицу a. Субъединица a вместе с периферической ножкой неподвижна относительно мембраны, а c-кольцо вращается. Часть F₁ выступает в матрикс и содержит три пары α- и β-субъединиц; каталитические центры расположены в β-субъединицах. Кольцо c и центральная ножка, включающая γ-субъединицу, образуют ротор, а периферическая ножка удерживает α₃β₃ неподвижно.Через F₀ H⁺ проходят не по сквозной поре. Субъединица a прилегает к c-кольцу сбоку и образует два водных полуканала, смещённых друг относительно друга вдоль окружности кольца. Один открыт в межмембранное пространство (в митохондриях — в просвет крист), другой — в матрикс, и каждый заканчивается у кольца, не достигая противоположной стороны мембраны. Между полуканалами лежит консервативный положительно заряженный остаток аргинина субъединицы a. В каждой c-субъединице есть консервативная карбоксильная группа (остаток глутамата, у некоторых бактерий — аспартата), которая обратимо присоединяет H⁺. Поэтому H⁺ переходит из межмембранного пространства в матрикс только вместе с поворотом кольца, которое переносит c-субъединицу от одного полуканала к другому.Направленное вращение возникает из нескольких свойств интерфейса a–c. Заряженная (депротонированная) карбоксильная группа не может войти в гидрофобный слой мембраны, а протонированная нейтральная группа может. Аргинин субъединицы a притягивает депротонированную группу и разделяет места связывания и высвобождения, поэтому H⁺ не переходит из одного полуканала в другой, минуя кольцо. По расчётам, сродство группы к H⁺ у полуканала со стороны межмембранного пространства выше, чем у полуканала в матрикс, что соответствует направлению градиента H⁺. На одной c-субъединице события при синтезе ATP идут в таком порядке: (1) у первого полуканала группа присоединяет H⁺ из межмембранного пространства; (2) нейтральная субъединица уходит в липидный бислой, и кольцо поворачивается на один шаг; (3) почти за полный оборот эта субъединица доходит до второго полуканала и отдаёт H⁺ в матрикс; (4) заряженная группа притягивается аргинином и вновь оказывается у первого полуканала. Вращающий момент создают электростатические взаимодействия на поверхности контакта a–c, а электрохимический градиент H⁺ делает присоединение у одного полуканала и отдачу у другого более вероятными и тем самым задаёт направление вращения.Вращение кольца превращается в синтез ATP через γ-субъединицу. Кольцо c и центральная ножка вращаются вместе, поэтому γ-субъединица поворачивается внутри α₃β₃ и поочерёдно меняет конформацию β-субъединиц. В любой момент три центра находятся в разных состояниях: открытом, связывающем ADP и Pi и прочно удерживающем ATP. При повороте ротора на 120° каждый центр переходит в следующее состояние. Один шаг c₈-кольца равен 45° и соответствует одному H⁺, поэтому состояния β меняются не на каждый H⁺, а через два–три шага кольца. Этот механизм изменения связывания предложил П. Бойер; вращение γ-субъединицы при гидролизе ATP подтверждено экспериментально (Noji 1997). Сопряжение вращения с катализом называют роторным катализом.Число c-субъединиц в кольце зависит от организма. У млекопитающих кольцо содержит 8 субъединиц, поэтому за полный оборот через F₀ проходят 8 H⁺, а образуются 3 ATP — около 2,7 H⁺ на ATP (Watt 2010). Ещё примерно один H⁺ на молекулу ATP затрачивается на перенос Pi в матрикс и обмен ADP на ATP. Кольца из 10–15 субъединиц, известные у дрожжей (c₁₀), в хлоропластах (c₁₄) и у бактерий, нельзя переносить на митохондрии человека.ATP-синтаза обратима. Если Δp мала, а ATP доступен, F₁ гидролизует ATP и вращает γ-субъединицу и c-кольцо в противоположную сторону. Те же два полуканала работают в обратном порядке: у полуканала, открытого в матрикс, карбоксильные группы присоединяют H⁺, а у полуканала, открытого в межмембранное пространство, отдают его, так что F₀ переносит H⁺ из матрикса против градиента. Такой режим поддерживает мембранный потенциал, но расходует ATP. Олигомицин блокирует F₀ и прекращает перенос H⁺ в обоих направлениях, а у клеток ρ⁰ нет субъединицы a (ATP6), поэтому полного пути для H⁺ нет; оба случая разобраны в следующих шагах.Типичная ошибка ATP-синтаза непосредственно передаёт протоны на ADP.Фосфатную группу ATP поставляет неорганический фосфат, а не H⁺. Поток H⁺ через F₀ вращает ротор, вращение меняет конформацию каталитических центров F₁, и это обеспечивает связывание субстратов, образование и высвобождение ATP. Сам F₀ при этом не сквозная пора: H⁺ присоединяется к c-субъединице у одного полуканала и отдаётся у другого.ATP-синтаза работает в режиме синтеза ATP: доступны ADP и Pi, протондвижущая сила достаточна. Как движение H⁺ через мембранную часть фермента связано с образованием ATP?А. Протоны присоединяются к ADP и образуют концевую фосфатную группу. (неверный вариант)Фосфатную группу поставляет неорганический фосфат. Перенос протонов обеспечивает энергию сопряжённого процесса.Б. Вращение ротора меняет состояния каталитических центров F₁. (верный вариант)Механическое сопряжение связывает движение H⁺ с конформационными изменениями каталитических центров и образованием и высвобождением ATP.В. Электроны поступают с ротора прямо на каталитически связанный ADP. (неверный вариант)ATP-синтаза не является участком переноса электронов дыхательной цепи. Сопряжение осуществляется через Δp и вращение.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаWatt I. N., Montgomery M. G., Runswick M. J., Leslie A. G. W., Walker J. E. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:16823–16827. doi:10.1073/pnas.1011099107Boyer P. D. The ATP synthase — a splendid molecular machine. Annu Rev Biochem. 1997;66:717–749.Noji H., Yasuda R., Yoshida M., Kinosita K. Jr. Direct observation of the rotation of F1-ATPase. Nature. 1997;386:299–302.Kühlbrandt W. Structure and mechanisms of F-type ATP synthases. Annu Rev Biochem. 2019;88:515–549. doi:10.1146/annurev-biochem-013118-110903Marciniak A., Chodnicki P., Hossain K. A., Slabonska J., Czub J. Determinants of directionality and efficiency of the ATP synthase Fo motor at atomic resolution. J Phys Chem Lett. 2022;13:387–392. doi:10.1021/acs.jpclett.1c03358Wong J. E., Zíková A., Gahura O. The ancestral shape of the access proton path of mitochondrial ATP synthases revealed by a split subunit-a. Mol Biol Evol. 2023;40(6):msad146. doi:10.1093/molbev/msad146Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма; состояния центров (открытое, слабо и прочно связывающее) показаны качественно по механизму Бойера. Стехиометрия c₈ — для митохондрий млекопитающих (кристаллическая структура F₁-c₈ быка, Watt 2010); прямое наблюдение вращения — одиночные молекулы F₁ термофильной бактерии (Noji 1997). Вопрос шага рассматривает прямой режим при достаточной Δp и наличии ADP и Pi. Установлено структурами ATP-синтаз (криоЭМ): c-кольцо вращается относительно субъединицы a, в которой есть два водных полуканала, разделённых консервативным аргинином; в митохондриях один из них открыт в просвет крист (Kühlbrandt 2019, прочитан только реферат; Wong 2023). Порядок присоединения и отдачи H⁺, направление вращения и роль аргинина показаны в расчётах для F₀ дрожжей (Marciniak 2022; моделировали кольцо дрожжей, а не человека) и согласуются с данными мутагенеза, на которые ссылаются авторы. Для человеческого фермента детальная последовательность элементарных событий в F₀ не установлена, поэтому номера остатков не приводятся, а остатки дрожжей и бактерий на него не переносятся. Шаги 45° на один H⁺ и 120° на смену состояний β на схеме — геометрическая модель с жёсткой передачей вращения; времена и скорости не моделируются.
Хемиосмотическое сопряжение · шаг 4 из 30Почему доступность ADP влияет на скорость дыханияВ сопряжённых митохондриях скорость дыхания зависит от того, как быстро протондвижущая сила используется для синтеза ATP. Когда расход ATP в клетке растёт, образуется больше ADP; ATP-синтаза быстрее возвращает H⁺ в матрикс, и перенос электронов ускоряется.Процессы, расходующие ATP, образуют ADP и Pi; эти субстраты переносятся в матрикс и используются ATP-синтазой.Чем быстрее ATP-синтаза возвращает H⁺ в матрикс, тем слабее Δp противодействует дальнейшему переносу H⁺ комплексами дыхательной цепи.Перенос электронов и потребление O₂ ускоряются, а содержание ATP может почти не измениться: растут оба потока — образования и расхода.Когда субстраты окисления и O₂ доступны, скорость дыхания всё равно не максимальна. Перенос H⁺ комплексами дыхательной цепи совершается против протондвижущей силы: чем больше Δp, тем сильнее она тормозит дальнейший перенос H⁺ и вместе с ним перенос электронов. Поэтому скорость дыхания зависит от того, сколько H⁺ возвращается в матрикс через ATP-синтазу и другими путями.Если клетка расходует ATP быстрее — например, при сокращении мышечного волокна или усиленном синтезе белка, — образуется больше ADP и Pi. Переносчики доставляют их в матрикс, ATP-синтаза работает быстрее и быстрее возвращает H⁺. Δp немного снижается, перенос электронов ускоряется, и потребление O₂ растёт. Эту зависимость скорости дыхания от использования протондвижущей силы для фосфорилирования ADP называют дыхательным контролем.Важно различать поток и содержание вещества. Ускорение дыхания означает больший поток синтеза ATP, но не обязательно рост содержания ATP: в установившемся состоянии ATP образуется и расходуется с одинаковой большей скоростью. Отношение ATP к ADP при этом может почти не меняться или даже немного снижаться.На изолированных митохондриях дыхательный контроль измеряют как отношение скоростей дыхания с добавленным ADP (состояние 3) и после его исчерпания (состояние 4). Это отношение зависит от субстрата, препарата митохондрий и протокола, поэтому его сравнивают только при одинаковых условиях. В клетках роль ATP-связанного дыхания оценивают по ответу на олигомицин (шаги о методах ниже).Типичная ошибка Ускорение дыхания обязательно означает накопление ATP.При усиленном расходе ATP дыхание ускоряется именно потому, что ATP быстрее превращается в ADP. Синтез и расход растут вместе, а содержание ATP может остаться почти прежним.В сопряжённых митохондриях достаточно субстратов и O₂, но доступность ADP исходно ограничивает синтез ATP. Почему увеличение доступности ADP может ускорить дыхание?А. ATP-синтаза быстрее использует Δp, ослабляя ограничение переноса электронов. (верный вариант)При использовании Δp для фосфорилирования уменьшается противодействие дальнейшему переносу H⁺ дыхательной цепью. Поэтому поток электронов и потребление O₂ могут увеличиться.Б. ATP-синтаза медленнее использует Δp, поскольку ADP тормозит её работу. (неверный вариант)ADP служит субстратом синтеза ATP. При исходном ограничении доступностью ADP его добавление ускоряет использование Δp, а не тормозит работу синтазы.В. Использование ADP повышает Δp и тем самым ускоряет перенос электронов. (неверный вариант)При более быстром использовании Δp ATP-синтазой ограничение переноса электронов ослабевает. Вариант меняет направление этой причинной связи.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаDivakaruni A. S., Paradyse A., Ferrick D. A., Murphy A. N., Jastroch M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods Enzymol. 2014;547:309–354. doi:10.1016/B978-0-12-801415-8.00016-3Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма; уровни скоростей — качественные. Сопряжённые митохондрии, доступные субстраты и O₂; сравниваются установившиеся состояния после изменения расхода ATP, без повреждения. Отношение дыхательного контроля (состояние 3 / состояние 4) относится к изолированным митохондриям; в клетках ATP-связанное дыхание оценивают по ответу на олигомицин (Divakaruni 2014).
Хемиосмотическое сопряжение · шаг 5 из 30Чем блок ATP-синтазы отличается от блока дыхательной цепиОлигомицин связывается с F₀ и прекращает поток H⁺ через ATP-синтазу. Ингибиторы дыхательной цепи действуют на другие мишени — на сами комплексы переноса электронов. Какой поток останавливает олигомицин, зависит от исходного режима синтазы: синтеза ATP или его гидролиза.В прямом режиме олигомицин прекращает возврат H⁺ через ATP-синтазу; Δp возрастает и тормозит перенос H⁺ дыхательной цепью, поэтому дыхание замедляется.Если дыхательная цепь остановлена, а ATP доступен, ATP-синтаза может гидролизовать ATP и выводить H⁺ из матрикса, поддерживая потенциал.В этом режиме олигомицин прекращает обращённую работу синтазы, и потенциал падает: знак ответа на олигомицин определяется исходным режимом фермента.Ингибиторы окислительного фосфорилирования различаются мишенями. Ротенон и пиерицидин A ингибируют комплекс I, малонат конкурирует с сукцинатом за активный центр комплекса II, антимицин A ингибирует комплекс III, цианид и азид — комплекс IV. Олигомицин связывается с F₀ ATP-синтазы и прекращает поток H⁺ через фермент; на перенос электронов он прямо не действует.Рассмотрим сопряжённые митохондрии, которые активно синтезируют ATP. Олигомицин прекращает возврат H⁺ через ATP-синтазу, и синтез ATP останавливается. H⁺ продолжает выходить из матрикса, пока Δp не возрастёт настолько, что перенос H⁺ комплексами дыхательной цепи затормозится. Дыхание замедляется до уровня, который поддерживает протонная утечка; мембрана немного гиперполяризуется.Иная картина возникает, если дыхательная цепь остановлена, например ингибиторами комплексов I или III. Тогда ATP-синтаза может работать в обратную сторону: гидролизовать ATP и переносить H⁺ из матрикса, поддерживая пониженный мембранный потенциал. На изолированных митохондриях при остановленной цепи олигомицин вызывал немедленную деполяризацию — признак того, что синтаза работала в режиме гидролиза; ATP для этого в описанных условиях давало субстратное фосфорилирование в матриксе (Chinopoulos 2010).Поэтому утверждение «олигомицин гиперполяризует митохондрии» верно только для исходного режима синтеза ATP. Одна проба с ингибитором показывает, какой поток зависел от мишени в данных условиях, но не устанавливает всю причинную цепочку.Типичная ошибка Олигомицин всегда вызывает деполяризацию.В сопряжённых митохондриях, синтезирующих ATP, олигомицин прекращает возврат H⁺ через синтазу, и Δp обычно возрастает. Деполяризацию он вызывает, когда синтаза работала в обратном режиме — гидролизовала ATP при остановленной дыхательной цепи.К активно фосфорилирующим сопряжённым митохондриям добавили олигомицин. Какое раннее сочетание изменений ожидается при достаточных субстратах и O₂?А. Синтез ATP снижается, Δp обычно возрастает, дыхание замедляется. (верный вариант)Блок F₀ ограничивает возврат H⁺ через ATP-синтазу. Возрастание Δp тормозит сопряжённый перенос электронов. Условие прямой работы фермента здесь существенно.Б. Синтез ATP снижается, Δp обычно снижается, дыхание ускоряется. (неверный вариант)Такой ответ смешивает блок ATP-синтазы с разобщением. При блоке F₀ протонный градиент исходно обычно увеличивается.В. Синтез ATP возрастает, Δp обычно снижается, дыхание ускоряется. (неверный вариант)Олигомицин подавляет работу ATP-синтазы и не может объяснить ускорение синтеза ATP в заданном режиме.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаDivakaruni A. S., Paradyse A., Ferrick D. A., Murphy A. N., Jastroch M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods Enzymol. 2014;547:309–354. doi:10.1016/B978-0-12-801415-8.00016-3Chinopoulos C. et al. Forward operation of adenine nucleotide translocase during F0F1-ATPase reversal: critical role of matrix substrate-level phosphorylation. FASEB J. 2010;24:2405–2416. doi:10.1096/fj.09-149898Схема механизма; изменения показаны качественно. Вопрос: изолированные сопряжённые митохондрии активно синтезируют ATP, субстраты и O₂ доступны, короткое воздействие олигомицина. Обращённый режим и деполяризация от олигомицина — изолированные митохондрии печени крысы с остановленной дыхательной цепью (ротенон, стигмателлин или KCN); ATP в матриксе давало субстратное фосфорилирование сукцинил-CoA-синтетазой (Chinopoulos 2010; контрольные эксперименты — митохондрии печени и сердца кролика). Небольшая гиперполяризация от олигомицина в клетках — Divakaruni 2014. Таблица мишеней — учебная сводка без доз.
Хемиосмотическое сопряжение · шаг 6 из 30Как разобщение меняет дыхание, синтез ATP и образование теплаПри разобщении H⁺ возвращается в матрикс в обход ATP-синтазы. Перенос электронов продолжается и даже ускоряется, но всё меньшая часть его энергии используется для синтеза ATP. Разобщение вызывают протонофоры, например FCCP, а в бурой жировой ткани — регулируемый белок UCP1; энергия градиента рассеивается в виде теплоты.Протонофор или белок с протонной проводимостью создаёт путь возврата H⁺ в матрикс, не связанный с ATP-синтазой.Δp снижается и меньше тормозит перенос H⁺ дыхательной цепью; при доступных субстратах и O₂ дыхание ускоряется.Синтез ATP митохондриями снижается, а энергия окисления в большей степени рассеивается в виде теплоты.Протонная утечка существует всегда: часть H⁺ возвращается в матрикс через внутреннюю мембрану без участия ATP-синтазы. В клетках её вклад определяют по дыханию, которое сохраняется после олигомицина. Разобщение — это усиление такого возврата H⁺, при котором сопряжение переноса электронов с синтезом ATP снижается.FCCP — липофильная слабая кислота, протонофор. В протонированной форме она проходит через мембрану, в матриксе отдаёт H⁺ и в анионной форме возвращается обратно. Так FCCP переносит H⁺ в матрикс в обход синтазы. Δp снижается, торможение дыхательной цепи ослабевает, и при доступных субстратах и O₂ дыхание ускоряется. Синтез ATP митохондриями при этом снижается: Δp становится недостаточной для синтазы.Ответ на FCCP зависит от дозы. Дозу подбирают титрованием: подобранная доза вызывает максимальное дыхание, а избыток разобщителя может снижать потребление O₂. Одна из возможных причин — уменьшение движущей силы для переноса анионных субстратов (пирувата, глутамата) в матрикс (Divakaruni 2014). Поэтому вывод о максимальной дыхательной способности делают только после титрования.Физиологический пример — UCP1 во внутренней мембране бурых адипоцитов. При активации термогенеза (например, при охлаждении) UCP1 увеличивает протонную проводимость мембраны, и энергия окисления жирных кислот в большей степени выделяется в виде теплоты. UCP1 и FCCP приводят к сходному результату, но это разные молекулы: UCP1 — регулируемый белок определённых клеток, FCCP — синтетическое вещество, проходящее через любые мембраны.Типичная ошибка Быстрое потребление O₂ при разобщении означает высокий синтез ATP.При разобщении дыхание ускоряется именно потому, что H⁺ возвращается в обход ATP-синтазы. Потребление O₂ растёт, а синтез ATP митохондриями снижается: энергия рассеивается в виде теплоты.К митохондриям с сохранной цепью добавили подобранную дозу FCCP. Доступны субстраты и O₂. Как может измениться дыхание при снижении митохондриального синтеза ATP?А. Дыхание обязательно прекращается, поскольку FCCP блокирует комплекс IV. (неверный вариант)FCCP не является специфическим ингибитором комплекса IV. Избыточные дозы могут снижать OCR, но это другой режим.Б. Дыхание ускоряется, поскольку FCCP усиливает возврат H⁺ через ATP-синтазу. (неверный вариант)FCCP обеспечивает возврат H⁺ в обход ATP-синтазы. Именно рассеяние градиента уменьшает сопряжение с образованием ATP.В. Дыхание может ускориться, поскольку H⁺ возвращается в обход ATP-синтазы. (верный вариант)Разобщитель рассеивает Δp и уменьшает ограничение переноса электронов. Энергия окисления в меньшей степени используется для синтеза ATP.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаDivakaruni A. S., Paradyse A., Ferrick D. A., Murphy A. N., Jastroch M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods Enzymol. 2014;547:309–354. doi:10.1016/B978-0-12-801415-8.00016-3Chouchani E. T., Kazak L., Spiegelman B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metab. 2019;29:27–37.Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма; уровни показаны качественно. Дыхательная цепь сохранна, субстраты и O₂ не лимитируют, доза FCCP подобрана титрованием; оценивается митохондриальный синтез ATP. Снижение дыхания при избытке протонофора и его возможные причины — Divakaruni 2014. UCP1 — бурые адипоциты при активации термогенеза (Chouchani 2019).
Хемиосмотическое сопряжение · шаг 7 из 30Что можно установить по кривой потребления O₂Респирометр регистрирует, как убывает концентрация O₂ в замкнутом объёме с клетками или митохондриями. Скорость потребления O₂ (OCR) получают из наклона этой кривой. Последовательное добавление олигомицина, FCCP и ингибиторов цепи разделяет OCR на части, но не измеряет синтез ATP напрямую.Датчик O₂ (электрод или оптический сенсор) регистрирует концентрацию O₂ во времени; OCR — скорость её снижения с учётом объёма и нормировки на число клеток или белок.Олигомицин снижает OCR на величину ATP-связанного дыхания; подобранная доза FCCP показывает максимальное дыхание; ингибиторы комплексов I и III оставляют немитохондриальный остаток.Одинаковый OCR возможен при разной доле утечки, поэтому скорость синтеза ATP по одному значению OCR не определяется.В закрытой камере с электродом Кларка или в лунке микропланшетного анализатора клетки потребляют O₂, и его концентрация убывает. Датчик записывает концентрацию O₂ во времени, а OCR рассчитывают как скорость её снижения. Чтобы сравнивать образцы, OCR нормируют на число клеток, количество белка или ДНК: две лунки с разным числом одинаковых клеток дают разный сырой сигнал, но одинаковый нормированный.Стандартный протокол включает последовательные добавки (Divakaruni 2014). Сначала регистрируют базальное дыхание. Олигомицин прекращает синтез ATP, и OCR снижается: разность оценивает ATP-связанное дыхание, а остаток — дыхание, связанное с протонной утечкой. Подобранная титрованием доза FCCP показывает максимальное дыхание; разность максимального и базального называют резервной дыхательной способностью. В конце добавляют ротенон и антимицин A: оставшееся потребление O₂ немитохондриальное, его вычитают из остальных величин.У этих оценок есть границы. После олигомицина мембрана немного гиперполяризуется, и утечка возрастает, поэтому ATP-связанное дыхание немного недооценивается. Максимальное дыхание в интактной клетке может ограничиваться поступлением субстратов, а не мощностью цепи. Немитохондриальное потребление O₂ у разных клеток различно.Главное ограничение: OCR — это поток O₂, а не скорость синтеза ATP. Одинаковый OCR в двух образцах возможен при разной доле утечки, и тогда митохондрии синтезируют ATP с разной скоростью. Для вывода о синтезе ATP нужны дополнительные измерения — ответ на олигомицин, принятое отношение P/O или независимое определение ATP.Типичная ошибка OCR непосредственно измеряет скорость синтеза ATP.OCR измеряет скорость потребления O₂. Часть её поддерживает протонную утечку, часть может быть немитохондриальной. Скорость синтеза ATP оценивают по ответу на олигомицин и дополнительным измерениям.В двух образцах зарегистрировали одинаковую скорость потребления O₂. Достаточно ли этого, чтобы заключить, что митохондрии синтезируют ATP с одинаковой скоростью?А. Недостаточно: одинаковое дыхание возможно при разной степени сопряжения. (верный вариант)Часть дыхания может поддерживать протонную утечку; вклад немитохондриальных реакций также следует учитывать. Для оценки ATP нужны дополнительные измерения или обоснованный расчёт.Б. Достаточно: каждому значению OCR соответствует одна скорость синтеза ATP. (неверный вариант)Постоянное соответствие OCR и синтеза ATP не выполняется при изменении сопряжения и субстратов.В. Достаточно, если среднее содержание ATP в клетках также одинаково. (неверный вариант)Содержание ATP зависит от его образования и расхода. Равенство содержания не устанавливает равенства скоростей синтеза.Эта тема относится к вопросу 1 практикума. Открыть сценарии вопроса 1 →Источники и условия научного выводаDivakaruni A. S., Paradyse A., Ferrick D. A., Murphy A. N., Jastroch M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods Enzymol. 2014;547:309–354. doi:10.1016/B978-0-12-801415-8.00016-3Учебная модель: трасса O₂ и числа OCR — условные единицы, не данные эксперимента. Последовательность добавок и смысл каждой величины — по Divakaruni 2014 (микропланшетная респирометрия; в примере авторов — миобласты C2C12, олигомицин 2 мкг/мл, FCCP 800 нМ, ротенон 1 мкМ и антимицин A 2 мкМ). Нормировка показана на двух лунках с одинаковыми клетками и разным их числом.
Потенциал и транспорт · шаг 8 из 30Что означает мембранный потенциал и его модульМембранный потенциал Δψm — электрическая составляющая протондвижущей силы. Его записывают со знаком: потенциал матрикса относительно межмембранного пространства отрицателен. Поэтому изменение с −160 до −100 мВ — это уменьшение модуля потенциала, то есть деполяризация, хотя число стало больше.Знак Δψm задан выбором точки отсчёта: Δψm = ψматрикса − ψмежмембранного пространства; в работающей митохондрии матрикс заряжен отрицательно.Модуль |Δψm| показывает величину разности потенциалов; деполяризация — уменьшение модуля, гиперполяризация — его увеличение.Δψm — только часть протондвижущей силы: ΔpH изменяется отдельно, поэтому значение потенциала не определяет скорость всех процессов, зависящих от градиента.Разность потенциалов на мембране всегда указывают относительно выбранной стороны. Для митохондрий принято записывать потенциал матрикса относительно межмембранного пространства: Δψm = ψматрикса − ψмежмембранного пространства. Поскольку дыхательная цепь выводит положительно заряженные H⁺ из матрикса, матрикс заряжен отрицательно, и Δψm в работающей митохондрии — отрицательное число. В культивируемых клетках его оценивают примерно от −120 до −160 мВ; в работе Gerencser 2012 для нейронов коры крысы в культуре получено около −139 мВ в покое.С отрицательными числами легко ошибиться. Переход от −160 к −100 мВ — это увеличение числа, но уменьшение модуля со 160 до 100 мВ: электрическая составляющая ослабла. Такое изменение называют деполяризацией. Обратное изменение, например от −140 к −170 мВ, увеличивает модуль и называется гиперполяризацией. Деполяризация не означает обязательного исчезновения потенциала: при −100 мВ матрикс остаётся заряженным отрицательно.Чтобы не путаться в знаках, на неотрицательных шкалах пишут «модуль потенциала |Δψm|, мВ». Тогда деполяризация выглядит как укорочение столбца, а гиперполяризация — как его удлинение.Мембранный потенциал — не вся протондвижущая сила. Химическая составляющая ΔpH может изменяться независимо: например, перенос ионов через мембрану способен перераспределять энергию градиента между двумя составляющими. Разные процессы используют разные составляющие (это предмет следующего шага), поэтому по одному значению Δψm нельзя определить скорость синтеза ATP, импорта или транспорта.Типичная ошибка При переходе от −160 к −100 мВ потенциал становится сильнее, потому что число возрастает.Число возрастает, но модуль уменьшается со 160 до 100 мВ: разность потенциалов становится меньше. Это деполяризация. Сравнивать нужно модули, а знак показывает, какая сторона мембраны заряжена отрицательно.Потенциал матрикса относительно межмембранного пространства изменился с −160 до −100 мВ. Как называется это изменение?А. Деполяризация: модуль потенциала уменьшился со 160 до 100 мВ. (верный вариант)Матрикс остаётся отрицательным, но электрическая составляющая градиента ослабла. Это деполяризация.Б. Полная потеря потенциала: разность потенциалов стала равной нулю. (неверный вариант)Разность потенциалов −100 мВ сохраняется; деполяризация не обязательно означает её полное исчезновение.В. Гиперполяризация: модуль потенциала увеличился на 60 мВ. (неверный вариант)Алгебраическое увеличение отрицательного числа не означает увеличения его модуля.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаGerencser A. A., Chinopoulos C., Birket M. J., Jastroch M., Vitelli C., Nicholls D. G., Brand M. D. Quantitative measurement of mitochondrial membrane potential in cultured cells: calcium-induced de- and hyperpolarization of neuronal mitochondria. J Physiol. 2012;590:2845–2871. doi:10.1113/jphysiol.2012.228387Nicholls D. G., Ferguson S. J. Bioenergetics 4. London: Academic Press; 2013. Chapters 3–4 (протондвижущая сила, её составляющие и измерение).Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Схема механизма с заданными учебными значениями −160, −100, −140 и −170 мВ; они не измерены в конкретной клетке. Знак определяется относительно межмембранного пространства. Пример измеренного значения: около −139 мВ в покое — нейроны коры крысы в культуре, расчёт по распределению TMRM с калибровкой (Gerencser 2012).
Потенциал и транспорт · шаг 9 из 30Почему ANT и PiC используют разные составляющие градиентаДля синтеза ATP в матриксе нужны ADP и Pi, а готовый ATP должен выйти в цитозоль. Эти потоки обеспечивают два переносчика внутренней мембраны. ANT обменивает ATP⁴⁻ на ADP³⁻ и поэтому использует мембранный потенциал; PiC переносит фосфат вместе с H⁺ без переноса заряда и использует ΔpH.ANT выводит из матрикса ATP⁴⁻ в обмен на ADP³⁻: за один цикл наружу переносится один отрицательный заряд, поэтому обмен электрогенен.Отрицательный потенциал матрикса способствует выходу более отрицательно заряженного ATP⁴⁻ и входу ADP³⁻.PiC переносит H₂PO₄⁻ вместе с H⁺ (или в обмен на OH⁻); суммарный заряд не переносится, и движущей силой служит ΔpH.ATP образуется в матриксе, а расходуется в основном в цитозоле. Внутренняя мембрана для нуклеотидов непроницаема, поэтому обмен ATP на ADP осуществляет специальный переносчик — ANT (ADP/ATP-переносчик, транслоказа адениновых нуклеотидов). При физиологических значениях pH и с учётом связывания Mg²⁺ переносятся свободные формы ATP⁴⁻ и ADP³⁻. Обмен строго один на один: на каждую выведенную молекулу ATP в матрикс входит одна молекула ADP.Поскольку ATP⁴⁻ несёт на один отрицательный заряд больше, чем ADP³⁻, каждый цикл переносит из матрикса один отрицательный заряд. Такой обмен называют электрогенным. Отрицательный потенциал матрикса способствует выходу ATP⁴⁻ и входу ADP³⁻, поэтому ANT использует электрическую составляющую градиента. Благодаря этому отношение ATP к ADP в цитозоле поддерживается выше, чем в матриксе.Неорганический фосфат входит в матрикс через фосфатный переносчик PiC. В принятой схеме он переносит H₂PO₄⁻ вместе с H⁺; суммарный заряд при этом не переносится, и такой перенос электронейтрален. Его движущей силой служит ΔpH: более щелочной матрикс способствует входу H⁺ вместе с фосфатом. Механизм сопряжения с H⁺ изучен, в частности, на реконструированном переносчике дрожжей (Phelps 1996).Вместе эти переносы расходуют часть протондвижущей силы — примерно один H⁺ на молекулу ATP. Поэтому на синтез одного ATP, доставленного в цитозоль, приходится около 2,7 H⁺ через ATP-синтазу и ещё около одного H⁺ на транспорт (см. шаг об ATP-синтазе). Механистический расчёт для кольца c₈ даёт около 2,7 ATP на NADH и 1,6 на сукцинат; измеренные значения P/O (около 2,5 и 1,5) ниже из-за протонной утечки и условий эксперимента (Hinkle 2005). Электрическая и химическая составляющие связаны, но на эти два переносчика они действуют по-разному.Типичная ошибка Любой транспорт через внутреннюю мембрану непосредственно определяется только Δψm.Электрогенный обмен ANT зависит от мембранного потенциала, а электронейтральный перенос фосфата через PiC — от ΔpH. Поэтому по одному Δψm нельзя судить обо всех транспортных процессах.Какое описание различия ANT и фосфатного переносчика PiC соответствует их транспортным механизмам?А. Обмен ANT электронейтрален; перенос Pi через PiC создаёт электрический ток. (неверный вариант)Различие зарядов ATP⁴⁻ и ADP³⁻ делает обмен ANT электрогенным. PiC непосредственно не переносит суммарный заряд в этой схеме.Б. Обмен ANT электрогенен; перенос Pi через PiC электронейтрален и связан с ΔpH. (верный вариант)ANT переносит нуклеотиды с различным зарядом. Для PiC важен протон-сопряжённый электронейтральный перенос фосфата.В. Оба переносчика осуществляют один и тот же электрогенный обмен ATP на ADP. (неверный вариант)PiC переносит неорганический фосфат, а не адениновые нуклеотиды.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаKlingenberg M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochim Biophys Acta. 2008;1778:1978–2021.Phelps A., Briggs C., Mincone L., Wohlrab H. Mitochondrial phosphate transport protein. Replacements of glutamic, aspartic, and histidine residues affect transport and protein conformation and point to a coupled proton transport path. Biochemistry. 1996;35:10757–10762. doi:10.1021/bi961052xChinopoulos C. et al. Forward operation of adenine nucleotide translocase during F0F1-ATPase reversal: critical role of matrix substrate-level phosphorylation. FASEB J. 2010;24:2405–2416. doi:10.1096/fj.09-149898Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма; показан обычный режим обмена при синтезе ATP. Электрогенность обмена ATP⁴⁻/ADP³⁻ — Klingenberg 2008; электронейтральный H⁺-сопряжённый перенос фосфата — реконструированный переносчик дрожжей (Phelps 1996); для человека механизм принят по аналогии. Режимы обращения ANT при деполяризации рассматривает Chinopoulos 2010.
Потенциал и транспорт · шаг 10 из 30Почему импорт в матрикс требует потенциала и ATPБольшинство белков матрикса синтезируются в цитозоле в виде предшественников с положительно заряженной N-концевой сигнальной последовательностью. Их перенос в матрикс требует двух разных источников энергии: Δψm для начального перемещения сигнала через внутреннюю мембрану и ATP для работы матричного мотора.Предшественник проходит через наружную мембрану по каналу TOM, затем сигнальная последовательность входит в транслоказу внутренней мембраны TIM23.Отрицательный потенциал матрикса электрофоретически перемещает положительно заряженную сигнальную последовательность через внутреннюю мембрану.Матричный мотор PAM с ATPазой mtHsp70 протягивает остальную цепь в матрикс; протеаза MPP отщепляет сигнальную последовательность.Митохондрия содержит более тысячи разных белков, и подавляющее большинство из них кодирует ядро. Белки матрикса синтезируются на рибосомах цитозоля в виде предшественников, у которых на N-конце есть сигнальная последовательность длиной обычно 15–50 аминокислотных остатков. Она образует амфипатическую спираль с несколькими положительно заряженными остатками и узнаётся рецепторами комплекса TOM наружной мембраны.Через канал TOM предшественник попадает в межмембранное пространство и связывается с транслоказой внутренней мембраны TIM23. Название транслоказы дано по одной из её субъединиц, Tim23, но в экспериментах на дрожжах путь, по которому проходит цепь, связан прежде всего с субъединицей Tim17 (Fielden 2023; Sim 2023). Дальнейшее перемещение сигнальной последовательности через внутреннюю мембрану требует мембранного потенциала: отрицательно заряженный матрикс притягивает положительно заряженный N-конец (Martin 1991).Одного потенциала недостаточно для переноса всего белка. В матриксе к входящей цепи присоединяется mtHsp70 — шаперон с ATPазной активностью, главный компонент импортного мотора PAM. Циклы связывания и гидролиза ATP позволяют mtHsp70 удерживать и протягивать цепь в матрикс. Другие компоненты мотора выполняют иные функции: Tim44 связывает mtHsp70 с транслоказой, а Pam18 стимулирует его ATPазную активность. После входа в матрикс протеаза MPP отщепляет сигнальную последовательность, и белок сворачивается в зрелую форму.Поэтому нарушение импорта может иметь разные причины: при деполяризации задерживается начальный перенос сигнала, а при недостатке ATP в матриксе — дальнейшее протягивание цепи. Сохранённый потенциал не гарантирует завершения импорта. Зависимость импорта от потенциала используется и для контроля качества: киназа PINK1 в здоровой митохондрии импортируется и расщепляется, а при деполяризации накапливается на наружной мембране (подробнее — в семинаре 12).Типичная ошибка Если потенциал сохранён, ATP для полного импорта не нужен.Δψm перемещает через внутреннюю мембрану только положительно заряженную сигнальную последовательность. Протягивание остальной цепи обеспечивает ATP-зависимый мотор PAM с mtHsp70, поэтому без ATP в матриксе импорт не завершается.У предшественника есть положительно заряженная N-концевая сигнальная последовательность. Δψm сохранён, но ATP для матричного мотора PAM недостаточно. Гарантирован ли полный импорт белка в матрикс?А. Нет: потенциал и ATP-зависимый цикл mtHsp70 выполняют разные функции. (верный вариант)Δψm способствует раннему переносу сигнальной последовательности, а ATP-зависимый мотор поддерживает последующие стадии транслокации.Б. Да: электрическое поле полностью заменяет работу матричных шаперонов. (неверный вариант)Электрический вклад не заменяет ATP-зависимые циклы моторного комплекса.В. Да: ATP нужен только для синтеза предшественника в цитозоле. (неверный вариант)Помимо синтеза предшественника, ATP требуется для работы матричного импортного мотора. Сохранение Δψm не устраняет эту потребность.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаMartin J., Mahlke K., Pfanner N. Role of an energized inner membrane in mitochondrial protein import. Δψ drives the movement of presequences. J Biol Chem. 1991;266:18051–18057. doi:10.1016/S0021-9258(18)55235-2Fielden L. F. et al. Central role of Tim17 in mitochondrial presequence protein translocation. Nature. 2023;621:627–634.Sim S. I. et al. Structural basis of mitochondrial protein import by the TIM23 complex. Nature. 2023;621:620–626.Wiedemann N., Pfanner N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annu Rev Biochem. 2017;86:685–714.Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Схема механизма; четыре сочетания условий показаны качественно. Белок с N-концевой сигнальной последовательностью, путь в матрикс; не все митохондриальные белки используют этот путь. Требование Δψm для переноса сигнальной последовательности — изолированные митохондрии Neurospora crassa и дрожжей (Martin 1991). Роль Tim17 в пути транслокации — структурные и функциональные данные на дрожжах (Fielden 2023; Sim 2023); для человека схема принята по гомологии.
Потенциал и транспорт · шаг 11 из 30Почему у митохондриальных белков несколько путей импортаМитохондриальные белки направляются в четыре компартмента: наружную мембрану, межмембранное пространство, внутреннюю мембрану и матрикс. Для этого существуют разные пути импорта. Большинство путей начинается с канала TOM, а дальше белки распределяются по адресу, который определяют сигналы в их последовательности.Белки матрикса с N-концевой сигнальной последовательностью идут через TOM и TIM23 и протягиваются мотором PAM.Переносчики внутренней мембраны семейства SLC25 (например, ANT) имеют внутренние сигналы: после TOM их ведут малые белки TIM межмембранного пространства к транслоказе TIM22.Белки, синтезированные на миторибосомах, встраиваются во внутреннюю мембрану со стороны матрикса инсертазой OXA1L; β-бочонки наружной мембраны встраивает SAM, а белки межмембранного пространства с остатками цистеина удерживает система MIA.Путь TOM–TIM23–PAM, описанный в предыдущем шаге, — основной, но не единственный. Адрес белка определяют сигналы в его последовательности: отщепляемая N-концевая последовательность, внутренние сигналы, мотивы остатков цистеина или особенности β-бочонка. Почти все ядерно кодируемые белки проходят через канал TOM, а после него пути расходятся.Переносчики внутренней мембраны семейства SLC25 — ANT, фосфатный переносчик и другие — не имеют отщепляемой сигнальной последовательности. После TOM их гидрофобные участки связывают малые белки TIM межмембранного пространства, которые предохраняют их от агрегации и передают транслоказе TIM22. TIM22 встраивает переносчик во внутреннюю мембрану; этот этап тоже зависит от мембранного потенциала.Белки наружной мембраны со структурой β-бочонка (например, VDAC и сам Tom40) после TOM возвращаются к наружной мембране и встраиваются комплексом SAM. Небольшие белки межмембранного пространства с остатками цистеина удерживаются там системой MIA, которая образует в них дисульфидные связи. Белки, кодируемые мтДНК, синтезируются на миторибосомах в матриксе и встраиваются во внутреннюю мембрану инсертазой OXA1L; миторибосома связана с мембраной, и встраивание идёт одновременно с синтезом.Поэтому нарушение одного пути не обязательно нарушает все остальные. Основная схема здесь дана для митохондрий человека; многие молекулярные детали установлены на дрожжах, и названия субъединиц у человека могут отличаться.Типичная ошибка Каждый белок митохондрии проходит через TOM и TIM23 в матрикс.TIM23 — путь белков с N-концевой сигнальной последовательностью. Переносчики внутренней мембраны встраиваются через TIM22, β-бочонки наружной мембраны — через SAM, белки межмембранного пространства удерживает MIA, а белки, синтезированные в митохондрии, встраивает OXA1L.Ядерно кодируемый переносчик семейства SLC25, например ANT, использует внутренние адресующие сигналы. Какой комплекс прежде всего рассматривают для его встраивания во внутреннюю мембрану после прохождения через TOM?А. Инсертазу OXA1L, участвующую во встраивании с матричной стороны. (неверный вариант)OXA1L участвует во встраивании с матричной стороны, в частности белков, синтезированных в митохондриях. Для указанного импортируемого переносчика классический путь связан с TIM22.Б. Комплекс SAM наружной мембраны. (неверный вариант)SAM участвует в сборке β-бочонковых белков наружной мембраны и не является основным ответом для данного груза.В. Транслоказу TIM22 внутренней мембраны. (верный вариант)Классический путь митохондриальных переносчиков связан с TIM22; его следует отличать от пути N-концевых сигнальных последовательностей через TIM23.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаWiedemann N., Pfanner N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annu Rev Biochem. 2017;86:685–714.Fielden L. F. et al. Central role of Tim17 in mitochondrial presequence protein translocation. Nature. 2023;621:627–634.Sim S. I. et al. Structural basis of mitochondrial protein import by the TIM23 complex. Nature. 2023;621:620–626.Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Карта путей — схема механизма для митохондрий человека; молекулярные детали получены преимущественно на дрожжах и отделены от схемы человека (Wiedemann 2017; Fielden 2023; Sim 2023). Энергетическая зависимость указана только там, где она обсуждается в тексте.
Потенциал и транспорт · шаг 12 из 30Как потенциал способствует поступлению Ca²⁺ через MCUCa²⁺ входит в матрикс через MCU — высокоизбирательный ионный канал внутренней мембраны. Энергию для этого переноса поставляет электрохимический градиент Ca²⁺, а не гидролиз ATP. Отрицательный потенциал матрикса притягивает двухзарядный катион, поэтому при деполяризации электрическая составляющая движущей силы ослабевает.MCU образует пору, по которой Ca²⁺ проходит по электрохимическому градиенту; канал не сопряжён с гидролизом ATP.Движущая сила входа складывается из разности концентраций Ca²⁺ и мембранного потенциала: отрицательный матрикс притягивает положительный ион.Каждый вошедший Ca²⁺ переносит два положительных заряда и сам может уменьшать модуль потенциала.Митохондриальный Ca²⁺-унипортер давно был известен как путь быстрого входа Ca²⁺ в матрикс, но его порообразующий белок MCU идентифицировали только в 2011 г. (Baughman 2011; De Stefani 2011). Ранее электрофизиологические записи на митопластах — митохондриях без наружной мембраны — показали, что унипортер является высокоизбирательным Ca²⁺-каналом (Kirichok 2004).Канал не расходует ATP. Ca²⁺ проходит через него по электрохимическому градиенту, который складывается из двух составляющих. Химическая составляющая — разность концентраций: свободная [Ca²⁺] в матриксе в покое близка к цитозольной и составляет порядка десятых долей микромоля, а около мест высвобождения Ca²⁺ из ЭПР она может быть значительно выше. Электрическая составляющая — мембранный потенциал: матрикс заряжен отрицательно и притягивает двухзарядный катион.Если при прочих равных условиях модуль потенциала уменьшается, электрическая составляющая ослабевает, и вход Ca²⁺ через тот же канал замедляется. Поэтому деполяризация митохондрий снижает их способность накапливать Ca²⁺.Вход Ca²⁺ электрогенен: каждый ион вносит в матрикс два положительных заряда. При большом потоке Ca²⁺ это само по себе уменьшает модуль потенциала, и для его поддержания нужен дополнительный перенос H⁺ дыхательной цепью. Регуляцию канала и роль локальной концентрации Ca²⁺ рассматривает раздел о контактах ЭПР и митохондрии.Отрицательный потенциал матрикса способствует и входу K⁺. Во внутренней мембране описаны K⁺-каналы mitoKATP и mitoBK. Канал mitoKATP подавляется миллимолярными концентрациями ATP; его образуют порообразующая субъединица MITOK и ATP-связывающая субъединица MITOSUR (Paggio 2019). Канал mitoBK активируется Ca²⁺ и зависит от потенциала; его кодирует ген KCNMA1, а в митохондрии белок направляет участок C-конца, включаемый при альтернативном сплайсинге (Singh 2013). Вход K⁺ вносит в матрикс положительный заряд; вслед за K⁺ и анионами в матрикс поступает вода, и объём матрикса увеличивается. Сверхэкспрессия MITOK вызывала набухание митохондрий и снижение Δψm, а удаление его гена — нестабильность Δψm и снижение окислительного фосфорилирования (Paggio 2019).Типичная ошибка MCU расходует ATP на каждый переносимый ион Ca²⁺.MCU — ионный канал, а не насос. Ca²⁺ проходит через него по электрохимическому градиенту, который создают разность концентраций и мембранный потенциал. ATP расходует, например, SERCA — Ca²⁺-ATPаза ЭПР.Модуль отрицательного потенциала матрикса уменьшили, сохранив концентрации Ca²⁺ и состояние MCU. Как изменится электрическая составляющая движущей силы входа Ca²⁺?А. Она увеличится, поскольку матрикс станет менее отрицательным. (неверный вариант)Менее отрицательный матрикс слабее способствует входу катиона. Здесь изменён именно электрический вклад.Б. Она уменьшится, поскольку ослабеет притяжение положительного иона к матриксу. (верный вариант)Электрический вклад определяется зарядом иона и разностью потенциалов. При уменьшении модуля отрицательного потенциала этот вклад ослабевает.В. Она не изменится, поскольку MCU получает энергию только от гидролиза ATP. (неверный вариант)MCU — ионный канал. Его проводимость не сопряжена с непосредственным гидролизом ATP.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаKirichok Y., Krapivinsky G., Clapham D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 2004;427:360–364. doi:10.1038/nature02246Baughman J. M., Perocchi F., Girgis H. S., Plovanich M., Belcher-Timme C. A., Sancak Y., Bao X. R., Strittmatter L., Goldberger O., Bogorad R. L., Koteliansky V., Mootha V. K. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 2011;476:341–345. doi:10.1038/nature10234De Stefani D., Raffaello A., Teardo E., Szabò I., Rizzuto R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 2011;476:336–340. doi:10.1038/nature10230Paggio A., Checchetto V., Campo A., Menabò R., Di Marco G., Di Lisa F., Szabo I., Rizzuto R., De Stefani D. Identification of an ATP-sensitive potassium channel in mitochondria. Nature. 2019;572:609–613.Singh H., Lu R., Bopassa J. C., Meredith A. L., Stefani E., Toro L. MitoBK(Ca) is encoded by the Kcnma1 gene, and a splicing sequence defines its mitochondrial location. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:10836–10841.Схема механизма; сравниваются ранние состояния при неизменных концентрациях Ca²⁺, проводимости канала и остальных условиях. MCU как высокоизбирательный канал — ток в митопластах из клеток COS-7 (Kirichok 2004); идентификация MCU — Baughman 2011 (клетки HeLa, печень мыши) и De Stefani 2011 (клетки HeLa, реконструкция в бислое). K⁺-каналы: mitoKATP — клетки и мыши, реконструкция MITOK и MITOSUR в липосомах и бислое (Paggio 2019); mitoBK — кардиомиоциты мыши и крысы (Singh 2013).
Потенциал и транспорт · шаг 13 из 30Как может сохраняться потенциал при отсутствии мтДНККлетки ρ⁰ не содержат мтДНК и поэтому не могут собрать дыхательную цепь и полноценную ATP-синтазу. При этом митохондрии у них есть, и импорт ядерно кодируемых белков продолжается. Пониженный мембранный потенциал в таких клетках поддерживает не перенос H⁺, а электрогенный обмен ATP⁴⁻ на ADP³⁻ через ANT вместе с гидролизом ATP в матриксе.Без 13 белков, кодируемых мтДНК, комплексы I, III и IV не собираются, а у ATP-синтазы нет субъединиц a (ATP6) и A6L (ATP8): полноценная F₀F₁ не образуется, и H⁺ через мембрану не переносится.ATP гликолиза входит в матрикс через ANT как ATP⁴⁻ в обмен на ADP³⁻: каждый цикл вносит в матрикс один отрицательный заряд.Неполный комплекс с ATPазной активностью F₁ гидролизует ATP в матриксе и образует ADP для следующего цикла обмена; так поддерживается пониженный Δψm.Клетки ρ⁰ — культивируемые клетки, полностью утратившие мтДНК (King 1989). Без мтДНК клетка не синтезирует 13 белков дыхательной цепи и ATP-синтазы, поэтому комплексы I, III и IV не работают, а у ATP-синтазы нет двух мембранных субъединиц, кодируемых мтДНК. ATP такие клетки получают гликолизом; для роста им добавляют в среду пируват и уридин.Тем не менее митохондрии в ρ⁰-клетках сохраняются, а ядерно кодируемые белки продолжают импортироваться — для этого нужен мембранный потенциал. Его источник был выяснен на клетках человека линии 143B (Appleby 1999; Buchet 1998). ANT работает в обратном обычному направлении: ATP⁴⁻ из цитозоля входит в матрикс, а ADP³⁻ выходит. Каждый цикл вносит в матрикс один отрицательный заряд.Чтобы обмен продолжался, ATP в матриксе должен превращаться в ADP. Это делает неполный комплекс ATP-синтазы с работающей частью F₁. Ингибиторы ANT и азид, ингибирующий F₁, снимали потенциал, а олигомицин, действующий на мембранную часть, — нет. В интактных ρ⁰-клетках модуль потенциала по оценке авторов не превышал примерно 67 мВ, то есть был ниже, чем в исходных клетках, но достаточным для импорта.Отсюда два вывода. Отсутствие мтДНК не означает отсутствия митохондрий и потенциала. И полноценная F₀F₁ в ρ⁰-клетке не работает как протонный насос: ответ на олигомицин у этих клеток иной, чем у клеток с мтДНК. Механизм описан для определённых линий клеток человека; при недостатке гликолитического ATP потенциал не поддерживается.Типичная ошибка Отсутствие мтДНК означает отсутствие митохондрий и любого Δψm.Митохондрии в ρ⁰-клетках сохраняются: почти все их белки кодирует ядро. Пониженный потенциал поддерживает электрогенный обмен ATP⁴⁻ на ADP³⁻ через ANT вместе с гидролизом ATP неполной ATP-синтазой в матриксе.В культивируемых ρ⁰-клетках отсутствует мтДНК, но сохраняются гликолиз и ядерно кодируемые белки митохондрий. Возможно ли сохранение пониженного Δψm и импорта части ядерно кодируемых белков?А. Невозможно: при отсутствии мтДНК внутренней мембраны митохондрий не существует. (неверный вариант)ρ⁰ означает отсутствие мтДНК, а не исчезновение органелл и их мембран.Б. Возможно: комплекс II в одиночку заменяет все протонные насосы дыхательной цепи. (неверный вариант)Комплекс II не перекачивает H⁺. Сохранение Δψm здесь объясняется другим механизмом.В. Возможно: потенциал может поддерживаться за счёт ATP и электрогенного обмена ANT. (верный вариант)В описанных клеточных системах импорт ATP⁴⁻ в обмен на экспорт ADP³⁻ создаёт электрический вклад. Гидролиз ATP в матриксе обеспечивает ADP для продолжения обмена. Этот механизм может поддерживать пониженный потенциал и часть импортных процессов.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаAppleby R. D., Porteous W. K., Hughes G., James A. M., Shannon D., Wei Y. H., Murphy M. P. Quantitation and origin of the mitochondrial membrane potential in human cells lacking mitochondrial DNA. Eur J Biochem. 1999;262:108–116. doi:10.1046/j.1432-1327.1999.00350.xBuchet K., Godinot C. Functional F1-ATPase essential in maintaining growth and membrane potential of human mitochondrial DNA-depleted ρ° cells. J Biol Chem. 1998;273:22983–22989.King M. P., Attardi G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 1989;246:500–503.Chinopoulos C. et al. Forward operation of adenine nucleotide translocase during F0F1-ATPase reversal: critical role of matrix substrate-level phosphorylation. FASEB J. 2010;24:2405–2416. doi:10.1096/fj.09-149898Схема механизма; уровни показаны качественно. Культивируемые клетки человека (линия 143B и производные ρ⁰-клетки), в которых описан ANT-зависимый механизм, при достаточном образовании ATP гликолизом (Appleby 1999; Buchet 1998). Оценка |Δψm| ≈ 67 мВ — верхняя граница для интактных клеток, получена при допущении, что весь накопленный зонд находится в митохондриях. Не все организмы и линии ведут себя одинаково; ответ ρ⁰-клеток на олигомицин нельзя переносить с клеток, содержащих мтДНК. Получение ρ⁰-клеток — King 1989.
Потенциал и транспорт · шаг 14 из 30Как раздельно проверяют потенциал и импорт белкаМембранный потенциал и импорт белка измеряют разными экспериментами. Сигнал катионного зонда TMRM — это не потенциал в милливольтах и тем более не число импортированных белков. Импорт проверяют отдельно: меченый предшественник инкубируют с митохондриями и выясняют, защищён ли он от протеазы.TMRM — липофильный катион; он распределяется через плазматическую и внутреннюю мембраны в соответствии с их потенциалами и накапливается в отрицательно заряженном матриксе.Интенсивность сигнала зависит также от режима измерения, массы митохондрий и потенциала плазматической мембраны; FCCP служит контролем полной деполяризации.Импорт подтверждают защитой меченого белка от протеиназы K и отщеплением сигнальной последовательности; детергент, растворяющий мембраны, снимает защиту.TMRM и TMRE — липофильные катионы, проходящие через мембраны. В равновесии они распределяются по закону Нернста: сначала между средой и цитозолем в соответствии с потенциалом плазматической мембраны, затем между цитозолем и матриксом в соответствии с Δψm. При низкой концентрации зонда (режим без гашения) яркость митохондрий тем выше, чем больше модуль потенциала. При высокой концентрации зонд накапливается так сильно, что флуоресценция гасится, и связь сигнала с потенциалом меняется: деполяризация сначала усиливает сигнал митохондрий и всей клетки, потому что зонд выходит из матрикса и гашение ослабевает.Поэтому падение флуоресценции TMRM может иметь разные причины: деполяризацию митохондрий, уменьшение их массы, изменение потенциала плазматической мембраны или выход зонда из клеток. Контроли обязательны: FCCP в конце эксперимента показывает сигнал при полной деполяризации, олигомицин — вклад ATP-синтазы. Перевод сигнала в милливольты требует отдельной калибровки (Gerencser 2012).Импорт белка проверяют в другом эксперименте. Предшественник, меченный радиоактивной аминокислотой, инкубируют с изолированными митохондриями, затем добавляют протеиназу K. Белок, вошедший в митохондрию, защищён мембранами и сохраняется; часто он ещё и укорачивается, потому что MPP отщепила сигнальную последовательность. Если мембраны растворить детергентом, защита исчезает. Если перед импортом снять потенциал разобщителем, защищённого продукта нет (Martin 1991).Только сопоставление обоих экспериментов позволяет связать частичную деполяризацию с нарушением импорта конкретного белка.Типичная ошибка Уменьшение интенсивности TMRM само по себе доказывает прекращение импорта.Сигнал TMRM зависит от режима измерения, массы митохондрий и потенциала плазматической мембраны. Даже подтверждённая частичная деполяризация не показывает, насколько нарушен импорт данного белка: импорт проверяют отдельным экспериментом с защитой от протеазы.После воздействия снизилась флуоресценция TMRM. Достаточно ли этого наблюдения, чтобы утверждать, что импорт белка в матрикс полностью прекратился?А. Недостаточно: нужно проверить условия регистрации зонда и сам импорт белка. (верный вариант)Сигнал зависит от нескольких факторов. Даже подтверждённая частичная деполяризация ещё не устанавливает степень нарушения конкретного импортного пути.Б. Достаточно: любое уменьшение флуоресценции означает полное исчезновение Δψm. (неверный вариант)Падение сигнала не означает автоматически нулевой потенциал. Требуются соответствующие контроли и режим измерения.В. Достаточно: интенсивность TMRM прямо равна числу импортированных молекул. (неверный вариант)TMRM отражает распределение потенциалчувствительного зонда и не измеряет число молекул импортированного белка.Эта тема относится к вопросу 2 практикума. Открыть сценарии вопроса 2 →Источники и условия научного выводаGerencser A. A., Chinopoulos C., Birket M. J., Jastroch M., Vitelli C., Nicholls D. G., Brand M. D. Quantitative measurement of mitochondrial membrane potential in cultured cells: calcium-induced de- and hyperpolarization of neuronal mitochondria. J Physiol. 2012;590:2845–2871. doi:10.1113/jphysiol.2012.228387Perry S. W., Norman J. P., Barbieri J., Brown E. B., Gelbard H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 2011;50:98–115.Martin J., Mahlke K., Pfanner N. Role of an energized inner membrane in mitochondrial protein import. Δψ drives the movement of presequences. J Biol Chem. 1991;266:18051–18057. doi:10.1016/S0021-9258(18)55235-2Fielden L. F. et al. Central role of Tim17 in mitochondrial presequence protein translocation. Nature. 2023;621:627–634.Учебная модель: яркость и полосы — условные качественные уровни, не данные эксперимента. Распределение катионного зонда через две мембраны, режимы с гашением и без него, необходимость калибровки — Gerencser 2012, Perry 2011. Эксперимент импорта с защитой от протеазы и зависимость от Δψm — изолированные митохондрии Neurospora crassa и дрожжей (Martin 1991); роль транслоказы — Fielden 2023. Для вопроса исходное наблюдение — изменение флуоресценции без калибровки и без измерения импорта.
Ca²⁺ и контакты с ЭПР · шаг 15 из 30Почему локальный сигнал Ca²⁺ отличается от среднего цитозольногоCa²⁺, выходящий из ЭПР через IP₃R, создаёт около открытого канала локальную микрообласть высокой концентрации. Митохондрия, расположенная в контакте с ЭПР, оказывается внутри этой микрообласти. Поэтому вход Ca²⁺ в митохондрии определяется не средней концентрацией в цитозоле, а концентрацией у их поверхности.IP₃R открывается при связывании IP₃ и выпускает Ca²⁺ из просвета ЭПР; около канала концентрация Ca²⁺ на короткое время много выше средней по цитозолю.В участках контакта мембраны ЭПР и наружная мембрана митохондрии сближены на десятки нанометров, но не сливаются; Ca²⁺ проходит наружную мембрану через VDAC, а внутреннюю — через MCU.Митохондрия вблизи канала получает высокую локальную концентрацию Ca²⁺, а удалённая — низкую, даже если средний сигнал по клетке одинаков.В покое свободная [Ca²⁺] в цитозоле составляет порядка 0,1 мкМ, а в просвете ЭПР — сотни микромолей. Когда гормон или медиатор вызывает образование IP₃, рецепторы IP₃R мембраны ЭПР открываются, и Ca²⁺ выходит в цитозоль. Ион быстро связывается белками-буферами и закачивается обратно в ЭПР Ca²⁺-ATPазой SERCA, поэтому около открытого канала возникает небольшая область высокой концентрации, которая с расстоянием быстро убывает.Многие митохондрии расположены вплотную к ЭПР. В участках контакта мембраны двух органелл сближены на расстояние порядка 10–50 нм и связаны белками; при этом каждая органелла сохраняет свою мембрану. У наружной мембраны митохондрии, находящейся ближе 50 нм к источнику Ca²⁺, концентрация Ca²⁺ может в десятки раз превышать среднюю по цитозолю (Cartes-Saavedra 2025). Классические эксперименты с адресованными зондами показали, что митохондрии, близкие к ЭПР, накапливают Ca²⁺ быстрее и сильнее (Rizzuto 1998).Через наружную мембрану Ca²⁺ проходит по каналам VDAC, а через внутреннюю — по каналу MCU. Белки, участвующие в связи органелл, включают комплекс IP₃R–GRP75–VDAC и митофузин 2, но это не сплошной «туннель» для Ca²⁺: ион проходит через цитозольный зазор и два разных канала. Роль митофузина 2 спорна: в одних моделях его удаление уменьшало число контактов, в других — увеличивало (Lim 2021).Участки ЭПР, прилегающие к митохондриям, называют MAM — митохондрия-ассоциированными мембранами. Это не отдельная органелла, а часть ЭПР. Расстояние между мембранами само по себе не измеряет поток Ca²⁺ — это обсуждается в шаге о методах.Состав контакта зависит от типа клеток. В сердечной мышце Ca²⁺ к митохондриям поступает и через рианодиновые рецепторы RyR2 саркоплазматического ретикулума: небольшая часть саркоплазматического ретикулума остаётся связанной с изолированными митохондриями сердца крысы и передаёт им Ca²⁺ локально (García-Pérez 2008). В MAM сосредоточен шаперон ЭПР SIGMAR1: при снижении [Ca²⁺] в ЭПР он отделяется от шаперона BiP, стабилизирует IP₃R3 и тем самым продлевает поступление Ca²⁺ в митохондрии (Hayashi 2007, клетки CHO). Положение митохондрий тоже регулируется: кинезин перемещает их по микротрубочкам, связываясь с белком наружной мембраны Miro через адаптер Milton; связывание Ca²⁺ с Miro останавливает движение митохондрий (Wang 2009, нейроны гиппокампа крысы).Типичная ошибка Средняя [Ca²⁺] в цитозоле полностью задаёт концентрацию у MCU.Концентрация Ca²⁺ в цитозоле неоднородна: около открытого IP₃R она много выше средней. Митохондрия в контакте с ЭПР получает высокую локальную концентрацию, удалённая — низкую, даже при одинаковом среднем сигнале.В двух клетках средний цитозольный сигнал Ca²⁺ одинаков. Может ли поступление Ca²⁺ в митохондрии различаться из-за организации контактов с ЭПР?А. Не может: средняя [Ca²⁺] одинакова во всех точках цитозоля. (неверный вариант)Среднее по клетке не означает пространственной однородности концентрации.Б. Может: локальная [Ca²⁺] у митохондриальной поверхности может различаться. (верный вариант)Одинаковое пространственное среднее не исключает разных локальных микрообластей Ca²⁺. Их положение относительно митохондрии влияет на поступление иона.В. Не может: в контакте мембраны сливаются и Ca²⁺ проходит без каналов. (неверный вариант)Контакт сохраняет самостоятельность мембран. Для пути Ca²⁺ важны мембранные каналы и локальная диффузия.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLim D., Dematteis G., Tapella L., Genazzani A. A., Calì T., Brini M., Verkhratsky A. Ca²⁺ handling at the mitochondria–ER contact sites in neurodegeneration. Cell Calcium. 2021;98:102453.Cartes-Saavedra B., Ghosh A., Hajnóczky G. The roles of mitochondria in global and local intracellular calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:456–475.Rizzuto R., Pinton P., Carrington W., Fay F. S., Fogarty K. E., Lifshitz L. M., Tuft R. A., Pozzan T. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca²⁺ responses. Science. 1998;280:1763–1766.García-Pérez C., Hajnóczky G., Csordás G. Physical coupling supports the local Ca²⁺ transfer between sarcoplasmic reticulum subdomains and the mitochondria in heart muscle. J Biol Chem. 2008;283:32771–32780.Hayashi T., Su T.-P. Sigma-1 receptor chaperones at the ER–mitochondrion interface regulate Ca²⁺ signaling and cell survival. Cell. 2007;131:596–610.Wang X., Schwarz T. L. The mechanism of Ca²⁺-dependent regulation of kinesin-mediated mitochondrial motility. Cell. 2009;136:163–174.Учебная модель: профиль концентрации качественный, числа на оси условные. Сравнивается разное расстояние при одинаковом высвобождении, буферировании, состоянии MCU и Δψm. Порядок величин (до ≈ 10 мкМ в пределах 50 нм от источника при среднем сигнале ≈ 0,1–1 мкМ) — Cartes-Saavedra 2025; связь близости к ЭПР с накоплением Ca²⁺ — клетки HeLa с адресованным экворином и цифровой микроскопией (Rizzuto 1998); противоречивые данные о митофузине 2 — Lim 2021; RyR2 и митохондрии — изолированные митохондрии сердца крысы (García-Pérez 2008); SIGMAR1 — клетки CHO (Hayashi 2007); Miro, Milton и кинезин — нейроны гиппокампа крысы (Wang 2009).
Ca²⁺ и контакты с ЭПР · шаг 16 из 30Как MCU и его регуляторы ограничивают поступление Ca²⁺Митохондриальный Ca²⁺-унипортер — комплекс нескольких белков. MCU образует пору, EMRE связывает пору с регуляторными субъединицами, а MICU1 и MICU2 со стороны межмембранного пространства контролируют её открывание. При низкой концентрации Ca²⁺ MICU-белки удерживают пору закрытой, а при повышенной — связывают Ca²⁺ и пропускают ион.Четыре субъединицы MCU образуют избирательную для Ca²⁺ пору во внутренней мембране; EMRE необходим для работы поры у млекопитающих и связывает её с MICU1.MICU1 в паре с MICU2 (или MICU3) содержит Ca²⁺-связывающие EF-мотивы: при низкой [Ca²⁺] димер ограничивает проводимость поры, при повышенной — связывает Ca²⁺ и снимает ограничение.Без MCU быстрый вход Ca²⁺ в матрикс почти исчезает; без MICU1 пора открыта и при низкой [Ca²⁺], а результат зависит от ткани и компенсаторных изменений.Унипортер состоит из порообразующего белка MCU и регуляторных субъединиц. Четыре субъединицы MCU образуют в мембране канал с высокой избирательностью для Ca²⁺. Небольшой белок EMRE пронизывает мембрану рядом с порой: у млекопитающих без него пора не работает, и он же закрепляет на комплексе регуляторную субъединицу MICU1.MICU1 расположен со стороны межмембранного пространства и образует димер с MICU2 или MICU3. Эти белки содержат EF-мотивы, связывающие Ca²⁺. При низкой концентрации Ca²⁺ димер MICU ограничивает прохождение ионов через пору. Когда концентрация у поверхности митохондрии повышается (по оценкам, выше ≈ 0,4–0,6 мкМ), EF-мотивы связывают Ca²⁺, и пора открывается. Поэтому зависимость входа от концентрации крутая: при покое ион почти не входит, а в микрообласти около IP₃R вход резко ускоряется (Cartes-Saavedra 2025).Удаление MCU в клетках и тканях мыши почти устраняет быстрый вход Ca²⁺ в митохондрии, хотя медленное накопление Ca²⁺ другими путями может сохраняться. Удаление MICU1 даёт иной результат: пора перестаёт закрываться при низкой концентрации, и Ca²⁺ входит в матрикс уже в покое. У мышей без MICU1 при этом наблюдали компенсаторное снижение содержания MCU и EMRE, поэтому итог зависит от ткани и длительности изменения.MCU и MICU1 — не два названия одного канала, а разные белки одного комплекса: пора и её регулятор.Типичная ошибка MCU и MICU1 — два названия одного и того же канала.MCU — порообразующая субъединица во внутренней мембране, MICU1 — Ca²⁺-связывающий регулятор со стороны межмембранного пространства. Без MCU пора отсутствует, без MICU1 пора есть, но теряет закрывание при низкой концентрации Ca²⁺.При одинаковом цитозольном импульсе Ca²⁺ и сохранном Δψm из модели удалён MCU. Как изменится быстрый вход Ca²⁺ в матрикс по сравнению с исходной моделью?А. Он возрастёт, поскольку MICU1 самостоятельно заменит проводящий канал. (неверный вариант)Регуляторный белок MICU1 не заменяет отсутствующий порообразующий MCU.Б. Он уменьшится, поскольку отсутствует основной проводящий компонент комплекса. (верный вариант)MCU образует проводящий путь комплекса. Это не означает, что любой остаточный Ca²⁺ в матриксе обязан исчезнуть.В. Он сохранится, поскольку MCU переносит только H⁺, а не Ca²⁺. (неверный вариант)MCU проводит Ca²⁺. Перенос H⁺ дыхательной цепью и вход Ca²⁺ — разные процессы.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаBaughman J. M., Perocchi F., Girgis H. S., Plovanich M., Belcher-Timme C. A., Sancak Y., Bao X. R., Strittmatter L., Goldberger O., Bogorad R. L., Koteliansky V., Mootha V. K. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 2011;476:341–345. doi:10.1038/nature10234De Stefani D., Raffaello A., Teardo E., Szabò I., Rizzuto R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 2011;476:336–340. doi:10.1038/nature10230Kirichok Y., Krapivinsky G., Clapham D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 2004;427:360–364. doi:10.1038/nature02246Cartes-Saavedra B., Ghosh A., Hajnóczky G. The roles of mitochondria in global and local intracellular calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:456–475.Схема механизма; состояния качественные. Сравниваются ранние MCU-зависимые ответы при сопоставимом цитозольном импульсе и сохранном Δψm; компенсаторные перестройки не моделируются. Состав комплекса и порог открывания MICU1–MICU2 (≈ 0,4–0,6 мкМ) — Cartes-Saavedra 2025; идентификация MCU — Baughman 2011, De Stefani 2011; MCU как канал — Kirichok 2004.
Ca²⁺ и контакты с ЭПР · шаг 17 из 30Как Ca²⁺ связывает клеточную активность с образованием NADHCa²⁺ в матриксе активирует три дегидрогеназы, образующие NADH: пируватдегидрогеназный комплекс, NAD-зависимую изоцитратдегидрогеназу (IDH3) и оксоглутаратдегидрогеназу (OGDH). Механизмы разные: пируватдегидрогеназа активируется через дефосфорилирование фосфатазой PDP1, а две другие дегидрогеназы — прямым связыванием Ca²⁺.Киназа PDK фосфорилирует субъединицу E1 пируватдегидрогеназного комплекса и ингибирует его; Ca²⁺ активирует фосфатазу PDP1, которая снимает это ингибирующее фосфорилирование.IDH3 и OGDH активируются Ca²⁺ без фосфорилирования: связывание иона повышает их сродство к субстратам. Половина максимальной активации OGDH достигается при [Ca²⁺] около 1 мкМ, IDH3 — при более высокой концентрации.Образуется больше NADH, дыхательная цепь получает больше электронов, и при доступных субстратах, O₂ и ADP синтез ATP может ускориться вслед за потребностью.Многие сигналы, повышающие [Ca²⁺] в цитозоле, одновременно увеличивают расход ATP: Ca²⁺ запускает сокращение мышечного волокна, секрецию, работу насосов. Ca²⁺, вошедший в матрикс, позволяет митохондриям ускорить образование NADH одновременно с ростом потребности, а не только после того, как ADP начнёт накапливаться.Пируватдегидрогеназный комплекс (PDH) превращает пируват в ацетил-CoA и образует NADH. Его активность регулируется фосфорилированием: киназы PDK фосфорилируют субъединицу E1 и ингибируют комплекс, а фосфатазы PDP снимают фосфатные группы. Из двух фосфатаз чувствительна к Ca²⁺ только PDP1: Ca²⁺ способствует её связыванию с комплексом, и доля дефосфорилированного, активного PDH растёт (Denton 2009).NAD-зависимая изоцитратдегидрогеназа цикла трикарбоновых кислот (IDH3) и оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (OGDH) регулируются иначе. Ca²⁺ непосредственно связывается с ними и повышает их сродство к субстратам; фосфорилирование здесь не участвует. Чувствительность ферментов к Ca²⁺ разная: в митохондриях сердца крысы половина максимальной активации OGDH достигалась при [Ca²⁺] около 1 мкМ, а IDH3 — при 5–43 мкМ, причём в присутствии ATP требовалась в 3–10 раз более высокая концентрация, чем в присутствии ADP (Rutter 1988; Denton 2009). Ещё одна Ca²⁺-чувствительная дегидрогеназа, FAD-зависимая глицерол-3-фосфатдегидрогеназа, расположена на наружной поверхности внутренней мембраны и отвечает на цитозольный Ca²⁺.Итог — больше NADH и больше электронов для дыхательной цепи. Ca²⁺ сам не синтезирует ATP: ускорение синтеза возможно, только если дыхательная цепь и ATP-синтаза работают, а субстраты, O₂ и ADP доступны. Регуляция этих дегидрогеназ ионами Ca²⁺ описана у позвоночных (Denton 2009).Типичная ошибка Ca²⁺ одинаково активирует все изоформы всех дегидрогеназ.Пируватдегидрогеназа активируется через Ca²⁺-чувствительную фосфатазу PDP1 (PDP2 к Ca²⁺ нечувствительна), IDH3 и OGDH — прямым связыванием Ca²⁺. NADP-зависимые изоцитратдегидрогеназы и большинство других ферментов матрикса к Ca²⁺ нечувствительны.В матриксе умеренно повысилась [Ca²⁺], активировалась PDP1; пируват доступен. Какое изменение пируватдегидрогеназного комплекса соответствует этому механизму?А. Дефосфорилирование комплекса способствует увеличению его активности. (верный вариант)PDP1 — фосфатаза. Она снимает ингибирующее фосфорилирование пируватдегидрогеназного комплекса.Б. PDP1 повышает активность комплекса без изменения его фосфорилирования. (неверный вариант)В рассматриваемом механизме PDP1 действует как фосфатаза. Активация связана со снятием ингибирующего фосфорилирования.В. PDP1 фосфорилирует комплекс и тем самым повышает его активность. (неверный вариант)Вариант меняет направление модификации: фосфатаза катализирует дефосфорилирование.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаDenton R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 2009;1787:1309–1316. doi:10.1016/j.bbabio.2009.01.005Rutter G. A., Denton R. M. Regulation of NAD⁺-linked isocitrate dehydrogenase and 2-oxoglutarate dehydrogenase by Ca²⁺ ions within toluene-permeabilized rat heart mitochondria. Interactions with regulation by adenine nucleotides and NADH/NAD⁺ ratios. Biochem J. 1988;252:181–189.Cartes-Saavedra B., Ghosh A., Hajnóczky G. The roles of mitochondria in global and local intracellular calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:456–475.Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма; изменения качественные. Позвоночные, сохранные ферменты, доступный пируват; кратковременный умеренный импульс Ca²⁺ в матриксе; субстраты, O₂ и ADP доступны. Утверждение о PDP относится к Ca²⁺-чувствительной изоформе PDP1. K½ активации ионами Ca²⁺: OGDH — около 1 мкМ, IDH3 — 5–43 мкМ в зависимости от отношения ATP/ADP (митохондрии сердца крысы, сделанные проницаемыми толуолом, — Rutter 1988; обзор, в том числе очищенные ферменты, — Denton 2009). В обзорах для IDH3 приводят 5–50 мкМ (как в справке практикума). K½ активации не равна константе диссоциации Ca²⁺.
Ca²⁺ и контакты с ЭПР · шаг 18 из 30Как NCLX участвует в восстановлении матричного Ca²⁺После импульса Ca²⁺ выводится из матрикса прежде всего Na⁺-зависимым путём, который классически связывают с обменником NCLX. Вход через MCU быстрый, выход — медленнее, поэтому матричный сигнал продолжается дольше цитозольного. Большая часть вошедшего Ca²⁺ связывается буферами матрикса, поэтому свободная концентрация Ca²⁺ и его общая концентрация — разные величины.При Na⁺-зависимом выходе Ca²⁺ покидает матрикс в обмен на Na⁺, который входит в матрикс; энергию даёт градиент Na⁺, поддерживаемый за счёт протондвижущей силы. В учебной модели этот путь назван NCLX; какой белок переносит ионы, в работах 2025–2026 гг. обсуждается.Матричные буферы — прежде всего фосфат — связывают большую часть вошедшего Ca²⁺; свободная [Ca²⁺] поэтому много меньше общей концентрации Ca²⁺ в матриксе.Когда вход прекращается, свободная [Ca²⁺] снижается со скоростью выхода; если этот выход ослаблен, спад замедляется.Прекращение входа через MCU не удаляет из матрикса уже вошедший Ca²⁺. В митохондриях сердца и мозга его выводит в основном Na⁺-зависимый путь внутренней мембраны: Ca²⁺ выходит, а Na⁺ входит в матрикс. С 2010 г. этот обмен связывают с белком NCLX: при снижении его содержания в клетках Na⁺-зависимый выход Ca²⁺ уменьшался (Palty 2010). Градиент Na⁺ поддерживают Na⁺/H⁺-обменники, использующие градиент H⁺, поэтому выход Ca²⁺ в конечном счёте тоже зависит от протондвижущей силы. Описаны и другие пути выхода, например обменник TMBIM5, работающий без Na⁺ (Cartes-Saavedra 2025).Скорость Na⁺-зависимого выхода меньше максимальной скорости входа через MCU. Поэтому при коротком импульсе Ca²⁺ в матриксе повышается быстро, а снижается медленнее: матричный сигнал продолжается дольше цитозольного. Если этот выход подавлен генетически или фармакологически, спад замедляется ещё больше. Для такого эксперимента применяют ингибитор CGP-37157, но он действует и на другие системы переноса Ca²⁺, а по новым данным связывается с белком TMEM65 (Zhang 2025). Поэтому ответ на CGP-37157 согласуется с участием CGP-чувствительного выхода Ca²⁺, но сам по себе не доказывает ни этого, ни роли именно NCLX.Работы 2025–2026 гг. сделали молекулярную основу этого пути предметом спора. В нескольких линиях клеток человека без NCLX Na⁺-зависимый выход Ca²⁺, подавляемый CGP-37157, сохранялся (Fan 2025). О том, на какие ионы обменивает Ca²⁺ сам NCLX, данные расходятся: по одним экспериментам — на H⁺ (Fan 2025: ооциты шпорцевой лягушки и митохондрии клеток HeLa), по другим — на разные одновалентные катионы, в том числе Na⁺ (Zhang 2026: белок на плазматической мембране клеток HEK). Белок внутренней мембраны TMEM65 одни авторы считают необходимым регулятором NCLX (Garbincius 2025), другие — самостоятельным Na⁺/Ca²⁺-обменником (Zhang 2025; Vetralla 2026). Поэтому в этом семинаре «выход через NCLX» означает Na⁺-зависимый выход Ca²⁺ в классической интерпретации, а не окончательно установленный белок-переносчик; точная стехиометрия обмена тоже обсуждается.В матриксе большая часть вошедшего Ca²⁺ связывается буферами, прежде всего фосфатом, а также ATP и другими анионами. Свободная [Ca²⁺] в матриксе в покое составляет порядка 0,1–0,2 мкМ. Общая концентрация, включающая свободный и связанный Ca²⁺ в расчёте на тот же объём матрикса, после сильной нагрузки может во много раз превышать свободную. Индикатор Ca²⁺ регистрирует свободные ионы, поэтому одинаковый сигнал индикатора не означает одинакового общего количества Ca²⁺ в матриксе.Типичная ошибка После закрытия MCU выход Ca²⁺ больше не нужен.Закрытие MCU прекращает вход, но не удаляет уже вошедший Ca²⁺. Чтобы свободная [Ca²⁺] вернулась к исходной, ион должен выйти из матрикса, прежде всего Na⁺-зависимым путём; связанный буферами Ca²⁺ высвобождается и выводится постепенно.После одинакового импульса вход Ca²⁺ прекратился; NCLX исходно выводит Ca²⁺ из матрикса. При сохранных Δψm, Na⁺-градиенте и буферировании активность NCLX снизили. Как может измениться спад свободной [Ca²⁺] в матриксе?А. Спад может замедлиться из-за уменьшения одного из путей выхода Ca²⁺. (верный вариант)При заданных сопоставимых условиях уменьшение выхода через NCLX способствует более длительному сохранению матричного сигнала. Конкретная кинетика зависит и от других путей и буферирования.Б. Спад ускорится, поскольку NCLX в этих условиях переносит Ca²⁺ только внутрь. (неверный вариант)Здесь рассматривается обычное направление Na⁺-зависимого выхода Ca²⁺. Обратное направление требует иных условий.В. Сигнал сразу станет нулевым, поскольку закрытие MCU удаляет весь Ca²⁺. (неверный вариант)Прекращение входа не удаляет уже накопленный Ca²⁺; нужны выход и взаимодействие с буферами.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLim D., Dematteis G., Tapella L., Genazzani A. A., Calì T., Brini M., Verkhratsky A. Ca²⁺ handling at the mitochondria–ER contact sites in neurodegeneration. Cell Calcium. 2021;98:102453.Palty R., Silverman W. F., Hershfinkel M., Caporale T., Sensi S. L., Parnis J., Nolte C., Fishman D., Shoshan-Barmatz V., Herrmann S., Khananshvili D., Sekler I. NCLX is an essential component of mitochondrial Na⁺/Ca²⁺ exchange. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:436–441.Cartes-Saavedra B., Ghosh A., Hajnóczky G. The roles of mitochondria in global and local intracellular calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:456–475.Fan M., Tsai C.-W., Zhang J., Zhang J., Krishnan A. R., Liu T.-Y., Huang Y.-L., Aydin D., Du S., Sobecks B. L., Rodriguez M. X., Reiter A. H., Bertozzi C. R., Dror R. O., Tsai M.-F., Feng L. Structure and mechanism of the mitochondrial calcium transporter NCLX. Nature. 2025;646:1272–1280.Garbincius J. F., Salik O., Cohen H. M., Choya-Foces C., Mangold A. S., Makhoul A. D., Schmidt A. E., Khalil D. Y., Doolittle J. J., Wilkinson A. S., Murray E. K., Lazaropoulos M. P., Hildebrand A. N., Tomar D., Elrod J. W. TMEM65 regulates and is required for NCLX-dependent mitochondrial calcium efflux. Nat Metab. 2025;7:714–729.Zhang J. L., Chang Y.-C., Lai P.-H., Yeh H.-I., Tsai C.-W., Huang Y.-L., Liu T.-Y., Lee I.-C., Foulon N., Xu Y., Rao B., Shih H.-M., Tu Y.-C., Reyes A. V., Xu S.-L., Feng L., Tsai M.-F. TMEM65 functions as the mitochondrial Na⁺/Ca²⁺ exchanger. Nat Cell Biol. 2025;27:1301–1310.Vetralla M., Wischhof L., Kahsay A., Cadenelli V., Scifo E., Xie B., Sbrissa M., Habert M. S., Ehninger D., Rizzuto R., Bano D., De Stefani D. TMEM65-dependent Ca²⁺ extrusion safeguards mitochondrial homeostasis. Nat Commun. 2026;17:923 (опубликовано онлайн 17.12.2025).Zhang L., Han Y., Zeng W., Xue J., Wang Y., Jiang Y. Molecular mechanisms of mitochondrial Ca²⁺ exchanger NCLX. Nat Commun. 2026;17.Учебная модель: кривые рассчитаны по условным параметрам (одинаковый импульс входа, постоянная доля связанного Ca²⁺, насыщаемый выход); это не данные эксперимента. Сохранены Δψm и градиент Na⁺, вход и буферирование сопоставимы; объём матрикса постоянен, поэтому свободная и общая концентрации отнесены к одному объёму. Выход в модели — Na⁺-зависимый путь, классически приписываемый NCLX (Palty 2010). Сохранение этого выхода в линиях клеток без NCLX и обмен Ca²⁺ на H⁺ через NCLX — Fan 2025 (клетки HeLa, HEK293, HCT116; ооциты шпорцевой лягушки, где часть белка находилась на плазматической мембране); TMEM65 как необходимый регулятор NCLX — Garbincius 2025 (клетки и мыши); TMEM65 как Na⁺/Ca²⁺-обменник — Zhang 2025 (в том числе белок в липосомах) и Vetralla 2026; широкая катионная избирательность NCLX — белок на плазматической мембране клеток HEK (Zhang 2026), что ограничивает перенос вывода на митохондрии. Другие пути и буферирование фосфатом — Cartes-Saavedra 2025; обзор — Lim 2021.
Ca²⁺ и контакты с ЭПР · шаг 19 из 30Когда кальциевый сигнал становится перегрузкойКраткий импульс Ca²⁺ ускоряет образование NADH и затем выводится. Длительное или чрезмерное поступление Ca²⁺ ведёт к его накоплению в матриксе — кальциевой перегрузке. Общее количество Ca²⁺ в матриксе растёт, когда вход превышает выход; буферы ограничивают рост свободной концентрации, но не выводят Ca²⁺ из матрикса. Чрезмерное накопление повышает вероятность перехода проницаемости внутренней мембраны, но единого порога гибели нет.При длительном входе общее количество Ca²⁺ в матриксе растёт, потому что Na⁺-зависимый выход медленнее входа через MCU.Накопленный Ca²⁺ вместе с фосфатом и окислительным стрессом способствует переходу проницаемости внутренней мембраны; этому противодействуют сохранный потенциал и восстановленное состояние матрикса.Вход каждого Ca²⁺ расходует электрическую составляющую градиента; при перегрузке митохондрия хуже поддерживает Δψm и синтез ATP.Последствия одного и того же иона зависят от дозы и длительности. Краткий умеренный импульс повышает свободную [Ca²⁺] в матриксе до микромолярного диапазона, активирует дегидрогеназы и затем выводится из матрикса. При длительном или очень сильном поступлении — например, при постоянном высвобождении Ca²⁺ из ЭПР или при избыточном входе Ca²⁺ в клетку — вход надолго превышает выход, и общее количество Ca²⁺ в матриксе растёт.Накопленный Ca²⁺ сам по себе не ускоряет синтез ATP. Напротив, каждый входящий ион вносит в матрикс положительные заряды: вход Ca²⁺ расходует электрическую составляющую градиента, и меньшая её часть остаётся для синтеза ATP. При значительном накоплении Ca²⁺ вместе с фосфатом и окислительным стрессом повышается вероятность митохондриального перехода проницаемости — резкого увеличения проницаемости внутренней мембраны (следующий шаг).Где проходит граница между сигналом и перегрузкой, зависит от многих условий: скорости выхода, буферной ёмкости матрикса, содержания фосфата, окислительно-восстановительного состояния и способности митохондрии поддерживать мембранные градиенты. Поэтому универсальной концентрации Ca²⁺, после которой митохондрия обязательно повреждается, нет; на схеме риск показан качественно.Типичная ошибка Чем выше матричный Ca²⁺, тем больше синтез ATP при любых условиях.Ca²⁺ ускоряет образование NADH в определённом диапазоне концентраций и при работающей цепи. Чрезмерное накопление расходует мембранный потенциал на вход ионов и повышает вероятность перехода проницаемости, что нарушает синтез ATP.Почему краткий импульс матричного Ca²⁺ и длительное накопление Ca²⁺ могут иметь разные последствия?А. Ca²⁺ при любой длительности действует только как субстрат синтеза ATP. (неверный вариант)Ca²⁺ — регулятор и переносимый ион, а не субстрат образования ATP; его действие ограничено состоянием системы.Б. Любой краткий импульс обязательно разрушает внутреннюю мембрану. (неверный вариант)Краткие физиологические сигналы не равнозначны обязательному повреждению. Важны интенсивность, длительность и условия.В. При длительном накоплении повышается риск нарушения мембранных градиентов и функции. (верный вариант)Умеренный сигнал способен поддерживать метаболическую регуляцию, тогда как перегрузка зависит от баланса входа, выхода, буферирования и состояния митохондрии.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLim D., Dematteis G., Tapella L., Genazzani A. A., Calì T., Brini M., Verkhratsky A. Ca²⁺ handling at the mitochondria–ER contact sites in neurodegeneration. Cell Calcium. 2021;98:102453.Denton R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 2009;1787:1309–1316. doi:10.1016/j.bbabio.2009.01.005Bernardi P. et al. Identity, structure, and function of the mitochondrial permeability transition pore: controversies, consensus, recent advances, and future directions. Cell Death Differ. 2023;30:1869–1885. doi:10.1038/s41418-023-01187-0Учебная модель: свободный Ca²⁺ и риск перехода проницаемости рассчитаны по условным параметрам и показаны качественно; это не предсказание жизнеспособности ткани. Зависимость перехода проницаемости от Ca²⁺, фосфата и окислительного стресса — Bernardi 2023; регуляция дегидрогеназ в микромолярном диапазоне — Denton 2009; баланс входа, выхода и буферирования — Lim 2021.
Ca²⁺ и контакты с ЭПР · шаг 20 из 30Чем переход проницаемости отличается от MOMPМитохондриальный переход проницаемости (mPT) — резкое увеличение проницаемости внутренней мембраны для небольших молекул. MOMP — пермеабилизация наружной мембраны белками BAX и BAK. Это разные события в разных мембранах; они могут быть связаны, но ни одно не следует из другого обязательно.При перегрузке Ca²⁺ вместе с фосфатом и окислительным стрессом во внутренней мембране открывается неспецифическая пора; циклофилин D облегчает её открывание.Через пору выравниваются концентрации малых веществ, потенциал падает, матрикс набухает; растяжение может вторично повредить наружную мембрану.При MOMP белки BAX и BAK образуют проницаемые структуры в наружной мембране; цитохром c выходит в цитозоль и запускает образование апоптосомы и активацию каспаз.Митохондриальный переход проницаемости — это внезапное увеличение проницаемости внутренней мембраны для растворённых веществ массой примерно до 1,5 кДа. Его вызывает накопление Ca²⁺ в матриксе, особенно вместе с высоким содержанием фосфата и окислительным стрессом. Белок матрикса циклофилин D облегчает открывание поры, а его ингибитор циклоспорин A повышает необходимую для открывания нагрузку Ca²⁺. Молекулярный состав поры обсуждается: рассматривают участие ATP-синтазы и переносчика ANT, а VDAC, когда-то считавшийся обязательным компонентом, для перехода проницаемости не нужен (Baines 2007; Bernardi 2023).Когда пора открыта, потенциал на внутренней мембране исчезает, синтез ATP прекращается, а вода входит в матрикс вслед за осмотически активными веществами. Матрикс набухает; при этом наружная мембрана может разорваться, и белки межмембранного пространства выходят в цитозоль. Клетки мышей без циклофилина D были устойчивы к некоторым формам некротической гибели, а на апоптотические стимулы отвечали обычно (Nakagawa 2005).MOMP — другой механизм. При внутреннем пути апоптоза белки BAX и BAK олигомеризуются в наружной мембране и делают её проницаемой для белков межмембранного пространства. Цитохром c выходит в цитозоль, связывается с белком APAF1, образуется апоптосома, и активируются каспазы. Внутренняя мембрана при этом может долго оставаться непроницаемой.Выход цитохрома c в цитозоль сам по себе не показывает, какой механизм сработал: он возможен и при MOMP, и при разрыве наружной мембраны после набухания. Поэтому mPT и MOMP нельзя считать двумя названиями одной поры или обязательными звеньями одной цепи.Типичная ошибка mPTP и MOMP — разные названия одной поры.Переход проницаемости затрагивает внутреннюю мембрану и связан с Ca²⁺, фосфатом, окислительным стрессом и циклофилином D. MOMP затрагивает наружную мембрану и осуществляется белками BAX и BAK. Механизмы могут взаимодействовать, но это разные события.В одном случае возникает неселективная проницаемость внутренней мембраны для малых растворённых веществ с набуханием матрикса. В другом цитохром c выходит через BAX/BAK-зависимые структуры наружной мембраны. Как соотносятся эти события?А. Это переход проницаемости в обоих случаях: выход цитохрома c требует набухания. (неверный вариант)BAX/BAK-зависимая MOMP может происходить без набухания матрикса, связанного с переходом проницаемости внутренней мембраны.Б. Это MOMP в обоих случаях: изменение проницаемости относится к наружной мембране. (неверный вариант)Первый случай прямо относится к внутренней мембране и неспецифическому переходу проницаемости. MOMP обозначает проницаемость наружной мембраны.В. Это переход проницаемости внутренней мембраны и MOMP соответственно. (верный вариант)Митохондриальный переход проницаемости и MOMP могут взаимодействовать, но различаются по затронутой мембране и механизму.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаBernardi P. et al. Identity, structure, and function of the mitochondrial permeability transition pore: controversies, consensus, recent advances, and future directions. Cell Death Differ. 2023;30:1869–1885. doi:10.1038/s41418-023-01187-0Baines C. P., Kaiser R. A., Sheiko T., Craigen W. J., Molkentin J. D. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat Cell Biol. 2007;9:550–555.Nakagawa T. et al. Cyclophilin D-dependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death. Nature. 2005;434:652–658. doi:10.1038/nature03317Bock F. J., Tait S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:85–100.Схема механизма; события показаны качественно, без обязательной последовательности. Состав поры и роль ATP-синтазы и ANT — предмет исследований (Bernardi 2023); необязательность VDAC — митохондрии мышей без VDAC1, VDAC3 или обоих и фибробласты без всех трёх изоформ VDAC (Baines 2007); роль циклофилина D в некрозе, но не в апоптозе — мыши без циклофилина D (Nakagawa 2005); MOMP и апоптосома — Bock 2020.
Ca²⁺ и контакты с ЭПР · шаг 21 из 30Как сопоставляют локальный Ca²⁺, матричный сигнал и контакт мембранКонтакт ЭПР и митохондрии, концентрацию Ca²⁺ и ток через MCU измеряют разными методами, и каждый метод даёт свою величину. Геометрия контакта не измеряет перенос иона: для вывода о переносе Ca²⁺ нужен функциональный сигнал в нужных компартментах.Генетически кодируемые индикаторы с сигналом адресации регистрируют свободную [Ca²⁺] в цитозоле, на поверхности митохондрий или в матриксе; нужны контроли pH и правильной локализации.Расстояние между мембранами измеряют электронной микроскопией, сверхразрешающей микроскопией или сенсорами сближения; обычный световой микроскоп нанометровый зазор не разрешает.Ток через унипортер регистрируют методом пэтч-кламп на митопластах — митохондриях без наружной мембраны.Свободную [Ca²⁺] в определённом компартменте измеряют генетически кодируемыми индикаторами: экворином, GCaMP и их вариантами. К белку-индикатору присоединяют сигнал адресации, например N-концевую последовательность белка матрикса, и индикатор накапливается в матриксе. Затем регистрируют изменение флуоресценции или люминесценции во времени после стимула. Необходимы контроли: проверка локализации индикатора, его чувствительности к pH (у некоторых флуоресцентных индикаторов сигнал меняется при сдвиге pH), а также запись цитозольного сигнала в тех же условиях.Геометрию контакта оценивают по-другому. Электронная микроскопия и электронная томография показывают расстояние между мембранами ЭПР и митохондрии с нанометровым разрешением, но на фиксированных препаратах. Сверхразрешающая световая микроскопия разрешает объекты мельче предела обычного микроскопа и позволяет работать с более сохранными образцами. Сенсоры сближения — пары флуоресцентных белков для FRET или фрагменты, восстанавливающие сигнал только при близком расположении, — выявляют сближение мембран в живых клетках. Совпадение окрасок ЭПР и митохондрий в обычном световом микроскопе не разрешает зазор в десятки нанометров.Ток через унипортер прямо измерили на митопластах — митохондриях, у которых наружная мембрана удалена осмотическим разрывом. Электрод присасывают к внутренней мембране и регистрируют ток Ca²⁺ при заданном потенциале (Kirichok 2004).Каждый метод отвечает на свой вопрос. Увеличение площади контакта не доказывает усиления переноса Ca²⁺, а содержание MCU — его проводимости. Для такого вывода нужно сравнить динамику Ca²⁺ в соответствующих компартментах при сопоставимом исходном высвобождении Ca²⁺ из ЭПР и Δψm.Типичная ошибка Более тесный контакт мембран сам по себе доказывает увеличение потока Ca²⁺.Расстояние между мембранами — структурный показатель. Поток Ca²⁺ зависит также от высвобождения из ЭПР, состояния MCU и Δψm, поэтому его измеряют отдельно — по динамике свободного Ca²⁺ в цитозоле и в матриксе.На изображениях увеличилась площадь сближения ЭПР и митохондрий. Какое дополнительное наблюдение нужно для вывода об изменении переноса Ca²⁺?А. Только повторное измерение площади того же контакта при другом увеличении. (неверный вариант)Повторная оценка геометрии повышает надёжность описания контакта, но не заменяет измерение Ca²⁺.Б. Динамика Ca²⁺ в соответствующих компартментах при сопоставимых исходных условиях. (верный вариант)Геометрия контакта не измеряет перенос иона. Нужны функциональный сигнал, правильная адресация индикаторов и учёт Δψm и исходного высвобождения Ca²⁺.В. Только увеличение содержания MCU в тех же клетках. (неверный вариант)Содержание канала не измеряет его текущую проводимость или перенос Ca²⁺. Нужна динамика иона при сопоставимых условиях.Эта тема относится к вопросу 3 практикума. Открыть сценарии вопроса 3 →Источники и условия научного выводаLim D., Dematteis G., Tapella L., Genazzani A. A., Calì T., Brini M., Verkhratsky A. Ca²⁺ handling at the mitochondria–ER contact sites in neurodegeneration. Cell Calcium. 2021;98:102453.Kirichok Y., Krapivinsky G., Clapham D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 2004;427:360–364. doi:10.1038/nature02246Rizzuto R., Pinton P., Carrington W., Fay F. S., Fogarty K. E., Lifshitz L. M., Tuft R. A., Pozzan T. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca²⁺ responses. Science. 1998;280:1763–1766.Csordás G., Renken C., Várnai P., Walter L., Weaver D., Buttle K. F., Balla T., Mannella C. A., Hajnóczky G. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 2006;174:915–921.Cartes-Saavedra B., Ghosh A., Hajnóczky G. The roles of mitochondria in global and local intracellular calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26:456–475.Принципиальные схемы методов, не данные экспериментов. Ток унипортера в митопластах — клетки COS-7 (Kirichok 2004); близость ЭПР и накопление Ca²⁺ — адресованный экворин и микроскопия в клетках HeLa (Rizzuto 1998); электронная томография и искусственные связки ЭПР с митохондриями — Csordás 2006; обзор методов и ограничений — Lim 2021, Cartes-Saavedra 2025. Не следует объединять разные препараты, виды и методики в один якобы проведённый эксперимент.
Два генома и гетероплазмия · шаг 22 из 30Почему дыхательный аппарат зависит от двух геномовДыхательный аппарат человека собирается из продуктов двух геномов. Митохондриальная ДНК кодирует 13 белков, 22 тРНК и 2 рРНК, а все остальные митохондриальные белки — более тысячи — кодирует ядро. Комплекс II целиком кодируется ядром; белки мтДНК входят в состав комплексов I, III, IV и ATP-синтазы. Это и есть двойной генетический контроль.мтДНК человека — кольцевая молекула длиной около 16,6 тыс. пар нуклеотидов; её 13 белков — гидрофобные субъединицы комплексов I, III, IV и V, синтезируемые на миторибосомах в матриксе.22 тРНК и 2 рРНК мтДНК нужны для митохондриальной трансляции; все белки самой системы трансляции, репликации и транскрипции кодирует ядро.Субъединицы, кодируемые ядром, синтезируются в цитозоле, импортируются и собираются вместе с митохондриальными субъединицами при участии ядерно кодируемых факторов сборки.Последовательность мтДНК человека определили в 1981 г. (Anderson 1981). Это кольцевая молекула длиной около 16,6 тыс. пар нуклеотидов, содержащая 37 генов: 13 кодируют белки, 22 — тРНК и 2 — рРНК. Все 13 белков — субъединицы дыхательных комплексов: семь субъединиц комплекса I (ND1–ND6 и ND4L), цитохром b комплекса III, три субъединицы цитохромоксидазы (COX1–COX3) и две субъединицы ATP-синтазы (ATP6 и ATP8). тРНК и рРНК мтДНК используются только для синтеза этих 13 белков на миторибосомах.Все остальные белки митохондрии кодирует ядро — по обзору Russell 2020, более 1200. Среди них большинство субъединиц дыхательных комплексов, все четыре субъединицы комплекса II, белки миторибосом, ферменты репликации и транскрипции мтДНК и факторы сборки комплексов. Ядерно кодируемые белки синтезируются в цитозоле и импортируются, а митохондриально кодируемые синтезируются в матриксе. Комплексы I, III, IV и V собираются только тогда, когда доступны субъединицы обоих происхождений.Поэтому дефект дыхательной цепи может быть вызван патогенным вариантом в любом из двух геномов. Варианты ядерных генов наследуются по законам Менделя; аутосомный ген представлен в клетке двумя копиями, и вариант может находиться в одной из них или в обеих — проявление зависит от гена и самого варианта. мтДНК человека наследуется по материнской линии, а её вариант может присутствовать лишь в части многочисленных молекул мтДНК клетки.Происхождение двух геномов объясняет эндосимбиотическая теория: митохондрии произошли от бактерий, и большая часть их генов в ходе эволюции перешла в ядро. Почему небольшая часть генов осталась в органелле, обсуждается; одна из гипотез связывает это с возможностью регулировать синтез ключевых гидрофобных субъединиц прямо на месте сборки.Типичная ошибка Все белки дыхательной цепи кодируются мтДНК.мтДНК кодирует только 13 белков. Большинство субъединиц дыхательных комплексов, все субъединицы комплекса II и все белки, обеспечивающие репликацию и экспрессию самой мтДНК, кодирует ядро.Какое утверждение о генетическом контроле комплексов окислительного фосфорилирования человека верно?А. Все субъединицы комплексов I–V кодируются митохондриальной ДНК. (неверный вариант)Большинство митохондриальных белков, включая многие субъединицы и факторы сборки, кодируется ядерными генами.Б. Все субъединицы комплекса II кодируются ядерными генами; часть субъединиц комплексов I, III, IV и V — мтДНК. (верный вариант)У человека 13 белков, кодируемых мтДНК, входят в состав комплексов I, III, IV и V. Все субъединицы комплекса II кодируются ядерными генами.В. Все субъединицы комплекса II кодируются мтДНК, а субъединицы комплексов I, III, IV и V — ядерными генами. (неверный вариант)Здесь обращено распределение: все субъединицы II кодируются ядерными генами, а у остальных перечисленных комплексов есть вклад мтДНК.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRussell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Anderson S., Bankier A. T., Barrell B. G., de Bruijn M. H., Coulson A. R., Drouin J., Eperon I. C., Nierlich D. P., Roe B. A., Sanger F., Schreier P. H., Smith A. J., Staden R., Young I. G. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 1981;290:457–465.Signes A., Fernandez-Vizarra E. Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I–V and supercomplexes. Essays Biochem. 2018;62:255–270.Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Нельсон Д., Кокс М. Основы биохимии Ленинджера. Том 2.Схема механизма. Числа 37/13/22/2 относятся к мтДНК человека (Anderson 1981), а не ко всем эукариотам. Число субъединиц в комплексах — принятый подсчёт для комплексов млекопитающих (Signes 2018; совпадает с практикумом); подсчёт зависит от того, учитывают ли дополнительные субъединицы и изоформы. Число ядерно кодируемых митохондриальных белков — Russell 2020.
Два генома и гетероплазмия · шаг 23 из 30Как экспрессия мтДНК связана со сборкой комплексовЭкспрессия мтДНК проходит несколько этапов: транскрипцию, процессинг РНК, трансляцию на миторибосомах, встраивание белка в мембрану и сборку комплекса с ядерно кодируемыми субъединицами. Нарушение любого этапа может помешать образованию комплекса, поэтому наличие мРНК ещё не означает, что комплекс собран.РНК-полимераза POLRMT вместе с TFAM и TFB2M транскрибирует мтДНК с образованием длинных полицистронных предшественников РНК.Нуклеазы вырезают из предшественника тРНК, расположенные между генами мРНК и рРНК, и высвобождают отдельные РНК; мРНК стабилизируются белками, в частности LRPPRC.Миторибосома, связанная с внутренней мембраной, синтезирует белок, OXA1L встраивает его в мембрану, и он собирается в комплекс с импортированными субъединицами.Транскрипцию мтДНК осуществляет митохондриальная РНК-полимераза POLRMT, кодируемая ядром. Для начала транскрипции с промоторов мтДНК в очищенной системе достаточно двух факторов — TFAM и TFB2M (Litonin 2010). Транскрипция идёт на большие расстояния, и образуются длинные полицистронные предшественники, содержащие сразу много генов. Белок MTERF1, связывающийся с мтДНК сразу за генами рРНК, долго считали регулятором соотношения рРНК и мРНК. У мышей без MTERF1 содержание рРНК не изменилось, но снизилась транскрипция с промотора лёгкой цепи; на этом основании авторы заключили, что MTERF1 останавливает транскрипцию противоположной цепи мтДНК и не даёт ей мешать началу транскрипции с промотора лёгкой цепи (Terzioglu 2013).В мтДНК гены тРНК расположены между генами мРНК и рРНК. Нуклеазы узнают тРНК в составе предшественника и вырезают их: по 5′-концу тРНК предшественник разрезает митохондриальная RNase P — у человека это белковый комплекс из трёх субъединиц (MRPP1–3), в отличие от рибонуклеопротеиновой RNase P бактерий и ядра (Holzmann 2008), а по 3′-концу — другая эндонуклеаза. При этом освобождаются и отдельные мРНК и рРНК. Такую схему назвали моделью тРНК-пунктуации (Ojala 1981). Дальше РНК созревают: к тРНК присоединяется CCA-конец, мРНК полиаденилируются и стабилизируются белками, например LRPPRC. Эти белки участвуют в определённых этапах, а не управляют всей экспрессией.Миторибосомы синтезируют 13 белков, используя 22 тРНК и 2 рРНК мтДНК. Миторибосома связана с внутренней мембраной, и новосинтезированный гидрофобный белок сразу встраивается в мембрану инсертазой OXA1L (Itoh 2021). Для трансляции отдельных мРНК нужны свои активаторы: например, TACO1 необходим для эффективного синтеза COX1 (Weraarpachai 2009).Наконец, белки мтДНК собираются в комплексы вместе с импортированными ядерно кодируемыми субъединицами при участии факторов сборки. Транскрипт, белок и собранный комплекс — разные уровни: при сохранной мРНК, но нарушенной трансляции субъединица не синтезируется, и комплекс не собирается. Несобранные и повреждённые белки удаляют протеазы митохондрий: LONP1 — в матриксе, AAA-протеазы внутренней мембраны — YME1L1 с активным центром в межмембранном пространстве и m-AAA-протеаза с активным центром в матриксе; OMA1 активируется при стрессе, например при потере мембранного потенциала, и расщепляет белок слияния OPA1 (Deshwal 2020).Типичная ошибка Наличие мРНК субъединицы означает, что соответствующий комплекс уже собран.Между мРНК и собранным комплексом есть трансляция, встраивание в мембрану и сборка с ядерно кодируемыми субъединицами. Если нарушен любой из этих этапов, мРНК есть, а комплекса нет.В клетке сохранена мРНК митохондриальной субъединицы, но нарушена её трансляция. Что можно заключить о наличии собранного комплекса?А. Комплекс обязательно собран, поскольку его ядерные субъединицы продолжают синтезироваться. (неверный вариант)Продолжение синтеза субъединиц, кодируемых ядерными генами, не компенсирует нарушение синтеза субъединицы, кодируемой мтДНК. Для сборки необходимы оба компонента.Б. Комплекс обязательно собран, поскольку для сборки достаточно самой мРНК. (неверный вариант)мРНК служит матрицей для синтеза белка и не заменяет его в дыхательном комплексе.В. Сохранение мРНК само по себе не гарантирует синтез субъединицы и сборку. (верный вариант)Транскрипт, белок и собранный комплекс — разные уровни. Между ними необходимы трансляция, встраивание и сборка с другими субъединицами.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRussell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Litonin D. et al. Human mitochondrial transcription revisited: only TFAM and TFB2M are required for transcription of the mitochondrial genes in vitro. J Biol Chem. 2010;285:18129–18133. doi:10.1074/jbc.C110.128918Ojala D., Montoya J., Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Nature. 1981;290:470–474.Itoh Y. et al. Mechanism of membrane-tethered mitochondrial protein synthesis. Science. 2021;371:846–849. doi:10.1126/science.abe0763Weraarpachai W., Antonicka H., Sasarman F., Seeger J., Schrank B., Kolesar J. E., Lochmüller H., Chevrette M., Kaufman B. A., Horvath R., Shoubridge E. A. Mutation in TACO1, encoding a translational activator of COX I, results in cytochrome c oxidase deficiency and late-onset Leigh syndrome. Nat Genet. 2009;41:833–837.Holzmann J., Frank P., Löffler E., Bennett K. L., Gerner C., Rossmanith W. RNase P without RNA: identification and functional reconstitution of the human mitochondrial tRNA processing enzyme. Cell. 2008;135:462–474.Terzioglu M., Ruzzenente B., Harmel J., Mourier A., Jemt E., López M. D., Kukat C., Stewart J. B., Wibom R., Meharg C., Habermann B., Falkenberg M., Gustafsson C. M., Park C. B., Larsson N.-G. MTERF1 binds mtDNA to prevent transcriptional interference at the light-strand promoter but is dispensable for rRNA gene transcription regulation. Cell Metab. 2013;17:618–626.Deshwal S., Fiedler K. U., Langer T. Mitochondrial proteases: multifaceted regulators of mitochondrial plasticity. Annu Rev Biochem. 2020;89:501–528.Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Схема механизма для митохондрий человека; скорости этапов и полный набор факторов созревания РНК не показаны. Минимальная система транскрипции POLRMT–TFAM–TFB2M — очищенные белки человека (Litonin 2010); модель тРНК-пунктуации — Ojala 1981; связь миторибосомы с OXA1L — структурные данные (Itoh 2021); RNase P — белки человека, реконструкция активности (Holzmann 2008); MTERF1 — мыши с удалённым геном (Terzioglu 2013); протеазы — обзор Deshwal 2020. Разные дефекты дают разную остаточную функцию.
Два генома и гетероплазмия · шаг 24 из 30Как ядро регулирует биогенез и поддержание мтДНКЯдро не только кодирует большинство субъединиц, но и регулирует количество митохондриального аппарата и поддерживает саму мтДНК. Совокупность этих процессов называют митохондриальным биогенезом. Коактиватор PGC-1α усиливает экспрессию ядерных генов митохондриальных белков, а ядерно кодируемые TFAM и белки репликации POLG, POLG2 и TWNK поддерживают мтДНК.PGC-1α сам не связывается с ДНК: он коактивирует транскрипционные факторы, прежде всего NRF1 и NRF-2 (GABP), которые активируют гены митохондриальных белков, в том числе TFAM.TFAM упаковывает мтДНК в нуклеоиды и участвует в её транскрипции; ДНК-полимераза γ (POLG и POLG2) и хеликаза TWNK реплицируют мтДНК.Дефект ядерного гена поддержания мтДНК может уменьшить число копий мтДНК или привести к её делециям без какого-либо исходного варианта мтДНК.Количество митохондрий и их белков меняется при физической нагрузке, охлаждении, изменении питания. Одним из регуляторов этого служит PGC-1α — коактиватор транскрипции. Он не связывается с ДНК сам, а взаимодействует с транскрипционными факторами и усиливает их действие. В культуре мышечных клеток повышение содержания PGC-1 усиливало экспрессию NRF1 и NRF-2 и через них — экспрессию TFAM и митохондриальный биогенез (Wu 1999). PGC-1α — не единственный регулятор: в сеть входят и другие коактиваторы и факторы (Scarpulla 2011).NRF-2 — второе название фактора GABP (Virbasius 1993). Его не следует путать с NRF2 (NFE2L2) — фактором ответа на окислительный стресс, который регулирует антиоксидантные гены (Moi 1994). Названия похожи, а белки и функции разные.TFAM кодируется ядром, импортируется в матрикс и упаковывает мтДНК в нуклеоиды; он же участвует в транскрипции мтДНК. Реплицируют мтДНК ядерно кодируемые белки: каталитическая субъединица ДНК-полимеразы γ (POLG), её вспомогательная субъединица (POLG2) и хеликаза TWNK. Эти белки вместе с белком, связывающим одноцепочечную ДНК, образуют минимальную систему репликации in vitro (Korhonen 2004).Поэтому митохондриальная болезнь может быть вызвана мутацией ядерного гена. Мутации POLG или TWNK могут уменьшать число копий мтДНК (истощение мтДНК) или приводить к множественным делециям — без исходной гетероплазмии одного точечного варианта. Связь идёт и в обратную сторону: состояние митохондрий меняет экспрессию ядерных генов (ретроградная сигнализация); стрессовые ответы такого рода рассматривает семинар 10.Типичная ошибка TFAM — фактор транскрипции ядерных генов, а PGC-1α сам связывает их промоторы.TFAM работает в матриксе: упаковывает мтДНК и участвует в её транскрипции. PGC-1α — коактиватор: он не связывает ДНК сам, а усиливает действие ядерных факторов NRF1 и NRF-2 (GABP).При дефекте ядерного гена POLG число копий мтДНК уменьшилось, но исследуемого мутантного варианта мтДНК нет. Возможен ли дефицит дыхательной функции?А. Невозможен: любой дефект дыхания требует высокой доли мутантной мтДНК. (неверный вариант)Митохондриальные болезни могут быть связаны с ядерными генами и истощением мтДНК, а не только с гетероплазмией точечной мутации.Б. Возможен: уменьшение числа копий мтДНК может снизить синтез кодируемых ею белков. (верный вариант)Число копий и доля определённого варианта — разные характеристики. Ядерные дефекты поддержания мтДНК могут нарушать дыхательный аппарат и без данного варианта.В. Невозможен: ядерные гены не участвуют в поддержании мтДНК. (неверный вариант)POLG кодируется в ядре; его продукт участвует в репликации мтДНК.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRussell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Wu Z. et al. Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1. Cell. 1999;98:115–124. doi:10.1016/S0092-8674(00)80611-XScarpulla R.C. Metabolic control of mitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatory network. Biochim Biophys Acta. 2011;1813:1269–1278. doi:10.1016/j.bbamcr.2010.09.019Virbasius J.V., Virbasius C.A., Scarpulla R.C. Identity of GABP with NRF-2, a multisubunit activator of cytochrome oxidase expression, reveals a cellular role for an ETS domain activator of viral promoters. Genes Dev. 1993;7:380–392. doi:10.1101/gad.7.3.380Moi P., Chan K., Asunis I., Cao A., Kan Y.W. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91:9926–9930. doi:10.1073/pnas.91.21.9926Korhonen J.A., Pham X.H., Pellegrini M., Falkenberg M. Reconstitution of a minimal mtDNA replisome in vitro. EMBO J. 2004;23:2423–2429. doi:10.1038/sj.emboj.7600257Структурная карта связей, а не модель фиксированного усиления биогенеза. PGC-1, NRF и TFAM — культура мышечных клеток C2C12 (Wu 1999); идентичность GABP и NRF-2 — Virbasius 1993; NRF2 (NFE2L2) — Moi 1994; минимальная система репликации — очищенные белки человека (Korhonen 2004); болезни поддержания мтДНК — Russell 2020. Причины болезни зависят от конкретного варианта гена.
Два генома и гетероплазмия · шаг 25 из 30Почему эффект гетероплазмии может проявляться нелинейноПри гетероплазмии в клетке сосуществуют молекулы мтДНК разных вариантов; при гомоплазмии все анализируемые молекулы одинаковы. Функция обычно снижается не пропорционально доле варианта, а нелинейно: пока молекул дикого типа достаточно, дефект скрыт, а после некоторой доли проявляется. Эту долю называют порогом гетероплазмии.Каждая клетка содержит сотни или тысячи копий мтДНК; патогенный вариант может присутствовать в части из них.Мутации мтДНК функционально рецессивны: молекулы дикого типа обеспечивают синтез нормальных субъединиц, а у комплексов есть резерв мощности.Поэтому функция почти не меняется до высокой доли варианта, а затем резко падает; где именно — зависит от варианта, ткани и выбранного показателя.Митохондриальная ДНК присутствует в клетке во многих копиях. Если патогенный вариант возник в части молекул, клетка гетероплазмична; долю варианта выражают отношением числа молекул с вариантом к общему числу проанализированных молекул. Если все молекулы несут один вариант, клетка гомоплазмична.Мутации мтДНК функционально рецессивны: оставшиеся молекулы дикого типа продолжают кодировать нормальные субъединицы. Кроме того, мощность дыхательной цепи в покое обычно используется не полностью. Поэтому при росте доли варианта функция сначала почти не меняется, а затем, когда молекул дикого типа становится слишком мало, снижается резко. По обзору Russell 2020, для биохимического дефекта в отдельной клетке патогенный вариант обычно должен достигать высокой доли — более 70 %.Порог — не свойство варианта вообще, а результат сравнения в определённых условиях. Он зависит от самого варианта (вариант гена тРНК затрагивает синтез всех 13 белков, вариант гена одной субъединицы — один комплекс), от ткани и её потребности в ATP, от выбранного показателя и критерия «дефицита». В клетках с вариантом m.3243A>G при постепенном росте его доли экспрессия генов менялась скачкообразно в нескольких диапазонах (Picard 2014).Поэтому универсальной границы вроде «60–90 % для всех болезней» нет. Одна и та же доля варианта не означает одинаковой тяжести болезни: у носителей одного варианта при сходной гетероплазмии проявления сильно различаются, в том числе из-за ядерных генетических факторов (Russell 2020).Типичная ошибка Одна доля мутантной мтДНК соответствует одинаковой тяжести любой болезни.Порог зависит от варианта, ткани, измеряемой функции и критерия дефицита, а тяжесть болезни — ещё и от ядерного генетического фона. Одна и та же доля варианта может давать разные последствия.Для одного варианта мтДНК найден порог снижения определённого дыхательного показателя. Можно ли использовать это число как общий порог всех митохондриальных болезней?А. Можно: доля мутантной мтДНК всегда прямо равна доле погибающих клеток. (неверный вариант)Доля молекул варианта не определяет непосредственно ни распределение по клеткам, ни гибель клеток.Б. Можно: любой ген мтДНК изменяет все комплексы в одинаковой степени. (неверный вариант)Белок-кодирующий вариант и вариант тРНК могут иметь разный спектр последствий; даже варианты одного гена не равнозначны.В. Нельзя: порог зависит от варианта, клеточного контекста и выбранной функции. (верный вариант)Порог — результат определённого функционального сравнения. Его перенос на другой вариант, ткань или показатель требует самостоятельного обоснования.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRussell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Picard M., Zhang J., Hancock S., Derbeneva O., Golhar R., Golik P., O'Hearn S., Levy S., Potluri P., Lvova M., Davila A., Lin C. S., Perin J. C., Rappaport E. F., Hakonarson H., Trounce I. A., Procaccio V., Wallace D. C. Progressive increase in mtDNA 3243A>G heteroplasmy causes abrupt transcriptional reprogramming. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:E4033–E4042. doi:10.1073/pnas.1414028111Учебная модель, общая с практикумом (вопрос 4), в упрощённом виде: обеспеченность субъединицей f = min(1, (1 − h)/0,40) — полного синтеза субъединицы достигают уже 40 % молекул дикого типа (условный параметр практикума), относительная мощность комплекса g = (1 + R)·f / (R + f), R — условный параметр резерва; критерий дефицита задан как доля мощности, необходимая при низкой или высокой потребности. Кривая — не данные пациента и не диагностический порог. Нелинейный ответ на m.3243A>G — цибриды с разной долей варианта (Picard 2014); порог > 70 % для дефекта в отдельной клетке и клиническая изменчивость — Russell 2020.
Два генома и гетероплазмия · шаг 26 из 30Почему одинаковая гетероплазмия не означает одинакового числа копий дикого типаДоля варианта — относительная величина; число копий мтДНК — абсолютная. Одинаковая доля варианта в клетках с разным числом копий означает разное абсолютное число молекул дикого типа. Арифметика простая, но она ещё не говорит, хватит ли этих молекул для функции.Число копий дикого типа равно общему числу копий, умноженному на долю дикого типа: Nдт = Nобщ · (1 − h).При h = 70 % и 1000 копиях остаётся 300 молекул дикого типа, а при 500 копиях — 150.Хватит ли этих молекул, зависит от экспрессии, потребности ткани и типа варианта: вариант тРНК нарушает синтез всех 13 белков, вариант субъединицы — один комплекс.Чтобы сравнивать клетки, нужно различать два показателя. Доля варианта h — это отношение числа молекул с вариантом к общему числу молекул мтДНК. Число копий — сколько всего молекул мтДНК находится в клетке или в образце в расчёте на выбранную единицу (клетку, диплоидный ядерный геном).Пусть в клетке X 1000 копий мтДНК, в клетке Y — 500, и в обеих доля варианта 70 %. Тогда доля дикого типа — 30 %, и в X остаётся 1000 · 0,3 = 300 молекул дикого типа, а в Y — 500 · 0,3 = 150. Доля одинаковая, а абсолютное число нормальных молекул различается вдвое. Число мутантных молекул — 700 и 350.Из этой арифметики ещё не следует, что Y работает вдвое хуже. Функция зависит от того, сколько РНК и белка синтезируется с каждой молекулы, какова потребность ткани и сколько резерва у комплексов. Значение имеет и тип варианта. Вариант в гене одной субъединицы затрагивает один комплекс. Вариант в гене тРНК, например m.3243A>G в гене тРНК лейцина, нарушает синтез всех 13 белков мтДНК и поэтому затрагивает комплексы I, III, IV и V.Поэтому в генетическом анализе определяют и долю варианта, и число копий (шаг о методах), а о функции судят по отдельным измерениям.Типичная ошибка При одинаковой гетероплазмии число молекул дикого типа одинаково.Одинакова только доля. Абсолютное число молекул дикого типа равно общему числу копий, умноженному на долю дикого типа, и при разном числе копий различается.В каждой из двух клеток есть только молекулы мтДНК дикого типа и данного мутантного варианта. В X всего 1000 копий, в Y — 500; в обеих доля мутантного варианта 70 %. Сколько копий дикого типа остаётся в каждой клетке?А. В X и Y — по 300 копий дикого типа. (неверный вариант)Одинаковая доля не устраняет различия общего числа молекул: в Y их вдвое меньше.Б. В X — 300, в Y — 150 копий дикого типа. (верный вариант)Доля дикого типа равна 30 %. Умножение на общее число даёт 300 и 150; вывод о функции требует дополнительных условий.В. В X — 700, в Y — 350 копий дикого типа. (неверный вариант)Это число копий мутантного варианта, а не дикого типа.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRussell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Арифметический пример по заданным значениям: Nобщ = 1000 и 500, h = 0,70; это не измерение клеток и не кривая болезни. Не предполагается, что каждая копия дикого типа вносит одинаковый вклад во всех тканях. Влияние варианта тРНК на все белки мтДНК — Russell 2020.
Два генома и гетероплазмия · шаг 27 из 30Как наследование и сегрегация меняют распределение вариантов мтДНКмтДНК человека наследуется по материнской линии. При делениях клеток молекулы распределяются между дочерними клетками случайно, и доля варианта у них может различаться — это митотическая сегрегация. В зародышевой линии на одном из этапов передаётся небольшое эффективное число молекул — генетическое бутылочное горлышко; поэтому дети одной матери могут получить очень разную долю варианта.При делении клетки копии мтДНК распределяются между дочерними клетками случайно, а репликация отдельных молекул не связана с клеточным циклом.Чем меньше эффективное число независимо передаваемых единиц, тем сильнее доли варианта у потомков отклоняются от исходной в обе стороны.Случайный дрейф меняет распределение долей, не сдвигая его направленно; направленный сдвиг требует отбора, например отбора против тяжёлых вариантов в зародышевой линии.При оплодотворении митохондрии сперматозоида, как правило, не передаются потомству, и мтДНК человека наследуется от матери. Если у матери гетероплазмия, её ооциты получают из общего набора лишь часть молекул. При каждом делении клетки копии мтДНК распределяются между дочерними клетками случайно; кроме того, отдельные молекулы реплицируются независимо от клеточного цикла. Поэтому доля варианта в разных клетках и тканях одного человека может различаться.В зародышевой линии этот эффект особенно силён. Многие исследования указывают на этап, на котором передаётся небольшое эффективное число молекул или единиц сегрегации, — генетическое бутылочное горлышко. Его механизм и биологический смысл обсуждаются (Xie 2026). Эффективный размер выборки — параметр, описывающий итоговый разброс; это не буквальное число молекул в каждом ооците.Следствие видно в семьях: дети одной матери с гетероплазмией могут получить очень разную долю варианта (Russell 2020). Если отбора нет, средняя доля у потомков близка к материнской, а разброс тем больше, чем меньше эффективная выборка. Отбор — отдельный процесс: показано, что патогенные варианты часто передаются через женскую зародышевую линию хуже нейтральных (Xie 2026).Отсюда прямой переход к клинике. Женщина с гетероплазмическим вариантом не может заранее знать, какую долю варианта получит ребёнок. Одна из возможностей — преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ-мт): после экстракорпорального оплодотворения у эмбриона берут биопсию нескольких клеток, определяют в ней долю варианта и для переноса выбирают эмбрион с наименьшей долей. Метод подходит не при всех вариантах и не всем женщинам, а число эмбрионов с низкой долей варианта ограничено (Russell 2020). Насколько доля в биопсии отражает весь эмбрион и как она меняется до рождения, показывают собранные в открытом «Атласе ПГТ-мт» опубликованные данные о гетероплазмии мтДНК в эмбрионах — с источником каждого значения.Бутылочное горлышко объясняет разброс долей варианта у потомков, но не определяет, при какой доле нарушается функция: это биохимический порог, рассмотренный выше.Типичная ошибка Бутылочное горлышко непосредственно создаёт один универсальный порог функции.Бутылочное горлышко меняет распределение долей варианта у потомков. Порог функции — другая зависимость: он определяется вариантом, тканью и показателем.В учебной модели исходная доля варианта мтДНК равна 50 %. Размер независимой случайной выборки молекул уменьшили; отбора нет. Как изменится распределение долей варианта у потомков при многократном повторении?А. Доля варианта обязательно вырастет одинаково у каждого потомка. (неверный вариант)Случайная выборка может увеличить или уменьшить долю; направленный сдвиг требует дополнительных факторов, например отбора.Б. Доли у всех потомков обязательно станут равны исходной доле. (неверный вариант)При конечной случайной выборке возникают отклонения от исходной доли; меньшая выборка обычно усиливает их.В. Разброс долей обычно увеличится при многократном повторении выборки. (верный вариант)Меньшая выборка усиливает случайные различия. Это утверждение о распределении, а не об обязательном направлении изменения в каждой клетке.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRussell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Xie Q., Walker H. E., Minczuk M., Chiaratti M. R., Chinnery P. F. Inheritance and selection of the mitochondrial genome. Nat Rev Genet. 2026.Nitsch L., Lareau C. A., Ludwig L. S. Mitochondrial genetics through the lens of single-cell multi-omics. Nat Genet. 2024;56:1355–1365.Атлас ПГТ-мт — открытая база опубликованных данных о гетероплазмии мтДНК в эмбрионах при преимплантационном генетическом тестировании (ПГТ-мт), с источником каждого значения. https://fresll.github.io/pgt-mt-atlas/ru/ (дата обращения: 23.10.2026).Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. Том 2.Учебная модель: доли у потомков получены независимыми случайными выборками заданного размера (биномиальное распределение) из набора с долей 50 %, без отбора; эффективные размеры 200 и 10 условны, это не подсчёт молекул в реальном ооците. Модель не предсказывает риск болезни конкретного ребёнка. Механизмы горлышка и отбор в зародышевой линии — Xie 2026; разброс у потомков и преимплантационная диагностика (выбор эмбриона с наименьшей долей варианта, ограничения метода) — Russell 2020; опубликованные значения гетероплазмии эмбрионов при ПГТ-мт с первоисточниками — «Атлас ПГТ-мт».
Два генома и гетероплазмия · шаг 28 из 30Как разделяют ядерный и митохондриальный вклад в дефектЧтобы понять, вызван ли дефект ядерным геном или вариантом мтДНК, измеряют долю варианта, число копий мтДНК и проверяют, переносится ли дефект вместе с мтДНК в клетки с другим ядром — цибриды. Средняя доля варианта в ткани и его распределение по отдельным клеткам — разные величины.Долю варианта определяют секвенированием: из числа прочтений с вариантом и без него рассчитывают его долю в образце.Число копий мтДНК на клетку оценивают количественной ПЦР: при двух копиях ядерной мишени на диплоидную клетку оно равно 2 × Qмт / Qядр; отдельные клетки анализируют после лазерной микродиссекции или одноклеточными методами.Цибрид получают, перенося митохондрии донора в ρ⁰-клетки с другим ядром. Если состав и число копий мтДНК сопоставимы, сохранение дефекта поддерживает предположение о вкладе мтДНК донора; исчезновение дефекта совместимо с ядерной причиной, но само по себе её не доказывает.Долю варианта мтДНК в образце определяют секвенированием. При глубоком секвенировании каждая позиция прочитывается многократно, и доля прочтений с вариантом оценивает долю молекул с ним. Это средняя величина для всех клеток образца: ткань с 50 % варианта может состоять из клеток с разной долей — почти без варианта и почти целиком с вариантом.Число копий мтДНК оценивают количественной ПЦР: сравнивают количество митохондриальной мишени Qмт с количеством ядерной мишени Qядр. Если ядерная мишень представлена двумя копиями на диплоидную клетку, число копий мтДНК на клетку равно 2 × Qмт / Qядр; при расчёте учитывают эффективность амплификации обеих мишеней. Для анализа отдельных клеток их вырезают из среза ткани лазерной микродиссекцией; современные одноклеточные методы позволяют одновременно определять варианты мтДНК и экспрессию генов в тысячах клеток (Nitsch 2024).Цибриды позволяют исследовать вклад двух геномов. ρ⁰-клетки с выбранным ядром сливают с безъядерными фрагментами клеток донора, несущими его митохондрии (King 1989). В цибриде мтДНК донора работает на фоне ядра реципиента. Если состав и число копий мтДНК сопоставимы с исходными, сохранение дефекта поддерживает предположение о вкладе мтДНК. Исчезновение дефекта совместимо с ядерной причиной, но может зависеть и от взаимодействия мтДНК с новым ядерным фоном, поэтому по одному исходу переноса единственную причину не устанавливают.В реальном эксперименте нужны проверки: ядерного происхождения цибрида, числа копий и состава мтДНК, условий культивирования. Цибриды разных клонов с одинаковой мтДНК тоже могут различаться.Типичная ошибка Цибрид переносит одновременно ядро пациента и мтДНК в неизменном виде.В цибрид переносят митохондрии и мтДНК донора, а ядро принадлежит реципиенту (ρ⁰-клетке). Если единственная причина дефекта — ядерный ген донора, нормальное ядро реципиента обеспечивает функцию, и дефект не воспроизводится; если причина — вариант мтДНК, дефект обычно воспроизводится. В реальном исследовании исход оценивают с контролем ядерного фона, состава и числа копий мтДНК.Единственная заданная причина дефекта комплекса I — мутация ядерного гена; мтДНК донора нормальна. Её перенесли в ρ⁰-клетки с нормальным ядром и получили цибриды с обычным числом копий мтДНК. Ожидается ли перенос исходного дефекта?А. Ожидается: донорские митохондрии сохраняют дефект независимо от ядра реципиента. (неверный вариант)При заданной ядерной причине функция зависит от нормального ядерного фона реципиента. Донорская мтДНК в условии нормальна.Б. Ожидается: использование ρ⁰-реципиента необратимо исключает сборку комплекса I. (неверный вариант)После восстановления мтДНК ρ⁰-происхождение реципиента само по себе не означает необратимой невозможности сборки комплекса. В задаче заданы нормальное ядро и обычное число копий.В. Не ожидается: мутантный ядерный ген в цибриды не переносится. (верный вариант)При заданной единственной причине нормальное ядро реципиента обеспечивает соответствующий ядерно кодируемый компонент. В реальном эксперименте нужны проверки ядерного фона, копийности и состава мтДНК.Эта тема относится к вопросу 4 практикума. Открыть сценарии вопроса 4 →Источники и условия научного выводаRussell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Nitsch L., Lareau C. A., Ludwig L. S. Mitochondrial genetics through the lens of single-cell multi-omics. Nat Genet. 2024;56:1355–1365.King M. P., Attardi G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 1989;246:500–503.Принципиальные схемы методов, не данные экспериментов. Мысленный эксперимент вопроса: единственная заданная причина — ядерный дефект, мтДНК донора нормальна, ядро реципиента нормальное; это не гарантия для реального неконтролируемого переноса. Получение ρ⁰-клеток и цибридов — King 1989; одноклеточные методы — Nitsch 2024; общая логика диагностики — Russell 2020.
Исследование · шаг 29 из 30Как выбрать величину, метод и контрольКаждый вывод о митохондриях опирается на определённую измеряемую величину. Скорость потребления O₂, скорость синтеза ATP, Δψm, импорт белка, свободная [Ca²⁺], расстояние между мембранами, доля варианта и число копий мтДНК — разные величины, и каждую измеряют своим методом. Чтобы проверить причинное предположение, нужны согласованные измерения нескольких величин и контроль, исключающий другие объяснения.Сначала формулируют предположение в виде цепочки: какое звено изменено и какие величины должны измениться вслед за ним.Для каждой величины выбирают метод и контроль: например, олигомицин для ATP-связанного дыхания, FCCP для нулевого потенциала, цибрид для разделения ядерного и митохондриального вклада.Одно измерение показывает изменение одной величины; причинную цепочку подтверждает согласованное изменение нескольких величин при вмешательстве в предполагаемое звено.Методы предыдущих шагов отвечают на разные вопросы. Респирометрия измеряет потребление O₂, но не синтез ATP. Зонд TMRM отражает потенциал, но не импорт белка. Адресованный индикатор показывает свободную [Ca²⁺] в одном компартменте, но не расстояние между мембранами. Секвенирование даёт среднюю долю варианта в образце, но не функцию отдельной клетки.Поэтому исследование начинают с вопроса: какое звено предположительно изменено и какие величины должны измениться вслед за ним? Если предполагается разобщение, ожидают одновременно ускорения дыхания, снижения Δp и снижения синтеза ATP. Если снижен расход ATP — замедления дыхания при сохранном сопряжении. Наблюдая только одну величину, эти варианты не различить.Каждое измерение требует контроля. Для дыхания — немитохондриальный остаток и ответ на олигомицин; для потенциала — FCCP как нулевой уровень; для импорта — защита от протеазы и детергент; для генетического вклада — цибрид с известным ядром. Число изменившихся показателей само по себе ничего не доказывает: важно, чтобы они изменялись согласованно с предполагаемой цепочкой и чтобы вмешательство в предполагаемое звено воспроизводило результат.Схема шага сводит вопросы, величины, методы, контроли и границы вывода в одну таблицу; принципиальные схемы методов показаны в соответствующих шагах.Типичная ошибка Чем больше разных маркеров изменилось, тем надёжнее доказана любая причинная цепочка.Доказательность зависит не от числа изменившихся показателей, а от того, согласуются ли они с предполагаемой цепочкой и подтверждает ли её вмешательство в предполагаемое звено с контролями.Нужно проверить предположение, что снижение синтеза ATP вызвано именно разобщением. Какое сопоставление наиболее содержательно?А. Совместная оценка дыхания, синтеза ATP и состояния градиента с контролями. (верный вариант)Разобщение связывает перенос электронов, Δp и использование энергии для ATP. Согласованная оценка этих величин проверяет предполагаемое звено, хотя причинный вывод всё равно зависит от вмешательства и контролей.Б. Только определение содержания ATP: его снижение само по себе доказывает разобщение. (неверный вариант)Содержание ATP может снижаться из-за изменения образования или расхода. Однократное измерение содержания ATP не устанавливает причину его снижения.В. Только оценка дыхания: его ускорение само по себе доказывает разобщение. (неверный вариант)Ускорение дыхания возможно при увеличении потребления ATP и других изменениях. Без оценки сопряжения и контролей оно не выделяет разобщение.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаDivakaruni A. S., Paradyse A., Ferrick D. A., Murphy A. N., Jastroch M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods Enzymol. 2014;547:309–354. doi:10.1016/B978-0-12-801415-8.00016-3Gerencser A. A., Chinopoulos C., Birket M. J., Jastroch M., Vitelli C., Nicholls D. G., Brand M. D. Quantitative measurement of mitochondrial membrane potential in cultured cells: calcium-induced de- and hyperpolarization of neuronal mitochondria. J Physiol. 2012;590:2845–2871. doi:10.1113/jphysiol.2012.228387Lim D., Dematteis G., Tapella L., Genazzani A. A., Calì T., Brini M., Verkhratsky A. Ca²⁺ handling at the mitochondria–ER contact sites in neurodegeneration. Cell Calcium. 2021;98:102453.Nitsch L., Lareau C. A., Ludwig L. S. Mitochondrial genetics through the lens of single-cell multi-omics. Nat Genet. 2024;56:1355–1365.Сопоставление методов не является экспериментальным результатом. Связь величин и методов — Divakaruni 2014 (респирометрия), Gerencser 2012 (потенциал), Lim 2021 (Ca²⁺), Nitsch 2024 (генетический анализ отдельных клеток). Для численной оценки скорости синтеза ATP нужен самостоятельный измерительный или расчётный протокол.
Исследование · шаг 30 из 30Почему кальциевый сигнал не устраняет любой дефект дыхательного аппаратаОбъединим механизмы. Пусть мутация ядерного гена фактора сборки снизила предельную мощность дыхательной цепи, а субстраты и O₂ доступны. Может ли умеренный Ca²⁺-сигнал, ускоряющий дегидрогеназы, исправить дефект? Нет: Ca²⁺ регулирует образование NADH, а ограничение задано сборкой комплексов. Усиление подачи электронов не создаёт недостающих комплексов.Ca²⁺ в матриксе активирует PDH, IDH3 и OGDH, и образование NADH ускоряется.Перенос электронов ограничен числом собранных комплексов: дополнительный NADH может использоваться только в пределах остаточной мощности цепи.Длительный сигнал добавляет к дефекту затраты потенциала на вход Ca²⁺ и риск перегрузки, а не устраняет дефект.В этой задаче соединены все четыре вопроса. Генетическое звено: мутация ядерного гена фактора сборки уменьшила число собранных комплексов, то есть предельную мощность цепи. Энергетическое звено: мощность цепи определяет, какую Δp и какой синтез ATP митохондрия может поддерживать при данной нагрузке. Транспорт: от Δψm зависят импорт белков и вход Ca²⁺. Сигнальное звено: Ca²⁺ ускоряет образование NADH.Если мощность цепи полная, умеренный сигнал Ca²⁺ помогает синтезу ATP следовать за потребностью: NADH образуется быстрее, а цепь способна окислить его. При дефекте сборки скорость окисления дополнительного NADH ограничена остаточной мощностью цепи. В покое резерва может хватать, и дефект почти не заметен; при нагрузке Δp и синтез ATP снижаются, а Ca²⁺ этого не исправляет, потому что регулирует другое звено.Длительный сигнал добавляет новые затраты: вход каждого иона Ca²⁺ использует электрическую составляющую градиента, а накопление Ca²⁺ в матриксе повышает вероятность перехода проницаемости. При ограниченной мощности цепи митохондрии хуже компенсируют эти затраты.Схема качественная и не предсказывает ни выживания клеток, ни тяжести болезни: исход зависит от конкретного варианта, остаточной мощности, ткани и нагрузки.Типичная ошибка Любое увеличение Ca²⁺ восстанавливает ATP при любом генетическом дефекте.Ca²⁺ ускоряет образование NADH, но не восстанавливает сборку комплексов. При ограниченной мощности цепи дополнительный NADH используется только в пределах остаточного резерва, а длительный сигнал повышает риск перегрузки.Ядерный дефект сборки ограничил максимальную мощность дыхательного аппарата; субстраты и O₂ доступны. Умеренный Ca²⁺-сигнал активировал матричные ферменты. Устраняет ли это само по себе дефект сборки?А. Да: активация матричных ферментов сама по себе восстанавливает сборку комплексов. (неверный вариант)Изменение активности матричных ферментов не заменяет нарушенный этап сборки. В условии первичное ограничение задано именно сборкой.Б. Да: повышение образования NADH полностью компенсирует ограничение мощности цепи. (неверный вариант)Дополнительный NADH не устраняет заданный предел мощности дыхательного аппарата. Компенсация возможна лишь в пределах сохранных звеньев и резерва.В. Нет: усиление образования NADH само по себе не устраняет нарушение сборки комплексов. (верный вариант)Регуляция образования NADH и сборка комплексов — разные звенья. Ответ на Ca²⁺ может зависеть от остаточной функции, но из активации ферментов не следует устранение первичного дефекта.Этот шаг объединяет материал всех четырёх вопросов практикума. Вопрос 1 → Вопрос 2 → Вопрос 3 → Вопрос 4 →Источники и условия научного выводаDenton R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 2009;1787:1309–1316. doi:10.1016/j.bbabio.2009.01.005Russell O. M., Gorman G. S., Lightowlers R. N., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 2020;181:168–188. doi:10.1016/j.cell.2020.02.051Lim D., Dematteis G., Tapella L., Genazzani A. A., Calì T., Brini M., Verkhratsky A. Ca²⁺ handling at the mitochondria–ER contact sites in neurodegeneration. Cell Calcium. 2021;98:102453.Качественная учебная схема. В задаче ограничение задано сборкой дыхательного аппарата, а не недостатком субстратов; нет утверждения о любой мутации или любом Ca²⁺-ответе. Регуляция дегидрогеназ Ca²⁺ — Denton 2009; генетические дефекты сборки — Russell 2020; перегрузка Ca²⁺ — Lim 2021.
