От пространственной организации к клеточному ответу и регуляторной памяти: 48 понятий семинаров 1–6 и связи между ними — 61 научная связь, проверенная по первоисточникам, и 5 учебных сопоставлений.
Как читать карту
Стрелка означает зависимость, а не обязательно перенос вещества или следующую реакцию. Тип связи всегда назван словами в паспорте связи.
Сплошная линия — научная связь, проверенная по первоисточникам; точечная — вывод зависит от изучаемой системы; пунктир — сопоставление понятий, а не причинная связь (без стрелки — понятия сравниваются, а не влияют одно на другое). Стрелка — влияние в указанном направлении, Т-образный конец — тормозящее влияние.
Буква в паспорте и в списке связей — форма утверждения: Ф — экспериментально установленный факт, В — вывод из выписанных посылок, Г — гипотеза. У каждого метода в паспорте связи есть схема (блок «Методы карты» под картой).
Порядок семинаров — порядок изучения, а не цепь событий в клетке.
Вопросы программы показаны дословно; «сквозной вопрос» семинара — подсказка для карты, а не вопрос коллоквиума.
Режим рецензента. Вердикты и замечания сохраняются только в этом браузере.
научная связь (Ф, В, Г)зависит от системысопоставление, не причинная связьтормозящее влияние
Методы карты: схемы (31)
Что измеряет каждый метод, упомянутый в паспортах связей, и чего он не показывает.
Адресный FRET-сенсорЧто показывает: концентрацию вещества (pH, Ca²⁺, cAMP, Ran-GTP, PIP₃) в выбранном компартменте живой клетки; сенсор сам связывает часть вещества.Быстрый и медленный буферы Ca²⁺Что показывает: расстояние «канал — сенсор»: BAPTA связывает Ca²⁺ быстро и подавляет события и у самого канала, EGTA — медленно и действует лишь на удалении.Фотоосвобождение IP₃Что показывает: как далеко и как быстро распространяется сигнал от точки, где вспышка света освободила IP₃ из неактивной формы с фотолабильной защитной группой (caged IP₃).Опустошение депо и возврат Ca²⁺ в средуЧто показывает: первый подъём — выход Ca²⁺ из ЭПР, второй — депо-зависимый вход из среды; выключение STIM1 или Orai1 убирает второй подъём.Задание профиля входа (оптогенетика, фиксация концентрации Ca²⁺)Что показывает: ответ на вход заданной длительности и формы: экспериментатор задаёт сигнал в обход рецептора и сравнивает короткий и длительный вход.Иммунофлуоресценция и прижизненная локализацияЧто показывает: где находится белок (ядро, цитоплазма, мембрана органеллы), но не с каким участком ДНК он связан и не активность гена.Картирование связывания (ChIP, CUT&RUN)Что показывает: относительное обогащение фактора на участках ДНК в среднем по клеткам, а не абсолютную долю занятых копий; не показывает, активирует ли он ген.ATAC-seqЧто показывает: доступен ли участок для транспозазы; не показывает, какой фактор с ним связан и идёт ли транскрипция.Синтез новой РНК (PRO-seq, nuclear run-on)Что показывает: идёт ли транскрипция гена в момент измерения: метят только растущие цепи РНК.Содержание мРНК и время её полужизниЧто показывает: содержание мРНК (ОТ-ПЦР) — итог синтеза и распада; после блока транскрипции по скорости снижения мРНК оценивают её время полужизни.Вестерн-блот с фосфоспецифичными антителамиЧто показывает: относительное изменение фосфосигнала, нормированного на весь белок, в среднем по клеткам; долю фосфорилированных молекул (стехиометрию) блот сам по себе не даёт — для неё нужны калибровка или сдвиг подвижности белка (Dephoure 2013); обработка λ-фосфатазой проверяет, что антитело узнаёт именно фосфорилированную форму.Одноклеточные репортёры активности во времениЧто показывает: временной ряд активности киназы в каждой клетке; среднее по популяции (жирная линия) может скрывать импульсы и переключения отдельных клеток.FRAPЧто показывает: скорость обмена молекул в выбранной области с окружением после фотообесцвечивания; сам по себе не доказывает фазового разделения.Прижизненная съёмка и кимограммаЧто показывает: положение отдельных органелл во времени: наклонные линии — движение (направление и скорость пробега), вертикальные — остановка.Эпителий на пористом фильтреЧто показывает: ответ на лиганд, добавленный сверху (апикально) или снизу (базолатерально); целостность барьера плотных контактов проверяют отдельно — по трансэпителиальному сопротивлению.Доступность ДНК для нуклеаз (рестриктазы, MNase)Что показывает: скорость расщепления сайта в нуклеосоме и на свободной ДНК; MNase-картирование — положение и занятость нуклеосом.Реконструкция из очищенных компонентов (in vitro)Что показывает: достаточно ли заданного набора белков и ДНК для процесса; не показывает, так ли процесс идёт в клетке.Солевая диссоциация нуклеосомЧто показывает: при повышении ионной силы нуклеосома теряет димеры H2A–H2B, и на ДНК остаётся тетрасома (H3–H4)₂; менее стабильные нуклеосомы теряют димеры раньше; сравнивают нативные нуклеосомы с разным набором вариантов.Бисульфитное секвенирование и метод шпилькиЧто показывает: метилирование CpG: неметилированный C превращается в U и читается как T, 5mC остаётся C; шпилька связывает две цепи одной молекулы и выявляет полуметилированные CpG.Hi-C и 4CЧто показывает: частоту пространственной близости участков ДНК (сшивка и лигирование концов); контакт не означает активации гена.CRISPRiЧто показывает: нужен ли энхансер для экспрессии гена: каталитически неактивный Cas9 с репрессорным доменом (dCas9–KRAB) выключает выбранный участок, затем измеряют РНК гена-мишени.Острое удаление белка (дегрон) или острое ингибированиеЧто показывает: ранние последствия утраты белка или активности: белок разрушается за минуты–часы, и измерение проводят до компенсаторных изменений.Вмешательство: выключение гена, мутант, ингибитор, возвращение белкаЧто показывает: выключение или ингибитор показывают, что белок нужен, если специфичность вмешательства проверена; возвращение устойчивого к вмешательству белка дикого типа поддерживает специфичность эффекта, а вывод усиливают сопоставимые количество и локализация белка, независимое второе вмешательство и восстановление самого исследуемого процесса; достаточность проверяют добавлением или принудительной активацией.Кривые «доза — ответ» и связыванияЧто показывает: крутизну (коэффициент Хилла) и полумаксимальную дозу; сравнение с занятостью рецептора выявляет резерв рецепторов; титрование вверх и вниз проверяет гистерезис.Конформационные сенсоры (нанотела)Что показывает: на какой мембране находится активная форма рецептора или Gs: нанотело из цитозоля связывается только с активной конформацией и накапливается на этой мембране.Репортёрная конструкцияЧто показывает: активность регуляторного участка (энхансер, промотор, сайт AP-1) по количеству белка-репортёра; сравнивают варианты участка или условия.Искусственная привязкаЧто показывает: достаточно ли положения белка для эффекта: индуцируемая димеризация или синтетический линкер переносят белок в выбранное место (мембрана, контакт органелл).Клональный анализЧто показывает: передачу состояния через деления: состояние прослеживают у потомков одной клетки после снятия исходного сигнала.Схема эксперимента на регуляторную памятьЧто показывает: ответ на повторный стимул сравнивают с ответом наивных клеток на тот же стимул; без этой группы память не отличить от адаптации.Мембранный потенциал отдельных митохондрий и дыханиеЧто показывает: потенциал-зависимый краситель показывает разнородность митохондрий; потребление кислорода — дыхание клеток в целом.Структура комплексаЧто показывает: взаимное расположение белков и участков связывания (рентгеноструктурный анализ, криоэлектронная микроскопия); показывает возможный механизм, но не частоту образования комплекса в клетке.
Связи, исключённые после научной проверки (видно только с ?audit)
Предскажи: AKT, FOXO и ген-мишень
Учебная качественная модель: никаких численных значений; ответ «недостаточно данных» — полноправный вариант. Модель учитывает только AKT: другие киназы и ацетилирование тоже меняют локализацию FOXO.
Обратная задача
По иммунофлуоресценции FOXO находится в ядре, но содержание мРНК гена-мишени не повысилось. Какие объяснения совместимы с этими данными? Отметьте все подходящие.
А. Иммунофлуоресценциягде находится белок, но не с каким участком ДНК он связанБ. Картирование связывания (ChIP, CUT&RUN)с какими участками ДНК связан факторВ. ATAC-seqдоступен ли участок, но не какой фактор с ним связанГ. Синтез новой РНКидёт ли транскрипция в момент измерения
Какой эксперимент различит объяснения «FOXO не связан с участком» и «FOXO связан, но ген не активируется»?
Собери объяснение
Почему инсулин может снижать FOXO-зависимую транскрипцию гена? Отмечайте звенья объяснения по порядку — первым начальное событие; повторное нажатие снимает звено.